JP4133344B2 - レポーター（標識）分子間相互作用を利用した分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、レポーター間相互作用による物質の分析方法に関する。特に各レポーターを近接させ、レポーター間相互作用を高める高感度分析方法に関する。
【０００２】
背景技術
特定物質の分析測定は、臨床診断、食品衛生、環境衛生など様々な分野において、測定系の高感度化、簡易化等の研究が精力的に行われてきた。なかでも、抗原抗体反応を利用した免疫測定は、感度、特異性の理由により広く利用されている。代表的な免疫測定法としては、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）があげられる。
【０００３】
サンドイッチＥＩＡとは、測定対象物質に対する２種類の抗体のうち、一方を固相に固定化し、この固相と酵素標識したもう一方の抗体と試料を混ぜ入れて反応させ、未反応の酵素標識抗体を洗浄により除去した後、酵素の基質溶液を添加し、免疫複合体の生成量を酵素活性により測定するというものである。この方法は、再現性が良くしかも高感度に抗原濃度を測定できるため、広く利用されている。しかし、サンドイッチ法においては、未反応の標識抗体を除去するために煩雑で時間のかかる洗浄操作が必要であるなどの問題点がある。
【０００４】
このような問題点を解消するために、近年、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および化学発光エネルギー移動（ＣＲＥＴ）などのエネルギー移動現象や一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性などの分子間相互作用を利用した免疫測定法が注目されている。蛍光エネルギー移動とは、ある特定の蛍光物質間で観察される現象であり、蛍光エネルギー供与体の蛍光スペクトルと蛍光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、蛍光エネルギー供与体の蛍光エネルギーが受容体に移動し、蛍光エネルギー受容体の発光が観察されるという現象である。
【０００５】
生物発光エネルギー移動とは、ホタルルシフェラーゼのような生物発光を触媒する酵素と蛍光物質間で観察される現象であり、生物発光酵素の発光スペクトルと発光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、生物発光エネルギー供与体の発光エネルギーが受容体に移動し、発光エネルギー受容体の蛍光が観察されるという現象である。
【０００６】
化学発光エネルギー移動とは、ペルオキシダーゼのような化学発光を触媒する酵素と蛍光物質間で観察される現象であり、化学発光酵素の発光スペクトルと発光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、化学発光エネルギー供与体の発光エネルギーが受容体に移動し、発光エネルギー受容体の蛍光が観察されるという現象である。
【０００７】
一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性とは、β−ガラクトシダーゼのα部位欠損変異体Δαとω部位欠損変異体Δωに代表される現象であり、Δα、Δωそれぞれ単独ではβ−ガラクトシダーゼ酵素活性が低下しているが、２者が近接し、会合することによってβ−ガラクトシダーゼ酵素活性が上昇するというものである。このようなエネルギー移動現象および一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性を免疫測定および蛋白質−蛋白質相互作用の検出に応用した例がこれまでにいくつか報告されている。
【０００８】
その中でエネルギー移動現象を免疫測定に応用した例としては、東洋紡績（株）により報告された方法が挙げられる（特開平１０−３１９０１７）。この方法とは、測定対象物質（Ｘ）に対して結合能を有する物質Ａ、Ｂをそれぞれ蛍光エネルギー供与体と受容体の関係にある物質Ｆ１、Ｆ２で標識し、Ａ−Ｆ１、Ｘ、Ｂ−Ｆ２を混合し、一定時間反応させ複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２を形成させた後、洗浄操作をおこなうことなく、Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２量をＦ１からＦ２への蛍光エネルギー移動効率として測定するというものである。
【０００９】
しかし、実際の免疫測定の対象物質（抗原）としては高分子の蛋白質であることが多く、また２種類のモノクローナル抗体を用いた場合などは２つの抗原決定基は空間的に離れているために、反応複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２を形成したとしても、Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２中でのＦ１とＦ２の空間的距離が近接せず、効率的なエネルギー移動が起こらない。そのために、測定感度が低いという問題を抱えている。
【００１０】
フェルスターの蛍光エネルギー移動に関する理論によると、蛍光エネルギー移動の効率は、供与体、受容体間の距離の６乗に反比例する（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８．１〜１３．１９９４）。このためＦＲＥＴ、ＢＲＥＴおよびＣＲＥＴなどのエネルギー移動現象を免疫測定に応用するには、このような免疫複合体の中における発光エネルギー供与体と受容体を常に一定の位置に配置させる技術の確立が必要である。
【００１１】
ＦＲＥＴの免疫測定への応用において、エネルギー供与体と受容体の空間的配置をうまくおこなった例としては、上田らの方法があげられる（特開平１０−７８４３６）。その方法とは、抗体断片ＶＬ、ＶＨを蛍光エネルギー供与体および受容体で標識し、抗原存在下において、抗原とＶＬとＶＨが安定な三者会合体を形成した時にのみ、蛍光エネルギー移動が起こり、蛍光エネルギー供与体と受容体の蛍光強度比を測定することにより、抗原濃度を測定するというものである。なお、ＶＬ、ＶＨを利用したこの測定方法は、ＢＲＥＴにおいても抗原濃度測定可能であることが示されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９．７７〜８１．２００１）。
【００１２】
この方法は、抗原存在時に抗体断片ＶＬ、ＶＨが常に５ｎｍ以内に近接するという性質と蛍光エネルギー移動を組み合わせた非常にユニークな免疫測定法であるが、自然界に存在する抗体の多くは、抗原非存在時に置いてもＶＬとＶＨが会合する性質を持つために全ての抗体においてこの原理を応用することができない。そのため、実用化には至っていない。
【００１３】
また、一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性を蛋白質−蛋白質相互作用のモニタリングに応用した方法が、ＲＯＳＳＩらにより報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４．８４０５〜８４１０．１９９７）。ＲＯＳＳＩらの方法とは、Ｒａｐａｍｙｃｉｎによりダイマー化が誘導されるＦＲＡＰ、ＦＫＢＰ１２蛋白質とβ−ガラクトシダーゼΔα、Δωをそれぞれ融合した発現ベクターを動物細胞に導入し、これらキメラ蛋白質を発現している細胞にＲａｐａｍｙｃｉｎを添加したところ、ＲａｐａｍｙｃｉｎによってＦＲＡＰ、ＦＫＢＰ１２蛋白質のダイマー化が起こり、その結果、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ濃度依存的なβ−ガラクトシダーゼ活性が測定できるというものである。
【００１４】
この方法は、生細胞内の物質の測定が行える非常に優れた方法であるが、低分子のＲａｐａｍｙｃｉｎによってＦＲＡＰ、ＦＫＢＰのダイマー化が誘導されることを利用した非常に特殊な例である。このような酵素の相補性を免疫測定における免疫複合体の検出に用いる場合も、ＦＲＥＴなどのエネルギー移動を利用する免疫測定方法と同様、レポーター蛋白質を常に一定の位置に配置させる技術が必要である。
【００１５】
従って、本発明は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光−蛍光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）などのエネルギー移動現象および一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性などの分子間相互作用を物質の濃度測定の検出系に用いるにあたり、精度よくしかも高感度に測定をおこなうために、反応複合体中におけるエネルギー供与体とエネルギー受容体または相補反応供与体と相補反応受容体の空間的配置を制御する方法およびそれを利用した測定系を提供することにある。
【００１６】
発明の開示
本発明者らは、まず、測定対象物質に対して親和性を有する２種類の物質（測定対象物質と直接的に親和・結合する物質）それぞれに、蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせの蛍光物質（レポーター）を標識した。さらにこれらの蛍光物質を標識した物質または蛍光物質自体それぞれにロイシンジッパーペプチド（レポーターを近接した状態で安定化させるための物質）を標識した試薬を作製した。この試薬と検体を混合し、免疫複合体を形成させ、一方の蛍光物質を励起したところ、反応複合体中において互いに弱い親和性を有する物質どうしの親和性に基づく結合によりそれぞれの蛍光物質が空間的に近接し、より効率的なエネルギー移動が起こることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、測定対象物質（Ｘ）に結合することができる物質（Ａ）を第一レポーター（Ｒ１）で標識した第一試薬と、測定対象物質（Ｘ）に対し物質（Ａ）とは異なる部位で結合することができる物質（Ｂ）を、第一レポーター（Ｒ１）と相互作用を引き起こす第二レポーター（Ｒ２）で標識した第二試薬とを用いる測定対象物質（Ｘ）の測定方法であって、
第一試薬が、第一レポーター（Ｒ１）と結合する物質（Ｃ）を含み、物質（Ａ）および第一レポーター（Ｒ１）が直接結合するかまたは物質（Ｃ）を介して結合してなる試薬（Ａ−Ｒ１−ＣまたはＡ−Ｃ−Ｒ１）であり、
第二試薬が、第二レポーター（Ｒ２）と結合し、物質（Ｃ）と親和性を有する物質（Ｄ）を含み、物質（Ｂ）および第二レポーター（Ｒ２）が直接結合するかまたは物質（Ｄ）を介して結合してなる試薬（Ｂ−Ｒ２−ＤまたはＢ−Ｄ−Ｒ２）であり、
第一試薬、第二試薬および測定対象物質が反応複合体を形成し、
該反応複合体における第一試薬中の物質（Ｃ）と第二試薬中の物質（Ｄ）との親和性に基づく結合により、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが空間的に近接された状態で安定化され、これら２つのレポーター間に測定可能な相互作用が引き起こされる、前記測定方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、測定対象物質（Ｘ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部、細胞、細胞内オルガネラまたは低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００１９】
また本発明は、物質（Ａ）および／または物質（Ｂ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部または低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２０】
さらに本発明は、物質（Ｃ）および／または物質（Ｄ）が、蛋白質、ペプチド、核酸および糖鎖からなる群より選択される１または２以上からなる物質または低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。 また本発明は、第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が異なる蛍光物質であり、レポーター間の測定可能な相互作用が蛍光エネルギー移動からなることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２１】
さらに本発明は、第一レポーター（Ｒ１）が生物発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される生物発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、第一レポーター（Ｒ１）が化学発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される化学発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２２】
さらに本発明は、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）が酵素の一部を構成する分子であって、第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が、それぞれ単独では酵素活性を欠失または減じているが、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが相互作用することによって、酵素活性が生じるかまたは増加することを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、物質（Ａ）および物質（Ｂ）が、測定対象物質（Ｘ）に対してそれぞれ異なる部位を認識する抗体もしくは抗体由来の単鎖Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆｖの一部、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたはそれらの変異体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２３】
さらに本発明は、物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、ペプチド性物質からなり、第一試薬および第二試薬が融合蛋白質からなることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、いずれもロイシンジッパーペプチドであることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
