JP4203191B2 - 液体クロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤、更に詳しくはカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カチオン交換基としてカルボキシル基やスルホン酸基を有する充填剤（カチオン交換基含有充填剤）を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分析等に極めて有用な方法である。
【０００３】
有機合成高分子からなるカチオン交換基含有充填剤の従来の製造方法としては、以下の２つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、カチオン交換基含有化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスルホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００４】
（２）カルボキシル基含有単量体を、架橋性単量体と重合する方法。
例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキシル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記（１）、（２）の方法で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤には、以下の問題点が残っている。
上記（１）の方法による充填剤：
後処理によりカチオン交換基を導入する方法においては、カチオン交換基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、単量体由来のカチオン交換基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。従って、液体クロマトグラフィー用充填剤としての分離性能がばらつくという欠点がある。また後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
【０００６】
上記（２）の方法による充填剤：
カルボキシル基含有単量体の添加量や重合条件を制御することにより、充填剤に対して定量的にカルボキシル基を含有させることができ、また操作も簡便であるが、カルボキシル基を有する充填剤は、使用できるｐＨが約５．５以上と限定されるため、低ｐＨ溶離液での分析が行えないという欠点がある。また、スルホン酸基含有単量体を用いて、スルホン酸基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤を調製した例は開示されていない。
従って従来のスルホン酸基含有充填剤は上記（１）の方法による充填剤のみであるが、該充填剤は吸着能が強く、測定条件によっては、試料中の妨害物質の非特異吸着を起こし、その結果カラムの寿命が短いという欠点がある。
【０００７】
一方、溶出位置が近接するピークを含む短時間分析などの場合、特に溶出条件の変更だけでは分離できない場合などでは、充填剤の選択が重要である。しかし従来のカルボキシル基含有充填剤とスルホン酸基含有充填剤とでは、カチオン交換能があまりにも違いすぎ、充填剤の微調整は困難であった。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、液クロ充填剤としての性能のバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、カラム寿命の十分な液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の本発明（以下、本発明１という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項２の本発明（以下、 本発明２という）では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、一般式（１）； Ｒ 1（ＣＨ2 ＯＣＯＣＲ2 ＝ＣＨ2 ）2 （式中Ｒ 1は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ2 は、水素原子又は、メチル基を表す。）で表されることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項３の本発明（以下、本発明３という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなる請求項１又は、２記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
【００１０】
以下、本発明の詳細を説明する。
（１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ））
本発明における上記１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）としては、例えば、１分子中に１個以上のスルホン酸基と１個以上のビニル基を有する単量体が挙げられる。このような単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、およびこれらの誘導体や塩類などが挙げられる。単量体（Ａ）としては、分子中にベンゼン骨格を有さない単量体がより好ましい。ベンゼン骨格は、特に生体関連物質の分析等では、タンパク質など試料中の物質の非特異吸着を誘発するので好ましくない。
【００１１】
上記単量体（Ａ）の量は、少なくなると得られる重合体のカチオン交換容量が小さすぎて、被測定物質との十分なカチオン交換反応が行われにくくなり、多くなると得られる重合体の親水性が大きくなりすぎて、重合中に凝集が発生しやすくなるので、重合時において架橋性単量体（Ｃ）１００重量部に対して１０〜２００重量部添加することが好ましい。
【００１２】
（１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ））
本発明における１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）としては、一般式（１）； Ｒ 1（ＣＨ2 ＯＣＯＣＲ2 ＝ＣＨ2 ）2 で表されるものが用いられる。上記一般式中Ｒ 1は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ2 は、水素原子及び、メチル基を表す。
上記アルキレン基は、直鎖パラフィン炭化水素の両端の炭素原子から水素原子各１個を除いた２価の基（一般式；−Ｃn Ｈ2n−）を示す。
また、上記オキサアルキレン基は、上記アルキレン基の少なくとも一つのメチレン基（−ＣＨ2 −）をエーテル基（−Ｏ−）に置換したものを示す。
【００１３】
上記一般式（１）で表されるものとして、例えば、１分子中に１個以上の水酸基と２個以上のビニル基を有する単量体が挙げられ、このような単量体としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオールなどが挙げられる。
【００１４】
上記単量体（Ｂ）の量は、少なくなると試料中の生体成分（タンパク質など）の非特異吸着を抑制する効果が十分に得られにくくなり、多くなると、重合体の親水性が増大し、重合中に凝集が発生しやすくなるため、重合時において架橋性重合体（Ｃ）１００重量部に対して、５〜１００重量部添加することが好ましい。
【００１５】
（架橋性単量体（Ｃ））
本発明における架橋性単量体（Ｃ）は、上記（Ｂ）以外の、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体を言い、イオン交換基を有さないか又は有していても微量である単量体であって、単量体（Ａ）及び単量体（Ｂ）よりも疎水性であるものが好ましい。
このような、架橋性単量体（Ｃ）としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の脂肪族ジエン化合物；及び上記単量体の誘導体などが挙げられる。これらは２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１６】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体には、必要に応じて、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）以外の非架橋性単量体（Ｄ）が構成単位の一部として混合されていてもよい。
上記非架橋性単量体（Ｄ）としては、例えば、スチレン、α- メチルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００１７】
上記非架橋性単量体（Ｄ）の量は、上記単量体（Ｂ）と（Ｃ）をあわせて１００重量部に対して１００重量部以下であることが好ましい。上記非架橋性単量体（Ｄ）の量が１００重量部より多くなると重合体粒子内の空隙が大きくなるため、膨潤、収縮などがおこりやすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液への平衡化に長時間を要するようになるためである。
