JPH087198B2 - 糖化ヘモグロビンの定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，糖化ヘモグロビンの定量法，特に液体クロ
マトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの定量法に関
する。

（従来の技術） 糖化ヘモグロビンは，赤血球中のヘモグロビンが非酵
素的に血液中のグルコースと反応して形成される。糖化
ヘモグロビンを測定することにより血液中のグルコース
の平均濃度がわかるため，該糖化ヘモグロビンの測定は
糖尿病の診断に広く用いられている。糖化ヘモグロビン
は，現在では，主として高速液体クロマトグラフィー
（以下HPLCとする）により定量が行なわれている。HPLC
法によれば，従来のカラムクロマトグラフィー法，電気
泳動法，比色法などに比べて迅速な測定が可能である。

糖化ヘモグロビンを測定するときのHPLCに用いられる
充填剤は，一般に弱カチオン性のイオン交換樹脂でな
り，通常，イオン交換基としてカルボキシル基を有する
イオン交換樹脂が用いられる。このようなHPLC用充填剤
としては、主として有機ポリマー系充填剤または無機系
充填剤が使用されている。有機ポリマー系充填剤として
は，例えば，特開昭58−221164号に，テトラメチロール
メタントリアクリレートなどのアクリル酸またはメタク
リル酸のエステルとアクリル酸またはメタクリル酸との
共重合体でなる充填剤が開示されている。無機系充填剤
としては，特開昭63−75558号に，シリカ基材にカルボ
キシル基を導入した充填剤が開示されている。

一般に糖化ヘモグロビンの定量は，溶離液として溶出
力の弱い液（以下第１液とする）と溶出力の強い液（以
下第２液とする）との二種を用いてステップあるいは連
続グラジエント法により実施される。第１液は，充填剤
中の遊離カルボキシル基を増加させる。これにより試料
中の糖化ヘモグロビン以外のヘモグロビンは充填剤に保
持され，糖化ヘモグロビンは分離されて溶出する。第２
液はイオン強度が大きいため，遊離カルボキシル基が塩
となる。そのため，保持されていた糖化ヘモグロビン以
外のヘミグロビンが速やかに溶出する。

しかし，上記方法をポリマー系充填剤を用いる場合に
次のような問題がある。ポリマー系充填剤は，例えば上
記特開昭58−221164号に示されるように，疎水性および
親水性のモノマーを用いて調製されるため，主として親
水性モノマーに起因するイオン交換基が充填剤粒子全体
に分布する。このような充填剤に第２液を接触させる
と，充填剤が膨潤してカラム内の圧力が高くなる。ひと
つの検体を測定した後，次の検体を測定のためには，第
１液を流してカルボキシル基を遊離型に戻す操作が必要
とされる。このときに，充填剤内部に存在するイオン交
換基を充分に遊離型にもどすためには相当量の第１液を
流す必要があるため測定時間が長くなる。ポリマー系充
填剤を用いたHPLCにより糖化ヘモグロビンを比較的高速
で測定できるようになったが，さらに測定速度を上げよ
うとすると上記のように，充填剤内部のイオン交換基が
充分に交換しない，あるいは，充填剤が膨潤するという
理由から，分離性能が低下する。高精度での分離を行な
うには，溶離速度を低下させる必要がある。

他方シリカを基材とする無機系充填剤は，一般に耐圧
性および耐膨潤性において優れているが，表面に残存す
るシラノール基によってタンパクの非特異吸着を起こし
やすいなどの問題が指摘されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来法の欠点を解決するものであり，そ
の目的とするところは,HPLCにより糖化ヘモグロビンを
短時間のうちに高精度で分離・定量する方法を提供する
ことにある。本発明の他の目的は，カラム操作時にカラ
ム圧を上昇させることがなく，溶離液との平衡化が速や
かであり，かつタンパクなどを非特異吸着させることの
ない充填剤を用いて,HPLCにより糖化ヘモグロビンを効
果的に定量する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は，液体クロマトグラフィーにより試料中の糖
化ヘモグロビンを定量する方法であって， 該液体クロマトグラフィーに使用する充填剤が、疎水
性架橋重合体粒子の表面部分に，アクリル酸および／ま
たはメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重
合体粒子でなり，そのことにより上記目的が達成され
る。

