JP4140976B2 - ４，７―ジクロロローダミン色素 - Google Patents

４，７―ジクロロローダミン色素 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、一般に、分子プローブとして有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な4,7-ジクロロローダミン色素に関する。
参考文献
Figure 0004140976
Figure 0004140976
発明の背景
生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、重要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことにより、安全性が高まり、試薬廃棄物の環境上の影響が著しく低下し、その結果、分析コストが低減される。このような非放射性検出方法を使用する方法の例には、DNA配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが包含される。
多くの用途では、混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多重DNAプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色DNA配列決定法などが必要である。複数座のDNAプローブアッセイの場合には、多色検出を提供することにより、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの製造が促進される。自動化したDNA配列決定の場合には、多色標識化により、単一レーンの４個の塩基全ての分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力が増え、レーン間の電気泳動の可動性の変化に付随した不確実性がなくなる。
多重検出では、特に、電気泳動分離および酵素処理が必要な分析（例えば、DNA配列決定）に対して、色素標識の選択について、非常に多くの厳しい制約が課せられている。第１に、有機蛍光色素の典型的な発光バンドの半値幅は、約40〜80ナノメーター（nm）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源により制限されるので、その発光スペクトルが分光的に解析される一連の色素を見つけるのは困難である。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する色素を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセットは、依然として、適当ではない。例えば、DNA配列決定の場合には、試料の充填を多くしても、低い蛍光効率を補填できない（Pringle）。第３に、数個の蛍光色素を同時に使用するとき、これらの色素の吸収バンドが広範囲に分離するために、同時励起が困難となる。第４に、これらの色素の電荷、分子サイズおよび立体配座は、そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響を与えてはならない。最後に、これらの蛍光色素は、これらのフラグメントを製造するかまたは操作するのに使用する化学物質（例えば、DNA合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。
これらの厳しい制約のために、多色用途（特に、４色DNA配列決定の領域）で使用できる蛍光色素のセットは、少数発見されているにすぎない（Smith 1992, 1995, Prober；Connell）。
多色用途において特に有用な蛍光色素の１つのクラスはローダミン色素である（例えば、テトラメチルローダミン（TAMRA）、ローダミンX（ROX）、ローダミン6G（R6G）、ローダミン110（R110）など（Bergot）。（1）代表的に、ローダミンはフルオレセインよりも光安定であり、（2）ローダミン標識されたジデオキシヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ酵素のよりよい基質であり、そして（3）ローダミン色素の発光スペクトルは、フルオレセインの赤（より高波長）より顕著であるので、ローダミン色素はフルオレセイン色素に比べて特に魅力的である。
しかし、多重検出法の状況下で現在利用可能なローダミン色素の１つの重要な欠点は、このような色素の比較的広い発光スペクトルである。この広い発光スペクトルは、スペクトルが隣接する色素間で低いスペクトル分解能を生じ、それによりこのような色素組み合わせの多成分分析を困難にする。図７Aに示される蛍光スペクトルは、この高程度のスペクトルの重複を実証する。現在利用可能なローダミン色素の２つ目の欠点は、それらの吸収スペクトルが、現在利用可能な固体二重周波数緑ダイオードレーザー（例えば、ネオジム固体YAGレーザー、これは約532nmでの発光系列を有する）の波長と調和しないことである。これらのコンパクトなサイズ、長い寿命、および電力の効率的な使用のため、このようなレーザーを使用することは非常に有利である。
発明の要旨
本発明は、分子プローブとして有用な4,7-ジクロロローダミン色素のクラスの発見に関する。
本発明の目的は、現在利用可能なローダミン色素より実質的に狭い発光スペクトル領域を有するローダミン色素のクラスを提供することにある。
本発明の他の目的は、現存のローダミン色素に比べて赤色側に約15nmまでシフトした吸収スペクトルを有するローダミン色素のクラスを提供することにある。
第１の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、次式を有する化合物により達成される：
Figure 0004140976
ここで可変置換基は以下のように定義される。R1-R6は、別個に水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基あるいはそれらの組合せ、または、一緒になった場合、R1およびR6はベンゾ、または、一緒になった場合、R4およびR5はベンゾである。好ましくは、R1-R6は、水素、メチルまたはエチルである。Y1-Y4は、別個に水素あるいは低級アルキル、または、一緒になった場合、Y1およびR2はプロパノおよびY2およびR1はプロパノ、または、一緒になった場合、Y3およびR3はプロパノおよびY4およびR4はプロパノである。X1-X3は、別個に水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸、-CH2OH、および連結基である。好ましくは、X1はカルボキシレートであり、かつX2およびX3は別個に水素または連結基である。
第２の局面では、本発明は、次式を有する標識化ヌクレオチドを包含する：
Figure 0004140976
ここで可変置換基および連結は以下のように定義される。Dは、本発明の4,7-ジクロロローダミン色素化合物である。Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シトシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンである。W1およびW2は別個に、HまたはOHである。W3はOH、-PO4、-P2O7、-P3O10であり、そのアナログを含む。１つの好ましい実施態様において、W1はＨ、W2はＯＨ、およびW3は-P3O10である。第２の好ましい実施態様において、W1およびW2はHであり、W3は-P3O10である。Bがプリンまたは7-デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのN9-位に結合しており、そしてBがピリミジンである場合、糖部分はピリミジンのN1-位に結合している。BとDとを連結する連結は、R1-R5またはX1-X3のうちの１つの位置でDに結合する。好ましくは、BとDとを連結する連結は、X2またはX3のうちの１つの位置でDに結合する。特に好ましい実施態様において、連結は以下のものである：
Figure 0004140976
Bがプリンである場合、この連結はプリンの8-位に結合し、Bが7-デアザプリンである場合、この連結は7-デアザプリンの7-位に結合し、そしてBがピリミジンである場合、この連結はピリミジンの5-位に結合する。
第３の局面において、本発明は以下の式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチドを含む：
Figure 0004140976
ここで可変の置換基および連結は以下のように定義される。Dは、本発明の4,7-ジクロロローダミン色素化合物である。Bは、7-デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくはウラシル、シトシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンである。Z1は、HまたはOHである。Z2はH、OH、-PO4、またはNuc、隣接ヌクレオチドであり、ここでNucおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結またはそのアナログによって結合され、この連結はNucの5’-位に結合している。Z3はＨ、-PO3（ホスフェートアナログを含む）、またはNucであり、ここでNucおよびヌクレオシドはホスホジエステル連結またはそのアナログによって結合され、この連結はNucの3’-位に結合している。Bがプリンまたは7-デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのN9-位に結合しており、そしてBがピリミジンである場合、糖部分はピリミジンのN1-位に結合している。BとDとを連結する連結は、R1-R6またはX1-X3のうちの１つの位置でDに結合する。好ましくは、BとDとを連結する連結は、X2またはX3のうちの１つの位置でDに結合する。特に好ましい実施態様において、結合は以下のものである：
Figure 0004140976
Bがプリンである場合、この連結はプリンの8-位に結合し、Bが7-デアザプリンである場合、この連結は7-デアザプリンの7-位に結合し、そしてBがピリミジンである場合、この連結はピリミジンの5-位に結合する。