【００１８】
（充填剤の重合方法）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合は、公知の重合方法が用いられ、例えば、懸濁重合、乳化重合、分散重合などにより製造され得る。
さらに、例えば、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合し、これに重合開始剤を所定量添加した後、分散媒中に添加して昇温し重合する方法が挙げられる。また上記単量体（Ｂ）及び（Ｃ）を用いて架橋性重合体粒子を調製した後、該重合体粒子に重合開始剤を含浸させた後、上記単量体（Ａ）を分散場媒中に添加して重合する方法も挙げられる。
【００１９】
さらに、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。
すなわち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った重合体粒子（Ｅ）に、上記単量体（Ａ）〜（Ｄ）、または、これらの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がより均一化される。
【００２０】
上記重合体粒子（Ｅ）とは、粒度分布の揃った重合体粒子のことを指し、例えば、上記非架橋性単量体（Ｄ）などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などが挙げられる。 また、上記重合体粒子（Ｅ）として、上記非架橋性単量体（Ｄ）と上記架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）との共重合体である架橋共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）の割合を１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２１】
上記重合体粒子（Ｅ）の製造方法は、公知の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
【００２２】
上記重合体粒子（Ｅ）の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として４０％以下が好ましい。
【００２３】
上記重合体粒子（Ｅ）の量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して０．５〜１００重量部が好ましい。
【００２４】
上記の重合体粒子（Ｅ）を用いる場合には、架橋性単量体（Ｂ）及び（Ｃ）（必要に応じて、非架橋性単量体（Ｄ）も含む）と重合開始剤を、重合体粒子（Ｅ）に吸収させて重合を進めることが好ましい。
【００２５】
本発明の重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。
【００２６】
上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。この重合開始剤は、上記単量体に溶解して用いてもよい。
【００２７】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体は、その製造時に多孔質化剤が用いられて製造されることにより、多孔質化されていてもよい。
多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒を重合反応系に添加して重合すればよい。このような多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
上記多孔質化剤の使用量は、多くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるので、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して、１００重量部以下が好ましい。
【００２８】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の粒径）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の平均粒径は０．５〜１００μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。このような、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、重合によって得られた重合体粒子を、必要に応じて分級することにより得られる。分級には、乾式又は湿式など公知の方法が用いられ得る。
【００２９】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の使用）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、ステンレス製などのカラムに充填されてカチオン交換液体クロマトグラフィーなどに用いられる。カラムへの充填に際しては、適宜の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００３０】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンクロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適である。
【００３１】
本発明の充填剤を適用できる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００３２】
本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。
【００３３】
（作 用）
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなり、該スルホン酸基は、スルホン酸基を１個以上含む単量体に由来するものであり、従来法の後処理によるスルホン酸基の導入方法により得られた充填剤と異なり、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用できる。さらに１分子中に水酸基を１個以上含む単量体を構成単位に有しているため、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなるので、このように単量体を一定の比率で添加して重合させることにより、充填剤のイオン交換能の微調整が可能となり、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）２００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３５】
（実施例２）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇを用いた以外は、実施例１と同様重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３６】
（実施例３）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合した。
重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、８０℃で３時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３７】
（実施例４）
アリルスルホン酸（単量体（Ａ）：キシダ化学社製）１００ｇ、１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、ジビニルベンゼン（単量体（Ｃ）：キシダ化学社製）３００ｇ、スチレン（非架橋性単量体（Ｄ））２００ｇ、トルエン（多孔質化剤）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。 窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３８】
（比較例１）スルホン酸基を後処理により導入して得られた充填剤の例：
２−ヒドロキシエチルメタクリレート２００ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４０ｇ、メチルメタクリレート（和光純薬社製）１５ｇ及びtert−ブチルパーピバレート（重合開始剤：和光純薬社製）５ｇの混合溶液を硫酸ナトリウム２０ｇを溶解した２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１２時間重合した。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの粒子を得た。
この粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％水酸化ナトリウム水溶液に分散し、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、室温で４時間反応させた。