本発明方法に用いられる充填剤を調製するのに使用さ
れる疎水性架橋重合体粒子の素材としては，疎水性架橋
性単量体を（共）重合させて得られる（共）重合体また
は疎水性架橋性単量体と疎水性非架橋性単量体との共重
合体が用いられる。上記疎水性架橋性単量体および疎水
性非架橋性単量体は，それぞれ単独で，あるいは二種以
上が組みあわせて用いられ得る。上記疎水性架橋性単量
体としては，たとえばエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート，ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート，プロピレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト，ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート
などのジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロー
ルメタントリ（メタ）アクリレート，テトラメチロール
メタンテトラ（メタ）アクリレートなどの多価アルコー
ルのポリ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼ
ン，ジビニルトルエン，ジビニルキシレン，ジビニルナ
フタレンなどの２個以上のビニル基を有する芳香族系化
合物などが用いられる。上記疎水性非架橋性単量体とし
ては，疎水性の性質を有する非架橋性の重合性単量体で
あれば，いずれもが使用され得る。例えばメチル（メ
タ）アクリレート，エチル（メタ）アクリレート，プロ
ピル（メタ）アクリレート，イソプロピル（メタ）アク
リレート，ブチル（メタ）アクリレート,t−ブチル（メ
タ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル；
酢酸ビニル；およびスチレン，メチルスチレンなどのス
チレン系単量体が用いられる。上記架橋性および非架橋
性の単量体を混合して用いる場合には，架橋性単量体が
全単量体100重量部に対し10重量部以上，好ましくは20
重量部以上となるように使用される。

上記疎水性架橋重合体粒子を調製するときに用いられ
る重合開始剤，および得られた疎水性架橋重合体粒子に
含浸させる重合開始剤（後述）は，ラジカルを発生する
触媒であり，疎水性であれば特に限定されない。例えば
ベンゾイルパーオキサイド，クメンパーオキサイドなど
の有機過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル，アゾビ
スイソブチロアミドなどのアゾ化合物など既知のラジカ
ル発生触媒のいずれもが使用され得る。

上記疎水性架橋重合体粒子を被覆するために用いられ
るアクリル酸および／またはメタクリル酸（以下，（メ
タ）アクリル酸とする）は，カルボキシル基を有するた
め，疎水性架橋重合体粒子の表面において重合したとき
に，該カルボキシル基がイオン交換基として機能する。
アクリル酸およびメタクリル酸以外にもカルボキシル基
を持ち，水溶性の単量体であれば他の単量体も使用する
ことが可能である。（メタ）アクリル酸の使用量は，単
量体の種類によって異なるが，通常，疎水性架橋重合体
100重量部に対して５〜50重量部である。

本発明方法に用いる液体クロマトグラフィー用充填剤
を調製するには，まず，疎水性架橋重合体粒子が調製さ
れる。この疎水性架橋重合体粒子は既知の任意の水性懸
濁重合法により調製され得る。まず上記疎水性架橋性単
量体および必要に応じて疎水性非架橋性単量体と上記重
合開始剤とを希釈剤に溶解させる。希釈剤としては，上
記単量体を溶解させ，かつその重合体を溶解させない有
機溶媒のいずれもが使用可能である。例えば，トルエ
ン，キシレン，ジエチルベンゼン，ドデシルベンゼンな
どの芳香族炭化水素類；ヘキサン，ヘプタン，オクタ
ン，デカンなどの飽和炭化水素類；イソアミルアルコー
ル，ヘキシルアルコール，オクチルアルコールなどのア
ルコール類があげられる。その使用量は何ら限定されな
いが上記単量体100重量部に対して15〜200重量部の割合
であることが好ましい。上記単量体の希釈液を，ポリビ
ニルアルコール，リン酸カルシウムなどの懸濁安定剤を
分散した水相に添加し，窒素置換後攪拌しながら50〜10
0℃に加熱することにより懸濁重合を行う。得られた重
合体粒子中には希釈剤である有機溶媒が分散して存在す
るため，重合終了後に有機溶媒を除去することにより，
多孔性の球状粒子が得られる。希釈剤として上記疎水性
単量体混合物と相溶性の異なる種々の有機溶媒を使用す
ることにより，多孔性重合体の細孔の大きさを任意に変
化させることが可能である。