第４の局面において、本発明はポリヌクレオチド配列決定の方法を包含し、このような方法は以下の工程を含む。第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成し、その結果、第１のクラスの各ポリヌクレオチドは3’-末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識され、第２のクラスの各ポリヌクレオチドは3’-末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２の色素で標識され、第３のクラスの各ポリヌクレオチドは3’-末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識され、第４のクラスの各ポリヌクレオチドは3’-末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４の色素で標識される。色素は、第１、第２、第３、または第４の色素のうちの１つは、本発明の4,7-ジクロロローダミン色素であり、他の色素は4,7-ジクロロローダミン色素および互いからスペクトル分解可能であるように選択される。ポリヌクレオチドを電気泳動上で分離し、それにより類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドを形成し、色素を蛍光放射させ得る照射ビームでバンドを照射し、そして色素の蛍光スペクトルによりバンド中のポリヌクレオチドのクラスを同定する。
本発明のこれらおよび他の局面、目的、特徴、ならびに利点は、以下の説明、図面、および添付の請求の範囲を参考にしてよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
図1Aおよび1Bは、本発明の数種の好ましい実施態様の色素の化合物の構造を示す。
図2Aおよび2Bは、本発明の色素標識化ジデオキシターミネーター（2A）および色素標識プライマー（2B）を用いた４色配列決定反応の電気泳動図を示す。
図3A〜3Hは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色C終結反応の電気泳動図を示す。
図4A〜4Gは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色T終結反応の電気泳動図を示す。
図5A〜5Iは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色A終結反応の電気泳動図を示す。
図6A〜6Hは、本発明の数種の異なるジデオキシターミネーターを用いた単色G終結反応の電気泳動図を示す。
図7Aおよび図7Bは、存在するローダミン化合物で標識されたオリゴヌクレオチド（7A）と、本発明の数種の好ましい4,7-ジクロロローダミンオリゴヌクレオチド化合物（7B）との蛍光発光スペクトルを比較したものである。
図8Aおよび図8Bは、本発明の色素化合物の調製のための好ましい合成を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の好ましい実施態様を、ここで、詳細に言及する。その例は、添付の図に示される。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないことが分かる。逆に、本発明は、添付の請求の範囲で規定した本発明の範囲内に含まれ得る代替、改良および等価物を含むことを意図している。
一般に、本発明は、蛍光色素として有用な新規なクラスの4,7-ジクロロローダミン化合物、このような色素を分子標識として使用する試薬、およびこのような色素および試薬を分析生物工学の領域で使用する方法を包含する。本発明の化合物は、多色蛍光DNA配列決定およびフラグメント解析の領域で、特に用途が見出されている。
本発明は、一部は、4,7-ジクロロローダミンの蛍光特性、および関連色素の発見をベースとする。それらの放射バンド幅は、4,7-ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、通常、２０〜３０％狭く、それらの放射、および最大吸収は、4,7-ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、通常、約１０〜３０ｎｍ高い波長に存在する。
Ｉ．定義
他に述べない場合、本明細書で使用する以下の用語および言い回しは、以下の意味を有することを意図する：
「連結基」（Ｌ）は、試薬に結合される「補足的官能基」と反応し得る（例えば、色素を試薬に連結する「結合」を形成する反応）官能基を言う。使用される特定の連結基は、補足的官能基の性質、および所望の結合のタイプに依存する。いくつかの場合、連結基は、補足的官能基との反応の前に、活性化されねばならない（例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステルを形成するカルボキシレート連結基の活性化）。好ましくは、補足官能基がアミンの場合常に、本発明の連結基、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒドまたはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、または他の活性カルボキシレートである。好ましくは、補足官能基が、スルフヒドリルの場合常に、連結基は、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤（例えば、フルオロベンゼン、など）である。補足官能基が、カルボキシレートの場合、連結基は、好ましくは、ジアゾアラン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、およびカルボジイミド（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）である。特に好ましい実施態様では、連結基は、アミン補足官能基と反応する活性化ＮＨＳエステルであり、活性化ＮＨＳエステルを形成する場合、カルボキシレート連結基を含む本発明の色素が、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応し、ＮＨＳエステルを形成する。以下の表１は、代表的な連結基のサンプルを、互換性のある補足官能基および得られる結合と共に示す。
Figure 0004140976
用語「低級アルキル」は、１〜８の炭素原子を含む直鎖および分岐の炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、など）を意味する。用語「プロパノ」は、特に、部分−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−を意味する。「低級置換アルキル」は、電子吸引性置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホ、など）を含む低級アルキルを意味する。「低級ハロアルキル」は、１つ以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）を有する低級置換アルキルを意味する。「低級アルケン」は、低級アルキルまたは低級置換アルキル（ここで、１つ以上の炭素−炭素結合が、二重結合である）を意味する。「低級アルキン」は、低級アルキル、または低級置換アルキル（ここで、１つ以上の炭素−炭素結合が、三重結合である）を意味する。「スルホネート」は、２つの酸素原子に二重結合し、そして１つの酸素原子に単結合した硫黄原子を含む部分（それらの一塩基塩、二塩基塩を含む（例えば、ナトリウムスルホホネート、カリウムスルホネート、ジナトリウムスルホネート、など））を意味する。「スルホン」は、２つの酸素原子に二重結合した硫黄原子を含む部分を意味する。「アミノ」は、２つの水素原子、低級アルキル部分、またはそれらの任意の組み合わせに結合した窒素原子を含む部分を意味する。「アミド」は、酸素原子に二重結合し、そしてアミノ部分に単結合した炭素原子を含む部分を意味する。「ニトリル」は、窒素原子に三重結合した炭素原子を含む部分を意味する。「低級アルコキシ」は、酸素原子に単結合した低級アルキルを含む部分を意味する。「アリール」は、単独の、または複数のフェニル、または置換フェニル（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、など）を意味する。
用語「ヌクレオシド」は、１’位でペントースと結合したプリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、など）からなる化合物（２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型（Ｓｔｒｙｅｒ）を含む）を意味する。本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、トリリン酸エステル）を意味し、ここで、エステル化の最も一般的な位置は、ペントースのＣ−５位に結合したヒドロキシル基である。本発明の開示中の多くの場合、用語ヌクレオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含むことを意図する。ヌクレオシドに関する「アナログ」は、修飾された塩基部分、修飾された糖部分、および／または修飾されたリン酸エステル部分（例えば、（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）に記載）を含む合成アナログを含む。用語「標識化ヌクレオシド」は、式Ｉの色素化合物を共有結合したヌクレオシドを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、２本および１本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形、などを含む天然のヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログの直線状ポリマーを意味する。通常、ヌクレオシドモノマーは、リン酸ジエステル結合によって結合され、ここで、本明細書中で使用される場合、用語「リン酸ジエステル結合」は、リン酸ジエステル結合、またはそれらのアナログ（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、などを含む（対イオンが存在する場合、結合対イオン（例えば、Ｈ、ＮＨ4、Ｎａなど）を含む））を意味する。ポリヌクレオチドは、代表的には、大きさの種類においては、数モノマー単位から、例えば８〜４０、数千モノマー単位までの範囲である。ポリヌクレオチドが、文字の配列（例えば、”ＡＴＧＣＣＴＧ”）によって表される場合常に、ヌクレオチドは、５’〜＞３’順序で、左から右へであり、他の方法で示され無ければ、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、および「Ｔ」はチミジンを意味することが理解される。