さらに得られた粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、充填剤を得た。
【００３９】
（比較例２）単量体（Ｂ）を含有しないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４０】
（比較例３）単量体（Ｂ）含有量が少ないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４１】
（性能評価）
実施例及び比較例で得られた充填剤について、以下のようにして性能評価をした。
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００４２】
（２）タンパク質混合物の測定：
実施例１、２及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：下記溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．７）
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２５４ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００４３】
（測定試料）
ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００４４】
（測定結果）
実施例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図１、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図２に示す（なお、実施例４で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムは図１と同様であった）。
図中、ピーク１はミオグロビン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチームを示す。
図１は、図２に比べて短時間測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。
【００４５】
（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定
実施例２、３及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
【００４６】
（測定条件）
システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いたシステムと同様。
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む２種類の緩衝液によるステップグラディエント法で溶出した。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）の保持時間が適当となるように、溶離液Ｃの塩濃度及びｐＨを適宜調整した。
溶離液Ｃ：塩濃度を１５〜１００ｍＭ、ｐＨ５．６〜６．０の間で調節した。
溶離液Ｄ：塩濃度３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
【００４７】
（測定試料）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。これにグルコースを５００ｍｇ／ｄｌとなるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００４８】
（測定結果）
実施例２、３で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図３、４、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図５に示す。
図中は、ピーク５はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク６はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）；ピーク７は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク８は安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク９はヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）を示す。
ＨｂＦ（ピーク６）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク８）の良好な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要があるが、図３及び４ではこの順序通りに各ピークが溶出し、しかも短時間の測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。図５では各ピークの分離が、測定時間が長いにもかかわらず悪く、検出されないピークもあった。
【００４９】
（４）充填剤のロット間差の評価：
本発明のスルホン酸基を有する充填剤（実施例３）及び後処理によりスルホン酸基を導入する従来法による充填剤（比較例１）のロット間差を以下のようにして確認した。
各々３０回重合して、得られた充填剤３０ロット間の性能のバラツキをみた。
上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を、それぞれの充填剤の各３０ロットについて行い、ピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を調べた。なお、溶離液Ｃは、ピーク８の保持時間が約２分となるよう各充填剤毎に調製した。
【００５０】
（測定結果）
スルホン酸基を有する充填剤（実施例３）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．１５分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、６．８２％であった。
一方、従来法による充填剤（比較例１）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．９１分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、
４１．１％であった。
以上より、本発明の充填剤は、製造再現性に優れていることが判った。
【００５１】
（５）カラムの寿命の評価：
実施例２、３及び比較例２、３の充填剤を充填したカラムを用いて、上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を繰り返し行い、以下の式で示されるピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値の変化を調べた。
ピーク８の面積値（％）＝（ピーク８の面積）÷（全ピークの面積）×１００
【００５２】
（測定結果）
測定結果を図６に示した。図６において、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
図６より、実施例２及び３の充填剤は、３０００回測定後も良好な測定値を示しているが、一方、比較例２及び３の充填剤では、測定回数が増えると測定値が低下し、正確な測定ができなくなってくることが判る。
【００５３】
【発明の効果】
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなるため、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、上記重合体１００重量部に対して、５〜５０重量部であるので、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】カラム寿命の評価の結果を示すグラフであり、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
【符号の説明】
１ ミオグロビンのピーク
２ α−キモトリプシノーゲンのピーク
３ リボヌクレアーゼＡのピーク
４ リゾチームのピーク
５ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
６ ＨｂＦのピーク
７ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
８ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
９ ＨｂＡ０のピーク
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤、更に詳しくはカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カチオン交換基としてカルボキシル基やスルホン酸基を有する充填剤（カチオン交換基含有充填剤）を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分析等に極めて有用な方法である。