次に，得られた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を
含浸させる。重合開始剤を含浸させるには，該重合開始
剤を，低沸点で，かつ疎水性架橋重合体と親和性の良い
溶媒に溶解させ，これに上記疎水性架橋重合体粒子を浸
漬する。このことにより重合開始剤が粒子中に浸透す
る。溶媒を，必要に応じて重合開始剤の分解点以下の温
度で加熱しながら留去すれば重合開始剤を疎水性架橋重
合体粒子中に含有する粒子が得られる。この重合開始剤
含有粒子を（メタ）アクリル酸が溶解する水性分散媒中
に分散させ，あるいは，該粒子が分散する水性媒体中に
（メタ）アクリル酸を添加し，窒素置換後攪拌下に加熱
して重合を行なう。水性分散媒には疎水性架橋重合体の
分散性を安定させるため，カルボキシメチルセルロー
ス，ポリビニールアルコールなどの分散安定剤を使用す
ることが望ましい。重合の温度および時間は，アクリル
酸を用いるかメタクリル酸を用いるかによって，あるい
は重合開始剤の種類によって異なるが,50〜100℃で0.5
〜10時間程度である。

上記重合開始剤を含浸させた架橋重合体粒子を（メ
タ）アクリル酸の重合反応に供する方法の他，架橋重合
体粒子の調製に引き続いて（メタ）アクリル酸を反応さ
せる連続法によっても上記二層構造の重合体粒子が調製
され得る。この方法においては，まず，上記架橋重合体
粒子を調製するための重合反応を開始する。重合がある
程度進行し，かつ未反応の単量体が残存しているときに
（メタ）アクリル酸が反応系に加えられる。このような
状態においては，系内の油層および生成した疎水性架橋
重合体粒子内部に重合開始剤が存在するため，引き続い
て（メタ）アクリル酸の重合が起こり，しかも該疎水性
架橋重合体粒子の表面部分を被覆する形で（メタ）アク
リル酸の（共）重合体の層が形成される。

上記各方法で得られた重合体粒子を熱水，有機溶媒な
どで十分洗浄し，粒子に付着している懸濁安定剤，溶
媒，残存単量体などが除去される。さらに必要に応じて
粒子を分級して，クロマトグラフィー用の充填剤が得ら
れる。

本発明方法により糖化ヘモグロビンの測定を行なうに
は，まず，試料の血液を必要に応じて溶血させる。これ
を，上記充填剤が充填されたカラムにかけ，通常の液体
クロマトグラフィーの手法により糖化ヘモグロビンの定
量を行なう。適当な緩衝液を選択するこにより，試料中
の糖化ヘモグロビン，次いで他のヘモグロビンが分離さ
れて順次溶出される。

本発明方法に用いられる充填剤は，疎水性架橋重合体
を骨格とし，（メタ）アクリル酸重合体で該疎水性架橋
重合体の表面部分が被覆された２層構造の重合体粒子か
らなる。骨格部分として架橋度の高い重合体を用いるこ
とによって，機械的強度が極めて大きく耐圧性に優れた
液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。
この充填剤の骨格部分には親水性の基が存在しないた
め，膨潤および収縮の度合が極めて低い。したがって糖
化ヘモグロビンの定量において，第２液通液時の圧力上
昇が極めて少ない。表面部分のみがカルボキシル基を有
する（メタ）アクリル酸重合体層で覆われているため，
充填剤のイオン交換能が高く，さらに，カルボキシル基
の平衡化も非常に速い。そのため糖化ヘモグロビンの分
離性能が優れ，短時間での測定が可能となる。さらにタ
ンパクの非特異的吸着も全く認められない。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