本明細書で使用される場合、色素のセットに関する用語「スペクトル分解」は、色素の蛍光放射スペクトルが、十分に分かれ（すなわち、十分に重なっていない）、通常の光検出系（例えば、バンドパスフィルター（ｂａｎｄ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）および光マルチプライヤー管（ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）の系、スペクトログラフ（ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ）と組み合わせた荷電対（ｃｈａｒｇｅｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ）デバイス、など（（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）に記載の系によって例示される））を用いて、それぞれの色素に結合している試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、それぞれの色素によって生じる蛍光シグナルのベースによって区別され得ることを意味する。
ＩＩ．4,7-ジクロロローダミン色素化合物
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラスの4,7-ジクロロローダミン色素化合物を包含する。（本明細書中で提供した全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン付加状態を含むことを意図していることに注意のこと）。
Figure 0004140976
式Ｉにおいて、Ｒ1からＲ6は、別々に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わせである。あるいは、Ｒ1およびＲ6は、一緒になって、ベンゾであり、および／または、Ｒ4およびＲ5は、ベンゾである。好ましい実施態様では、Ｒ1からＲ6は、別々に、水素、メチル、またはエチルである。より好ましくは、Ｒ1からＲ6は、別々に、水素、またはメチルである。
Ｙ1からＹ4は、別々に、水素、および低級アルキルからなる群から選択される。あるいは、Ｙ1は、Ｒ2と一緒になってプロパノであり、およびＹ2は、Ｒ1と一緒になって、プロパノであり、および／または、Ｙ3は、Ｒ3と一緒になってプロパノであり、およびＹ4は、Ｒ4と一緒になって、プロパノである。好ましくは、Ｙ1からＹ4は、別々に、水素、メチル、またはエチルである。
Ｘ1〜Ｘ3は、別々に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸、−ＣＨ2ＯＨ、または連結基である。好ましくは、Ｘ1は、カルボキシレートである。好ましい実施態様では、Ｘ2またはＸ3の１つは、連結基である。
本発明の１つの特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲ１１０として示す）では、Ｒ1〜Ｒ6は、別々に、水素であり、Ｙ1〜Ｙ4は、別々に、水素であり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の１つは、連結基（Ｌ）であり、その他は、水素である。ＤＲ１１０の構造を以下に式ＩＩとして示す。
Figure 0004140976
本発明の第２の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲ６Ｇとして示す）では、Ｒ1およびＲ4は、別々に、メチルであり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5およびＲ6は、水素であり、Ｙ1およびＹ2の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｙ3およびＹ4の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。ＤＲ６Ｇの構造を以下に式ＩＩＩとして示す。
Figure 0004140976
本発明の第３の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＴＭＲとして示す）では、Ｒ1〜Ｒ6は、別々に、水素であり、Ｙ1〜Ｙ4は、別々に、メチルであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。ＤＴＭＲの構造を以下に式ＩＶとして示す。
Figure 0004140976
本発明の第４の特に好ましい化合物（本明細書では、ＤＲＯＸとして示す）では、Ｒ1およびＹ2は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ2およびＹ1は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ3およびＹ3は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ4およびＹ4は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ5およびＲ6は、水素であり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。ＤＲＯＸの構造を以下に式Ｖとして示す。
Figure 0004140976
本発明の色素化合物のいくつかの追加の特に好ましい実施態様を、図１Ａおよび１Ｂに示す。化合物１ａにおいて、Ｒ1は、メチルであり、Ｒ2〜Ｒ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｙ3およびＹ4は、別々に、水素であり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｂにおいて、Ｒ1は、メチルであり、Ｒ2〜Ｒ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｙ3およびＹ4は、別々に、メチルであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｃにおいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2は、別々に、メチルであり、Ｒ3およびＹ3は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ4およびＹ4は、一緒になって、プロパノであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｄにおいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2は、別々に、水素であり、Ｒ3およびＹ3は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ4およびＹ4は、一緒になって、プロパノであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｅにおいて、Ｒ1は、メチルであり、Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2の一方はエチルであり、他方は、水素であり、Ｒ3およびＹ3は、一緒になって、プロパノであり、Ｒ4およびＹ4は、一緒になって、プロパノであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。化合物１ｆにおいて、Ｒ1〜Ｒ6は、別々に、水素であり、Ｙ1およびＹ2は、別々に、水素であり、Ｙ3およびＹ4は、別々に、メチルであり、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3の一方は、連結基であり、他方は、水素である。
図８Ａおよび８Ｂは、本発明の4,7-ジクロロローダミン色素の調製のための好ましい一般化された合成スキームを示す。各図において示される変換可能な置換基は、上記で定義されたものである。
図８Ａは、置換基Ｘ1がカルボキシレートより他のものであり得る一般化された合成スキームを示す。図において、Ｘ’は、Ｘ1の前駆体である部分を示す。図８Ａの方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体８ａ／８ｂ（例えば、３−ジメチルアミノフェノール）が、１当量のジクロロベンゼン誘導体８ｃ（例えば、４−カルボキシ−３，６，ジクロロ−２−スルホ安息香酸環式無水物（すなわち、ここで、８ｃのＸ1’部分は、一緒になって以下である））と反応する。
Figure 0004140976
次いで、反応物を、１２時間、強酸（例えば、ポリリン酸、または硫酸）中で、１８０℃で加熱する。粗色素８ｄを、水の添加によって沈澱し、遠心分離によって単離する。対称体の生成物を形成するために、反応物８ａおよび８ｂの置換基は、同じであり、一方、非対称体の生成物を形成するために、置換基は、異なる。
図８Ｂは、置換基Ｘ1がカルボキシレートである一般化された合成を示す。図８Ｂの方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体８ａ／８ｂ（例えば、３−ジメチルアミノフェノール）が、１当量のフタル酸無水物誘導体８ｅ（例えば、３，６−ジクロロトリメリット酸無水物と反応する。次いで、反応物を、１２時間、強酸（例えば、ポリリン酸、または硫酸）中で、１８０℃で加熱する。粗色素８ｄを、水の添加によって沈澱し、遠心分離によって単離する。対称体の生成物を形成するために、反応物８ａおよび８ｂの置換基は、同じであり、一方、非対称体の生成物を形成するために、置換基は、異なる。