【０００３】
有機合成高分子からなるカチオン交換基含有充填剤の従来の製造方法としては、以下の２つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、カチオン交換基含有化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスルホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００４】
（２）カルボキシル基含有単量体を、架橋性単量体と重合する方法。
例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキシル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記（１）、（２）の方法で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤には、以下の問題点が残っている。
上記（１）の方法による充填剤：
後処理によりカチオン交換基を導入する方法においては、カチオン交換基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、単量体由来のカチオン交換基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。従って、液体クロマトグラフィー用充填剤としての分離性能がばらつくという欠点がある。また後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
【０００６】
上記（２）の方法による充填剤：
カルボキシル基含有単量体の添加量や重合条件を制御することにより、充填剤に対して定量的にカルボキシル基を含有させることができ、また操作も簡便であるが、カルボキシル基を有する充填剤は、使用できるｐＨが約５．５以上と限定されるため、低ｐＨ溶離液での分析が行えないという欠点がある。また、スルホン酸基含有単量体を用いて、スルホン酸基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤を調製した例は開示されていない。
従って従来のスルホン酸基含有充填剤は上記（１）の方法による充填剤のみであるが、該充填剤は吸着能が強く、測定条件によっては、試料中の妨害物質の非特異吸着を起こし、その結果カラムの寿命が短いという欠点がある。
【０００７】
一方、溶出位置が近接するピークを含む短時間分析などの場合、特に溶出条件の変更だけでは分離できない場合などでは、充填剤の選択が重要である。しかし従来のカルボキシル基含有充填剤とスルホン酸基含有充填剤とでは、カチオン交換能があまりにも違いすぎ、充填剤の微調整は困難であった。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、液クロ充填剤としての性能のバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、カラム寿命の十分な液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の本発明（以下、本発明１という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項２の本発明（以下、 本発明２という）では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、一般式（１）； Ｒ 1（ＣＨ2 ＯＣＯＣＲ2 ＝ＣＨ2 ）2 （式中Ｒ 1は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ2 は、水素原子又は、メチル基を表す。）で表されることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項３の本発明（以下、本発明３という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなる請求項１又は、２記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
【００１０】
以下、本発明の詳細を説明する。
（１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ））
本発明における上記１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）としては、例えば、１分子中に１個以上のスルホン酸基と１個以上のビニル基を有する単量体が挙げられる。このような単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、およびこれらの誘導体や塩類などが挙げられる。単量体（Ａ）としては、分子中にベンゼン骨格を有さない単量体がより好ましい。ベンゼン骨格は、特に生体関連物質の分析等では、タンパク質など試料中の物質の非特異吸着を誘発するので好ましくない。
【００１１】
上記単量体（Ａ）の量は、少なくなると得られる重合体のカチオン交換容量が小さすぎて、被測定物質との十分なカチオン交換反応が行われにくくなり、多くなると得られる重合体の親水性が大きくなりすぎて、重合中に凝集が発生しやすくなるので、重合時において架橋性単量体（Ｃ）１００重量部に対して１０〜２００重量部添加することが好ましい。
【００１２】
（１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ））
本発明における１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）としては、一般式（１）； Ｒ 1（ＣＨ2 ＯＣＯＣＲ2 ＝ＣＨ2 ）2 で表されるものが用いられる。上記一般式中Ｒ 1は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ2 は、水素原子及び、メチル基を表す。
上記アルキレン基は、直鎖パラフィン炭化水素の両端の炭素原子から水素原子各１個を除いた２価の基（一般式；−Ｃn Ｈ2n−）を示す。
また、上記オキサアルキレン基は、上記アルキレン基の少なくとも一つのメチレン基（−ＣＨ2 −）をエーテル基（−Ｏ−）に置換したものを示す。
【００１３】
上記一般式（１）で表されるものとして、例えば、１分子中に１個以上の水酸基と２個以上のビニル基を有する単量体が挙げられ、このような単量体としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオールなどが挙げられる。
【００１４】
上記単量体（Ｂ）の量は、少なくなると試料中の生体成分（タンパク質など）の非特異吸着を抑制する効果が十分に得られにくくなり、多くなると、重合体の親水性が増大し、重合中に凝集が発生しやすくなるため、重合時において架橋性重合体（Ｃ）１００重量部に対して、５〜１００重量部添加することが好ましい。
【００１５】
（架橋性単量体（Ｃ））
本発明における架橋性単量体（Ｃ）は、上記（Ｂ）以外の、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体を言い、イオン交換基を有さないか又は有していても微量である単量体であって、単量体（Ａ）及び単量体（Ｂ）よりも疎水性であるものが好ましい。
このような、架橋性単量体（Ｃ）としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の脂肪族ジエン化合物；及び上記単量体の誘導体などが挙げられる。これらは２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１６】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体には、必要に応じて、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）以外の非架橋性単量体（Ｄ）が構成単位の一部として混合されていてもよい。
上記非架橋性単量体（Ｄ）としては、例えば、スチレン、α- メチルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００１７】
上記非架橋性単量体（Ｄ）の量は、上記単量体（Ｂ）と（Ｃ）をあわせて１００重量部に対して１００重量部以下であることが好ましい。上記非架橋性単量体（Ｄ）の量が１００重量部より多くなると重合体粒子内の空隙が大きくなるため、膨潤、収縮などがおこりやすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液への平衡化に長時間を要するようになるためである。
【００１８】
（充填剤の重合方法）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合は、公知の重合方法が用いられ、例えば、懸濁重合、乳化重合、分散重合などにより製造され得る。
