JP4354184B2 - 核酸の配列決定のための装置および方法 - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は、核酸の配列を決定するための装置および方法に関する。
（発明の背景）
多くの疾患は、特定のＤＮＡ配列に関連する。このＤＮＡ配列は、しばしば、ＤＮＡ多型と呼ばれ、非罹患個体における対応するＤＮＡ配列と異なる疾患状態に関連するＤＮＡ配列を示す。ＤＮＡ配列多型は、例えば、１つの配列における、第２の配列と比較してのヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。特定のＤＮＡ配列多型の例は、ヒトゲノムの特定の位置での、５’−ＡＴＧＧ−３’に対する５’−ＡＴＣＧ−３’である。後者の配列における第１ヌクレオチド「Ｇ」は、前者の配列においてヌクレオチド「Ｃ」で置換されている。前者の配列は、特定の疾患状態に関連し、後者の配列は、その疾患に罹患していない個体において見出される。従って、ヌクレオチド配列「５’−ＡＴＣＧ−３’」の存在は、個体が特定の疾患を有することを示す。この特定の型の配列多型は、配列の差が、１つのヌクレオチドにおける変化に起因することから、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）として公知である。
従って、単一ＤＮＡ塩基変化の迅速な検出を可能にする技術は、遺伝子分析において使用するための重要な方法である。ヒトゲノムの大きさは大きい（３０億塩基対のオーダー）ので、多型を同定する技術は、核酸の潜在的に大きな集団において多型を含む配列を特異的に同定するのに十分高感度でなければならない。
代表的に、ＤＮＡ配列多型分析は、個体からＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡを、例えば、制限酵素でそのＤＮＡを消化することによって操作し、そして／または単離したＤＮＡにおける配列のサブセットを増幅することにより実施される。次いで、操作したＤＮＡは、特定の配列が存在するか否かを決定するためにさらに試験される。
ＤＮＡを分析するために一般的に使用される手順としては、電気泳動が挙げられる。電気泳動の一般的な適用としては、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられる。ＤＮＡ配列は、ゲルに挿入または充填され、そして電場に供される。ＤＮＡは、均一な負電荷を有するので、ＤＮＡは、電場の適用の際に、配列の長さ、三次元構造、およびゲルマトリクスとの相互作用を含む特性に基づきゲルを通って移動する。ほとんどの適用において、より小さいＤＮＡ分子は、より大きいフラグメントよりも迅速にゲルを通って移動する。電気泳動が十分な時間継続された後、ＤＮＡ配列の最初の集団のＤＮＡは、それらの相対的な大きさに従って分離される。
次いで、特定のＤＮＡ分子が、種々の検出方法を用いて検出され得る。いくつかの適用について、特定のＤＮＡ配列は、特定のＤＮＡ分子に結合された検出可能なタグ（例えば、放射性標識）の存在により同定される。
電気泳動に基づく分離分析は、特定の配列多型について多くの核酸サンプルを迅速、経済的、および正確に分析することが望まれる適用には望ましくない。例えば、電気泳動に基づく分析は、多量の注入ＤＮＡを必要とする。さらに、電気泳動に基づく核酸に基づく分析に必要とされる多量のサンプルを処理することは、労働力を要し得る。さらに、これらの技術は、同一のＤＮＡ分子のサンプルを必要とし得、電気泳動の前に、多額であり得る費用を取り繕わなければならない。
近年、自動電気泳動システムが入手可能となった。しかし、電気泳動は、高スループットを有する比較的コスト効果のある装置が必要とされる臨床的配列決定のような適用には不向きであり得る。従って、配列決定のための非電気泳動方法に対する必要性が大きい。多くの適用について、電気泳動は、ＤＮＡ配列分析と組み合わせて使用される。
電気泳動に基づく配列決定に対するいくつかの代替法が記載されている。これらの方法としては、走査型トンネル顕微鏡、ハイブリダイゼーションによる配列決定、および単一ヌクレオチド検出法が挙げられる。
電気泳動に基づく分離分析に対する別の代替法は、固体基質に基づく核酸分析である。これらの方法は、代表的に、固体支持体上の異なる位置に固定された多量の核酸プローブの使用に基づく。これらの固体支持体としては、例えば、ガラス表面、プラスチックマイクロタイタープレート、プラスチックシート、薄層ポリマー、または半導体が挙げられる。これらのプローブは、例えば、支持体に吸着または共有結合され得るか、あるいは基質マトリクス、膜、またはフィルムでマイクロカプセル化またはそうでなければ捕捉され得る。
基質に基づく核酸分析は、特定の配列多型を含むことが既知であるかまたはその疑いのあるサンプル核酸を、固体支持体に結合したプローブのアレイに適用する工程を包含し得る。集団中の多型は、存在する場合、基質に取り付けられた相補配列にハイブリダイズする。次いで、核酸配列のハイブリダイズは、検出工程において検出される。
固体支持体マトリックスに基づくハイブリダイゼーションおよび配列決定法は、高いサンプルＤＮＡ濃度を必要とし得、そして核酸サンプルと、固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとの比較的遅いハイブリダイゼーション速度により阻まれ得る。しばしば、少量のみの鋳型ＤＮＡが入手可能であり、そして標的核酸配列の高い濃度を有することが望ましくあり得る。従って、基質に基づく検出分析は、しばしば、標的核酸のコピー、または標的核酸中の配列のサブセットが増幅される工程を包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法は、例えば、溶液中で、少量のプローブ標的を、数オーダー増加させ得る。しかし、ＰＣＲは、固相アプローチに組み込むのが困難であり得る。なぜならば、増幅したＤＮＡが固体支持体マトリクスの表面上に固定されないからである。
固相に基づく配列多型の検出は、記載されている。例としては、Ｈｕｌｔｍａｎら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：４９３７−４９４６；Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４−６９２により記載される固相原理に基づく「ミニシーケンス」プロトコルである。この研究において、放射標識ヌクレオチドの取り込みが測定され、そしてヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子の三対立遺伝子多型の分析のために使用された。しかし、このような放射性方法は、慣用的な臨床的適用に十分適しておらず、従って、迅速なＤＮＡ配列分析のための簡単で、高感度の非放射性方法の開発もまた、大きな目的である。
（発明の要旨）
本発明は、一部、核酸の配列を決定するためのアレイの使用に基づく。
