SE516272C2 - Metoder och kit för analytdetektion mha proximitets-probning - Google Patents

Description

516 272 Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning karakteriseras av dess förmåga att detektera och kvantifiera en eller flera analyter i lösning i ett homogent format i ett och samma reaktionskärl med hög känslig- het och speciñcitet. Så kallade proximitets-prober, innefattande en bindande enhet med affinitet för analyten och en reaktiv funktionalitet, tillsätts till provlösningen. Dessa prober får sedan interagera med varandra och gör så i större utsträckning om två eller flera proximitets- prober har bundit till en och samma analytmolekyl. Efiersom proximitetsprobema kan binda till analyten på flera platser verkar analyten på ett sätt som påminner om en katalysator genom att föra de reaktiva probema närmare varandra, vilket ökar deras förmåga att interagera genom den ökade lokala koncentrationen. Interaktionen mellan de kopplade reaktiva funktionaliteterna resulterar i en detekterbar signal i en påföljande sekundär reaktion.

I standardutförandet av metoden kan analytema vara proteiner, eller vilken annan molekyl som helst av intresse som specifikt kan binda två eller flera proximitets-prober. Komplex av olika proteiner kan också detekteras genom analysen. I detta fallet så binder proximitets- probema till två olika proteiner, men kommer nära varandra om dessa proteiner befinner sig närhet av varandra.

Många neurologiska sjukdomar orsakas av bildningen av proteinaggregat, så kallade amyloida plack. Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, motor neuron sjukdom, och Huntingtons sjukdom är några exempel (4). När dessa sjukdomar utvecklas bildas mer och mer aggregat. Om dessa aggregat kunde detekteras vid ett tidigt stadium av sjukdomen, kunde tillbörliga medicinska åtgärder vidtagas. Att detektera prion proteiner, som orsakar scrapie, är ett annat exempel på aggregatbildande proteiner (5). Dessa aggregat är idealiska analytiska mål för proximitets-probning. Efiersom ett aggregat innehåller många kopior av samma protein, kan en proximitets-prob med specificitet till detta protein binda till flera platser på samma aggregat. Proximitets-proberna kommer då nära varandra vid bindning till aggregatet. Genom den höga känsligheten i proximitets-probning skulle man kunna detektera sådan aggregatbildning under ett tidigt stadium av sjukdomen.

Förekomsten av infektiösa prionproteinaggregat i föda är också av stor vikt.

De bindande enheterna av proximitets-probema kan vara antikroppar, lektiner, nukleinsyror, kolhydrater, lösliga cellytesreceptorer, kombinatoriskt erhållna proteiner från fag-display eller ribosom-display, eller vilken annan typ av bindande enhet som helst. Kombinationer av bindande enheter kan också användas. a n Q n o o n o u o o n | u a un 516 272 n o u | o n o n o o n n v o a- Den reaktiva funktionaliteten av en proximitets-prob utgörs av en nukleinsyra kopplad till den bindande enheten. Denna koppling kan vara en kovalent tvärbindning eller icke kovalent, som kan exemplifieras med en streptavidin-biotin-koppling. När proximitets-prober fors nära varandra, som vid parvis bindning till målanalyten, så förs också de kopplade nukleinsyrorna i varandras närhet. Närheten av dessa målbundna nukleinsyror utnyttjas for att driva olika detekterbara interaktioner mellan dessa nukleinsyror. Denna nukleinsyrainteraktion detekteras i ett påföljande steg av analysen. I de flesta fall kommer den påfolj ande detektionen av graden av nukleinsyrainteraktion att innefatta en specifik amplifiering av interaktionsprodukten.

Då två proximitets-prober finns, har den ena bindande enheten vanligtvis en bestämd nuklein- syra kopplad till sig via nukleinsyrans 5 'ände medan den andra bindande enheten har en nukleinsyra kopplad till sig via dess 3 'ände 5'proximitets-proben har då en fri 3 'hydroxyl med förmåga att reagera med 5 'fosfaten på den andra bindande enheten via interaktion.

De reaktiva funktionalitetema (nukleinsyror) som finns på de bindande enheterna har förmåga att parvis reagera då dessa finns i hög koncentration. I detektions förfarandet tillsätts proximitets-probema till provet i låg koncentration. Koncentrationen är satt så lågt att proximitets-probema inte kommer att reagera med varandra i någon större utsträckning då dessa inte är nära varandra. Men när två eller fler proximitets-prober har bundit till analyten kommer den höga lokala koncentrationen att främja interaktionen mellan probema, vilket resulterar i en detektionssignal som överstiger den analyt-oberoende bakgrundssignalen.

Produkten som uppstår vid ligeringsreaktionen kommer i de flesta fall att finnas i mycket låg koncentration i behov av ett arnplifieringssteg for att kunna detektera den. Den uppkomna ligeringen mellan dessa nukleinsyror kan snabbt och enkelt amplifieras med hjälp av flera reaktioner, såsom polymeraskedjereaktion (PCR), strand displacement amplification (6), NASBA (7), RNA transkription (8), invader assay (9). Dessa amplifieringsreaktioner är utformade så att en produkt endast uppkommer när två nukleinsyror har tvärbundits via ligering. Detta görs genom att placera primers for PCR eller SDA, en på vardera av de kopplade nukleinsyrorna. Amplifieringsreaktionen kan följas i real-tid med sekvensspecifika TaqMan prober (10) eller molecular beacon prober(1l) eller med icke sekvensspecifika interkalerande och fluorescerande färger så som Sybr Green (12). Den resulterande produkten kan också kvantifieras med gel-elektrofores.