ＩＩＩ．4,7-ジクロロローダミン色素化合物を利用する試薬
他の局面では、本発明は、式Ｉの4,7-ジクロロローダミン色素化合物で標識した試薬を包含する。本発明の試薬は、事実上、本発明の色素が結合できるいずれのものでもよい。好ましくは、この色素は、この試薬に直接または結合を介して共有結合される。試薬には、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機重合体、およびそれらの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌、他の微生物、哺乳類細胞、組織糖タンパク）など）が挙げられる。
Ａ．ヌクレオチド試薬
本発明の好ましい種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン色素を含有するヌクレオチドおよびヌクレオシドを包含する。このようなヌクレオチド／ヌクレオシド試薬は、酵素合成により形成した標識ポリヌクレオチド（例えば、PCR増幅、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニック翻訳反応の文脈で使用されるヌクレオチド三リン酸）の文脈で、特に有用である。
本発明の好ましいヌクレオチド／ヌクレオシドは、式ＶＩで以下に示されており、
Figure 0004140976
ここで、Bは、ヌクレオシド塩基（例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン）である。W1およびW2は、別個に、H、OH、または−ＯＣＨ３である。W3は、OH、−ＰＯ4、−Ｐ2Ｏ7、−Ｐ3Ｏ10またはそれらのアナログ（例えば、リン酸チオエート、リン酸アニリデート、リン酸アロニチオエート、リン酸アミジエートおよび他の類似のリン酸アナログ）であり、これには、もし存在するなら、会合対イオン（例えば、H、Na、NH4など）が含まれる。Dは、式Ｉの色素化合物である。
Bがプリンまたは7-デアザプリンのとき、その糖部分は、プリンまたはデアザプリンのN9-位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、ピリミジンのN1-位にて結合している。
BおよびDを連結している結合は、R1〜R6またはＸ1〜Ｘ3位の１つで、Dに結合している。好ましくは、この結合は、Ｘ2またはＸ3の１つには結合している。
好ましくは、Bがプリンのとき、BおよびDを結合している結合は、プリンの8-位に結合しており、Bが7-デアザプリンのとき、結合は、7-デアザプリンの7-位に結合しており、Bがピリミジンのとき、結合は、ピリミジンの5-位にて結合している。
１つの特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下に式ＶＩＩで示す構造を有するジデオキシヌクレオチドトリリン酸エステル（存在する場合、会合した対イオンを含む）である。
Figure 0004140976
式ＶＩＩに示したもののような標識ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型DNA配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）において、鎖停止剤すなわち「ターミネーター」として、特定の用途が見出されている。
第二の特に好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＶＩＩＩに示した構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。
Figure 0004140976
式ＶＩＩＩに示したもののような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ）において、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手段として、特定の用途が見出されている。
ヌクレオチド／ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結基および関連する相補官能性を用いて、非常に多くの公知の連結基および関連する相補官能基を用いた公知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識化技術のいずれかを使用して、達成でき、好ましい連結基の説明について上記参照。この色素およびヌクレオシドを結合する結合は、（i）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、（ii）適切な酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であり、そして（iii）この色素の蛍光を消失させてはならない。
１つの好ましい実施態様では、本発明の色素は、ピリミジン塩基の5-炭素または7-デアザプリン塩基の7-炭素に共有結合される。本発明で使用できる数個の適当な塩基標識化操作が報告されている（Ｇｉｂｓｏｎ；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｌｉｓ；Ｎｅｌｓｏｎ １９９２；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｎ；Ｆｕｎｇ １９９８；Ｗａｒｄ；Ｗｏｏ．）。
好ましくは、この結合は、アセチレン性アミド結合またはアルケン性アミド結合であり、この色素とヌクレオチド塩基との間の結合は、この色素の活性化N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルと、ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成される。より好ましくは、得られた結合は、3-（カルボキシ）アミノ-1-プロピニルまたは3-アミノ-1-プロピン-1-イルである（式IＸ．１）。本発明の色素をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい結合は、式ＩＸ．１、式ＩＸ．２および式ＩＸ．３にて、以下に示す。
Figure 0004140976
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、（Hobbs １９８９，１９９２）によって記載され、要約すると、このアルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、5-ヨードピリミジンおよび7-ヨード-7-デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびCu（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンをフラッシュして空気を取り除き、無水DMFを添加し、続いて、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびPd（0）を添加することにより、形成される。この反応混合物は、数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌し得る。未保護のアルキニルアミンを使用するとき、このアルキニルアミノヌクレオシドは、この反応混合物を濃縮し、そして水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、カップリング反応で生成したヒドロハライドを中和することにより、単離できる。保護アルキニルアミンを使用するとき、この反応混合物には、メタノール/塩化メチレンを添加し得、続いて、重炭酸塩形態の強塩基性アニオン交換樹脂を添加し得る。次いで、このスラリーは、約45分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、追加のメタノール/塩化メチレンで洗浄し得る。合わせた濾液は濃縮し得、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。トリホスフェートは、標準的な方法により得られる。
Ｂ．ポリヌクレオチド試薬
本発明のさらに他の好ましい種類の試薬には、本発明の4,7-ジクロロローダミン色素で標識したポリヌクレオチドが包含される。このような標識ポリヌクレオチドは、DNA配列決定プライマー、PCＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非常に多くの状況で、有用である。
本発明のポリヌクレオチドには、次式を有するヌクレオチドが挙げられる：
Figure 0004140976
ここで、Bは、7-デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基である。Z1は、H、OH、−ＯＣＨ3である。Z2は、ＯＨ、−ＰＯ4、−Ｐ2Ｏ7、−Ｐ3Ｏ10またはそれらのアナログ（例えば、リン酸チオエート、リン酸アニリデート、リン酸アニロチオエート、リン酸アミデートおよび他の類似のリン酸アナログ（存在するならば、結合対イオン、例えばＨ、Ｎａ、ＮＨ4など）またはＮｕｃであり、ここで、Nucは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。式ＸのヌクレオシドおよびNucは、ホスホジエステル結合またはそれらのアナログにより連結され、この結合は、好ましくは、Nucの5’-位に結合している。Z3は、H、HPO3またはそれらのアナログまたはNucであり、ここで、Nucおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合またはそれらのアナログにより連結されており、この結合は、Nucの3’-位に結合している。そしてDは、式Ｉの色素化合物である。塩基Bは、本発明のヌクレオチド試薬について記述のようにして、この糖部分および色素化合物に結合される。ここで定義されるように、式Ｘの標識ヌクレオチドは、5’-末端ヌクレオチド、3’-末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドのいずれかの内部ヌクレオチドであり得る。