従って、１つの局面において、本発明は、平坦表面を備えるアレイに関し、この平坦表面に複数の反応チャンバが配置されている。反応チャンバは、５〜２００μｍの中心間距離を有し、そして各チャンバは、０．３μｍと１００μｍとの間の少なくとも１つの寸法の幅を有する。いくつかの実施形態において、アレイは、複数の空洞を有する平坦表面であり、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、アレイは、スライスした光ファイバー束（すなわち、融着した光ファイバーケーブルの束）から形成され、そして反応チャンバは、光ファイバー反応器アレイ（「ＦＯＲＡ」）の１つの表面をエッチングすることにより形成される。空洞がまた、エッチング、成形、またはミクロ機械加工を通じて基板上に形成され得る。
詳細には、アレイの各反応チャンバは、代表的に、０．３μｍと１００μｍとの間、好ましくは、０．３μｍと２０μｍとの間、最も好ましくは、０．３μｍと１０μｍとの間の少なくとも１つの寸法の幅を有する。別の実施形態において、本発明者らは、より大きい反応チャンバ（好ましくは、２０μｍと７０μｍとの間の少なくとも１つの寸法の幅を有する）を企図している。
このアレイは、代表的に、１，０００より多い反応チャンバ、好ましくは、４００，０００より多い反応チャンバ、より好ましくは、４００，０００と２０，０００，０００との間、そして最も好ましくは、１，０００，０００と１６，０００，０００との間の空洞または反応チャンバを含む。各空洞の形状は、しばしば、実質的に六角形であるが、空洞はまた円錐形であり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、平滑な壁表面を有する。しかし、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも１つの不規則な壁表面を有し得ることを企図している。各々の空洞の底は、平坦であってもくぼんでいてもよい。
このアレイは、代表的に、中心間距離が１０〜１５０μｍ、好ましくは、５０〜１００μｍの空洞または反応チャンバを有するよう構築される。
各空洞または反応チャンバは、代表的に、１０μｍと１００μｍとの間の深さを有する；あるいは、深さは、空洞の幅の０．２５倍と５倍との間の大きさ、好ましくは、空洞の幅の０．３倍と１倍との間の大きさである。
１つの実施形態において、本明細書中に記載されるアレイは、代表的に、平坦上表面および平坦底表面を備え、反応チャンバからの光学的シグナルが底平坦表面を通じて検出され得るように光学的に伝導性である。これらのアレイにおいて、代表的に、上表面と底表面との間の距離は、１０ｃｍ以下であり、好ましくは、３ｃｍ以下であり、最も好ましくは、２ｃｍ以下であり、そして通常は、０．５ｍｍと５ｍｍとの間である。
１つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。このアレイはまた、この平坦アレイから離れており、そしてそれらと対向して接触している第２表面を備え、その結果フローチャンバが、アレイ上に形成される。
別の局面において、本発明は、水性環境における別々の平行共通反応を実施するためのアレイ手段に関する。このアレイ手段は、少なくとも１，０００の異なる反応チャンバを有する基板を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、少なくとも１つの試薬を含む１以上の流体が各反応チャンバに送達される場合に、その試薬が壁の外側に拡散する拡散時間が、出発物質が試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるように寸法決めされている。この反応チャンバは、基板上に複数の空洞を作製することによるか、または複数の表面上に異なるパッチを作製することにより形成され得る。これらのパッチは、周囲の平坦表面と異なる表面化学を有する。
１つの実施形態において、アレイの各空洞または反応チャンバは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的に、核酸を含むこれらの反応チャンバ（アレイにおける全ての反応チャンバが必要とされるわけではない）が、１種のみの核酸（すなわち、目的の単一の配列）を含む。この種の核酸の単一のコピーが任意の特定の反応チャンバに存在し得るか、またはこれらは、複数のコピーであり得る。一般的に、反応チャンバは、少なくとも１００コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも１００，０００コピー、そして最も好ましくは、１００，０００〜１，０００，０００コピーの核酸を含むことが好ましい。１つの実施形態において、核酸種は、ＰＣＲ、ＲＣＡ、リガーゼ鎖反応、他の等温増幅、または他の従来の核酸増幅手段を用いて、所望の数のコピーを提供するように増幅される。１つの実施形態において、核酸は、一本鎖である。他の実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、各コピーが末端同士で共有結合したコンカテマーである。
核酸は、チャンバ自体への結合によるかまたはチャンバに送達される移動性固体支持体への結合のよるかのいずれかによって、反応チャンバ中で固定され得る。生物活性剤は、アレイにわたって複数の移動性固体支持体を分散させることにより、アレイに送達され得、各移動性固体支持体は、それらに固定された少なくとも１つの試薬を有し、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適している。
アレイはまた、反応チャンバに配置された移動性固体支持体の集団を含み得る。各移動性固体支持体は、それらに結合された１つ以上の生物活性剤（例えば、核酸または配列決定酵素）を有する。各移動性固体支持体の直径は変化し得、本発明者らは、移動性固体支持体の直径が、各空洞の幅の０．０１〜０．１倍であることを好む。各々の反応チャンバが、１つ以上の移動性固体支持体を含む必要はない。３つの企図されている実施形態が存在する。１つ目は、反応チャンバの少なくとも５％〜２０％が、少なくとも１つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり；２つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも２０％〜６０％が、少なくとも１つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合であり；そして３つ目の実施形態は、反応チャンバの少なくとも５０％〜１００％が、少なくとも１つの試薬が固定された移動性固体支持体を有し得る場合である。
移動性固体支持体は、代表的に、それらに固定された少なくとも１つの試薬を有する。ピロシーケンス反応またはより一般的にはＡＴＰ検出に関する実施形態について、この試薬は、スルフリラーゼまたはルシフェラーゼ活性、あるいはそれらの両方を有するポリペプチドであり得る。移動性固体支持体は、アレイにわたって、１つ以上の核酸配列またはタンパク質または酵素が固定された複数の移動性固体支持体を分散させる方法において使用され得る。