I vissa fall bildas mycket ligeringsprodukt. Denna kan då direkt analyseras utan behovet av amplifiering. Flera metoder kan då användas. Exempelvis kan den forsta av de två 516 272 sammanlänkade nukleinsyrasekvenserna utformas för att innehålla en sekvens med förmåga att genom hybridisering binda till en immobiliserad oligonukleotidprob. Vid bindning till oligonukleotidproben kommer den andra nukleinsyrasekvensen också att binda eftersom dessa nu är länkade genom ligeringen. Alla icke-bundna sekvenser kan tvättas av och en inmärkt hybridiseringsprob specifik för den andra sekvensen kommer att binda och detektera ligeringsprodukten.

De två sammanlänkade nukleinsyroma kan analyseras i en hybridiseringsbaserad analys där de sammanlänkade elementen binder kooperativt och därmed mycket starkare än icke sammanlänkade till en oligonukleotidprob. Sådana prober kan konstrueras i DNA- mikroarrayer för att selektivt binda nukleinsyror med sammanlänkade sekvenselement (13).

I en forsta aspekt avser uppfinningen en metod for detektion och/eller kvantifiering av en eller flera analyter i lösning, karakteriserad av; a) bindning av två eller flera proximitets-prober till deras respektive bindningsplats på nämnda analyt, där proximitets-probema består av en bindande enhet och en därtill kopplad (konjugerad eller via länkning så som biotin-streptavidin länkning) nukleinsyra, vilken också ibland benämns reaktiv funktionalitet; b) låta de bindande enheterna binda till analyten/analyterna och att låta nukleinsyroma att interagera med varandra om dessa är i närhet av varandra; och c)detektion och/eller kvantifiering av mängden interaktion mellan nukleinsyroma.

I en andra aspekt avser uppfinningen ett kit för detektion och kvantifiering av en eller flera analyter i lösning, innefattande - ett par av proximitets-prober innefattande bindande enheter med affinitet för analyten (analyterna) och där varje är försedd med en nukleinsyra (reaktiv funktionalitet) med förmåga att interagera med varandra. I en fóredragen utföringsform har en nukleinsyra en fri 3 'ände och den andra har en fri 5 'ände Följande komponenter kan valfritt inkluderas i kitet: - ett ligas för att sammanfoga nukleinsyrorna; och - primers som hybridiserar till varje nukleinsyra.

I ytterligare aspekter avser uppfinningen användandet av metoden och/eller kitet enligt uppfinningen för följande ändamål: 516 272 - genomsökande av ligand-receptor interaktionsantagonisteri en ”high throughput screening”-procedur; - for kompetitiv detektion och/eller kvantifiering av en okänd analyt i lösning; - for genomsökning av ligand-kandidater i en stor pool; - för genomsökning av läkemedelskandidater från stora bibliotek; - for detektion av infektiösa agens.

I ytterligare en aspekt avser uppfinningen en metod för genomsökning av ligand-receptor- interaktionsantagonister, karakteriserad av - reagerande av två proximitets-prober som har a) en bindande enhet med affmitet för receptor-liganden och b) en därtill kopplad (konjugerad eller via länkning så som biotin-streptavidin länkning) nukleinsyra med receptor-liganden och dess receptor och prov med potentiell ligand-receptor- interaktionantagonister i en ”high throughput screening” procedur; där en positiv signal genereras när en antagonist är närvarande.

I en annan aspekt avser uppfinningen en metod for detektion och kvantifiering av okända analyter i lösning, karakteriserad av - reagerande av proximitets-prober innefattande a) en bindande enhet med affmitet för analyten och b) en därtill kopplad nukleinsyra med en analyt med en därtill kopplad nukleinsyra i lösning innehållande den okända analyten; - tillåta att analyten med därtill kopplad nukleinsyra konkurrerar med den okända analyten för bindning till den bindande enheten; - tillåta att nukleinsyrorna binder till varandra; och - detektera och kvantifiera mängden bindningshändelser mellan nukleinsyrorna, vari signalen från reaktionen är omvänt proportionell mot koncentrationen av okänd analyt.

I ytterligare en aspekt avser uppfinningen en metod för detektion och kvantifiering av en okänd analyt i lösningen, karakteriserad av - reagerande av en receptor kopplad till en nukleinsyra (reaktiv fiinktionalitet) med dess receptor-ligand kopplad till en nukleinsyra (reaktiv funktionalitet) - låta nukleinsyrorna interagera med varandra; 516 272 o u o n u u o o u a u o o n n o nu - detektion och/eller kvantifiering av mängden interaktion mellan nukleinsyrorna, varvid detektionssignalen minskar om en molekyl blockerar receptorligand-komplexet som är närvarande.

Val av ligasenzymer och templat Ligeringsreaktionen är beroende av en hybridiserad templatsträng (också kallad DNA-splint eller splint-templat) när ett DNA ligas används, så som T4 DNA-ligas. De två oligonukleotiderna som skall ligeras måste hybridisera till templatet med 3 'änden av en oligonukleotid som ligger nära 5 'fosfaten i den andra.

När ligeringstemplatet tillsätts till reaktionen så kan den hybridisera till ett par av närliggande proximitets-prober och främja ligering. Men om varje proximitets-probs oligonukleotid har bundit ett ligeringstemplat kommer ingen ligering att ske eftersom inget enskilt ligerings- templat sträcker över ett par av ligerbara ändar. Om ligeringstemplatet tillsätts vid en hög koncentration kommer sannolikheten för ett till ett hybridisering att vara större. Men om proximitets-probema har bundit sin målmolekyl kommer den höga lokala koncentrationen av deras oligonukleotider att favorisera generering av tillbörliga ligeringssubstrat. Denna mekanism ser till att främja ligering i närvaro av analyten och att inaktivera proximitets- prober i frånvaro av antigen, vilket ökar signal-till-brus-förhållandet.