以下の実施例および比較例において得られた充填剤の
物性測定および性能評価の方法は次の通りである。

「充填剤の評価方法」 得られた充填剤を内径6mmおよび長さ75mmのステンレ
ス製カラムに充填し，耐圧性および水に対する膨潤性を
調べた。耐圧性はカラムに精製水を流し，流速を変えて
流速と圧力損失との関係より測定した。膨潤性は，イオ
ン強度の異なる液を流した時のカラム圧の変化より求め
た。

京都電子工業（株）製電位差自動滴定装置AT−310に
より充填剤表面のイオン交換基を定量した。さらに
（株）京都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒト血液のヘモグ
ロビンの分析を行い分離能などを従来品と比較した。測
定方法は次の通りである。ヒト血液検体として，同一人
（健常人）の血液を採取後直ちにヘパリンを添加したも
のを用いた。血液検体は，本装置付属の専用容血液21L
（ノニオン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液）によっ
て，自動的に290倍に希釈・溶血される。溶離液は本装
置付属の専用試薬であるＡ液（pH5.9のリン酸緩衝液）,
B液（pH7.2のリン酸緩衝液）およびＣ液（pH5.9のリン
酸緩衝液）を使用した。

実施例１ スチレン（疎水性非架橋性単量体）100g,ジビニルベ
ンゼン（疎水性架橋性単量体）200gおよびベンゾイルパ
ーオキサイド（重合開始剤）1gをトルエン200gに溶解さ
せた。これを４％ポリビニルアルコール水溶液2.5lに添
加して，攪拌しながら調粒した後，窒素置換下で80℃に
加熱し懸濁重合を行った。80℃で８時間重合した後，生
成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し，乾燥して微小
の疎水性架橋重合体粒子を得た。

この疎水性架橋重合体粒子200gをベンゾイルパーオキ
サイド0.5gが溶解しているアセトン１に浸漬して該重
合開始剤を含浸させた。次に，アセトンを20℃において
減圧下で留去した。１％ポリビニルアルコール水溶液2.
5lに上記含浸処理した疎水性架橋重合体を懸濁させ，攪
拌しながらアクリル酸50gを添加し，窒素置換後80℃で
２時間重合反応を行った。生成物を熱水およびアセトン
で順次洗浄し，乾燥した。得られた微小のポリマーゲル
を日清エンジニアリング（株）製空気分級機ターボクラ
シファイアTC−15Nにより分級して粒径が８〜10μｍの
粒子を集め，充填剤を得た。これを内径6mmおよび長さ7
5mmのステンレス製カラムに充填した。充填は精製水35m
lにゲル（充填剤）2gを取り５分間攪拌した後,2.0ml/分
で定流量充填することにより行った。

上記の方法により耐圧性および膨潤性の評価を行っ
た。耐圧性評価においては,150kg/cm²まで圧力損失が流
速と比例した。膨潤性試験を行ったところ，溶離液を40
mMのリン酸緩衝液から200mMのリン酸緩衝液に変えた場
合，カラム圧力の上昇は認められなかった。滴定により
ゲル表面のカルボキシル基を定量したところゲル1g当た
り0.08nmolであり，従って反応したアクリル酸は4.3gで
あった。さらに（株）京都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒ
ト血液の分析を行った。その結果得られたクロマトグラ
ムを第１図に示す。第１図および後述の第２図，第３図
において,1はヘモグロビンA_1aおよびA_1b,2は胎児性ヘモ
グロビン（Ｆ）,3は不安定型ヘモグロビンA_1C,4は安定
型ヘモグロビンA_1C，そして５は正常ヘモグロビンに起
因するピークである。