別の局面において、本発明は、光生成のための反応チャンバのアレイを同時にモニタリングするための装置に関する。この光生成は、反応が、特定の部位で起こっていることを示す。この実施形態において、反応チャンバはセンサであり、分析物および反応チャンバ中で光を生成する酵素的手段または蛍光手段を含むよう適合されている。本発明のこの実施形態において、センサは、生化学的アッセイまたは細胞に基づくアッセイにおける使用に適している。この装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバからの光が、光学的に感受性のデバイスの特定の予め決定された領域に衝突するよう配置された光学的に感受性のデバイス、ならびに予め決定された領域の各々に衝突する光のレベルを決定するための手段および各々の反応チャンバについて、時間と共に光のレベルの変化を記録する手段を備える。
１つの特定の実施形態において、この機器は、光捕捉手段を有する光検出手段および光を光検出手段に移送するための第２の光ファイバー束を備える。本発明者らは、光捕捉手段がＣＣＤカメラであることを企図している。第２の光ファイバー束は、代表的に、アレイと光学的に接触しており、その結果、個々の反応チャンバにおいて発生した光は、光捕捉手段への移送のための第２の光ファイバー束の別のファイバーまたは別のファイバーの群により捕捉される。
上記アレイは、水性環境における別の平行する共通の反応を実施するために使用され得る。この方法は、少なくとも１つの試薬を含む流体を記載されるアレイに送達する工程を包含する。ここで、アレイ上の特定の反応チャンバ（必ずしも全てではない）は、試薬と反応し得る出発材料を含む。各反応チャンバは、液体が各反応チャンバに送達される場合、試薬が壁の外側へ拡散するための拡散時間が、出発材料が、試薬と反応して生成物を形成するのに必要とされる時間を超えるような寸法である。この方法はまた、出発材料が各反応チャンバにおいて試薬と反応して生成物を形成した後であるが、任意の１つの反応チャンバに送達された試薬が反応チャンバから任意の他の反応チャンバへと拡散する前の期間に、アレイからの流体を洗浄する工程を包含する。１つの実施形態において、任意の１つの反応チャンバにおいて形成される生成物は、任意の他の反応チャンバにおいて形成さえる生成物から独立しているが、１つ以上の共通の試薬を用いて生成される。この出発材料は、核酸配列であり得、そして流体中の少なくとも１つの試薬は、核酸またはヌクレオチドアナログである。流体はさらに、核酸配列およびヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと反応し得るポリメラーゼを有し得る。この方法の工程は、連続的に反復され得る。
この装置は、アレイに液体試薬を提供するための、本明細書中に記載されるアレイと共に使用するのに適合された新規の試薬送達キュベット、および試薬送達キュベットと連通した試薬送達手段を備える。
本発明の１つ以上の実施形態の開示は、付属の以下の説明に示される。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を、ここに記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかである。明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照を含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者に一般的に理解されているのと同一の意味を有する。他に明らかに記載されない限り、本明細書中で使用または企図される技術は、当業者に周知の標準的な方法である。実施形態の例は、例示の目的にすぎない。本明細書中で列挙される全ての特許および刊行物は、参照として援用される。
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される方法および装置は、最初に核酸をクローニングする必要性なしに、核酸配列情報の決定を可能にする。さらに、この方法は、高感度であり、そして核酸の出発集団においてほんの数コピー存在する鋳型核酸のヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。さらに、この方法は、多量の核酸の配列を同時に決定するために使用され得る。
記載される方法および装置は、一般的に、任意の特定の核酸配列の同定が所望される任意の適用に有用である。例えば、これらの方法は、単一染色体上での単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、複数のＳＮＰを含むハロタイプ、または他の多型の同定、および転写プロファイリングを可能にする。他の用途としては、一次配列を確認または顕在化するため、またはランダム変異誘発スクリーニングから特定の変異クローンを同定するため、およびその種からの遺伝子発現プロフィールを決定するための任意の発達段階または環境条件から単一細胞、全組織、または器官からｃＤＮＡの配列を獲得するための人工ＤＮＡ構築物の配列決定が挙げられる。さらに、これらの方法は、任意の供給源から単離された任意の大きさのＰＣＲ産物および／またはクローン化されたＤＮＡフラグメントの配列決定を可能にする。
本明細書中で記載される方法は、サンプル調製プロセスを含み、このプロセスによって、標的核酸に相補的な１つ以上のコピーを含む核酸に共有結合した複数のアンカープライマーを含む固体アレイまたは移動性固体アレイが生成される。共有結合したアンカープライマーおよび標的核酸の１つ以上のコピーの形成は、好ましくは、環状核酸の相補領域にアンカープライマーをアニーリングし、次いで、アニールしたアンカープライマーをポリメラーゼで伸長して、この環状核酸に相補的な配列の１つ以上のコピーを含む核酸を形成することにより生じる。
固体支持体または移動性固体支持体へのアンカープライマーの結合は、アニールしたアンカープライマーの伸長の前、最中、および後に起こり得る。従って、１つの実施形態において、１つ以上のアンカープライマーが固体基板または移動性固体基板に連結され、その後、アンカープライマーは、標的核酸にアニールされ、そしてポリメラーゼの存在下で伸長される。あるいは、第２の実施形態において、アンカープライマーは、標的核酸に最初にアニールされ、そしてアニールしたアンカープライマーの３’ＯＨ末端がポリメラーゼにより伸長される。次いで、伸長したアンカープライマーは、固体基板または移動性固体基板に連結される。アンカープライマーの配列を変化させることにより、核酸の集団に存在する異なる標的核酸を特異的に増幅することが可能である。
標的核酸における配列は、多数の方法で同定され得る。好ましい配列決定プライマーは、増幅された核酸にアニーリングされ、そしてそれを使用して、配列決定産物を生成する。次いで、この配列決定産物のヌクレオチド配列が決定され、それによって、核酸の決定が可能になる。同様に、１つの実施形態において、テンプレート核酸が増幅され、その後、ビーズまたは他の移動性固体支持体に結合される。他の実施形態において、このテンプレート核酸は、ビーズに結合され、その後、増幅される。