Templatet bör vara konstruerat så att det inte kan ge upphov till några falska amplifierings- produkter. Om det är felaktigt konstruerat kan ligeringstemplatet användas av amplifierings- enzymet, så som ett DNA-polymeras, som ett templat för polymerisering. Denna extension, templaterat av ligeringstemplatet, kan ge upphov till falska produkter. För att överkomma detta problem kan DNA oligonukleotider ligeras med en RNA oligonukleotid som templat med hjälp av T4 DNA-ligasenzym. Taq DNA polymeras kan inte använda RNA som templat för polymerisering, därav uppstår inga falska PCR produkter från polymerisering på ett sådant ligeringstemplat. En DNA-splint med två korta hybridiseringsegioner (så som l0+10) fungerar också som en RNA-splint. Men efiersom hybridiseringen är svag så kan dom ej templatera polymerisering vid den höga temperaturen av PCR reaktionen pga. deras låga smälttemperatur.

Ett alternativt sätt att reagera de konjugerade oligonukleotiderna är genom T4 RNA-ligas som inte behöver någon templatsträng, eller att använda kemisk ligering för att koppla ändarna som inte kan utgöra startpunkt för polymeriseringsreaktioner. 516 272 0 o n ø n o n o n Q | o o u n ø nu Kompetitiva blind-prober (”dummy-probes”) Bakgrundssignalen som uppstår från ligerade proximitets-probe-oligonukleotider som inte har bundit målmolekylen kan minskas genom att tillsätta en blind-oligonukleotid. Denna oligonukleotid skall ha förmåga att ligera till den ena eller den andra oligonukleotiden konjugerad till den målmolekylbindande enheten genom samma ligeringstemplat som används i den reguljära ligeringen. Däremot kan en ligering mellan denna blind- oligonukleotid och proximitets-prob-oligonukleotiden ej ge upphov till någon PCR reaktion eftersom blind-oligonukleotiden är konstruerad att inte innehålla primerplatsen för PCR.

Koncentrationen av blind-oligonukleotiden optimeras så att den ligeras väl med icke- målmolekylbunda proximitets-prob-oligonukleotider, men kan vid ligering inte konkurrera med målmolekyl-bunda proximitets~prober pga. deras höga lokala koncentration.

Pre-ínkubering, följt av spädning och ligering för Iigander med låg affinitet Vid detektion av en mâlmolekyl med proximitets-prober med låg affmitet och långsam bindningskinetik, kan företrädesvis en pre-inkubering användas med proximitets-proberna tillsatta till en hög nog koncentration för att de flesta analytema ska binda. Denna pre- inkubering späds därefter snabbt ut i en stor volym kall buffert och en del av denna spädning tillsätts därefter till en ligeringsreaktionsblandning. Denna ligeringsreaktionsblandning innehåller templat, ATP, och ligasenzym. Ligeringsblandningen kan också innehålla detektionskomponentema som beskrivits ovan. Den låga temperaturen kommer att minimera dissociationen av existerande proximitets-prob-målmolekyls-komplex medan den stora utspädningen kommer att resultera i en minskad koncentration av proximitets-probs- oligonukleotider vilket minskar deras reaktivitet och minimerar bakgrundssignalen.

Spädningen kommer också atti en mindre utsträckning minska den positiva signalen.

Blockerande prober för komplexa prov och provspädning Prov av hög komplexitet, så som serumprover, innehåller många proteiner förutom analyten av intresse. När DNA-aptamerer används kommer detta att ge upphov till problem efiersom de ospecifikt kan binda till andra proteiner i lösningen förutom analyten. Analysen bör använda så lite prober som möjligt för att inte öka bakgrundssignalen, så om provet är komplext kommer signalen från analytbundna prober att minska och bakgrundssignalen att öka pga. behovet att tillsätta mer prober. Detta kan överkommas genom att tillsätta en blockerande molekyl som kommer att blockera ut ospeciñka interaktioner av analytspecifika prober. En sådan molekyl kan vara en aptamer som liknar den specifika men som inte har hög affinitet för analyten, eller några ligerbara ändar. Ett armat sätt att överkomma detta problem 516 272 o s o ø o v c o o Q n o o ø a o nu är genom att späda ut det komplexa provet före analysen. Detta kommer att dramatiskt minska mängden proteiner som proberna kan binda ospecifikt till och därmed kan man använda en lägre koncentration av prober. Analyten kommer i detta fall också att spädas ut, men den höga känsligheten av proximitets-probning kommer ändå att ge en god detektion och kvantifiering.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Det finns flera möjliga sätt på vilka oligonukleotider kopplade till de bindande enheterna kan interagera när de är i närhet, figurerna 1-8 representerar några exempel. Dessa interaktions- exempel kan också användas i kombinationer. Ligeringsreaktioner är inte begränsade till enzymatiskt katalyserad ligering utan kan även utföras genom kemisk ligering, eller katalyseras av katalytiskt RNA eller DNA.

Figur 1 förklarar de använda symbolerna.

Figur 2a) representerar hybridiseringen av en templatoligonukleotid för ligering av proximitets-prob-oligonukleotiderna. Denna ligering kan detekteras via arnpliñering med PCR-primers, genom att placera en på varje proxirnitets-prob-oligonukleotid.

Figur 2b) visar ytterligare en oligonukleotid ligerad emellan proximitets-prob-oligo- nukleotiderna.

Figur 3) visar en DNA polymeras-katalyserad ”fill-in”-reaktion initierad av en proximitets- prob-oligonukleotid, följt av ligering av proximitets-probparet.