好ましい１つの実施態様では、本発明の標識ポリヌクレオチドには、供与体色素と受容体色素との間で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複数の色素（本発明の色素化合物である少なくと１つ）が挙げられる。このような複数色素ポリヌクレオチドは、分光調整可能なプローブまたはＤＮＡ配列決定プライマー（Ｊｕ；Ｌｅｅ）として用途が見出されている。
標識ポリヌクレオチドは、例えば、DNAポリメラーゼまたはリガーゼ（Ｓｔｒｙｅｒ）を用いて、酵素的に合成するか、または例えば、ホスホルアミダイト法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成によるか（Gait）のいずれかにより、合成できる。標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して、酵素合成中に導入してもよく、または合成に引き続いて導入してもよい。
一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵素合成により製造されるなら、以下の操作が使用できる。テンプレートDNAが変性され、このテンプレートDNAに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールされる。この反応系に、デオキシヌクレオチド三リン酸および／またはジデオキシヌクレオチド三リン酸（dGTP、dATP、dCTP、dTTP、ddTTP、ddGTP、ddATP、ddCTPおよびddTTPを含めて）が添加され、この場合、このデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの１個の少なくとも断片は、上記の本発明の色素化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下にて、ポリメラーゼ酵素が添加される。ポリメラーゼ鎖合成中に、この標識デオキシヌクレオチドおよび／またはジオキシヌクレオチドの混入により、標識ポリヌクレオチドが形成される。別の酵素的合成法では、１個のプライマーの代わりに２個のプライマーが使用され、１個のプライマーは、この標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、他は、この標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、このポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、その反応温度は、変性温度と延長温度の間で反復され、それにより、PCR（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｉｎｎｉｓ）によって、標識成分が標的配列へと急激に合成される。
合成に引き続いて、このポリヌクレオチドは、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、5’-末端（Eckstein；Orgel；Smith）；ホスホジエステル骨格（Eckstein）；3’-末端（Nelson 1992a；Nelson 1992b；Nelson 1995）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識化操作の総説については、（Steiner）を参照のこと。
１つの好ましい合成後化学標識化法では、オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化される。カルボキシ連結基を含む色素は、無水酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量のN-ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、NHSエステルに転化される。この反応混合物は、５％HClで洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、この固形物は、DMSOに再懸濁される。このDMSO色素ストックは、次いで、過剰で（10〜20倍）、pH9.4にて、0.25M重炭酸塩/炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加され、そして６時間反応される（Fung 1998）。この色素標識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例えば、0.1Mトリエチルアミン酢酸塩（TEAA））で溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、未反応色素から分離される。この粗標識オリゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶離液を使用する逆相HPLCにより、さらに精製される。
IV．本発明の化合物および試薬を使用する方法
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を使用するいずれかの方法（特に、複数の空間的に重複した分析物の同時検出を必要とする方法）によく適合する。本発明の色素および試薬は、生化学分離操作（例えば、電気泳動）を受けるポリヌクレオチドの種類を同定するのに、特によく適合し、この場合、類似の物理化学的特性（例えば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性など）を有する標的物質のバンドまたはスポットが、線状または平面状の配列において存在する。本明細書中で使用する用語「バンド」は、類似のまたは同一の物理化学的な特性を基準にして、いずれかの空間的な配置または集塊を含む。通常、バンドは、色素−ポリヌクレオチド複合体の電気泳動による分離において、生じる。
ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況において生じ得る。「フラグメント解析」法または「遺伝解析」法と称する好ましいカテゴリーの方法では、標識プライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定方向酵素的合成（例えば、結合またはポリメラーゼ定方向プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオチド断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供される。分離した断片は、この分離に引き続いて、例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特に好ましい実施態様では、複数の種類のポリヌクレオチドが同時に分離され、異なる種類のものは、分光学的に分析可能な標識により、識別される。
このようなフラグメント解析の１方法は、増幅断片長多型検出（AmpFLP）として知られているが、PCRにより増幅した増幅断片長の多型現象（すなわち、制限断片長の多型現象）に基づいている（Vos）。種々のサイズのこれらの増幅断片は、系統による次の突然変異遺伝子のための連鎖マーカーとして役立つ。増幅断片が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合の相関が高くなる。多く遺伝的疾患に対する遺伝子は、同定されていないので、これらの結合マーカーは、疾患のリスクまたは起源を評価するのに役立つ。このAmpFLP方法では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌクレオチドPCRプライマーを用いることにより、またはPCR中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用することにより、標識できる。
他の代表的なフラグメント解析法は、可変数のタンデム繰り返し、すなわち、VNTRを基準にしている（Webber；Caskey）。VNTRは、特定の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖DNAの領域であり、繰り返し単位の数は、可変である。VNTR遺伝子座の例には、pYNZ22、pMCT118およびApo Bがある。VNTR法のサブセットには、微小サテライト繰り返しまたは短タンデム繰り返し（STR）、すなわち、短い（２個〜４個の塩基）繰り返し配列により特徴付けられるDNAのタンデム繰り返しの検出を基準にしている。ヒトにて最も豊富に点在した繰り返しDNAファミリーの１つには、（dC-dA）n-（dG-dT）nジヌクレオチド繰り返しファミリー（これはまた、（CA）nジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトのゲノムには、50,000個〜100,000個程度の（CA）n繰り返し領域があると考えられ、典型的には、１ブロックあたり、15個〜30個の繰り返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが多様であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましくは、VNTR法またはSTR法では、色素標識PCRプライマーを用いることにより、ポリヌクレオチド断片に標識が導入される。