さらに本発明は、測定が、第一試薬および第二試薬を同時に測定対象物質に作用させる均一系でおこなう測定であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２４】
また本発明は、測定が、第一試薬および第二試薬のうち、一方の試薬を予め固相に固定化し、その後に他方の試薬および測定対象物質を固定化した試薬に作用させる不均一系でおこなう測定であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
さらに本発明は、物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）を含む、前記の測定方法に用いるための測定用試薬に関する。
また本発明は、前記の測定用試薬を含む測定用キットに関する。
【００２５】
ここで「測定」とは、測定対象物質をレポーターの発するシグナルを測定することにより測定することであり、単に測定対象物質の存在を測定し検知すること、例えば細胞や組織において測定対象物質の存在する分布を測定すること、および測定対象物質の濃度を測定することなどを含む。
【００２６】
発明を実施するための形態
本発明による測定方法の特徴は、測定対象物質（Ｘ）に対して親和性を有する物質（Ａ）を第一レポーター（Ｒ１）で標識したＡ−Ｒ１および測定対象物質（Ｘ）に対して親和性を有する物質（Ｂ）を第二レポーター（Ｒ２）で標識したＢ−Ｒ２のそれぞれに、互いに弱い親和性を有する物質（Ｃ）および物質（Ｄ）をさらに導入した第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）および第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）を使用することにある。ここで物質（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ測定対象物質（Ｘ）の異なる部位において結合可能である。
第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）における各物質間の結合は、互いにそれぞれの物質の有する性質を失わせたり、低減させるものではない結合であることが望ましいが、これらの結合の組み合わせはとくに限定されないが、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）による結合によりレポーター同士を近接化するためには、Ａ−Ｒ１−ＣまたはＡ−Ｃ−Ｒ１が好ましい。これは第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）についても同様である。
【００２７】
なお、試薬の表記として、例えばＡ−（Ｒ１−Ｃ）との表記を適宜使用するが、括弧内の２つの部分のいずれかが括弧外の物質と結合していることを示す意図であり、とくに言及しない限りＡ−Ｒ１−ＣおよびＡ−Ｃ−Ｒ１を表している。
第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａと第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂを測定物質Ｘの存在する検体と混合することにより、複合体（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）が形成され、さらに複合体中で局所濃度が高まる作用により、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が結合し、より安定な複合体が形成される。また、第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａと第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂとが、ＣとＤの弱い相互作用により結合している状態でも、測定対象物質Ｘと第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａおよび第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂが結合することにより、安定な複合体が形成される。
【００２８】
さらに、測定対象物質Ｘと第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）の結合と、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）の間の結合（Ｃ：Ｄ）が同時に起こる場合も、同様に安定な複合体が形成される。その結果、複合体中において、Ｒ１とＲ２が近接した状態が安定化され、より効率的なエネルギー移動が観察される。一方、測定対象物質Ｘが存在しないときは、複合体（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）は形成されず、また、ＣとＤの相互作用は弱いため、Ａ−（Ｒ１−Ｃ）：（Ｄ−Ｒ２）−Ｂが形成されたとしても非常に不安定な複合体であるため、効率的なエネルギー移動は観察されない。
本発明の測定方法における測定対象物質Ｘは、該物質と結合能を有する物質が存在する物質であれば、特に限定されない。
【００２９】
このような測定対象物質Ｘとしては、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖、脂質などおよびこれらの一部、細胞および細胞内オルガネラなど、あるいはハプテンに総称される低分子化合物などが例としてあげられる。
本発明の測定方法における測定対象物質と結合能を有する物質ＡおよびＢは、測定対象物質と特異的に結合する物質であれば、特に限定されないが、物質ＡとＢは互いに親和性を有さず、それぞれ測定対象物質Ｘの異なる部分を認識し、結合する物質である必要がある。例えば、測定対象物質が抗原の場合、物質ＡおよびＢとしては、それぞれ別の抗原決定基を認識する抗体が考えられる。抗体としては、動物を免疫することによって得られるＩｇＧだけでなく、ＩｇＧのパパイン消化断片Ｆａｂ、ペプシン消化断片Ｆ（ａｂ’）２、などの抗体断片、または、遺伝子工学的に作製したＦｖ断片、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）等も利用することができる。
【００３０】
物質ＡおよびＢとしては、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、抗体、抗原、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質またはその一部またはハプテンなどの低分子化合物なども利用することができる。さらに、測定対象物質Ｘが抗体の場合、物質ＡがＸに認識されうるハプテン、物質Ｂが物質Ａとは異なる部位でＸと結合し得る物質などを利用することができる。
【００３１】
第一レポーターＲ１と第二レポーターＲ２は、一組のレポーターとして用いられるものであり、相互作用することで測定可能なシグナルを生じる。本発明の測定方法においては、該シグナルを適切な測定方法により測定することにより、測定対象物質Ｘの測定を行なう。
【００３２】
本発明の測定方法におけるレポーターＲ１およびＲ２は、ＦＲＥＴの場合、蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせであれば、特に限定されないが、Ｒ１としては、ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）およびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、フルオレセイン等の蛍光物質などが考えられ、Ｒ２としては、ＧＦＰおよびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、ローダミン等の蛍光物質などが考えられる。
【００３３】
また、ＢＲＥＴの場合、生物発光−蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせであれば、特に限定されない。レポーターＲ１としては、生物発光を触媒する酵素またはその改変体を使用することができ、例としては、発光細菌、ホタル、ウミホタル、ヒカリコメツキ、ウミシイタケ由来の発光酵素などがあげられる。また、Ｒ１は化学発光反応を触媒する酵素またその改変体でもよく、例としては、ペルオキシダーゼがあげられる。発光酵素の基質としては、ホタル由来のルシフェラーゼの場合、ルシフェリン、ペルオキシダーゼの場合、ルミノールがあげられる。レポーターＲ２としては、ＧＦＰおよびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、ローダミン等の蛍光物質などが例としてあげられる。
【００３４】
さらには、Ｒ１とＲ２が酵素の一部を構成する分子であって、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ単独では酵素活性を欠失または減じているが、Ｒ１とＲ２とが相互作用することによって、酵素活性が生じるかまたは増加するような組合せを利用することができる。このようなレポーターとしては、βガラクトシダーゼΔα変異体やΔω変異体などが例としてあげられる。
本発明において、測定可能なシグナルを生じるレポーターＲ１とＲ２の間の距離は、０〜５０ｎｍ、とくに１０ｎｍ以下で安定化されることが好ましい。
【００３５】
本発明の測定方法における物質ＣおよびＤは、互いに弱い親和性を有する物質であれば特に限定されず、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、核酸、糖鎖などまたはこれらの複合体を用いることができる。具体的には、たとえば、真核生物の核内転写調節因子ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓなどにみられるロイシンジッパー配列などのペプチド断片（ロイシンジッパーペプチド）を遺伝子工学的に作製し、それを利用することができる。この場合、それらのアミノ酸配列に変異を導入し、親和性の強弱を調節することが可能である。また、互いに相補性をもつＤＮＡ配列などを利用することもできる。この場合、これらのＤＮＡ配列の長さやＧＣ含量を調節することにより、親和性の強弱を調節することも可能である。さらに、物質Ｃをハプテンに総称される低分子化合物とし、物質Ｄとして物質Ｃを認識しうる抗体および抗体断片を利用することができる。
【００３６】
本発明の測定方法における第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）の作製においては、物質Ａ（Ｂ）、レポーターＲ１（Ｒ２）、物質Ｃ（Ｄ）がペプチド性物質の場合は、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）（Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））を遺伝子工学的に融合蛋白質として作製することが、部位特異的な標識ができる、製造工程を減らすことができるなどの点からより好ましいが、物質Ａ（Ｂ）、レポーターＲ１（Ｒ２）、物質Ｃ（Ｄ）それぞれの物質を調製し、それぞれを化学的に結合させて作製することも可能である。また、プロテインＧ、プロテインＡなどの抗体断片と親和性を有する蛋白質を介して、抗体断片にＲ１（Ｒ２）、Ｃ（Ｄ）などを標識することもできるし、アビジン−ビオチンの相互作用を利用して、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）（Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））を作製することも可能である。
【００３７】
本発明の測定方法は、蛍光エネルギー移動および発光−蛍光エネルギー移動を利用したものであるので、未反応の試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）を分離する必要がなく、通常のサンドイッチ法でおこなわれる洗浄操作をすることなく、測定物質濃度の測定が可能であるため、均一系、不均一系のどちらでも測定が可能であるが、簡便性の面から、均一系での測定が望ましい。
【００３８】
不均一系の測定の場合には、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）およびＢ−（Ｒ２−Ｄ）の一方を固相に固定化し、他方の試薬と検体を混合し、一定時間反応させた後、そのまま測定することもできるし、洗浄操作をおこなった後、測定することも可能である。固相としては、ラテックス粒子、ポリスチレンビーズ、ＥＬＩＳＡマイクロプレートなど通常の免疫測定に使用するものを適宣使用することができる。
次に本発明の測定系を模式図（図１）を用いて、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
抗原（Ｘ）を測定対象物質とする測定を行なう場合、抗原の異なる部位に結合する２つの抗体断片（１）および（２）（Ａ、Ｂ）を用意する。抗体断片（１）には蛍光蛋白質（１）（蛍光エネルギー供与体、Ｒ１）が結合し、さらにロイシンジッパー（Ｃ）が結合している。一方、抗体断片（２）には蛍光蛋白質（２）（蛍光エネルギー受容体、Ｒ２）が結合し、さらにロイシンジッパー（Ｄ）が結合している。
【００４０】
したがって、図１の測定系では、抗体断片（１）、蛍光蛋白質（１）およびロイシンジッパーを含む試薬（Ａ−Ｒ１−Ｃ）と、抗体断片（２）、蛍光蛋白質（２）およびロイシンジッパーを含む試薬（Ｂ−Ｒ２−Ｄ）との２種類の試薬を用いる。
これら２種類の試薬に測定対象物質である抗原（Ｘ）を添加して共存させることによって、図１に示す反応複合体（（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））が形成される。
【００４１】
反応複合体が形成されると、２つのロイシンジッパー（Ｃ、Ｄ）が互いに親和性結合により結合されることにより、蛍光蛋白質（１）（Ｒ１）と蛍光蛋白質（２）（Ｒ２）が近接するように配置される。図１においては、レポーターは蛍光蛋白質であることから、結合する必要はなく、近接すれば本発明の目的は果たせるが、レポーターの種類により、必要に応じて結合してもよい。なお、均一系の測定系の場合は、非特異的なシグナルが生じないように、レポーター間の結合は弱いかまたは結合しないことが好ましい。
【００４２】