Figur 4) visar användandet av en första hybridiseringsoligonukleotid (z) som binder till båda proximitets-probe-oligonukleotidema. Två andra oligonukleotider (x och y) hybridiserar en till varje proximitets-prob-oligonukleotid och ligerar och bildar en x-z-y oligonukleotid som specifikt detekteras. När proximitets-probema inte är nära varandra kommer en oligonukleotid z att hybridisera till alla proximitets-prob-oligonukleotider. Detta omöjliggör bildningen av någon x-z-y ligeringsprodukt, enbart bildandes x-z och z-y.

Figur 5) Bildande av cirkulärt DNA (ligerad padlock-prob) (15), med ligering av två oligonukleotider, templaterade av proximitets-prob oligonukleotiderna. Den cirkulära DNA molekylen kan amplifieras med en rullande cirkelampliñering (14). 516 272 c ø n ø n ~ u g y I n | n n o u o o o u c u n o en Figur 6) Ligering av en oligonukleotid, templaterad genom hybridisering till en proximitets- prob-oligonukleotid, bildande en cirkel (ligerad padlock-prob). Det cirkulära DNA:t kan initiera en rullande cirkel amplifiering när den andra proximitets-prob-oligonukleotiden är i närhet av den bildade cirkeln. Närheten ges av bindande till målmolekylen.

Figur 7) visar ligeringen av två proximitets-prob-oligonukleotider utan behovet av ett hybridiseringstemplat. T4 RNA-ligas kan katalysera en icke templaterad ligering och gör företrädesvis så när proximitets-prob-oligonukleotiderna är nära varandra.

Figur 8) visar initiering och templatering av DNA polymerisering av proximitets-prober. De två proximitets-prob-oligonukleotiderna är svagt hybridiserade till varandra och denna hybridisering stabiliseras av det kooperativa bindandet till analyten. Denna hybridisering och följande polymeriseringsreaktion optimeras så att de företrädesvis sker när proximitets- proberna är nära varandra.

Figur 9) Visar ligeringen av tre proximitets-prober bundna till samma analyt i behov av två ligerings-händelser for att ge signal. Proximitets-prob-oligonukleotiderna är ligerade och primerplatser för amplifiering är placerade så att de spänner över alla tre oligonukleotiderna.

Figur 10) är en schematisk beskrivning av PDGF -BB bunden av två aptamerbaserade proximitets-prober, Alc och A2c. Aptamersekvensen som binder till PDGF-BB visas nära proteinet. TaqMan-prob-sekvensen som används i PCR-detektionen visas. Ligeringsplatsen mellan proximitets-proberna är markerad med en linje mellan 3 'änden av Alc och 5' änden av A2c. Primerplatser är inramade.

Figur 11) resultat av proximitets-probning av PDGF-BB med separata ligerings- och ampliñering/detekteringsblandningar. 1 uL av prov från en spädningsserie analyserades.

Mängden ligerings produkt kvantifierades av 5' exonukleas TaqMan PCR analys. Ett högt Ct- värde motsvarar en liten mängd ligeringsgenererade PCR templat.

Figur 12) Resultat av proximitets-probning av PDGF-BB med en kombinerad ligerings- och amplifieringsblandning, 1 uL prov analyserades. Ett högt Ct-värde motsvarar en liten mängd ligeringsgenererade PCR templat. 516 272 n n I u ø u o o n | n c u n n nu 10 Figur 13) Exempel på universella proximitets-prober, baserade på antikroppar med förmåga att binda till flera primära antikroppstyper.

Figur 14) Exempel på ett proximitets-probs par använt i ett multiplex-analys. En positiv signal genereras när två matchande sekvensidentifieringsmarkörer (1D:A och ID:B) sammanförs.

Två PCR-primers visas, varvid den ena innehåller en biotinrest för att göra produkten enkelsträngad fore DNA mikroarray-hybridisering och den andra med en fluorescerande molekyl for detektion.

Exempel 1, PDGF detektion med SELEX aptamerer- Ett exempel på proximitets-probning är en analys med förmåga att detektera ”platelet derived growth factor BB” (PDGF-BB). I detta fallet är de bindande enheterna som binder proteinet vid två platser Selex (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)-aptamerer (16). Dessa är enkelsträngade oligonukleotider som selekterats iterativt från mycket stora bibliotek av slumpmässiga kombinatoriska bibliotek for affinitet mot ett målprotein, i detta fallet B-kedjan av PDGF (17). Aptarnersekvensema utökas lätt så att de innehåller ytterligare en polynukleotidsekvens förutom den bindande enheten. Denna extension innehåller den reaktiva funktionaliteten som nämnts ovan. En aptamer har en 5 'extension som avslutas med en 5 'fosfat-grupp och den andra aptameren har en 3 'extension som avslutas med en 3 'hydroxyl. Dessa två extensioner kan sammanfogas med en ligeringsreaktíon om de är hybridiserade till en templatsträng (figur 10). i Effektiviteten av en sådan ligeringsreaktion är beroende av koncentrationen av de två proximitets-proberna. Om dessa är i låg koncentration kan reaktionseffektiviteten ökas väldigt med närvaron av en molekyl (analyt) med förmåga att binda de två proximitets-proberna tillsammans, därmed ökar deras lokala koncentration och reaktionen mellan de reaktiva funktionaliteterna eller extensionerna främjas. PDGF verkar då som en ”katalysator” genom att föra samman de två aptamererna med 3 'respektive 5'extensioner. Om proximitets-prober tillsätts till en koncentration av 5 pM är ökningen av koncentrationen uppskattningsvis 15 miljoner gånger när proximitets-proberna har bundit PDGF.