本発明の方法はまた、分析技術によって作製されるＤＮＡフラグメントの配列決定のために使用され得、この分析技術は、酵素処理、放射線処理または化学処理（例えば、クロマチンの部分的なＤＮａｓｅ処理）に対するＤＮＡ構築物の異なる感受性によってか、あるいは、化学物質（これは、ポリメラーゼによって認識される有効な塩基として、メチル−シトシンをチミジン（または他のヌクレオチド）に転換する）での前処理を行ったかまたは行っていない所定の組織から生じる配列を比較することによってＤＮＡのメチル化状態を決定するために、より高いオーダーのＤＮＡ構築物を調査する。さらに、本発明の方法を使用して、一次配列のレベルにおける発達または老化の間に生じる細胞の生理学的変化をアッセイし得る。
本発明はまた、引き続く分析（例えば、配列決定）のための核酸配列を調製する方法を提供する。
（１．核酸の配列決定のための装置）
本発明は、核酸を配列決定するための装置を提供し、この装置は、一般に、配列決定反応を行うための１個以上の反応チャンバ、この反応チャンバにかまたはこの反応チャンバから反応物を送達するための手段、および配列決定反応事象を検出するための手段、を備える。別の実施形態において、この装置は、試薬送達キュベットを備え、このキュベットは、平面上に複数の空洞を備える。好ましい実施形態において、この装置は、この装置の個々の構成要素を制御するため、ならびに配列反応事象の検出から得られる情報を保存および／または分析するための、少なくとも１つコンピューターに接続されている。
本発明はまた、１個以上の反応チャンバを提供し、このチャンバは、不活性基材材料（これはまた、本明細書中で「固体支持体」とも呼ばれる）上にアレイの形態で配置され、規定空間内での配列決定反応において反応物を組み合わせ、そして配列決定反応事象を検出するのを可能にする。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「反応チャンバ」または「分析物反応チャンバ」とは、例えば、核酸の配列決定反応において、反応物の相互作用を容易にする基材材料上の局在化された領域をいう。以下でより完全に議論されるように、本発明によって企図される配列決定反応は、好ましくは、タンデムな多数の個々の核酸サンプルで生じる（特に、ゲノムＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ由来の多数の核酸サンプルの同時配列決定）。従って、本発明の装置は、好ましくは、アレイを備え、このアレイは、このような多数の個々の配列決定反応を行うために、十分な数の反応チャンバを有する。１つの実施形態において、このアレイは、少なくとも１，０００個の反応チャンバを備える。別の実施形態において、このアレイは、４００，０００個より多い反応チャンバを備え、好ましくは、４００，０００個と２０，０００，０００個との間の反応チャンバを備える。より好ましい実施形態において、このアレイは、１，０００，０００個と１６，０００，０００個との間の反応チャンバを備える。
アレイ上の反応チャンバは、代表的には、基材材料において空洞の形態かまたはウェルの形態をとり、このチャンバは、反応物が沈着され得る幅および深さを有する。１種以上の反応物は、代表的には、反応チャンバ内の基材材料に結合され、そして反応の残余物は、この反応を促進しそして反応チャンバを通って流れる媒介物中に存在する。空洞またはウェルとして形成される場合、このチャンバは、好ましくは、以下を可能にするのに、十分な寸法およびオーダーである：（ｉ）チャンバ内への、必要な反応物の導入、（ｉｉ）チャンバ内で生じる反応、ならびに、（ｉｉｉ）チャンバ間での反応物の混合の阻害。ウェルまたは空洞の形状は、好ましくは、環状または円筒状であるが、環状または円筒状の形状に近づくように多面化（ｍｕｌｔｉｓｉｄｅｄ）され得る。別の実施形態において、ウェルまたは空洞の形状は、実質的に六角形である。この空洞は、滑らかな壁面を有し得る。さらなる実施形態において、この空洞は、少なくとも１つの不規則な壁面を有し得る。この空洞は、平面底部または凹面底部を有し得る。反応チャンバは、５μｍと２００μｍとの間、離れて間隔を空けられ得る。２個の隣接した反応チャンバ間の中心間距離を測定することによって、空間が決定される。代表的には、この反応チャンバは、１０μｍと１５０μｍとの間、好ましくは、５０μｍと１００μｍとの間、離れて間隔を空けられ得る。１つの実施形態において、この反応チャンバは、０．３μｍと１００μｍとの間の寸法幅を有する。この反応チャンバは、０．３μｍと２０μｍとの間、好ましくは、０．３μｍと１０μｍとの間、そして最も好ましくは、約６μｍの寸法幅を有し得る。別の実施形態において、この反応チャンバは、２０μｍと７０μｍとの間の幅を有する。最終的には、チャンバの幅は、核酸サンプルが増幅を必要とするか否かに依存し得る。増幅が必要ではない場合、より小さい幅（例えば、０．３μｍ）が好ましい。増幅が必要な場合、より大きい幅（例えば、６μｍ）が好ましい。この反応チャンバの深さは、好ましくは、１０μｍと１００μｍとの間である。あるいは、この反応チャンバは、反応チャンバの寸法幅の０．２５倍と５倍との間の深さ、または別の実施形態において、この反応チャンバの寸法幅の０．３倍と１倍との間の深さを有し得る。
別の局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマーにおいて核酸配列を決定するための装置を包含する。この装置は、アレイを備え、このアレイは、複数の空洞を平面上に有する。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここでこの反応チャンバは、５μｍ〜２００μｍの間の中心間距離を有する。この装置はまた、テンプレート核酸ポリマーを反応チャンバ内に導入するための、核酸送達手段；および、試薬を反応チャンバ内に送達して重合環境を作るための、核酸送達手段を備える（ここで、この核酸ポリマーは、ヌクレオチドが添加される場合、相補的な核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する）。この装置はまた、一連の供給原料を重合環境に連続的に提供するための、試薬送達手段を備え、この各供給原料は、相補的な核酸ポリマーが形成されるヌクレオチド間から選択されるヌクレオチドを含有し、その結果、この供給原料中のヌクレオチドが、配列決定されるテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、このヌクレオチドは、その相補的なポリマー内に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。この装置はまた、無機ピロリン酸の形成を酵素学的に検出するための、検出手段；および、相補的なポリマー内の各ヌクレオチドの同一性を決定し、それによってテンプレートポリマーを配列決定するための、データ処理手段を備える。