さらに、例えば、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合し、これに重合開始剤を所定量添加した後、分散媒中に添加して昇温し重合する方法が挙げられる。また上記単量体（Ｂ）及び（Ｃ）を用いて架橋性重合体粒子を調製した後、該重合体粒子に重合開始剤を含浸させた後、上記単量体（Ａ）を分散場媒中に添加して重合する方法も挙げられる。
【００１９】
さらに、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。
すなわち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った重合体粒子（Ｅ）に、上記単量体（Ａ）〜（Ｄ）、または、これらの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がより均一化される。
【００２０】
上記重合体粒子（Ｅ）とは、粒度分布の揃った重合体粒子のことを指し、例えば、上記非架橋性単量体（Ｄ）などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などが挙げられる。 また、上記重合体粒子（Ｅ）として、上記非架橋性単量体（Ｄ）と上記架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）との共重合体である架橋共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）の割合を１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２１】
上記重合体粒子（Ｅ）の製造方法は、公知の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
【００２２】
上記重合体粒子（Ｅ）の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として４０％以下が好ましい。
【００２３】
上記重合体粒子（Ｅ）の量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して０．５〜１００重量部が好ましい。
【００２４】
上記の重合体粒子（Ｅ）を用いる場合には、架橋性単量体（Ｂ）及び（Ｃ）（必要に応じて、非架橋性単量体（Ｄ）も含む）と重合開始剤を、重合体粒子（Ｅ）に吸収させて重合を進めることが好ましい。
【００２５】
本発明の重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。
【００２６】
上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。この重合開始剤は、上記単量体に溶解して用いてもよい。
【００２７】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体は、その製造時に多孔質化剤が用いられて製造されることにより、多孔質化されていてもよい。
多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒を重合反応系に添加して重合すればよい。このような多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
上記多孔質化剤の使用量は、多くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるので、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して、１００重量部以下が好ましい。
【００２８】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の粒径）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の平均粒径は０．５〜１００μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。このような、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、重合によって得られた重合体粒子を、必要に応じて分級することにより得られる。分級には、乾式又は湿式など公知の方法が用いられ得る。
【００２９】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の使用）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、ステンレス製などのカラムに充填されてカチオン交換液体クロマトグラフィーなどに用いられる。カラムへの充填に際しては、適宜の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００３０】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンクロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適である。
【００３１】
本発明の充填剤を適用できる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００３２】
本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。
【００３３】
（作 用）
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなり、該スルホン酸基は、スルホン酸基を１個以上含む単量体に由来するものであり、従来法の後処理によるスルホン酸基の導入方法により得られた充填剤と異なり、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用できる。さらに１分子中に水酸基を１個以上含む単量体を構成単位に有しているため、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなるので、このように単量体を一定の比率で添加して重合させることにより、充填剤のイオン交換能の微調整が可能となり、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）２００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３５】
（実施例２）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇを用いた以外は、実施例１と同様重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３６】
（実施例３）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合した。
重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、８０℃で３時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３７】
（実施例４）
アリルスルホン酸（単量体（Ａ）：キシダ化学社製）１００ｇ、１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、ジビニルベンゼン（単量体（Ｃ）：キシダ化学社製）３００ｇ、スチレン（非架橋性単量体（Ｄ））２００ｇ、トルエン（多孔質化剤）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。 窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３８】
（比較例１）スルホン酸基を後処理により導入して得られた充填剤の例：
２−ヒドロキシエチルメタクリレート２００ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４０ｇ、メチルメタクリレート（和光純薬社製）１５ｇ及びtert−ブチルパーピバレート（重合開始剤：和光純薬社製）５ｇの混合溶液を硫酸ナトリウム２０ｇを溶解した２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１２時間重合した。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの粒子を得た。
この粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％水酸化ナトリウム水溶液に分散し、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、室温で４時間反応させた。
さらに得られた粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、充填剤を得た。
【００３９】
（比較例２）単量体（Ｂ）を含有しないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４０】
（比較例３）単量体（Ｂ）含有量が少ないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４１】
（性能評価）