Mängden PDGF närvarande i provet är proportionell mot ”threshold cycle” (Ct) om TaqMan- analysen används under PCR reaktionen. Efiersom PDGF-BB är en homodimer kan samma bindande enhet (selex-aptamer) användas för båda proximitets-proberna. Statistiskt sett kommer hälfien av de två prob/pdgf-komplexen att vara av typen 3 'prob/PDGF/5'prob, medan 3 'prob/PDGF/3 'prob och 5'prob/PDGF5'prob komplex inte kommer att ge upphov till någon detekterbar signal. 516 272 o o o o o ø ø o Q n ø | n Q u »n 11 Experimentfórfarande for proximitets-probning av PDGF-BB För att analysera flera prover beredes tre stamlösningar med reagens. Den forsta blandningen är inkuberingsblandningen till vilken det okända provet tillsättes och inkuberas i en till två timmar vid rumstemperatur. Denna blandning innehåller de två proximitets-proberna (selex- aptamer och ligerbar sekvens). Efter inkuberingen tillsättes ligeringsblandningne under fem minuter vid rumstemperatur. Denna blandning innehåller ligasenzymet, ligeringstemplat, och ATP. Ligeringsreaktionen inaktiveras med uppvärmning till 80 grader i 20 minuter. Till sist, innehåller amplifierings/detektionsblandningen PCR primers, TaqMan prob, dNTP's och DNA-polymeras. PCR-amplifieringen detekteras i realtid med TaqMan-analys och Ct-värdet avspeglar mängden PDGF närvarande i provet. Ct-värdet är ”treshold cycle”då PCR- reaktionen nått en kritisk mängd bildad amplifieringsprodukt. Figur 11 visar Ct-värden for en spädning av PDGF-BB i PBSM-buffert. Ett högt ct-värde motsvarar en låg eller odetekterbar PDGF-BB-koncentration.

Inkuberingsblandning: volym 14 uL, 50mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, BSA 0,01%, 3 mM MgCl2, 7,5 pM prob Alc och A2c. 1 uL av provet tillsätts till denna blandning.

Ligeringsblandning: volym 5 pL, 50mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 3 mM MgCl2, 0,8 mM ATP, 20 nM ligerings templat, 3 Weiss-enheter T4 DNA-ligas.

Amplifierings/detektionsblandning (TaqMan PCR): volym 30 pL, 50mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,4 mM MgCl2, 0,33 mM dNTPs, lx buffert A, 1 uM forward primer, 1 pM reverse primer, 83 nM TaqMan-prob, 1.56 enheter AmpliTaq Gold polymeras (Perkin-Elmer).

Prob Alc: TACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTATGTGGTCTATG TCGTCGTTCGCTAGTAGTTCCTGGG CTGCAC Prob A2c: TCGAGGCGTAGAATTCCCCCGATGCGCGCTGTTCTTACTCAGGGCACTGCAAGCA ATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT Splint-templat for ligering (6+20): GGGGGAATTCTACGCCTCGAGTGCAG Frw primer: ATGTGGTCTATGTCGTCGTTCG Rew primer: TGAGTAAGAACAGCGCGCAT Taq Man prob Al+2c: F luorescine-CTGCACTCGAGGCGTAGAATTCCCC-Tamra 516 272 a e o n ø o | ø o u | o n en 12 PCR-cykler: håll 10 min 95, cykla 95 (15 sek) - 60 (1 min) 45 gånger Kombinerad ligeringsblandning och PCR-blandning för ökad känslighet De två blandningarna för ligering och PCR-detektion slås samman och tillsättas i ett steg.

Inkuberingsblandningen förblir densamma med prov och reaktiva prober. Inkuberingen görs företrädesvis i en liten volym och vid tillsats av ligerings/detektionsblandningen ökar volymen i betydande grad, därmed späds obundna proximitets-prober ut vilket minskar deras reaktivitet. Däremot kommer analytbundna proximitets-prober att behålla sin höga lokala koncentration och höga reaktivitet eftersom en ny jämvikt inte hinner ställa in sig under den korta tiden som ligering sker. Figur 12 visar resultatet en sådan kombinerad 1igering/- detektionsvariant av proximitets-probning med selex-aptamerer som detekterar PDGF-BB.

Här innehöll detektionsblandningen 20 pM aptamerer Alc och A2c i en 10 uL volym med 1 uL prov. Den 40 L ligerings- och detektionsblandningen tillsattes och förvarades i rumstemperatur i 5 minuter, innan PCR reaktionen startades med uppvärmning av provet och därmed stoppas samtidigt ligeringsreaktionen. Ligerings/detektionsblandningen innehöll T4 DNA ligas, ligeringstemplat (10+10), 40nM ATP, TaqGold DNA-polymeras, dNTP's, PCR- primers, och TaqMan prob.

En femfaldig utspädning av de obundna proximitets-probema erhålles med volymökningen då ligerings/detektionsblandningen tillsätts. Denna procedur minimerar även risken för kontamination efiersom kärlet aldrig öppnas för ytterligare en tillsats, och känsligheten av analysen ökar genom spädningseffekten. 1xl0E-19 mol av PDGF-BB detekterades i analysen visad i figur 12. Detta är ungefär en 500-faldig ökning av känsligheten jämfört med den rapporterade känsligheten av kommersiella ELISAs för PDGF-BB.

Exempel 2. Universella proximitets-prober.

När man detekterar en analyt behöver inte alltid proximitets-proberna binda direkt till analyten sj älv, utan kan istället binda via ett första afñnitetsreagens. I detta fallet med en analyt med två bindningsplatser, binder det första aflinitetsreagenset analyten och proximitets-probema binder till dessa primära reagens (figur 13). Denna strategi har fördelar när man utvecklar universella proximitets-prober här exempliñerat med antikroppar som målmolekylbindande enheter.

Den laborativt arbetsamma konjugeringen av nukleinsyresekvenser till olika antikroppar eller andra bindande enheter kan uteslutas genom att tillverka universella proximitets-prober.