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置を包含する。この装置は、複数の空洞を平面上に備える、試薬キュベットを備える。各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、この反応チャンバは、５μｍ〜２００μｍの中心間距離を有する。この装置はまた、公知の窒素性塩基の１つである活性化ヌクレオチド５’−トリホスフェート前駆体を、各反応チャンバ内の反応混合物に加えるための、試薬送達手段を備える。各反応混合物は、テンプレート特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよび１本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを有し、この１本鎖ポリペプチドテンプレートは、相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖（このテンプレートよりも小さい少なくとも１つのヌクレオチド残基）にハイブリダイズされ、活性化ヌクレオシド５’−トリホスフェート前駆体をプロモーター鎖の３’末端上に組み込むのを可能にする反応条件下で、このプライマー鎖の３’末端にて、各テンプレート内で少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成するが、但し、この活性化ヌクレオシド５’トリホスフェート前駆体の窒素性塩基は、テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に相補的である。この装置はまた、ヌクレオシド５’トリホスフェート前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを検出するための検出手段を備え、このプライマー鎖において、このヌクレオシド５’トリホスフェート前駆体の組み込みは、テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、この組み込まれたヌクレオシド５’トリホスフェート前駆体の組成と相補的な窒素性塩基組成物を有することを示す。この装置はまた、第二工程および第三工程を連続して繰り返すための手段を備え、ここで、各連続した繰返しは、公知の窒素性塩基組成物の活性化ヌクレオシド５’トリホスフェート前駆体の１つの型を加えて、その型の組み込みを検出する。この装置はまた、ヌクレオシド前駆体を組み込んだ配列から、各反応チャンバ内のテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定するための、データ処理手段を備える。
（固体支持体材料）
任意の材料の表面がプライマーの安定な結合および核酸配列の検出を可能にする限り、この任意の材料は、固体支持体材料として使用され得る。固体支持体材料は、平面であり得るか、または空洞形成され（ｃａｖｉｔａｔｅｄ）得る（例えば、光ファイバーの空洞形成された末端においてか、またはエッチングされたか、成形されたか、さもなければ、例えば、超小型電気機械系の構成において通常使用される技術を使用して平面内に微細加工された、ミクロウェルにおいて）。例えば、Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ，ＡＮＤ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ，ＶＯＬＵＭＥ １：ＭＡＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，Ｖｏｌｕｍｅ ＰＭ３９，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｄｏｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９７），Ａｏｋｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．６７：９８−９（１９９２）；Ｋａｎｅら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０：２３６３−７６（１９９９）；Ｄｅｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：３１７６−８０（２０００）；Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２８３−９（２０００）を参照のこと。いくつかの実施形態において、固体支持体は、光学的に透過性（例えば、ガラス）である。
光学的に透過な固体支持体上の結合部位のアレイは、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，４４５，９３４号、同第５，７４４，３０５号および同第５，８００，９９２号：Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｆｏｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３（１９９１）；Ｇｕｓｈｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３−２１１（１９９７）；Ｋｉｎｏｓｉｔａら、Ｃｅｌｌ ９３：２１−２４（１９９８）；Ｋａｔｏ−Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９３７５−１９３７７（１９９８）；およびＹａｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ９３：１１１７−１１２４（１９９８）に記載される結合技術において記載される電気集積回路の構成において通常使用されるリソグラフィー技術を使用して、構成され得る。光リソグラフィーおよび電子ビームリソグラフィーは、改変された生体分子（例えば、タンパク質または核酸）の結合を可能にする連結基を用いて、固体支持体または基材を感作する。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：２７−２８（１９９９）；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，ＭＩＣＲＯＭＡＣＨＩＮＩＮＧ，ＡＮＤ ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ，ＶＯＬＵＭＥ １：ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ，Ｖｏｌｕｍｅ ＰＭ３９，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと。あるいは、感作部位のアレイは、Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１７２６−１７３３（１９９４）に記載されるような薄膜技術を使用して作製され得る。
（光ファイバー基材アレイ）