特に好ましいフラグメント解析法では、本発明に従って同定された種類のものは、４個の可能な末端塩基と分光学的に分析可能な色素のセットのメンバーとの間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドによって規定される（Fung 1989）。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および吸収バンド幅を測定することにより、本発明の色素から容易に組み立てられる。さらに好ましくは、DNA配列決定の化学的方法または鎖停止法の状況にて、階級が生じ、最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオキシDNA配列決定すなわちサンガー配列決定の状況において、階級が生じる。この方法は、配列が決定されるべき一本鎖または二本鎖DNAテンプレートを用いた、インビボでのDNAポリメラーゼによるDNA合成を包含する。合成は、このテンプレートにオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする１個の部位だけで、開始される。この合成反応は、連続DNA伸長を支持しないヌクレオチド類似物の含入により、停止される。この鎖停止ヌクレオチド類似物には、2’,3’-ジデオキシヌクレオシド5’-三リン酸（ddNTP）があり、これは、3’から5’へのDNA鎖の伸長に必要な3’-OH基がない。適切な割合のdNTP（2’-デオキシヌクレオシド5’-三リン酸）および４個のddNTPの１個を使用すると、酵素触媒した重合は、このddNTPが含入できる各部位で、鎖集団の断片において、停止される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ddNTPを使用するなら、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、蛍光により検出できる。
上記の各々のフラグメント解析法において、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動操作により、分離される（RickwoodおよびHames；Osterman）。好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜20重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋または非架橋ポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、DNA配列決定の状況では、特に、この電気泳動マトリックスは、鎖分離または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含有する。このようなマトリックスを構築する詳細な手順は、（Maniatis 1980；Maniatis 1975；ABI PRISMTM377 DNA Sequencer User’s Manual）に与えられる。特定の分離において使用される最適なポリマー濃度、pH、温度、変性剤の濃度などは、多くの要因に依存し、これらには、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究される分類の性質が含まれる。従って、本発明の適用には、特定の分離のための条件を最適化するためには標準予備試験が要求され得る。
電気泳動分離に引き続いて、色素−ポリヌクレオチド複合体は、この色素標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することにより検出される。このような検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段は、488nmと550nmの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。さらに好ましくは、この色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特に、488nmおよび514nmの発光系列のアルゴンイオンレーザー）、または532nmの発光系列のネオジム固相YAGレーザーにより発生したレーザー光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザーが市販されており、これらは、これらの系列で、同時にレーザーとして使える（例えば、Cyonics、Ltd.（Sunnyvale、Calif.）のModel 2001など）。次いで、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電結合素子など）により、その蛍光が検出される。
IV．実施例
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの実施例は、単に、本発明の例示であることを意図し、いずれの点でも、本発明の範囲を限定しない。
他に指示がなければ、全ての試薬は、Aldrich Chemical Co.（Milwaukee、WI）から購入した。3,6-ジクロロトリメリト酸無水物を（Khanna）に記載のように調製した。
実施例１
DR110（式II）の調製
Figure 0004140976
3-アミノフェノール（0.25g、2.3mmol）、3,6-ジクロロトリメリト酸無水物（0.33g、1.3mmol）および硫酸（1mL）の混合物を配合して、そして12時間190℃まで加熱した。水（10mL）を反応液に加え、そして、得られた黒固形物は濾過により分離した。次いで、固形物を、アセトニトリル（10mL）で抽出した。得られたオレンジ色の溶液は乾燥状態に濃縮し、そして、残基は炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（250mM、pH9、10mL）に溶解した。溶液を、濃HClで酸性化し、赤い沈澱物を遠心分離によって集め、そして減圧遠心分離器において乾燥した。赤い固形物を、得た（32mg、5％収率）。DR110生成物の溶液の吸光度極大は、40％アセトニトリル/トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中で、516nmであった。
実施例２
DTMR（式IV）の調製
Figure 0004140976
3-ジメチルアミノフェノール（3.6mmol、0.5g）（3,6-ジクロロメリト酸無水物（500mg、1.9mmol）、およびポリリン酸（PPA）（5g）の混合物を配合し、12時間180℃まで加熱した。水（20mL）を赤褐色の反応物に加え、混合物を濾過して、そして5% HClで洗浄した。暗い固形物を、得た（79mg、0.15mmol、８％収率）。DTMR生成物の溶液の吸光度極大は、40%アセトニトリル/トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液中で、570nmであった。
実施例３
DROX（式V）の調製
Figure 0004140976
8-ヒドロキシユロリジン（140mg、0.73mmol）、3,6-ジクロロトリメリト酸無水物（0.38mmol、100mg）およびポリリン酸（1g）の混合物を配合して、そして16時間180℃まで加熱した。水（10mL）を添加し、そして溶液を濾過した。固形物を水性HClで洗浄し、そして乾燥させて87mgの紫の固形物（0.14mmol、37％）を得た。
実施例４
DR6G（式III）の調製
Figure 0004140976
3-アミノメチル-p-クレゾール（0.66mmol、100mg）、3,6-ジクロロトリメリト酸無水物（0.38mmol、100mg）およびポリリン酸（0.5g）の混合物を配合して、12時間、180℃まで加熱した。水（10mL）を赤褐色の反応物に添加し、そして混合物を濾過した。固形物を、1M炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（pH9、25mL）に入れ、そして濾過した。濾液を、濃HClで酸性化し、そして固形物を遠心分離によって収集し、そして乾燥させた。固形物はアセトニトリル（10mL）で抽出し、そして抽出物を粘着性の固形物に濃縮した。固形物を、ジメチルホルムアミド（0.6mL）に溶解した。収率を、アリコートを40%アセトニトリル/トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液に希釈すること、およびUV／可視光分光光度計で吸光度を測定することにより推定した。50,000cm-1M-1の吸光係数を使用して、吸光極大は540nmであり、そして収率は９％であることが見い出された。
実施例５
DR6GのNHSエステルの調製
Figure 0004140976
ジメチルホルムアミド中のDR6G（0.1mL中に６μmol）の溶液を、N-ヒドロキシスクシンイミド（22mg、0.2mmol）および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（12mg、0.06mmol）と混合した。反応の進行を、ジクロロメタン、メタノールおよび酢酸（600：60：16）の混合物を溶離液として使用して、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィによって、モニターした。出発物質が消費された後、反応物をジクロロメタン（10mL）で希釈して、５％HCI（10mL）で洗浄した。両方の相に不溶であった物質を捨てた。有機相を、250mM炭酸塩/重炭酸塩（10mL）および5% HCI（10mL）で連続的に洗浄した。溶液を乾燥し（MgSO4）、そして暗色の油に濃縮した。残留物を、ジメチルホルムアミド（0.2mL）中に入れて、そして-20℃で保存した。
−20℃での３日間の後、金色の反射する結晶がジメチルホルムアミド溶液中で形成した。上清をデカントし、そして捨てた。残留物を、メチルスルホキシド（0.1mL）中に、溶解した。アリコートを、40%アセトニトリル/トリエチルアンモニウムアセテート緩衝液に希釈した。50.000cm-1M-1の吸光係数を使用して、吸光度極大が548nmであり、そして収率が７％であることが見い出された。
実施例６
DR6G標識したジデオキシアデノシン三リン酸の調製
Figure 0004140976
ddATP-NH2（５μL、20mM、0.1μmol）（Hobbs 1989、1992）、DR6G-NHS（0.15μmol）および250mM炭酸塩/重炭酸塩緩衝液、pH9（５μL）の溶液を混合した。室温での10分間の後、溶液を陰イオン交換カラムを有するHPLCに供し、そして40％アセトニトリル/60% 0.1Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩から40%アセトニトリル/60% 1.5Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩への勾配で溶出し遊離色素を除去した。色素標識ヌクレオチドおよび標識されていないヌクレオチドを含有する画分を減圧遠心分離器で濃縮し、そして逆相カラムを使用して第２のHPLCに供した。標識されていないヌクレオチドおよび色素標識ヌクレオチドの各色素異性体を15％アセトニトリル/85% 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートから35%アセトニトリル/65% 0.ｌMトリエチルアンモニウムアセテートへの溶出勾配を使用して分離した。色素標識ヌクレオチドの含有溶液を、減圧遠心分離器で濃縮し、そして10mM炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（pH9）に再溶解し、そしてUV／可視光分光光度計において溶液の吸光度を測定することによって、定量した。収率は、およそ１％であった。