Dessa innehåller ett sekundärt par av bindande enheter, var och en med förmåga att binda en gång till Fc-delen (konstant region) av ett primärt antikroppspar. Fc regionen är konstant för 516 272 n n u n n n ø s o v n I c o ø an 13 många olika antikroppar med skilda specificiteter. Alltså konjugeras nukleinsyror till dessa sekundära bindande enheter och används universellt for detektion av många olika analyter.

Det primära antikroppsparet inkuberas med analyten och de sekundära reaktiva bindande reagensen tillsätts och tillåts att företrädesvis reagera när dessa befinner sig i en hög lokal koncentration (figur 13).

Exempel 3. Kompetitiv proximitets-probning fór analyter med endast en bindningsplats Det är inte alltid så att två bindande enheter finns tillgängliga for en analyt. Detta kan kring- gås genom att använda en kompetitiv analys. Då konjugeras en renad mängd av sj älva analyten och till en nukleinsyra och den enda existerande bindande enheten konjugeras med den andra reaktiva nukleinsyran. När dessa två konjugat tillåts reagera i en provblandning innehållande en okänd mängd av analyten, kommer den icke-konjugerade analyten av okänd mängd i provet kommer att konkurrera for bindning till den bindande enheten av proximitets- proben vilket minskar sannolikheten for de konjugerade nukleinsyrorna att reagera. Signalen i reaktionen är i detta fall omvänt proportionell till analyt-koncentrationen.

Exempel 4: Multiplex proteindetektion Flera analyter kan detekteras samtidigt genom att använda flera proximitets-prob-par, vart och ett specifikt för dess enskilda analyt. Dessa proximitets-prob-par har unika nukleinsyra- sekvenser for att kunna skilja dem från andra par. I en utfóringsform har oligonukleotiderna alla samma PCR-primerplatser och samma ligeringsfog men unika identifieringssekvenser.

Om olika PCR-primerplatser och olika ligeringsfogningssekvenser används, kommer risken för att generera falska PCR-produkter genom korsreaktivitet att öka vilket bör undvikas.

Under PCR kommer de olika amplikonen som motsvarar närvaro av olika proteiner att amplifieras simultant. Dessa olika PCR-produkter kan detekteras med någon av flera olika metoder, så som DNA-mikroarrays, masspektrometii, gelelektrofores (olika längder av produkterna), eller någon annan metod. En korrekt ligering måste innehålla båda sekvens- identifieringsmarkörema från korrekta par av oligonukleotider for att läsas som en sann positiv signal, figur 14. Det är möjligt att använda en DNA-mikroarray for att sortera unika amplifikationsprodukter motsvarande närvaro av ett visst protein.

Exempel Sa: Genomsökning av ligandkandidater i en stor pool Ligander till exempelvis cellytesreceptorer kan finnas genom att genomsöka cDNA- expressionskloner fór affinitet mot den nämnda receptorn. Sådan genomsökning genomförs 516 272 14 vanligtvis i olika fast fas-format där den kända receptorn är immobiliserad. Proximitets- probning är ett alternativt sätt att genomsöka stora bibliotek av ligandkandidater utan behovet av en fast fas. Man behöver en antikropp med förmåga att binda till den kända receptom på ett sådant sätt att den blockerar bindningen av den okända receptorliganden. Till receptom konjugeras en oligonukleotid, som kan ligeras till en andra oligonukleotid konjugerad till antikroppen. Till en uppsättning provblandningar tillsätts receptorn och antikroppen for att interagera med en potentiell receptorligand. Ligeringsblandningen tillsätts till provet och om en receptorligand finns närvarande i provet kommer ligeringen av oligonukleotidema att vara ineffektiv pga. bristen på närhet mellan dessa eñersom receptor/antikropps-komplex inte bildas i närvaro av receptorliganden. Ett prov med en potentiell ligand kommer därför att ge en mindre signal. Denna metod är inte begränsad till receptorer och deras ligander utan kan även användas fór alla typer av biomolekylära interaktioner av intresse.

Exempel 5b: Genomsökning av läkemedelskandidater i stora bibliotek På ett snarlikt sätt till det beskrivna för metoden att genomsöka okända ligander kan man också genomsöka fór läkemedelskandidater. Exempelvis konjugeras både en receptor och dess ligand till oligonukleotider. I en blandning innehållande en kompetitiv läkemedels- kandidat kommer ligeringen mellan oligonukleotiderna att inhiberas eftersom receptorligand- komplexen inte bildas. Stora läkemedelskandidatsbibiliotek kan därmed genomsökas med minimal materialåtgång av receptom och dess ligand.

Exempel 6: Detektion av infektiösa agens Genom att använda prober med specificitet for ytmolekyler av ett infektiöst agens, så som ett virus eller en antikropp, kan proximitets-probning användas for att detektera sådana agens vid mycket låga mängder. De två proberna kan utformas så att de binder till samma målmolekyl om dessa finns i tillräcklig mängd på ytan i en klunga nära varandra. De två proberna kan också binda till två olika målmolekyler på agenset men också här med behovet av närhet mellan varandra.

Exempel 7: Målanalyt med fler än två bindningsplatser Genom att använda fler än två proximitets-prober per analyt kan en känsligare detektion åstadkommas. Denna analys konstrueras så att fler än en ligeringshändelse krävs for att generera en signal. När tre bindande enheter simultant kan binda till analyten kan tre olika proximitets-prober tillverkas, var och en med olika konjugerade nukleinssyra-sekvenser. En med en 3 'extension (A), en med en 5'extension (B), och en med både en 3' och en 5' 516 272 15 c extension (C). 3' änden av A ligeras till 5' änden av C och 3 ' änden av C ligeras till 5 ' änden av B. I fallet med PCR-detektion kommer primers placerade på A och B att resultera i en PCR-produkt som sträcker sig över hela C proben. C proben konstrueras företrädesvis med en ssDNA aptamer som bindande enhet för att underlätta polymeriseringen över nukleinsyran konjugerad till C proben.