図１に示すように、蛍光共鳴エネルギー供与体（Ｒ１）は、励起光λ（１）を照射すると、単独で蛍光λ（１）′を生じる。図１のように反応複合体を形成すると、蛍光共鳴エネルギー供与体（Ｒ１）と蛍光共鳴エネルギー受容体（Ｒ２）とが近接しており、これらの間に蛍光エネルギー移動が起きる。したがって、反応複合体に励起光λ（１）を照射すると、蛍光エネルギー移動が起きる結果、蛍光λ（２）′が生じる。
【００４３】
蛍光エネルギー移動の効率は、Ｒ１、Ｒ２間の距離の６乗に反比例するため、Ｃ、Ｄにより近接化された結果発せられるλ（２）′は、Ｃ、Ｄにより近接化されない場合よりも強い蛍光が得られるという観点から高感度測定に適しており、さらにＲ１、Ｒ２は反応複合体においてＣ、Ｄにより常に一定の距離に配置されるため、安定したシグナルが得られるという点で優れている。
このように、蛍光蛋白質をレポーターとして用いた場合は、蛍光エネルギー移動による蛍光が、測定可能なシグナルとなり、この蛍光を測定することにより、測定対象物質の検出、濃度測定等が可能になる。
【００４４】
測定対象物質を検出する場合は、蛍光エネルギー移動に起因する蛍光スペクトル変化、または、λ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比の変化を測定することによって行なう。
測定対象物質の濃度を測定する場合は、標準物質を用いて、λ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比を指標とした検量線を作成し、測定対象物質のλ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比を、検量線にあてはめることによって行なう。
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４５】
実施例１ （蛍光蛋白質ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ ＤＮＡの単離）
ＥＹＦＰは、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型にして、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＰＣＲによってＥＧＦＰ ＤＮＡを増幅した。プライマーは、
【表１】
を用いた。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動により、分離精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入した（ｐＢＳ／ＥＧＦＰとする）。このｐＢＳ／ＥＧＦＰを元にして、次のプライマー２本、
【表２】
を用いて、クンケル法により部位特異的塩基置換（４残基置換Ｓ６５Ｇ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｙ）をおこない、これをＥＹＦＰとした。
【００４６】
ＥＣＦＰは、ｐＥＣＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、ＰＣＲによってＥＣＦＰ ＤＮＡを増幅した。プライマーは、
【表３】
を用いた。
作製したＥＹＦＰ ＤＮＡ、ＥＣＦＰ ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれの断片を切り出し精製した。
【００４７】
実施例２ （フレキシブルリンカーＤＮＡの作製）
以下の２本のプライマーとＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、アニーリング・伸長反応をおこなうことにより、フレキシブルリンカー（以下ＦＬ４とする）ＤＮＡ断片を作製した。
プライマーは、
【表４】
を用いた。
作製したフレキシブルリンカーのアミノ酸配列は、
【表５】
である。作製したフレキシブルリンカーＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩで消化し、２％アガロースゲル電気泳動にかけ、断片を切り出し精製した。
【００４８】
実施例３ （ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢ遺伝子産物からのロイシンジッパー配列のクローニング）
ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢ遺伝子産物ｐＪａｃ−１、ｐＢＳＫＳ−ＦｏｓＢ（理化学研究所ＤＮＡ開発銀行）を含む大腸菌ＨＢ１０１を、５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）培地で一晩、３７℃培養し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、ＰＣＲによってｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢそれぞれのロイシンジッパー（以下Ｌｚｉｐとする）ＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、以下のものを用いた。
ｃ−Ｊｕｎ増幅用
【表６】
ＦｏｓＢ増幅用
【表７】
ＰＣＲ反応液をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿によって精製し、ＳａｌＩ（宝酒造）、ＸｈｏＩ（宝酒造）を用いて制限酵素消化した。制限酵素消化標品を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれ約１６０ｂｐの断片を切り出し精製した。
クローニングしたＬｚｉｐ ＤＮＡは、塩基配列の決定をおこない文献記載のロイシンジッパー配列と一致していることを確認した。
【００４９】
実施例４ （抗ＮＰ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ａｃｅｔｙｌ））抗体発現ベクターの作製）
融合蛋白質の発現系としては、ｐＥＴ ＴＲＸ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いた。
ｐＳｃＦｖ（ＮＰ）ＡＰ５．９ｋｂｐベクター（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２，３２２−３２９（１９９７））から制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって、抗ＮＰ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ａｃｅｔｙｌ；以下ＮＰと略する）抗体ＳｃＦｖ ＤＮＡ断片を単離した。この抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ））。次に、実施例２で作製したＦＬ４ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４）。
【００５０】
次に、実施例１で作製したＥＹＦＰ ＤＮＡ断片およびＥＣＦＰ ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ）。さらに、実施例３で作製したｃ−ＪｕｎおよびＦｏｓＢ Ｌｚｉｐ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰのＸｈｏＩ部位に挿入した。作製したベクターは、制限酵素消化により、挿入断片の大きさ、方向を確認した。
【００５１】
以下の４種類の発現ベクターを抗ＮＰ抗体発現ベクターとした。
（１）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）
（２）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）
（３）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ
（４）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ
【００５２】
実施例５ （ＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムの作製）
ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）３ｍｌにＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕ（ＣＲＢ社）２１ｍｇ（１００μｌＤＭＦに溶解させた）を添加し、４℃で一晩、緩やかに攪拌した。翌日、ＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂをディスポカラムにつめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）３０ｍｌでゲルを洗浄し、さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌで交互に洗浄を繰り返し、最後に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）９ｍｌで洗浄した。
【００５３】
実施例６ （抗ＮＰ抗体融合蛋白質の発現精製）
抗ＮＰ抗体発現ベクター（１）、（２）、（３）、（４）を用いて、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の形質転換をおこなった。形質転換したクローンを５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）培地、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、培養細胞を１．５ｌ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン：５ｌバッフル付フラスコ）に植え継ぎ、３０℃で培養を続けた。培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００＝約０．５に達したところ（約６時間培養）で、０．１Ｍ ＩＰＴＧを１．５ｍｌ添加し、温度を１６℃に下げ、一晩培養を続けた。翌日、遠心分離により菌体を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各サンプルに４０ｍｌ加え、菌体を縣濁させた。その後、この菌体液を遮光した状態で−８０℃、室温に置くことを２回繰り返した。凍結融解をおこなった後、さらに菌体を破砕するために超音波処理をおこなった。
【００５４】
超音波処理をおこなったサンプルを遠心分離し、上清を回収した。回収した上清にＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（実施例５）を各５００μｌ添加し、遮光した状態で４℃、一晩緩やかに攪拌した。翌日、ゲルをディスポカラム容器につめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ流し、洗浄をおこなった。次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＮＰ溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたもの）を５ｍｌ加え、目的蛋白質の溶出をおこなった。溶出液は１ｍｌづつエッペンドルフチューブに回収した。回収したサンプルは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析をおこなった。
【００５５】
実施例７ （ＮＰ標識ウシアルブミンの作製）
ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）５０ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたものに、ＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕ（ＣＲＢ社）１４ｍｇ（１００μｌのＤＭＦに溶解させたもの）を添加し、遮光した状態で一晩（４℃）緩やかに攪拌した。翌日、反応液をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にかけ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出をおこなった。ＮＰが黄色をしているため、ＮＰ標識ウシアルブミンと未反応のＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕがカラム中で分離されているのを確認し、先に溶出してくるピークを分取し、これをＮＰ標識ウシ血清アルブミンとした。分取したＮＰ標識ウシ血清アルブミンのＯ．Ｄ．２８０およびＯ．Ｄ．４２０を分光光度計（島津製作所）により測定し、ウシアルブミンに対するＮＰの標識率を求めたところ、標識率は、ＮＰ／ウシアルブミン＝約１５であった。
【００５６】
実施例８ （抗ＮＰ抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いたＮＰ標識ウシアルブミンの測定）
大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉで発現させ、ＮＰ標識Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムで精製した抗ＮＰ抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いて、ＮＰ標識ウシ血清アルブミンの濃度測定をおこなった。ＮＰカラムでアフィニティー精製した抗ＮＰ抗体融合蛋白質（実施例６）を、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）とＴｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰとＴｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰの組み合わせで、各融合抗体濃度が３μｇ／ｍｌになるように混合し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにそれぞれ２００μｌずつ注入した。そこに、ＮＰ標識ウシアルブミン（実施例７）を１０μｌ（ウシアルブミン濃度として０、１０、１００μｇ／ｍｌ、ブランクは０．１Ｍリン酸緩衝液）添加した。その後、遮光した状態で１時間室温に放置した。１時間後、各サンプルを蛍光光度計のセルに注入し、蛍光スペクトルを測定した。