実施例７
色素標識オリゴヌクレオチドの調製
5’-アミノヘキシル官能化オリゴヌクレオチドの色素標識オリゴヌクレオチドの溶液、（10μL、1mM）およびDR6G-NHS（10μL、メチルスルホキシド12mM中）および炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（2μL、1M）を混合した。アミノヘキシル誘導体化プライマーを、合成の最終サイクルにおいてAminolink-2を使用して自動化固相DNA合成（PE Applied Biosystems p/n 400808）により調製した。室温での10分間の後、溶液をSephadex G-25上のゲル濾過に供し遊離色素を分離した。色素標識オリゴヌクレオチドおよび標識されていないオリゴヌクレオチドを含有する画分を収集し、そして逆相カラム上のHPLC精製に供した。標識されていないオリゴヌクレオチドおよび色素標識したオリゴヌクレオチドの各色素アイソマーを、10％アセトニトリル/85% 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートから30%アセトニトリル/65% 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートへの溶出勾配を使用して分離した。色素標識オリゴヌクレオチド含有溶液を、減圧遠心機で濃縮し、そして10mM Tris、１mM EDTA、pH7.0（TE）含有緩衝液に再溶解した。
実施例８
本発明の4,7-ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネーターを利用した単色配列決定反応
色素ターミネーター反応を、ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Core Kit Manual（PE Applied Biosystems p/n 402116）の基本プロトコルに従って、AmpliTaq▲Ｒ▼DNAポリメラーゼ、FSで行った。（FS酵素は、二つの点変異（G46DおよびF667Y）を有する組換えthermus aquaticus DNAポリメラーゼである）。dNTP混合物および色素ターミネーター以外の全ての試薬は、ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Core Kit（PE Applied Biosystems p/n 402117）由来であった。反応成分のプレミックスは、以下のように調製した。容積は、毎反応（per reaction）ベースである：
５×緩衝液 ４μL
dNTP混合物 １μL
テンプレート：pGEM▲Ｒ▼-3Zf（+）、0.2μg/μL ５μL
プライマー：-21 M13（正方向）、0.8pmol/μL ２μL
AmpliTaq DNAポリメラーゼ、FS 0.5μL
水 2.5μL
反応物を、Perkin-Elmer 480 DNA Thermal Cycler（PE Applied Biosystems p/n N801-100）用の0.5mlチューブに準備した。全反応容積は、15μLの上記の反応プレミックス、適切な量の色素標識ターミネーター、および水を含む20μLであった。単色色素ターミネーター反応を、AおよびGターミネーターについては1pモルの色素ターミネーター、あるいはCおよびTターミネーターについては15pモルで準備した。少数の場合において、CまたはTについての色素ターミネーターは濃度が低すぎたため、５μLが15pモル未満の色素ターミネーターを生じた。これらの場合には、５μLの色素ターミネーターを使用して、水は反応物に添加しなかった。30μLのミネラルオイルを各反応物の容量の上部に添加し、熱サイクルの間の蒸発を低減させた。
反応は、以下のように熱サイクルさせた：
96℃ 30秒
50℃ 15秒
60℃ ４分 を25サイクル
続いてサイクルを４℃に保った。
全ての反応物をCentri-Sepスピンカラム（Princeton Separation, Adelphia, NJ, p/n CS-901）上でスピンカラム精製により精製した。カラム中のゲル材料を0.8mlの脱イオン水で室温で少なくとも30分間水和させた。カラムを水和し、そしてゲル材料中に泡が混入されていないことが明らかになった後、上側のキャップ次いで下側のキャップを除去した。カラムを重力により排水させた。次いで、カラムをCenti-Sepキットに提供される洗浄チューブ中に挿入し、そして可変速度微小遠心分離器（Eppendorf Model 5415）中で1300×gで２分間遠心分離した。カラムを洗浄チューブから取り出し、そしてサンプル回収チューブへ挿入した。反応混合物を油の下からガラスピペットを使用して慎重に取り出し、そしてCentri-Sepカラムの上に充填した。カラムを可変速度微小遠心分離器（Eppendorf Model 5415）中で1300×gで２分間遠心分離した。サンプルを減圧遠心分離器中で乾燥させた。
乾燥させたサンプルを25μLのTemplate Suppression Reagent（PE Applied Biosystems p/n 401674）に再懸濁し、ボルテックスし、95℃で２分間加熱し、氷上で冷却し、再度ボルテックスし、そして遠心分離（13,000×g）した。10μLの精製サンプルを、PE ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems p/n 310-00-100/120）での使用に適したサンプルバイアル（PE Applied Biosystems p/n 401957）にアリコートした。Model 310上での電気泳動には、50cmの検出器に対する長さを有する、長さ61cm、50μmID非被膜融合シリカキャピラリー（PE Applied Biosystems p/n 402840）を使用した。キャピラリーを直線状のジメチルポリアクリルアミド（DMA）篩ポリマー（Madabhushi）、緩衝液、および核酸変性剤（PE Applied Biosystems p/n 402837）を含有する溶液で満たした。サンプルを、2.5kVで30秒間、電気運動的に注入した。電気泳動をキャピラリー温度を42℃に維持しながら12.2kVで２時間実施した。
図3A〜3Hは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用した単色Ｃ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｃ末端ジデオキシヌクレオチドターミネーターに付着した。pGEM-3Zf（+）の塩基12〜82を各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の色素標識を、以下の表に示す：
Figure 0004140976
（「１」および「２」という名称は、使用する特定の色素アイソマーを示す。１アイソマーおよび２アイソマーは、C-8カラムおよび15％アセトニトリル／85％ 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートから35％アセトニトリル／65％ 0.1Mトリエチルアンモニウムアセテートへの溶出勾配を利用する逆相分離系における遊離色素の溶出順序によって規定する。）
図4A〜4Gは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用する単色Ｔ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｔ末端ジデオキシヌクレオチドターミネーターに付着した。pGEM-3Zf（+）の塩基７〜84を各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に示す：
Figure 0004140976
図5A〜5Iは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用する単色Ａ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ａ末端ジデオキシヌクレオチドターミネーターに付着した。PGEM-3Zf（+）の塩基94〜167を各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に示す：
Figure 0004140976
図6A〜6Hは、本発明のいくつかの異なるジデオキシターミネーターを使用した単色Ｇ停止反応の電気泳動図を示す。標識を、Ｇ末端ジデオキシヌクレオチドターミネーターに付着した。PGEM-3Zf（+）の塩基185〜252を各電気泳動図に示す。各電気泳動図において使用した特定の標識を、以下の表に示す：
Figure 0004140976
以上のデータは、本発明の色素標識したジデオキシターミネーターが、蛍光に基づくサンガー型のDNA配列決定における使用に適していることを示す。
実施例９
本発明の4,7ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネーターを利用する４色配列決定反応
４色のDNA配列決定反応液を調製し、そして実質的に実施例８に記載のように分析した。
図2Aは、４色の配列決定反応の電気泳動図を示す。ここでは、４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターを以下のように標識した：ddGはDR110色素で、ddAはDR6G-2色素で、ddCはDTMR-1色素で、およびddTはDROX-1色素で。図は、PGEM▲Ｒ▼テンプレートの塩基196〜238を示す。
実施例10
本発明の4,7ジクロロローダミンオリゴヌクレオチドプライマーを利用する４色配列決定反応