Denna strategi kommer att minska bakgrundsligeringen eftersom behovet av två ligerings- händelser för att ge en falsk positiv signal jämfört med en händelse som finns i ett system med två ligerbara proximitets-prober. Under analysoptimeringen kommer minskande proximitets- prob-koncentration att minska sannolikheten för bakgrundsligering med den tredje roten av koncentrationen jämfört med kvadratiska roten som för ett två probs system.

Exempel 8: Användning av en dimeriserande affinitetsenhet Om endast en bindande enhet kan konstrueras till en proximitets-prob kan ett multimeriskt affinitetsreagens ge proximitet genom att dimerisera analyterna och därmed möjligöra deras detektion. Detta kan exemplifieras med en aptamerbaserad bindande enhet konstruerad till en proximitets-prob och en antikropp som dimeriserar analyten.

Många Selex-framtagna aptamerer binder endast till en plats på mål-proteinet. Eftersom proximitets-probning kräver bindning av minst två prober till varje målmolekyl för att möjliggöra detektion, kommer dessa monovalenta målmolekyler att vara svåra att detektera.

Genom att till inkubationsblandningen tillsätta en bivalent antikropp ( eller annat afñnitets- reagens ) med förmåga att simultant binda två målmolekyler, kan detta problem kringgås.

Antikroppen måste binda på en plats skild från selex-aptameren så ett komplex av fem molekyler kan bildas bestående av antikroppen, två mål-proteiner, och de två ligerbara selex- aptamerbaserade proximitets-proberna.

I närvaro av målmolekyl kommer ligeringen av aptamerema att drivas av deras proximitet som tillhandahålls av den dimeriserande antikroppen. Detta system kan altemativt användas för att detektera och kvantifiera själva antikroppen genom att använda konstanta mängder av målmolekylen och selex-aptameren.

Exempel 9: Genomsökning fór ligand-receptor-interaktionsantagonister När man söker efier antagonister till en ligand-receptor-interaktion för farmaceutiskt bruk är ett känsligt, specifikt, och snabbt testsystem mycket fördelaktigt för att genomsöka stora bibliotek av kandidatsubstanser. Detta kallas ibland ”high throughput screening”.

Följande är ett exempel som visar hur PDLA-deketionssystemet kan konstrueras så att man kan testa om en substans binder en viss receptor. Denna genomsökningsprocedur 516 2 7 2 §ïï= få - J; - "F 1331 o uuuu a: 16 exemplifieras här av PDGF-BB och dess receptor-interaktion. Genom att tillsätta ett överskott av receptor till en inkubationsblandning av PDGF-BB och proximitets-proberna, kommer bindningen av probema till PDGF-BB att blockeras av receptom och ingen signal genereras.

Men om en molekyl som binder till receptom på ett kompetitivt sätt tillsätts till inkuberings- blandningen kommer PDGF att frigöras och vara tillgänglig för proximitets-probema och därmed generera en signal.

För att testa denna princip användes PDGF-AA för att efterlikna verkan av en antagonist eftersom den har förmåga att binda till PDGF-alfa receptom men inte till aptamererna. 6,4 pM PDGF-BB inkuberades med 5 pM aptamerbaserade proximitets-prober och 2,5 nM av en löslig PDGF-alfa-receptor (i överskott). Vid tillsats av 100 nM PDGF-AA, som binder receptom men inte aptamererna, ökade signalen 3-faldigt från frigjord PDGF-BB, nu tillgänglig för proximitets-proberna. 516 272 n n ~ a n. 17 Referenser: 1) Hart HE, Greenwald EB, Scintillation proximity assay (SPA)--a new method of immunoassay. Direct and inhibition mode detection with human albumin and rabbit antihuman albumin., Mol Immunol 1979 Apr;16(4):265-7 2) Szollosi J, Damjanovich S, Matyus L, Application of fluorescence resonance energy transfer in the clinical laboratory: routine and researchCytometry 1998 Aug 15;34(-'lv): l59-79 3) Ueda H, Kubota K, Wang Y, Tsumoto K, Mahoney W, Kumagai I, Nagamune T, l-íornogeiueous noncornpetitive immunoassay based on the energy transfer lietwec-nlluorolabeled antibody Variable domains (open sandxxviclï fluoroiriimunoassay).

Biotetfliiiiqties 1999 Oct;27(4):738-42 l 4) líoo EH, Lansbury PT Jr, Kelly JW, Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neuroclegeneration., Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Aug 31;96(18):99S9-9O 5) Prusiner SB, McKinley MP, Bowman KA, Bolton DC, Bendheim PE, Groth DF, Glenner GG, Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods., Cell 1983 Dec;35(2 Pt 1):349-58 6) Nadeau JG, Pitner JB, Linn CP, Schram JL, Dean CH, Nycz CM, Real-Time, Sequeiice-Specific Detection of Nucleic Acids during Strand Displacement AmpliñcationAnal Biochern 1999 Dec 15;276(2):177-l87 7) van Deursen PB, Gunther AW, van Riel CC, van der Eijnden MM, Vos HL, van Gemen B, van Strijp DA, Tackent NM, Bertina RM, A novel quantitative multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14 mRNA levels in human monocytesNucleic Acids Res 1999 Sep 1;27(17):e15 8) White SR, et al., Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin., Nucleic Acids Res. 1999 Oct 1;27(l9):e25. 516 272 I 9) Kwiatkowski RW, Lyamichev V, de Arruda M, Neri B, Clinical, Genetic, and Pharmacogenetic Applications of the Invader Assay., Mol Diagn 1999 Dec;4(4):353-364 10) Gibson, U.E., hcid, C.A., Williams, P.M. Genome Res., 6, 995-1001 11) Tyagi, Slíramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization, Nat Biotechno1(l996), 14, 3 , 303-8 12) Steuemiald N, Cohen J, lelerrera RJ, Brenner CA, Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescence monitored l\"1“- PcRivioi Hum Repfod 1999 N0v;5(11);1o34-9 13) Gentalen E, Chec M , A novel method for determining linkage betxveen DNA sequences: hybridization to paired probe arrays., Nucleic Acids Res 1999 Mar 15;27(6):1485-9 l 14) Baner J, Nilsson M, Mendel-Hartvig M, Landegren U, Signal ampliñcation of padlock probes by rolling circle replication., Nucleic Acids Res 1998 Nov l5;26(22):5073-8 15) Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary BP, Landegren U, Padlock probes: circularizing olígonucleotides for localized DNA detection., Science 1994 Sep 30;265(5181):2085-8 16) Gold, L. Polisky, B. Uhlenbeck, O. Yarus, M., Diversity of oligonucleotide functions.