実施例及び比較例で得られた充填剤について、以下のようにして性能評価をした。
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００４２】
（２）タンパク質混合物の測定：
実施例１、２及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：下記溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．７）
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２５４ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００４３】
（測定試料）
ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００４４】
（測定結果）
実施例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図１、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図２に示す（なお、実施例４で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムは図１と同様であった）。
図中、ピーク１はミオグロビン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチームを示す。
図１は、図２に比べて短時間測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。
【００４５】
（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定
実施例２、３及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
【００４６】
（測定条件）
システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いたシステムと同様。
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む２種類の緩衝液によるステップグラディエント法で溶出した。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）の保持時間が適当となるように、溶離液Ｃの塩濃度及びｐＨを適宜調整した。
溶離液Ｃ：塩濃度を１５〜１００ｍＭ、ｐＨ５．６〜６．０の間で調節した。
溶離液Ｄ：塩濃度３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
【００４７】
（測定試料）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。これにグルコースを５００ｍｇ／ｄｌとなるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００４８】
（測定結果）
実施例２、３で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図３、４、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図５に示す。
図中は、ピーク５はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク６はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）；ピーク７は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク８は安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク９はヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）を示す。
ＨｂＦ（ピーク６）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク８）の良好な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要があるが、図３及び４ではこの順序通りに各ピークが溶出し、しかも短時間の測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。図５では各ピークの分離が、測定時間が長いにもかかわらず悪く、検出されないピークもあった。
【００４９】
（４）充填剤のロット間差の評価：
本発明のスルホン酸基を有する充填剤（実施例３）及び後処理によりスルホン酸基を導入する従来法による充填剤（比較例１）のロット間差を以下のようにして確認した。
各々３０回重合して、得られた充填剤３０ロット間の性能のバラツキをみた。
上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を、それぞれの充填剤の各３０ロットについて行い、ピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を調べた。なお、溶離液Ｃは、ピーク８の保持時間が約２分となるよう各充填剤毎に調製した。
【００５０】
（測定結果）
スルホン酸基を有する充填剤（実施例３）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．１５分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、６．８２％であった。
一方、従来法による充填剤（比較例１）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．９１分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、
４１．１％であった。
以上より、本発明の充填剤は、製造再現性に優れていることが判った。
【００５１】
（５）カラムの寿命の評価：
実施例２、３及び比較例２、３の充填剤を充填したカラムを用いて、上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を繰り返し行い、以下の式で示されるピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値の変化を調べた。
ピーク８の面積値（％）＝（ピーク８の面積）÷（全ピークの面積）×１００
【００５２】
（測定結果）
測定結果を図６に示した。図６において、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
図６より、実施例２及び３の充填剤は、３０００回測定後も良好な測定値を示しているが、一方、比較例２及び３の充填剤では、測定回数が増えると測定値が低下し、正確な測定ができなくなってくることが判る。
【００５３】
【発明の効果】
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなるため、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、上記重合体１００重量部に対して、５〜５０重量部であるので、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】カラム寿命の評価の結果を示すグラフであり、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
【符号の説明】
１ ミオグロビンのピーク
２ α−キモトリプシノーゲンのピーク
３ リボヌクレアーゼＡのピーク
４ リゾチームのピーク
５ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
６ ＨｂＦのピーク
７ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
８ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
９ ＨｂＡ０のピーク
Claims (2)
- １分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を構成単位とする重合体からなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
- １分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、一般式（１）；
Ｒ 1（ＣＨ2 ＯＣＯＣＲ2 ＝ＣＨ2 ）2 （１）
（式中Ｒ 1は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ2 は、水素原子又は、メチル基を表す。）で表されることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
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