【００５７】
蛍光スペクトル測定は蛍光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ２０００（日立製作所）を用い、４３３ｎｍで励起し、４５０〜６００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した（室温）。その結果、ロイシンジッパーを導入した融合蛋白質を用いた場合にのみ、ＮＰ標識ウシアルブミン濃度依存的な蛍光スペクトル変化が観察された。蛍光エネルギー移動の効率をＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ両者の蛍光強度比とし、添加したＮＰ標識ウシアルブミンの検量線を作製すると図２のようになり、ロイシンジッパーを導入することにより、ＦＲＥＴ効率が増強され、測定感度が向上したことが確認できた。
【００５８】
実施例９ （抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３ｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成）
１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ社）を用いて抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１３を分泌するハイブリドーマ（自家製）の培養をおこなった。細胞数が約１０７に達したところで、培養した細胞を遠心分離により集めた。集めたハイブリドーマからＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｍＲＮＡの抽出をおこなった。得られたｍＲＮＡ ２．０μｇを鋳型にして、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｃＤＮＡの合成をおこなった。
【００５９】
実施例１０ （抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３単鎖Ｆｖの作製）
抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１３ｃＤＮＡ（実施例９）を鋳型にして、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（オックスフォード出版）記載の公知の方法に従い、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、１３単鎖Ｆｖ ＤＮＡの作製をおこなった。
【００６０】
実施例１１ （抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターの作製）
抗ＮＰ抗体発現ベクター（１）〜（４）（実施例４）から抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ断片を制限酵素消化により切り出し、そこに抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマからクローニングした抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３ＳｃＦｖ（実施例１０）を挿入することによって、抗ヒトアルブミン発現ベクターの作製をおこなった。
【００６１】
抗ヒトアルブミン抗体ＳｃＦｖを鋳型にして、制限酵素部位（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ）を導入したプライマーを用いてＰＣＲをおこなった。次に、ＰＣＲ産物の制限酵素消化（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ）をおこない、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、抗ヒトアルブミン抗体ＳｃＦｖ断片を切り出し精製した。一方、実施例４で作製したｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰの制限酵素消化（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ：宝酒造）をおこない、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ断片以外のベクター部分を切り出し精製した。これらベクターのＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＮｏ．１１、１３抗体ＳｃＦｖを挿入することによって、抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターを作製した。作製したベクターについては、制限酵素消化により挿入断片の大きさ、方向を確認した。
【００６２】
以下の４種類の発現ベクターを抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターとした。Ａ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）Ｂ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）Ｃ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ Ｄ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ
【００６３】
実施例１２ （ヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムの作製）
ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｐｍａｃｉａ社）を６ｇとり、１ｍＭ塩酸（１．２Ｌ）で洗浄した。その後、ヒトアルブミン濃度が４ｍｇ／ｍｌになるようにＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂとヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を混合（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．３）し、４℃で一晩、緩やかに攪拌した。翌日、ヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で交互に洗浄した。
【００６４】
実施例１３ （抗ヒトアルブミン抗体融合蛋白質の発現精製）
抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（実施例１１）を用いて、大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）培地、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、培養細胞を１．５ｌ ＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で培養を続けた。培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００＝約０．５に達したところ（約６時間培養）で、０．１Ｍ ＩＰＴＧを１．５ｍｌ添加し、温度を１６℃に下げ、一晩培養を続けた。
翌日、遠心分離により菌体を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各サンプルに４０ｍｌ加え、菌体を縣濁させた。その後、この菌体液を遮光した状態で−８０℃、室温に置くことを２回繰り返した。凍結融解をおこなった後、さらに菌体を破砕するために超音波処理をおこなった。
【００６５】
超音波処理をおこなったサンプルを遠心分離し、上清を回収した。回収した上清にヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（実施例１２参照）を各５００μｌ添加し、遮光した状態で４℃、一晩緩やかに攪拌した。翌日、ゲルをディスポカラムにつめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ流し、洗浄をおこなった。次に、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）を２．５ｍｌ加え、目的蛋白質の溶出をおこなった。溶出液は５００μｌづつエッペンドルフチューブに回収した。各溶出画分には、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を１００μｌ添加し、中和をおこなった。
【００６６】
実施例１４ （抗ヒトアルブミン抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いたヒト血清アルブミンの測定）
大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現させ、ヒトアルブミン標識Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムで精製した抗ヒトアルブミン抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いて、ヒトアルブミンの濃度測定をおこなった。ヒトアルブミン標識カラムでアフィニティー精製した抗ヒトアルブミン抗体融合蛋白質（実施例１３）を、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）とＴｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰとＴｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰの組み合わせで、各融合抗体濃度が３μｇ／ｍｌになるように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｐＨ８．０）に混合し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにそれぞれ１９０μｌずつ注入した。そこに、ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を１０μｌ（０、３．１、６．３、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｐＨ８．０）で希釈したもの）を添加した。その後、遮光した状態で１時間室温に放置した。１時間後、各サンプルを蛍光光度計のセルに注入し、蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は蛍光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ２０００を用い、４３３ｎｍで励起し、４５０〜６００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した（室温）。
【００６７】
その結果、ＮＰ標識ウシアルブミンの結果と同様、ロイシンジッパーを導入した場合にのみ、ヒトアルブミン濃度依存的な蛍光スペクトル変化が観察できた。蛍光エネルギー移動の効率をＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ両者の蛍光強度比とし、ヒトアルブミンの検量線を作製すると図３のようになり、ＮＰ標識ウシアルブミンを用いた場合と同様に、２種類のモノクローナル抗体の組み合わせにおいても、ロイシンジッパーを導入することにより、ＦＲＥＴ効率が上昇し、測定感度の向上が確認できた。
【００６８】
産業上の利用の可能性
本発明の測定方法により、効率的なエネルギー転移が確実に得られ、バックグランドの低い高精度かつ高感度な物質濃度の測定が可能となる。また均一系での測定も可能であり、特に洗浄操作を必要としないため、臨床現場での使用も容易である。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定系模式図を示す。
【図２】本発明の測定系によるＮＰ標識ウシアルブミンの検量線を示す。
【図３】本発明の測定系によるヒトアルブミンの検量線を示す。
【配列表】
技術分野
本発明は、レポーター間相互作用による物質の分析方法に関する。特に各レポーターを近接させ、レポーター間相互作用を高める高感度分析方法に関する。
【０００２】
背景技術
特定物質の分析測定は、臨床診断、食品衛生、環境衛生など様々な分野において、測定系の高感度化、簡易化等の研究が精力的に行われてきた。なかでも、抗原抗体反応を利用した免疫測定は、感度、特異性の理由により広く利用されている。代表的な免疫測定法としては、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）があげられる。
【０００３】
サンドイッチＥＩＡとは、測定対象物質に対する２種類の抗体のうち、一方を固相に固定化し、この固相と酵素標識したもう一方の抗体と試料を混ぜ入れて反応させ、未反応の酵素標識抗体を洗浄により除去した後、酵素の基質溶液を添加し、免疫複合体の生成量を酵素活性により測定するというものである。この方法は、再現性が良くしかも高感度に抗原濃度を測定できるため、広く利用されている。しかし、サンドイッチ法においては、未反応の標識抗体を除去するために煩雑で時間のかかる洗浄操作が必要であるなどの問題点がある。
【０００４】
このような問題点を解消するために、近年、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および化学発光エネルギー移動（ＣＲＥＴ）などのエネルギー移動現象や一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性などの分子間相互作用を利用した免疫測定法が注目されている。蛍光エネルギー移動とは、ある特定の蛍光物質間で観察される現象であり、蛍光エネルギー供与体の蛍光スペクトルと蛍光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、蛍光エネルギー供与体の蛍光エネルギーが受容体に移動し、蛍光エネルギー受容体の発光が観察されるという現象である。
【０００５】
生物発光エネルギー移動とは、ホタルルシフェラーゼのような生物発光を触媒する酵素と蛍光物質間で観察される現象であり、生物発光酵素の発光スペクトルと発光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、生物発光エネルギー供与体の発光エネルギーが受容体に移動し、発光エネルギー受容体の蛍光が観察されるという現象である。