基材材料は、好ましくは、反応事象の検出を容易にする材料から作製される。例えば、代表的な配列決定反応において、ｄＮＴＰの、配列決定されたサンプル核酸への結合は、配列決定反応において遊離されたホスフェートに対する酵素作用によって生じる光子を検出することによって、モニタリングされ得る。従って、透過性材料または光学的に（すなわち、光）導線性の材料から作製される基材材料を用いると、光子の検出が容易になる。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、光生成物を検出および透過するのに使用される光ファイバーのバンドルに連結され得る。このバンドル内の光ファイバーの総数は、配列決定反応において使用されるアレイ内の個々の反応チャンバ数に一致するように変更され得る。バンドル内に組み込まれた光ファイバーの数は、１：１の画像化を可能にするような検出デバイスの解像度に整合するように設計される。バンドルの全体のサイズは、反応チャンバ内の所望の試薬の特性（流れ）を維持しながら、検出デバイスの有効領域を最適化するように選択される。従って、１５μｍ画素を有する４０９６×４０９６画素のＣＣＤ（電荷結合素子）アレイについて、ファイバーバンドルは、約６０ｍｍ×６０ｍｍに選択され得るか、または約９０ｍｍの寸法を有するように選択される。所望の数の光ファイバーが、最初に、バンドルまたは光ファイバーアレイ内に溶接され（ｆｕｓｅｄ）、次いで、この末端が、必要な厚さ（例えば、１．５ｍｍ）の「ウエハ」を形成するように切断および研磨され得る。得られる光ファイバーウエハは、ガラス平面のハンドリング特性と類似のハンドリング特性を有する。個々のファイバーは、任意のサイズ寸法（例えば、３μｍ〜１００μｍ）であり得る。
２つの光ファイバーバンドルが使用されるいくつかの実施形態において、第一のバンドル（本明細書中において、ファイバーバンドルまたはコネクターとも呼ばれる）は、検出デバイスに直接取り付けられ、そして第二のバンドルは、反応チャンバ基材（ウエハまたは基材）として使用される。この場合において、２つのバンドルは、直接接触して配置され、検出デバイス上で反応中心を画像化するために、必要に応じて、光学カップリング流体が使用される。ＣＣＤが検出デバイスとして使用される場合、ウエハは、このＣＣＤ領域の使用を最大にするためにわずかに大きいか、または代表的な顕微鏡スライドの形式（２５ｍｍ×７５ｍｍ）に一致するためにわずかに小さい。バンドル内の個々のファイバーの直径は、最新技術の制限内で、単一反応が検出デバイス内の単一画素で画像化される可能性を最大にするように選択される。例示的な直径は、ファイバーバンドルについては６〜８μｍであり、そしてウエハについては６〜５０μｍであるが、３〜１００μｍの範囲内の任意の直径が使用され得る。ファイバーバンドルは、ＣＣＤカメラの製造業者から市販され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、上面と底面との間の距離は、１０ｃｍより小さく、好ましくは、３ｃｍよりも小さく、最も好ましくは、２ｃｍよりも小さく、そして通常は、０．５ｍｍと５ｍｍとの間である。例えば、ウエハは、Ｉｎｃｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｃｈａｒｌｔｏｎ，ＭＡ）から得られ、切断され、そして光ファイバーの巨大な溶接物から研磨され得る（代表的には、２ｍｍ厚であるが、おそらく０．５〜５ｍｍ厚である）。ウエハは、窓ガラスまたはガラス顕微鏡スライドと類似のハンドリング特性を有する。
反応チャンバは、光ファイバー材料から作製される基材に形成され得る。この光ファイバーの表面は、ファイバーのバンドルの末端を処理して（例えば、酸を用いて）、光ファイバー材料に窪みを形成することによって空洞形成される。従って、空洞が光ファイバーバンドルから形成される実施形態において、好ましくは、この空洞は、この光ファイバーバンドルの一端をエッチングすることによって形成され得る。空洞形成された各表面は、反応チャンバを形成し得る。このようなアレイは、光ファイバー反応アレイまたはＦＯＲＡとして本明細書中で参照される。この深さにおける窪みは、個々の光ファイバーの約１／２の直径からこのファイバーの２〜３倍の直径までの範囲である。空洞は、光ファイバーウエハの一端を酸性浴中に種々の時間量置くことによって、このファイバーの末端に導入され得る。時間量は、所望の反応空洞の全体の深さに依存して、変化し得る（例えば、Ｗａｌｔら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１８８８を参照のこと）。広いチャネル空洞は、約１４ｍｍ×４３ｍｍの均一な流速の大きさを有し得る。従って、この適切な寸法と適切な４．８２×１０−４空洞／μｍ２の密度において、この装置は、約２９０，０００の流体的に受容可能な空洞を有し得る。光ファイバーバンドルの端部においてエッチングされた空洞において、分子を結合する（および、この結合した分子を検出する）ためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１２４２−１２４８（１９９８）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６８１−１６８４（１９９６）；ＨｅａｌｅｙおよびＷａｌｔ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２２１３−２２１６（１９９７）を参照のこと。反応性部位のパターンはまた、平面支持体上に反応性パッドのパターンを作製する際に使用される光リソグラフィー技術と類似の光リソグラフィー技術を使用して、ミクロウェルに作製され得る。Ｈｅａｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１０７８−１０８０（１９９５）；ＭｕｎｋｈｏｌｍおよびＷａｌｔ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８：１４２７−１４３０（１９８６）、ならびにＢｒｏｎｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：２７５０−２７５７（１９９５）を参照のこと。
光ファイバーウエハの反対面（すなわち、非エッチング面）は、代表的には、（例えば、浸漬油または他の光学カップリング流体によって）第二の光ファイバーバンドルへの光学カップリングを可能にするように、高度に研磨される。この第二の光ファイバーバンドルは、反応チャンバを備える光学ウエハの直径と正確に一致し、かつ取り付けられた検出デバイス（例えば、ＣＣＤ画像化システムまたはカメラ）に光産物を伝達するためのコンジットとして作動するのに役立つ。
１つの好ましい実施形態において、光ファイバーウエハは、例えば、１５％ Ｈ２Ｏ２／１５％ ＮＨ４ＯＨ（容量：水溶液中の容量）、次いで６回の脱イオン水でのリンス、次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ、次いで６回の脱イオン水、次いで１５％ Ｈ２Ｏ２／１５％ ＮＨ４ＯＨ、次いで６回の脱イオン水（各洗浄において、１／２時間のインキュベーション）の連続的な洗浄によって、全体にわたって洗浄される。
光ファイバーウエハの表面は、好ましくは、配列決定反応におけるその使用を容易にするようにコーティングされる。このコーティングされた表面は、好ましくは、光学的に透過であり、タンパク質および核酸の結合を容易にし、そして固定化されたタンパク質の活性に負の影響を及ぼさない。さらに、この表面は、好ましくは、高分子の非特異的吸収を最小にし、そして連結された高分子（例えば、結合された核酸およびタンパク質）の安定性を増強する。