色素プライマー反応を、ABI PRISMTMDye Primer Cycle Sequencing Core Kit Manual（PE Applied Biosystems, p/n 402114）に総括的に記載されるようにAmpliTaq▲Ｒ▼DNAポリメラーゼ、FSを使用して実施した。プライマーおよびテンプレート以外の全ての試薬は、ABI PRISMTMDye Primer Cycle Sequencing Core Kit（PE Applied Biosystems, p/n 402125）由来であった。色素標識した-21 M13プライマーを、0.4pモル／μLの濃度で溶解した。プライマーを以下のように標識した：Ｃ反応はDR110で、Ａ反応はDR6Gで、Ｇ反応はDTMRで、およびＴ反応はDROXで。反応成分のプレミックスを以下のように４つの各塩基反応用に調製した：
Figure 0004140976
M13mp18配列決定テンプレートを、0.05μg/μLの濃度で溶解した。
配列決定反応を、以下のように、0.2mlの薄壁Gene Amp9600 DNAサーマルサイクラーチューブ（PE Applied Biosystems, p/n N801-0540）中に準備した。
Figure 0004140976
反応は、以下の温度プロフィールを使用してサイクルさせた：
96℃ 10秒；
55℃ ５秒
70℃ １分間 を15サイクル
続いて、
96℃ 10秒
70℃ １分間 を15サイクル
に続いて４℃での保持サイクル。
４つの反応液を80μLの95％エタノール中で混合し、氷上で10分間放置し、そして微小遠心分離器中で最高速で15分間遠心分離した。エタノール上清を除去し、そしてペレットを減圧遠心分離器中で乾燥させた。
ペレットを６μL充填緩衝液中に再懸濁し、そしてABI PRISMTMMoel 377 DNA Sequencer（PE Applied Biosystems p/n 377-01-200/208）上で、標準フィルターセットＡまたは長波長セッティングを有する改変フィルターセットのいずれか使用して、分析した。図2Bは、塩基50〜塩基93までの得られたデータのサンプリングを示す。
実施例11
伝統的なローダミンおよび本発明の4,7,-ジクロロローダミンの蛍光発光スペクトルの比較
伝統的なローダミンで標識したオリゴヌクレオチドについての発光スペクトルを本発明の4,7,-ジクロロローダミンで標識したオリゴヌクレオチドについての蛍光発光スペクトルと比較した。各標識オリゴヌクレオチドの濃度は、TE緩衝液中で0.4μMであった。ローダミン色素の励起は、488nmであり、そして4,7-ジクロロローダミン色素の励起は500nmであった。スペクトルを、発光極大に対して標準化した。測定は、Perkin-Elmer LS-50機器を使用して行った。
図7Aは、４つの公知のローダミン色素5-R110、5-R6G、6-TMR、および6-ROX（Bergot）の発光スペクトルを示す。図7Bは、本発明の４つの好ましい4,7-ジクロロローダミン色素、DR110、DR6G-2、DTMR-2、およびDROX-2の発光スペクトルを示す。4,7-ジクロロローダミン色素についてのこの減少した発光スペクトル幅は、多数の空間的に重複する種が検出されるべきである場合に要求される多成分分析技術を実施するための能力の増加をもたらす。
全ての刊行物および特許出願は、本明細書中で、各個々の刊行物または特許出願が、特異的かつ別々に参照として援用されるように示されているのと同程度に参考として援用される。
以上に少しの実施態様のみが詳細に記載されているが、有機化学の当業者は、多くの改変が本発明の開示から逸脱することなく、好ましい実施態様において可能であることを明白に理解する。全てのこのような改変は、以下の請求の範囲内に包含されることが意図される。

Claims (13)

  1. 以下の式を有する蛍光標識試薬であって：
    Figure 0004140976
    ここで：
    Ｒ1〜Ｒ6は、別個に水素、メチルおよびエチルからなる群から選択され、または、一緒になった場合、Ｒ1およびＲ6はベンゾ、または、一緒になった場合、Ｒ4およびＲ5はベンゾであり；
    Ｙ1〜Ｙ4は、別個に水素、メチルおよびエチルからなる群から選択され、または、一緒になった場合、Ｙ1およびＲ2はプロパノであり、そしてＹ2およびＲ1はプロパノであり、または、一緒になった場合、Ｙ3およびＲ3はプロパノであり、そしてＹ4およびＲ4はプロパノであり；
    Ｘ1はカルボキシレートであり、および
    Ｘ2〜Ｘ3は、水素および連結基からなる群から選択され、
    ここで、Ｘ2〜Ｘ3のうちの少なくとも１つは連結基であり、
    該連結基は、アミン基、スルフヒドリル基またはカルボキシレート基と反応する能力を有する、
    蛍光標識試薬。
  2. Ｘ2およびＸ3のうちの１つが連結基であり、かつ、他方が水素である、請求項１に記載の蛍光標識試薬。
  3. Ｒ2およびＲ3が別個に水素である、請求項１に記載の蛍光標識試薬。
  4. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1〜Ｒ6は、別個に水素であり；
    Ｙ1〜Ｙ4は、別個に水素であり；および
    Ｘ2およびＸ3のうちの１つは、連結基であり、他方は水素である、
    蛍光標識試薬。
  5. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1およびＲ4は別個にメチルであり；
    Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、およびＲ6は水素であり；
    Ｙ1およびＹ2のうち１つはエチルであり、他は水素であり；
    Ｙ3およびＹ4のうち１つはエチルであり、他は水素であり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  6. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1〜Ｒ6は別個に水素であり；
    Ｙ1〜Ｙ4は別個にメチルであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  7. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1およびＹ2は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ2およびＹ1は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ3およびＹ3は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ4およびＹ4は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ5およびＲ6は水素であり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  8. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1はメチルであり；
    Ｒ2〜Ｒ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2のうち１つはエチルであり、他は水素であり；
    Ｙ3およびＹ4は別個に水素であり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  9. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1はメチルであり；
    Ｒ2〜Ｒ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2のうち１つはエチルであり、他は水素であり；
    Ｙ3およびＹ4は別個にメチルであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  10. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、およびＲ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2は別個にメチルであり；
    Ｒ3およびＹ3は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ4およびＹ4は一緒になってプロパノであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  11. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、およびＲ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2は別個に水素であり；
    Ｒ3およびＹ3は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ4およびＹ4は一緒になってプロパノであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  12. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1はメチルであり；
    Ｒ2、Ｒ5およびＲ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2のうち１つはエチルであり、他は水素であり；
    Ｒ3およびＹ3は一緒になってプロパノであり；
    Ｒ4およびＹ4は一緒になってプロパノであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
  13. 請求項１に記載の蛍光標識試薬であって、ここで：
    Ｒ1〜Ｒ6は別個に水素であり；
    Ｙ1およびＹ2は別個に水素であり；
    Ｙ3およびＹ4は別個にメチルであり；および
    Ｘ2およびＸ3のうち１つは連結基であり、他は水素である、
    蛍光標識試薬。
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