【０００６】
化学発光エネルギー移動とは、ペルオキシダーゼのような化学発光を触媒する酵素と蛍光物質間で観察される現象であり、化学発光酵素の発光スペクトルと発光エネルギー受容体の励起光スペクトルに重なりがあり、さらにこの２つの分子間距離が１０ｎｍ以下に近接する場合に、化学発光エネルギー供与体の発光エネルギーが受容体に移動し、発光エネルギー受容体の蛍光が観察されるという現象である。
【０００７】
一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性とは、β−ガラクトシダーゼのα部位欠損変異体Δαとω部位欠損変異体Δωに代表される現象であり、Δα、Δωそれぞれ単独ではβ−ガラクトシダーゼ酵素活性が低下しているが、２者が近接し、会合することによってβ−ガラクトシダーゼ酵素活性が上昇するというものである。このようなエネルギー移動現象および一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性を免疫測定および蛋白質−蛋白質相互作用の検出に応用した例がこれまでにいくつか報告されている。
【０００８】
その中でエネルギー移動現象を免疫測定に応用した例としては、東洋紡績（株）により報告された方法が挙げられる（特開平１０−３１９０１７）。この方法とは、測定対象物質（Ｘ）に対して結合能を有する物質Ａ、Ｂをそれぞれ蛍光エネルギー供与体と受容体の関係にある物質Ｆ１、Ｆ２で標識し、Ａ−Ｆ１、Ｘ、Ｂ−Ｆ２を混合し、一定時間反応させ複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２を形成させた後、洗浄操作をおこなうことなく、Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２量をＦ１からＦ２への蛍光エネルギー移動効率として測定するというものである。
【０００９】
しかし、実際の免疫測定の対象物質（抗原）としては高分子の蛋白質であることが多く、また２種類のモノクローナル抗体を用いた場合などは２つの抗原決定基は空間的に離れているために、反応複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２を形成したとしても、Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２中でのＦ１とＦ２の空間的距離が近接せず、効率的なエネルギー移動が起こらない。そのために、測定感度が低いという問題を抱えている。
【００１０】
フェルスターの蛍光エネルギー移動に関する理論によると、蛍光エネルギー移動の効率は、供与体、受容体間の距離の６乗に反比例する（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８．１〜１３．１９９４）。このためＦＲＥＴ、ＢＲＥＴおよびＣＲＥＴなどのエネルギー移動現象を免疫測定に応用するには、このような免疫複合体の中における発光エネルギー供与体と受容体を常に一定の位置に配置させる技術の確立が必要である。
【００１１】
ＦＲＥＴの免疫測定への応用において、エネルギー供与体と受容体の空間的配置をうまくおこなった例としては、上田らの方法があげられる（特開平１０−７８４３６）。その方法とは、抗体断片ＶＬ、ＶＨを蛍光エネルギー供与体および受容体で標識し、抗原存在下において、抗原とＶＬとＶＨが安定な三者会合体を形成した時にのみ、蛍光エネルギー移動が起こり、蛍光エネルギー供与体と受容体の蛍光強度比を測定することにより、抗原濃度を測定するというものである。なお、ＶＬ、ＶＨを利用したこの測定方法は、ＢＲＥＴにおいても抗原濃度測定可能であることが示されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９．７７〜８１．２００１）。
【００１２】
この方法は、抗原存在時に抗体断片ＶＬ、ＶＨが常に５ｎｍ以内に近接するという性質と蛍光エネルギー移動を組み合わせた非常にユニークな免疫測定法であるが、自然界に存在する抗体の多くは、抗原非存在時に置いてもＶＬとＶＨが会合する性質を持つために全ての抗体においてこの原理を応用することができない。そのため、実用化には至っていない。
【００１３】
また、一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性を蛋白質−蛋白質相互作用のモニタリングに応用した方法が、ＲＯＳＳＩらにより報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４．８４０５〜８４１０．１９９７）。ＲＯＳＳＩらの方法とは、Ｒａｐａｍｙｃｉｎによりダイマー化が誘導されるＦＲＡＰ、ＦＫＢＰ１２蛋白質とβ−ガラクトシダーゼΔα、Δωをそれぞれ融合した発現ベクターを動物細胞に導入し、これらキメラ蛋白質を発現している細胞にＲａｐａｍｙｃｉｎを添加したところ、ＲａｐａｍｙｃｉｎによってＦＲＡＰ、ＦＫＢＰ１２蛋白質のダイマー化が起こり、その結果、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ濃度依存的なβ−ガラクトシダーゼ活性が測定できるというものである。
【００１４】
この方法は、生細胞内の物質の測定が行える非常に優れた方法であるが、低分子のＲａｐａｍｙｃｉｎによってＦＲＡＰ、ＦＫＢＰのダイマー化が誘導されることを利用した非常に特殊な例である。このような酵素の相補性を免疫測定における免疫複合体の検出に用いる場合も、ＦＲＥＴなどのエネルギー移動を利用する免疫測定方法と同様、レポーター蛋白質を常に一定の位置に配置させる技術が必要である。
【００１５】
従って、本発明は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光−蛍光エネルギー移動（ＢＲＥＴ）などのエネルギー移動現象および一部を欠失あるいは改変した酵素分子同士の酵素活性の相補性などの分子間相互作用を物質の濃度測定の検出系に用いるにあたり、精度よくしかも高感度に測定をおこなうために、反応複合体中におけるエネルギー供与体とエネルギー受容体または相補反応供与体と相補反応受容体の空間的配置を制御する方法およびそれを利用した測定系を提供することにある。
【００１６】
発明の開示
本発明者らは、まず、測定対象物質に対して親和性を有する２種類の物質（測定対象物質と直接的に親和・結合する物質）それぞれに、蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせの蛍光物質（レポーター）を標識した。さらにこれらの蛍光物質を標識した物質または蛍光物質自体それぞれにロイシンジッパーペプチド（レポーターを近接した状態で安定化させるための物質）を標識した試薬を作製した。この試薬と検体を混合し、免疫複合体を形成させ、一方の蛍光物質を励起したところ、反応複合体中において互いに弱い親和性を有する物質どうしの親和性に基づく結合によりそれぞれの蛍光物質が空間的に近接し、より効率的なエネルギー移動が起こることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、測定対象物質（Ｘ）に結合することができる物質（Ａ）を第一レポーター（Ｒ１）で標識した第一試薬と、測定対象物質（Ｘ）に対し物質（Ａ）とは異なる部位で結合することができる物質（Ｂ）を、第一レポーター（Ｒ１）と相互作用を引き起こす第二レポーター（Ｒ２）で標識した第二試薬とを用いる測定対象物質（Ｘ）の測定方法であって、
第一試薬が、第一レポーター（Ｒ１）と結合する物質（Ｃ）を含み、物質（Ａ）および第一レポーター（Ｒ１）が直接結合するかまたは物質（Ｃ）を介して結合してなる試薬（Ａ−Ｒ１−ＣまたはＡ−Ｃ−Ｒ１）であり、
第二試薬が、第二レポーター（Ｒ２）と結合し、物質（Ｃ）と親和性を有する物質（Ｄ）を含み、物質（Ｂ）および第二レポーター（Ｒ２）が直接結合するかまたは物質（Ｄ）を介して結合してなる試薬（Ｂ−Ｒ２−ＤまたはＢ−Ｄ−Ｒ２）であり、
第一試薬、第二試薬および測定対象物質が反応複合体を形成し、
該反応複合体における第一試薬中の物質（Ｃ）と第二試薬中の物質（Ｄ）との親和性に基づく結合により、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが空間的に近接された状態で安定化され、これら２つのレポーター間に測定可能な相互作用が引き起こされる、前記測定方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、測定対象物質（Ｘ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部、細胞、細胞内オルガネラまたは低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００１９】
また本発明は、物質（Ａ）および／または物質（Ｂ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部または低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２０】
さらに本発明は、物質（Ｃ）および／または物質（Ｄ）が、蛋白質、ペプチド、核酸および糖鎖からなる群より選択される１または２以上からなる物質または低分子化合物であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。 また本発明は、第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が異なる蛍光物質であり、レポーター間の測定可能な相互作用が蛍光エネルギー移動からなることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２１】
さらに本発明は、第一レポーター（Ｒ１）が生物発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される生物発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、第一レポーター（Ｒ１）が化学発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される化学発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２２】
さらに本発明は、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）が酵素の一部を構成する分子であって、第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が、それぞれ単独では酵素活性を欠失または減じているが、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが相互作用することによって、酵素活性が生じるかまたは増加することを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、物質（Ａ）および物質（Ｂ）が、測定対象物質（Ｘ）に対してそれぞれ異なる部位を認識する抗体もしくは抗体由来の単鎖Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆｖの一部、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたはそれらの変異体であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２３】
さらに本発明は、物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、ペプチド性物質からなり、第一試薬および第二試薬が融合蛋白質からなることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
また本発明は、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、いずれもロイシンジッパーペプチドであることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
さらに本発明は、測定が、第一試薬および第二試薬を同時に測定対象物質に作用させる均一系でおこなう測定であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
【００２４】
また本発明は、測定が、第一試薬および第二試薬のうち、一方の試薬を予め固相に固定化し、その後に他方の試薬および測定対象物質を固定化した試薬に作用させる不均一系でおこなう測定であることを特徴とする、前記の測定方法に関する。
さらに本発明は、物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）を含む、前記の測定方法に用いるための測定用試薬に関する。
また本発明は、前記の測定用試薬を含む測定用キットに関する。
【００２５】
ここで「測定」とは、測定対象物質をレポーターの発するシグナルを測定することにより測定することであり、単に測定対象物質の存在を測定し検知すること、例えば細胞や組織において測定対象物質の存在する分布を測定すること、および測定対象物質の濃度を測定することなどを含む。
【００２６】
発明を実施するための形態
本発明による測定方法の特徴は、測定対象物質（Ｘ）に対して親和性を有する物質（Ａ）を第一レポーター（Ｒ１）で標識したＡ−Ｒ１および測定対象物質（Ｘ）に対して親和性を有する物質（Ｂ）を第二レポーター（Ｒ２）で標識したＢ−Ｒ２のそれぞれに、互いに弱い親和性を有する物質（Ｃ）および物質（Ｄ）をさらに導入した第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）および第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）を使用することにある。ここで物質（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ測定対象物質（Ｘ）の異なる部位において結合可能である。