アレイをコーティングするのに適切な材料としては、例えば、プラスチック（例えば、ポリスチレン）が挙げられる。プラスチックは、好ましくは、スピンコーティングされるかまたはスパッタリングされ得る（０．１μ厚）。アレイをコーティングための他の材料としては、金の層（例えば、２４カラットの金０．１μｍ厚）が挙げられ、これは、長鎖チオールアルカンの自己アセンブリングした単層に吸収される。次いで、ビオチンが、この表面に共有的にカップリングされ、そしてビオチン結合タンパク質（例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン）で飽和される。
コーティング材料としては、さらに、基材にプライマーを固着するために使用される系が挙げられる。オルガノシラン剤（これは、アミノ基、スルフヒドリル基またはカルボキシ基を介してタンパク質の直接的な共有カップリングを可能にする）もまた、アレイをコーティングするために使用され得る。さらなるコーティング物質としては、以下が挙げられる：光反応性リンカー（例えば、光ビオチン（ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ））（Ａｍｏｓら、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ａ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｉｓｅら（編）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ｐｐ．８９５９２６，１９９５）。
さらなるカップリング材料としては、以下が挙げられる：好ましくは、表面上かまたは重合後に共有結合されたポリマー鎖上で直接重合化され得る、親水性ポリマーゲル（ポリアクリルアミド、ポリサッカリド）（Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３４７，１９１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２．２４７８（１９９０））、ならびに、特に、ポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに吸収される、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー（トリブロックコポリマー（例えば、ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）；Ｆ−１０８としてもまた公知）（Ｈｏら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １４：３８８９−９４，１９９８）、ならびに、ビオチン結合タンパク質の受動的吸収層。この表面はまた、アミン結合を介して試薬のカップリングを可能にするエポキシドでコーティングされ得る。
さらに、上記材料のいずれかは、酵素およびヌクレオチドの固定化のために当該分野で一般的に公知の、１種以上の官能基（例えば、金属キレート基（例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、五座キレート剤）（これらは、６×Ｈｉｓタグ化タンパク質および核酸に結合する））で誘導体化され得る。
二次元表面の理論的な結合能力を越えた、引き続く処理（例えば、酵素の結合（後で議論される））のために利用可能な結合部位の数を増加させる表面コーティングが、使用され得る。
好ましい実施形態において、溶接された光ファイバーバンドル／ウエハを作製するために利用される個々の光ファイバーは、光学画像化システムにおいて利用され得る直径（すなわち、３μｍ）よりも大きい直径（すなわち、６μｍ〜１２μｍ）である。従って、単一の反応性部位を画像化するために、いくつかの光学画像化ファイバーが使用され得る。
（本発明のアレイの概要）
１つの局面において、本発明はアレイを包含し、このアレイは、その上に配置された複数の反応チャンバを有する平面を備え、ここで、この反応チャンバは、５〜２００μｍの中心間距離を有し、そして各チャンバは、０．３μｍと１００μｍとの間の、少なくとも１つの寸法幅を有する。いくつかの実施形態において、このアレイは、その上に複数の空洞を備える平面であり、ここで、各空洞は、分析物反応チャンバを形成する。好ましい実施形態において、このアレイは、スライスされた光ファイバーバンドル（すなわち、溶接された光ファイバーケーブルのバンドル）から作製され、そしてこの反応チャンバは、その光ファイバー反応アレイ（「ＦＯＲＡ」）の１つの表面をエッチングすることによって形成される。この空洞はまた、エッチング、成形または微細加工によって、基材に形成され得る。
詳細には、このアレイにおける各反応チャンバは、代表的には、０．３μｍと１００μｍとの間、好ましくは、０．３μｍと２０μｍとの間、最も好ましくは、０．３μｍと１０μｍとの間の、少なくとも１つの寸法幅を有する。別々の実施形態において、本発明者らは、好ましくは、２０μｍと７０μｍとの間の少なくとも１つの寸法幅を有する、巨大な反応チャンバを企図する。
このアレイは、代表的には、１，０００個より反応チャンバ、好ましくは、４００，０００個より多い、より好ましくは、４００，０００個と２０，０００，０００個との間、そして最も好ましくは、１，０００，０００個と１６，０００，０００個との間の、空洞または反応チャンバを備える。各空洞の形状は、しばしば実質的に六角形であるが、この空洞はまた、円筒状でもあり得る。いくつかの実施形態において、各空洞は、滑らかな壁面を有するが、本発明者らは、各空洞がまた、少なくとも１つの不規則壁面を有し得ることも企図する。空洞の各々の底面は、平面または凹面であり得る。
このアレイは、代表的には、１０μｍ〜１５０μｍの間、好ましくは、５０μｍ〜１００μｍの間の中心間距離を有する、空洞または反応チャンバを有するように構成される。
各空洞または反応チャンバは、代表的には、１０μｍ〜１００μｍの間の深さを有し、この深さは、空洞の幅の０．２５倍と５倍との間のサイズであり、好ましくは、空洞の幅の０．３倍と１倍との間のサイズである。
１つの実施形態において、本明細書中で記載されるアレイは、代表的には、平らな上面および平らな底面を備え、これは、光学的に導電性であり、その結果、反応チャンバからの光学シグナルは、この底平面を介して検出され得る。これらのアレイにおいて、代表的には、その上面と底面との間の距離は、１０ｃｍよりの小さく、好ましくは、３ｃｍよりも小さく、最も好ましくは、２ｃｍよりも小さい。
１つの実施形態において、アレイの各空洞は、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を備える。このアレイはまた、平面アレイから離れて間隔を空け、それと対向して接触した第二の表面を備え、その結果、流動チャンバが、このアレイにわたって形成される。
別の局面において、本発明は、水性環境において、別々の並列一般反応を行うための、アレイ手段を包含し、ここでこのアレイ手段は、少なくとも１，０００個の別個の反応チャンバを有する基材を備える。これらのチャンバは、試薬と反応し得る出発材料を含む。反応チャンバの各々は、特定の寸法を有し、その結果、少なくとも１種の試薬を含有する１種以上の流体が各反応チャンバに送達される場合、試薬がウェルから拡散するための拡散時間は、出発材料が試薬と反応して生成物を形成するために必要とする時間を上回る。この反応チャンバは、基材上に複数の空洞を作製することによってか、または平面上に別個のパッチ（これは、周囲平面と異なる表面化学を有する）を作製することによって形成され得る。