実施例２ 疎水性架橋重合体としてジエチレングリコールジメタ
クリレート300g,そして溶媒としてトルエンに代えてイ
ソアミルアルコール200g用い，実施例１に準じて疎水性
架橋重合体粒子を得た。さらに，アクリル酸の代わりに
メタクリル酸50gを用い,80℃で２時間反応させて実施例
１と同様の操作法によりポリマーゲル（充填剤）を調製
した。

実施例１と同様の評価を行った結果，耐圧性について
は150kg/cm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性
試験を行ったところ，溶離液を40mMのリン酸緩衝液から
200mMのリン酸緩衝液に変えた場合，カラム圧力の上昇
は認められなかった。さらに（株）京都第一科学製Hi−
AUTO A_1Cでヒト血液の分析を行った。その結果得られた
クロマトグラムを第２図に示す。

実施例３ この実施例では，疎水性架橋重合体粒子の調製に続い
て親水性単量体を反応させる連続した重合法を採用し
た。

スチレン100g,ジビニルベンゼン200gおよびベンゾイ
ルパーオキサイド1gをトルエン200gに溶解し,4％ポリビ
ニルアルコール水溶液2.5lに添加して，攪拌しながら調
粒した後，窒素置換下で80℃に加熱し懸濁重合を行っ
た。80℃で２時間重合した後，アクリル酸50gを添加
し，さらに80℃で２時間重合し生成物を熱水およびアセ
トンで順次洗浄し，乾燥し，分級した。得られた微小の
ポリマーゲルを実施例１と同様の方法で評価した。

耐圧性については150kg/cm²まで圧力損失と流速とが
比例した。膨潤性試験を行ったところ，溶離液を40mMの
リン酸緩衝液から200mMのリン酸緩衝液に変えた場合，
カラム圧力の上昇は認められなかった。さらに（株）京
都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒト血液の分析を行った。
その結果得られたクロマトグラフは第１図と同様であっ
た。

比較例１ スチレン100g,ジビニルベンゼン200g,アクリル酸150g
およびベンゾイルパーオキサイド1gをトルエン200gに溶
解し,4％ポリビニルアルコール水溶液2.5lに添加して，
攪拌しながら調粒した後,80℃に加熱し懸濁重合した。8
0℃で８時間重合した後，生成物を実施例１と同様な操
作により分級，充填し評価した。

実施例１と同様の評価を行った結果，耐圧性について
は80kg/cm²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性試
験を行ったところ、溶離液を40mMのりん酸緩衝液から20
0mMのリン酸緩衝液に変えた場合，カラム圧力が20kg/cm
²上昇した。このように実施例１の充填剤より耐圧性お
よび耐膨潤性が劣ることが明らかである。さらに（株）
京都第一科学製Hi−AUTO A_1Cでヒト血液の分析を行っ
た。その結果得られたクロマトグラムを第３図に示す。
第２図と比較すると，明らかに糖化ヘモグロビン類に対
する保持力は弱く，分離能が劣っている。

（発明の効果） 本発明によれば，このように，高精度でかつ短時間の
うちに糖化ヘモグロビンの定量がなされる。本法を用い
て，血液中の糖化ヘモグロビンを測定することにより，
糖尿病の診断などが迅速かつ正確になされ得る。

【図面の簡単な説明】 第１図〜第３図は，それぞれ実施例1,実施例２および比
較例１において得られた充填剤をカラムに充填し，糖化
ヘモグロビンの分離を行なった際のクロマトグラムを示
す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体クロマトグラフィーにより試料中の糖
   化ヘモグロビンを定量する方法であって， 該液体クロマトグラフィーに使用する充填剤が、疎水性
   架橋重合体粒子の表面部分に，アクリル酸および／また
   はメタクリル酸（共）重合体の層が形成された被覆重合
   体粒子でなる， 糖化ヘモグロビンの定量法。