第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）における各物質間の結合は、互いにそれぞれの物質の有する性質を失わせたり、低減させるものではない結合であることが望ましいが、これらの結合の組み合わせはとくに限定されないが、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）による結合によりレポーター同士を近接化するためには、Ａ−Ｒ１−ＣまたはＡ−Ｃ−Ｒ１が好ましい。これは第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）についても同様である。
【００２７】
なお、試薬の表記として、例えばＡ−（Ｒ１−Ｃ）との表記を適宜使用するが、括弧内の２つの部分のいずれかが括弧外の物質と結合していることを示す意図であり、とくに言及しない限りＡ−Ｒ１−ＣおよびＡ−Ｃ−Ｒ１を表している。
第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａと第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂを測定物質Ｘの存在する検体と混合することにより、複合体（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）が形成され、さらに複合体中で局所濃度が高まる作用により、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が結合し、より安定な複合体が形成される。また、第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａと第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂとが、ＣとＤの弱い相互作用により結合している状態でも、測定対象物質Ｘと第一試薬（Ｃ−Ｒ１）−Ａおよび第二試薬（Ｄ−Ｒ２）−Ｂが結合することにより、安定な複合体が形成される。
【００２８】
さらに、測定対象物質Ｘと第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）の結合と、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）の間の結合（Ｃ：Ｄ）が同時に起こる場合も、同様に安定な複合体が形成される。その結果、複合体中において、Ｒ１とＲ２が近接した状態が安定化され、より効率的なエネルギー移動が観察される。一方、測定対象物質Ｘが存在しないときは、複合体（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）は形成されず、また、ＣとＤの相互作用は弱いため、Ａ−（Ｒ１−Ｃ）：（Ｄ−Ｒ２）−Ｂが形成されたとしても非常に不安定な複合体であるため、効率的なエネルギー移動は観察されない。
本発明の測定方法における測定対象物質Ｘは、該物質と結合能を有する物質が存在する物質であれば、特に限定されない。
【００２９】
このような測定対象物質Ｘとしては、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖、脂質などおよびこれらの一部、細胞および細胞内オルガネラなど、あるいはハプテンに総称される低分子化合物などが例としてあげられる。
本発明の測定方法における測定対象物質と結合能を有する物質ＡおよびＢは、測定対象物質と特異的に結合する物質であれば、特に限定されないが、物質ＡとＢは互いに親和性を有さず、それぞれ測定対象物質Ｘの異なる部分を認識し、結合する物質である必要がある。例えば、測定対象物質が抗原の場合、物質ＡおよびＢとしては、それぞれ別の抗原決定基を認識する抗体が考えられる。抗体としては、動物を免疫することによって得られるＩｇＧだけでなく、ＩｇＧのパパイン消化断片Ｆａｂ、ペプシン消化断片Ｆ（ａｂ’）２、などの抗体断片、または、遺伝子工学的に作製したＦｖ断片、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）等も利用することができる。
【００３０】
物質ＡおよびＢとしては、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、抗体、抗原、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質またはその一部またはハプテンなどの低分子化合物なども利用することができる。さらに、測定対象物質Ｘが抗体の場合、物質ＡがＸに認識されうるハプテン、物質Ｂが物質Ａとは異なる部位でＸと結合し得る物質などを利用することができる。
【００３１】
第一レポーターＲ１と第二レポーターＲ２は、一組のレポーターとして用いられるものであり、相互作用することで測定可能なシグナルを生じる。本発明の測定方法においては、該シグナルを適切な測定方法により測定することにより、測定対象物質Ｘの測定を行なう。
【００３２】
本発明の測定方法におけるレポーターＲ１およびＲ２は、ＦＲＥＴの場合、蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせであれば、特に限定されないが、Ｒ１としては、ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）およびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、フルオレセイン等の蛍光物質などが考えられ、Ｒ２としては、ＧＦＰおよびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、ローダミン等の蛍光物質などが考えられる。
【００３３】
また、ＢＲＥＴの場合、生物発光−蛍光エネルギー移動を起こす組み合わせであれば、特に限定されない。レポーターＲ１としては、生物発光を触媒する酵素またはその改変体を使用することができ、例としては、発光細菌、ホタル、ウミホタル、ヒカリコメツキ、ウミシイタケ由来の発光酵素などがあげられる。また、Ｒ１は化学発光反応を触媒する酵素またその改変体でもよく、例としては、ペルオキシダーゼがあげられる。発光酵素の基質としては、ホタル由来のルシフェラーゼの場合、ルシフェリン、ペルオキシダーゼの場合、ルミノールがあげられる。レポーターＲ２としては、ＧＦＰおよびＧＦＰ変異体のような蛍光蛋白質、ローダミン等の蛍光物質などが例としてあげられる。
【００３４】
さらには、Ｒ１とＲ２が酵素の一部を構成する分子であって、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ単独では酵素活性を欠失または減じているが、Ｒ１とＲ２とが相互作用することによって、酵素活性が生じるかまたは増加するような組合せを利用することができる。このようなレポーターとしては、βガラクトシダーゼΔα変異体やΔω変異体などが例としてあげられる。
本発明において、測定可能なシグナルを生じるレポーターＲ１とＲ２の間の距離は、０〜５０ｎｍ、とくに１０ｎｍ以下で安定化されることが好ましい。
【００３５】
本発明の測定方法における物質ＣおよびＤは、互いに弱い親和性を有する物質であれば特に限定されず、蛋白質およびペプチドなどのペプチド性物質、核酸、糖鎖などまたはこれらの複合体を用いることができる。具体的には、たとえば、真核生物の核内転写調節因子ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓなどにみられるロイシンジッパー配列などのペプチド断片（ロイシンジッパーペプチド）を遺伝子工学的に作製し、それを利用することができる。この場合、それらのアミノ酸配列に変異を導入し、親和性の強弱を調節することが可能である。また、互いに相補性をもつＤＮＡ配列などを利用することもできる。この場合、これらのＤＮＡ配列の長さやＧＣ含量を調節することにより、親和性の強弱を調節することも可能である。さらに、物質Ｃをハプテンに総称される低分子化合物とし、物質Ｄとして物質Ｃを認識しうる抗体および抗体断片を利用することができる。
【００３６】
本発明の測定方法における第一試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、第二試薬Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）の作製においては、物質Ａ（Ｂ）、レポーターＲ１（Ｒ２）、物質Ｃ（Ｄ）がペプチド性物質の場合は、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）（Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））を遺伝子工学的に融合蛋白質として作製することが、部位特異的な標識ができる、製造工程を減らすことができるなどの点からより好ましいが、物質Ａ（Ｂ）、レポーターＲ１（Ｒ２）、物質Ｃ（Ｄ）それぞれの物質を調製し、それぞれを化学的に結合させて作製することも可能である。また、プロテインＧ、プロテインＡなどの抗体断片と親和性を有する蛋白質を介して、抗体断片にＲ１（Ｒ２）、Ｃ（Ｄ）などを標識することもできるし、アビジン−ビオチンの相互作用を利用して、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）（Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））を作製することも可能である。
【００３７】
本発明の測定方法は、蛍光エネルギー移動および発光−蛍光エネルギー移動を利用したものであるので、未反応の試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）、Ｂ−（Ｒ２−Ｄ）を分離する必要がなく、通常のサンドイッチ法でおこなわれる洗浄操作をすることなく、測定物質濃度の測定が可能であるため、均一系、不均一系のどちらでも測定が可能であるが、簡便性の面から、均一系での測定が望ましい。
【００３８】
不均一系の測定の場合には、試薬Ａ−（Ｒ１−Ｃ）およびＢ−（Ｒ２−Ｄ）の一方を固相に固定化し、他方の試薬と検体を混合し、一定時間反応させた後、そのまま測定することもできるし、洗浄操作をおこなった後、測定することも可能である。固相としては、ラテックス粒子、ポリスチレンビーズ、ＥＬＩＳＡマイクロプレートなど通常の免疫測定に使用するものを適宣使用することができる。
次に本発明の測定系を模式図（図１）を用いて、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
抗原（Ｘ）を測定対象物質とする測定を行なう場合、抗原の異なる部位に結合する２つの抗体断片（１）および（２）（Ａ、Ｂ）を用意する。抗体断片（１）には蛍光蛋白質（１）（蛍光エネルギー供与体、Ｒ１）が結合し、さらにロイシンジッパー（Ｃ）が結合している。一方、抗体断片（２）には蛍光蛋白質（２）（蛍光エネルギー受容体、Ｒ２）が結合し、さらにロイシンジッパー（Ｄ）が結合している。
【００４０】
したがって、図１の測定系では、抗体断片（１）、蛍光蛋白質（１）およびロイシンジッパーを含む試薬（Ａ−Ｒ１−Ｃ）と、抗体断片（２）、蛍光蛋白質（２）およびロイシンジッパーを含む試薬（Ｂ−Ｒ２−Ｄ）との２種類の試薬を用いる。
これら２種類の試薬に測定対象物質である抗原（Ｘ）を添加して共存させることによって、図１に示す反応複合体（（Ｃ−Ｒ１）−Ａ：Ｘ：Ｂ−（Ｒ２−Ｄ））が形成される。
【００４１】
反応複合体が形成されると、２つのロイシンジッパー（Ｃ、Ｄ）が互いに親和性結合により結合されることにより、蛍光蛋白質（１）（Ｒ１）と蛍光蛋白質（２）（Ｒ２）が近接するように配置される。図１においては、レポーターは蛍光蛋白質であることから、結合する必要はなく、近接すれば本発明の目的は果たせるが、レポーターの種類により、必要に応じて結合してもよい。なお、均一系の測定系の場合は、非特異的なシグナルが生じないように、レポーター間の結合は弱いかまたは結合しないことが好ましい。
【００４２】
図１に示すように、蛍光共鳴エネルギー供与体（Ｒ１）は、励起光λ（１）を照射すると、単独で蛍光λ（１）′を生じる。図１のように反応複合体を形成すると、蛍光共鳴エネルギー供与体（Ｒ１）と蛍光共鳴エネルギー受容体（Ｒ２）とが近接しており、これらの間に蛍光エネルギー移動が起きる。したがって、反応複合体に励起光λ（１）を照射すると、蛍光エネルギー移動が起きる結果、蛍光λ（２）′が生じる。
【００４３】
蛍光エネルギー移動の効率は、Ｒ１、Ｒ２間の距離の６乗に反比例するため、Ｃ、Ｄにより近接化された結果発せられるλ（２）′は、Ｃ、Ｄにより近接化されない場合よりも強い蛍光が得られるという観点から高感度測定に適しており、さらにＲ１、Ｒ２は反応複合体においてＣ、Ｄにより常に一定の距離に配置されるため、安定したシグナルが得られるという点で優れている。
このように、蛍光蛋白質をレポーターとして用いた場合は、蛍光エネルギー移動による蛍光が、測定可能なシグナルとなり、この蛍光を測定することにより、測定対象物質の検出、濃度測定等が可能になる。
【００４４】
測定対象物質を検出する場合は、蛍光エネルギー移動に起因する蛍光スペクトル変化、または、λ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比の変化を測定することによって行なう。
測定対象物質の濃度を測定する場合は、標準物質を用いて、λ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比を指標とした検量線を作成し、測定対象物質のλ（１）′とλ（２）′の蛍光強度比を、検量線にあてはめることによって行なう。
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４５】
実施例１ （蛍光蛋白質ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ ＤＮＡの単離）
ＥＹＦＰは、ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型にして、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＰＣＲによってＥＧＦＰ ＤＮＡを増幅した。プライマーは、
【表１】
【表２】
【００４６】
ＥＣＦＰは、ｐＥＣＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、ＰＣＲによってＥＣＦＰ ＤＮＡを増幅した。プライマーは、
【表３】
作製したＥＹＦＰ ＤＮＡ、ＥＣＦＰ ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれの断片を切り出し精製した。
【００４７】
実施例２ （フレキシブルリンカーＤＮＡの作製）
以下の２本のプライマーとＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、アニーリング・伸長反応をおこなうことにより、フレキシブルリンカー（以下ＦＬ４とする）ＤＮＡ断片を作製した。