Annu Rev Biochem, 1995, 64, 763-97 17) Green, L. S. Jellinek, D. Jenison, R. Ostman, A. Heldin, C. H. Janjic, N., Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain, Biochemistry, 1996, 35, 45, 14413-24

Claims (18)

516 272 19 PATENTKRAV

1. En metod for detektion och/eller kvantifiering av en eller flera analyter i lösning, kännetecknad av a) bindning av två eller fler proxirnitets-prober till respektive bindningsplats på nämnda analyt(er), vari proximitets-probema består av en bindande enhet och en därtill kopplad nukleinsyra; b) tillåta den bindande enheten att binda till analyten(erna) och att tillåta nukleinsyrorna att interagera med varandra om dessa är i närheten av varandra; och c) detektion och/eller kvantiñering av graden av interaktion mellan nukleinsyrorna med förbehåll for att de bindande enheterna och analyten(erna) inte samtliga består av nukleinsyra.

2. En metod enligt krav 1, bestående av amplifiering av de interagerade nukleinsyroma och detektion/kvantifiering av amplifieringsprodukten.

3. En metod enlig krav 1 och 2, vari de bindande enheterna av proxirnitets-proberna har valts antikropp, nukleinsyra, t ex en aptamer, löslig cellytesreceptor, kombinatoriskt erhållet protein från fag-display eller ribosom-display, eller kombinationer därav.

4. En metod enligt krav 1, 2, eller 3 där ana1yten(ema) är protein(er), proteinaggregat(er), och/eller prion(er).

5. En metod enligt krav 1, 2, 3, eller 4, där bindningsplatserna for de bindande enheterna av proximitets-proberna befinner sig på en och samma analyt, eller på två analyter i närheten av varandra.

6. En metod enligt någon av kraven ovan, där de bindande enheterna är antikroppar och nämnda antikroppar binder till analyten via en ytterliggare antikropp som har bindnings specificitet for ana1yten(ema), och där de bindande enheterna är riktade mot Fc delen av den ytterligare antikroppen. 516 272 20

7. En metod enligt något av kraven ovan, däri interaktionen av nämnda nukleinsyror kopplade till den bindande enheten sker genom hybridisering till ett gemensamt splint-templat och ligering av nukliensyra-ändarna.

8. Ett kit for detektion och kvantifiering av en eller flera analyt(er) i lösning, innefattande ett par av proximitets-prober bestående av bindande enheter med affinitet for analyten(erna) och försedda med en nukleinsyra (reaktiv funktion) med förmåga att interagera med varandra; och eventuellt ett ligas och ett splint-templat för sammanfogning av nukleinsyrorna, primers som hybridiserar till var och en av nukleinsyrorna.

9. Ett kit enligt krav 8, innefattande ett första par av bindande enheter varande ett första par av antikroppar med affinitet för analyten; och ett andra par av bindande enheter varande ett andra par av antikroppar riktade mot Fc-delen av det forsta paret av antikropparna.

10. Ett kit enligt krav 8, innefattande; tre proximitets-prober en med en fri 3 'nukleinsyra (A), en med en 5 'fri nukleinsyra (B), och en med både en 3'och en 5' fri nukleinsyra (C); vari 3 'änden av A interagerar med 5 'änden av C och 3 'änden av C interagerar med 5'änden av B.

11. 1 1. Ett kit enligt krav 8, vari de bindande enheterna är aptarnerer och ytterligare innefattande ett bivalent affinitetsreagens som dimeriserar två analyter varje med enbart en aptamer- bindningsplats.

12. Ett kit enligt krav 8, innefattande flera par av proximitets-prober, varje med en specifik bindande enhet och unika nukleinsyror for identifiering.

13. Användning av metoden enligt något av kraven 1-7 och/eller ett kit enligt något av kraven 8-12 för genomsökning av ligand-receptor-interaktionsantagonister med ett high throughput screening forfarande.

14. Användning av metoden enligt något av kraven 1-7 och/eller ett kit enligt något av kraven 8-12 för kompetitiv detektion och/eller kvantifiering av en okänd analyt i lösning. 516 272 121

15. Användning av metoden enligt något av kraven 1-7 och/eller ett kit enligt något av kraven 8-12 for screening av ligandkandidater i en stor pool.

16. Användning av metoden enligt något av kraven 1-7 och/eller ett kit enligt något av kraven 8-12 for screening av läkernedelskandidater från stora bibliotek.

17. Användning av metoden enligt något av kraven 1-7 och/eller ett kit enligt något av kraven 8-12 for detektion av infektiösa ämnen.

18. Användning enligt krav 17 for detektion av infektiösa ämnen i djur- och människofóda.