プライマーは、
【表４】
作製したフレキシブルリンカーのアミノ酸配列は、
【表５】
【００４８】
実施例３ （ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢ遺伝子産物からのロイシンジッパー配列のクローニング）
ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢ遺伝子産物ｐＪａｃ−１、ｐＢＳＫＳ−ＦｏｓＢ（理化学研究所ＤＮＡ開発銀行）を含む大腸菌ＨＢ１０１を、５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）培地で一晩、３７℃培養し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドＤＮＡを鋳型とし、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、ＰＣＲによってｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＢそれぞれのロイシンジッパー（以下Ｌｚｉｐとする）ＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、以下のものを用いた。
ｃ−Ｊｕｎ増幅用
【表６】
【表７】
クローニングしたＬｚｉｐ ＤＮＡは、塩基配列の決定をおこない文献記載のロイシンジッパー配列と一致していることを確認した。
【００４９】
実施例４ （抗ＮＰ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ａｃｅｔｙｌ））抗体発現ベクターの作製）
融合蛋白質の発現系としては、ｐＥＴ ＴＲＸ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ３２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いた。
ｐＳｃＦｖ（ＮＰ）ＡＰ５．９ｋｂｐベクター（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２，３２２−３２９（１９９７））から制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって、抗ＮＰ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ａｃｅｔｙｌ；以下ＮＰと略する）抗体ＳｃＦｖ ＤＮＡ断片を単離した。この抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ））。次に、実施例２で作製したＦＬ４ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４）。
【００５０】
次に、実施例１で作製したＥＹＦＰ ＤＮＡ断片およびＥＣＦＰ ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４のＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入した（ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ）。さらに、実施例３で作製したｃ−ＪｕｎおよびＦｏｓＢ Ｌｚｉｐ ＤＮＡ断片をｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰのＸｈｏＩ部位に挿入した。作製したベクターは、制限酵素消化により、挿入断片の大きさ、方向を確認した。
【００５１】
以下の４種類の発現ベクターを抗ＮＰ抗体発現ベクターとした。
（１）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）
（２）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）
（３）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ
（４）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ
【００５２】
実施例５ （ＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムの作製）
ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）３ｍｌにＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕ（ＣＲＢ社）２１ｍｇ（１００μｌＤＭＦに溶解させた）を添加し、４℃で一晩、緩やかに攪拌した。翌日、ＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂをディスポカラムにつめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）３０ｍｌでゲルを洗浄し、さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）６ｍｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）６ｍｌで交互に洗浄を繰り返し、最後に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）９ｍｌで洗浄した。
【００５３】
実施例６ （抗ＮＰ抗体融合蛋白質の発現精製）
抗ＮＰ抗体発現ベクター（１）、（２）、（３）、（４）を用いて、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の形質転換をおこなった。形質転換したクローンを５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）培地、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、培養細胞を１．５ｌ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン：５ｌバッフル付フラスコ）に植え継ぎ、３０℃で培養を続けた。培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００＝約０．５に達したところ（約６時間培養）で、０．１Ｍ ＩＰＴＧを１．５ｍｌ添加し、温度を１６℃に下げ、一晩培養を続けた。翌日、遠心分離により菌体を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各サンプルに４０ｍｌ加え、菌体を縣濁させた。その後、この菌体液を遮光した状態で−８０℃、室温に置くことを２回繰り返した。凍結融解をおこなった後、さらに菌体を破砕するために超音波処理をおこなった。
【００５４】
超音波処理をおこなったサンプルを遠心分離し、上清を回収した。回収した上清にＮＰ固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（実施例５）を各５００μｌ添加し、遮光した状態で４℃、一晩緩やかに攪拌した。翌日、ゲルをディスポカラム容器につめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ流し、洗浄をおこなった。次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＮＰ溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたもの）を５ｍｌ加え、目的蛋白質の溶出をおこなった。溶出液は１ｍｌづつエッペンドルフチューブに回収した。回収したサンプルは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析をおこなった。
【００５５】
実施例７ （ＮＰ標識ウシアルブミンの作製）
ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）５０ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたものに、ＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕ（ＣＲＢ社）１４ｍｇ（１００μｌのＤＭＦに溶解させたもの）を添加し、遮光した状態で一晩（４℃）緩やかに攪拌した。翌日、反応液をＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にかけ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出をおこなった。ＮＰが黄色をしているため、ＮＰ標識ウシアルブミンと未反応のＮＰ−ＣＡＰ−Ｏｓｕがカラム中で分離されているのを確認し、先に溶出してくるピークを分取し、これをＮＰ標識ウシ血清アルブミンとした。分取したＮＰ標識ウシ血清アルブミンのＯ．Ｄ．２８０およびＯ．Ｄ．４２０を分光光度計（島津製作所）により測定し、ウシアルブミンに対するＮＰの標識率を求めたところ、標識率は、ＮＰ／ウシアルブミン＝約１５であった。
【００５６】
実施例８ （抗ＮＰ抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いたＮＰ標識ウシアルブミンの測定）
大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉで発現させ、ＮＰ標識Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムで精製した抗ＮＰ抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いて、ＮＰ標識ウシ血清アルブミンの濃度測定をおこなった。ＮＰカラムでアフィニティー精製した抗ＮＰ抗体融合蛋白質（実施例６）を、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）とＴｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰとＴｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰの組み合わせで、各融合抗体濃度が３μｇ／ｍｌになるように混合し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにそれぞれ２００μｌずつ注入した。そこに、ＮＰ標識ウシアルブミン（実施例７）を１０μｌ（ウシアルブミン濃度として０、１０、１００μｇ／ｍｌ、ブランクは０．１Ｍリン酸緩衝液）添加した。その後、遮光した状態で１時間室温に放置した。１時間後、各サンプルを蛍光光度計のセルに注入し、蛍光スペクトルを測定した。
【００５７】
蛍光スペクトル測定は蛍光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ２０００（日立製作所）を用い、４３３ｎｍで励起し、４５０〜６００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した（室温）。その結果、ロイシンジッパーを導入した融合蛋白質を用いた場合にのみ、ＮＰ標識ウシアルブミン濃度依存的な蛍光スペクトル変化が観察された。蛍光エネルギー移動の効率をＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ両者の蛍光強度比とし、添加したＮＰ標識ウシアルブミンの検量線を作製すると図２のようになり、ロイシンジッパーを導入することにより、ＦＲＥＴ効率が増強され、測定感度が向上したことが確認できた。
【００５８】
実施例９ （抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３ｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成）
１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ社）を用いて抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１３を分泌するハイブリドーマ（自家製）の培養をおこなった。細胞数が約１０７に達したところで、培養した細胞を遠心分離により集めた。集めたハイブリドーマからＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｍＲＮＡの抽出をおこなった。得られたｍＲＮＡ ２．０μｇを鋳型にして、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｃＤＮＡの合成をおこなった。
【００５９】
実施例１０ （抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３単鎖Ｆｖの作製）
抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１３ｃＤＮＡ（実施例９）を鋳型にして、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（オックスフォード出版）記載の公知の方法に従い、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体Ｎｏ．１１、１３単鎖Ｆｖ ＤＮＡの作製をおこなった。
【００６０】
実施例１１ （抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターの作製）
抗ＮＰ抗体発現ベクター（１）〜（４）（実施例４）から抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ断片を制限酵素消化により切り出し、そこに抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマからクローニングした抗ヒトアルブミン抗体Ｎｏ．１１、１３ＳｃＦｖ（実施例１０）を挿入することによって、抗ヒトアルブミン発現ベクターの作製をおこなった。
【００６１】
抗ヒトアルブミン抗体ＳｃＦｖを鋳型にして、制限酵素部位（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ）を導入したプライマーを用いてＰＣＲをおこなった。次に、ＰＣＲ産物の制限酵素消化（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ）をおこない、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、抗ヒトアルブミン抗体ＳｃＦｖ断片を切り出し精製した。一方、実施例４で作製したｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（抗ＮＰ）−ＦＬ４−ＥＣＦＰの制限酵素消化（ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ：宝酒造）をおこない、１％アガロースゲル電気泳動にかけ、抗ＮＰ抗体ＳｃＦｖ断片以外のベクター部分を切り出し精製した。これらベクターのＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＮｏ．１１、１３抗体ＳｃＦｖを挿入することによって、抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターを作製した。作製したベクターについては、制限酵素消化により挿入断片の大きさ、方向を確認した。
【００６２】
以下の４種類の発現ベクターを抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターとした。Ａ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）Ｂ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）Ｃ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ Ｄ）ｐＥＴ３２／Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ
【００６３】
実施例１２ （ヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムの作製）
ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｐｍａｃｉａ社）を６ｇとり、１ｍＭ塩酸（１．２Ｌ）で洗浄した。その後、ヒトアルブミン濃度が４ｍｇ／ｍｌになるようにＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂとヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を混合（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．３）し、４℃で一晩、緩やかに攪拌した。翌日、ヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で交互に洗浄した。
【００６４】
実施例１３ （抗ヒトアルブミン抗体融合蛋白質の発現精製）
抗ヒトアルブミン抗体発現ベクターＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（実施例１１）を用いて、大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を５ｍｌ ＬＢ（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１５μｇ／ｍｌカナマイシン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）培地、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、培養細胞を１．５ｌ ＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で培養を続けた。培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００＝約０．５に達したところ（約６時間培養）で、０．１Ｍ ＩＰＴＧを１．５ｍｌ添加し、温度を１６℃に下げ、一晩培養を続けた。
翌日、遠心分離により菌体を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を各サンプルに４０ｍｌ加え、菌体を縣濁させた。その後、この菌体液を遮光した状態で−８０℃、室温に置くことを２回繰り返した。凍結融解をおこなった後、さらに菌体を破砕するために超音波処理をおこなった。
【００６５】
超音波処理をおこなったサンプルを遠心分離し、上清を回収した。回収した上清にヒトアルブミン固定化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（実施例１２参照）を各５００μｌ添加し、遮光した状態で４℃、一晩緩やかに攪拌した。翌日、ゲルをディスポカラムにつめ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ流し、洗浄をおこなった。次に、０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ＮａＯＨ（ｐＨ１２）を２．５ｍｌ加え、目的蛋白質の溶出をおこなった。溶出液は５００μｌづつエッペンドルフチューブに回収した。各溶出画分には、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を１００μｌ添加し、中和をおこなった。
【００６６】
実施例１４ （抗ヒトアルブミン抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いたヒト血清アルブミンの測定）
大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳで発現させ、ヒトアルブミン標識Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムで精製した抗ヒトアルブミン抗体−蛍光蛋白質−ロイシンジッパー融合蛋白質を用いて、ヒトアルブミンの濃度測定をおこなった。ヒトアルブミン標識カラムでアフィニティー精製した抗ヒトアルブミン抗体融合蛋白質（実施例１３）を、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰ−Ｌｚｉｐ（ＦｏｓＢ）とＴｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰ−Ｌｚｉｐ（ｃ−Ｊｕｎ）、Ｔｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１１）−ＦＬ４−ＥＣＦＰとＴｒｘ−ＳｃＦｖ（Ｎｏ．１３）−ＦＬ４−ＥＹＦＰの組み合わせで、各融合抗体濃度が３μｇ／ｍｌになるように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｐＨ８．０）に混合し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにそれぞれ１９０μｌずつ注入した。そこに、ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を１０μｌ（０、３．１、６．３、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｐＨ８．０）で希釈したもの）を添加した。その後、遮光した状態で１時間室温に放置した。１時間後、各サンプルを蛍光光度計のセルに注入し、蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は蛍光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ２０００を用い、４３３ｎｍで励起し、４５０〜６００ｎｍの蛍光スペクトルを測定した（室温）。
【００６７】
その結果、ＮＰ標識ウシアルブミンの結果と同様、ロイシンジッパーを導入した場合にのみ、ヒトアルブミン濃度依存的な蛍光スペクトル変化が観察できた。蛍光エネルギー移動の効率をＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ両者の蛍光強度比とし、ヒトアルブミンの検量線を作製すると図３のようになり、ＮＰ標識ウシアルブミンを用いた場合と同様に、２種類のモノクローナル抗体の組み合わせにおいても、ロイシンジッパーを導入することにより、ＦＲＥＴ効率が上昇し、測定感度の向上が確認できた。
【００６８】
産業上の利用の可能性
本発明の測定方法により、効率的なエネルギー転移が確実に得られ、バックグランドの低い高精度かつ高感度な物質濃度の測定が可能となる。また均一系での測定も可能であり、特に洗浄操作を必要としないため、臨床現場での使用も容易である。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定系模式図を示す。
【図２】本発明の測定系によるＮＰ標識ウシアルブミンの検量線を示す。
【図３】本発明の測定系によるヒトアルブミンの検量線を示す。
【配列表】
Claims (15)
- 測定対象物質（Ｘ）に結合することができる物質（Ａ）を第一レポーター（Ｒ１）で標識した第一試薬と、測定対象物質（Ｘ）に対し物質（Ａ）とは異なる部位で結合することができる物質（Ｂ）を、第一レポーター（Ｒ１）と相互作用を引き起こす第二レポーター（Ｒ２）で標識した第二試薬とを用いる測定対象物質（Ｘ）の測定方法であって、
第一試薬が、第一レポーター（Ｒ１）と結合する物質（Ｃ）を含み、物質（Ａ）および第一レポーター（Ｒ１）が直接結合するかまたは物質（Ｃ）を介して結合してなる試薬（Ａ−Ｒ１−ＣまたはＡ−Ｃ−Ｒ１）であり、
第二試薬が、第二レポーター（Ｒ２）と結合し、物質（Ｃ）と親和性を有する物質（Ｄ）を含み、物質（Ｂ）および第二レポーター（Ｒ２）が直接結合するかまたは物質（Ｄ）を介して結合してなる試薬（Ｂ−Ｒ２−ＤまたはＢ−Ｄ−Ｒ２）であり、
第一試薬、第二試薬および測定対象物質が反応複合体を形成し、
該反応複合体における第一試薬中の物質（Ｃ）と第二試薬中の物質（Ｄ）との親和性に基づく結合により、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが空間的に近接された状態で安定化され、これら２つのレポーター間に測定可能な相互作用が引き起こされる、前記測定方法。 - 測定対象物質（Ｘ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部、細胞、細胞内オルガネラまたは低分子化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
- 物質（Ａ）および／または物質（Ｂ）が、蛋白質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖質、腫瘍マーカー、サイトカイン、サイトカインレセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、細胞接着因子、細胞接着因子のリガンド、核酸、糖鎖および脂質からなる群から選択される物質もしくはその一部または低分子化合物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の測定方法。
- 物質（Ｃ）および／または物質（Ｄ）が、蛋白質、ペプチド、核酸および糖鎖からなる群より選択される１または２以上からなる物質または低分子化合物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
- 第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が異なる蛍光物質であり、レポーター間の測定可能な相互作用が蛍光エネルギー移動からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 第一レポーター（Ｒ１）が生物発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される生物発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 第一レポーター（Ｒ１）が化学発光を触媒する酵素であり、第二レポーター（Ｒ２）が第一レポーター（Ｒ１）によって触媒される化学発光の無放射的エネルギー移動の受容体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）が酵素の一部を構成する分子であって、第一レポーター（Ｒ１）および第二レポーター（Ｒ２）が、それぞれ単独では酵素活性を欠失または減じているが、第一レポーター（Ｒ１）と第二レポーター（Ｒ２）とが相互作用することによって、酵素活性が生じるかまたは増加することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 物質（Ａ）および物質（Ｂ）が、測定対象物質（Ｘ）に対してそれぞれ異なる部位を認識する抗体もしくは抗体由来の単鎖Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆｖの一部、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたはそれらの変異体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、ペプチド性物質からなり、第一試薬および第二試薬が融合蛋白質からなることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の測定方法。
- 物質（Ｃ）および物質（Ｄ）が、いずれもロイシンジッパーペプチドであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の測定方法。
- 測定が、第一試薬および第二試薬を同時に測定対象物質に作用させる均一系でおこなう測定であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の測定方法。
- 測定が、第一試薬および第二試薬のうち、一方の試薬を予め固相に固定化し、その後に他方の試薬および測定対象物質を固定化した試薬に作用させる不均一系でおこなう測定であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の測定方法。
- 物質（Ａ）、物質（Ｂ）、レポーター（Ｒ１）、レポーター（Ｒ２）、物質（Ｃ）および物質（Ｄ）を含む、請求項１〜１３に記載の測定方法に用いるための測定用試薬。
- 請求項１４に記載の測定用試薬を含む測定用キット。
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