１つの実施形態では、アレイの各空洞または反応チャンバーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的には、核酸を含むこれらの反応チャンバーは、（アレイ中のすべての反応チャンバーがそうである必要はないが）単一種のみの核酸の（すなわち、目的である単一の配列）を含む。任意の特定の反応チャンバー内にこの種の核酸の単一コピーが存在し得るか、またはそれらは複数コピーであり得る。一般に、反応チャンバーが、少なくとも１００コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも１００，０００コピーの核酸配列、そして最も好ましくは１００，０００〜１，０００，０００コピーの核酸を含むことが好ましい。当業者は、任意の１つの反応チャンバー中の核酸種のコピー数における変化が、高温配列決定反応で発生する光子の数に影響し、そして必要に応じて慣用的に調節され、多かれ少なかれ光子シグナルを提供し得ることを認識する。
１つの実施形態では、この核酸種は、ＰＣＲ、ＲＣＡ、リガーゼ連鎖反応、その他の等温増幅、または核酸増幅のその他の従来手段を用い、増幅されて所望のコピー数を提供する。１つの実施形態では、この核酸は一本鎖である。その他の実施形態では、この一本鎖ＤＮＡは、各コピーの端と端とが共有結合で連結されたコンカテマーである。
（送達手段）
上記反応チャンバーに反応物を送達するための手段の例は、本発明の灌流チャンバーであり、図３に示される。この灌流チャンバーは、透明の上部スライドおよび下部スライドをもつシールされた区画を備える。これは、基板表面の表面上の溶液の流れを可能にし、そして試薬の迅速な交換を可能にするように設計されている。従って、これは、例えば、ピロリン酸配列決定反応を実施するために適切である。このチャンバーの形状および寸法は、バルク流れ交換、拡散的交換、または層流または乱流措置いずれかの両方を含む試薬交換を最適化するために調節され得る。
この反応チャンバーへの反応物の正確な交換は、本発明における正確な測定のために重要である。バルク流体の対流不在下では、反応に関与する物質の輸送（および隣接反応部位間またはミクロベッセル間の交差汚染または「クロストーク」）は拡散によってのみ生じ得る。反応部位が２−Ｄ表面上の点源であると考えられるとき、目的の化学種（例えば、反応生成物）は、その生成の部位から半径方向に拡散し、上記表面上に実質的に半球形の濃度フィールドを生成する。
化学物質（ｅｎｔｉｔｙ）が所定の時間ｔに拡散し得る距離は、拡散の数学（Ｃｒａｎｋ、Ｔｈｅ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ、第２版、１９７５）を考慮することにより概算様式で推定され得る。任意の所定の方向ｘ（ｃｍ）の拡散輸送の速度は、Ｆｉｃｋの法則により以下の式で与えられる。
Figure 0004354184
 ここで、ｊは、拡散係数Ｄ（ｃｍ２／ｓ）をもつ種の単位面積あたりのフラックス（ｇ−ｍｏｌ／ｃｍ２−ｓ）であり、そして∂Ｃ／∂ｘは、その種の濃度勾配である。拡散の数学は、拡散単独により物質が移動し得る特徴または「平均」距離が、拡散係数および拡散が生じることを可能にする時間の両方の１／２べき乗で測定される。実際、オーダーの大きさまで、この特徴的拡散距離は、拡散係数と時間との積の平方根として（これは、システムの幾何学的構造および拡散プロセスに課せられる初期および／または境界条件の事項を考慮するオーダー一致（ｏｒｄｅｒ ｕｎｉｔｙ）の数的因子により調節される）推定され得る。
この特徴的拡散距離を、拡散物質が時間ｔにたどり得る、以下の２乗平均距離ｄｒｍｓとして推定することが便利である：
Figure 0004354184
 上記のように、拡散化学物質が代表的にたどる距離は、それが拡散するために利用可能な時間の平方根とともに変化し−−そして、反対に、拡散する化学物質が所定の距離をたどるために必要な時間は、拡散により横切られる距離の２乗で測定される。従って、オーダー１−１０−５ｃｍ２／秒の拡散係数Ｄにより特徴付けられる単純な低分子量生体分子について、０．１秒、１．０秒、２．０秒、および１０秒の時間間隔で横切られ得る２乗平均距離ｄｒｍｓは、式２により、それぞれ１４μｍ、４５μｍ、６３μｍ、および１４１μｍと推定される。
対流および拡散の両方の機構が同時に起こることを含む輸送プロセスにおける対流と拡散の相対的重要性は、無次元数−すなわちＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅの助けにより測定され得る。このＰｅｃｌｅｔ数は、２つの速度（ｒａｔｅまたはｖｅｌｏｃｉｔｙ）の比−すなわち、対流流れの速度を拡散「流れ」またはフラックスで除する、として概算され得る。より詳細には、このＰｅｃｌｅｔ数は、特徴的な流れ速度Ｖ（ｃｍ／秒）が特徴的な拡散速度Ｄ／Ｌ（これもまたｃｍ／秒の単位で表される）で除された比である−両者を同じ方向にとると：
Figure 0004354184
 式３において、Ｖは、対流流れの平均または特徴的スピードであり、ほぼ、容量流れ速度Ｑ（ｃｍ３／秒）を、流れが利用可能な断面積Ａ（ｃｍ２）で除することにより決定される。特徴的な長さＬは、流れの方向および拡散の方向に平行な方向（すなわち、最も急な濃度勾配の方向）に測定される代表的距離またはシステム寸法であり、そしてプロセス中で拡散が起こる代表的または「平均」距離を代表するように選択される。そして最終に、Ｄ（ｃｍ２／秒）は、問題の拡散種に対する拡散係数である。（代替であるが等価なＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅの公式は、それを、２つの特徴的な時間の比−すなわち、拡散および対流の代表的時間の比としてみる。Ｐｅｃｌｅｔ数についての式３は、特徴的拡散時間Ｌ２／Ｄを、特徴的な対流時間Ｌ／Ｖで除することにより等しく良好に得られ得る。）
輸送の対流成分は、一であること（ｕｎｉｔｙ）と比較してＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅが大きい状況において、拡散成分より優勢であることが予期され得る。逆に、輸送の拡散成分は、一であることと比較してＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅが小さい状況において、対流成分より優勢であることが予期され得る。Ｐｅｃｌｅｔ数が１よりかなり大きいか、またはかなり小さいかのいずれかの極端な状況では、輸送は、対流単独によるか、または拡散単独によるかのいずれかで生じると、それぞれ、正確に推測され得る。最後に、推定されたＰｅｃｌｅｔ数が一であることのオーダーである状況では、そのときは、対流および拡散の両方が、輸送プロセスの全体に顕著な役割を演じていることが予期され得る。
代表的な低分子量生体分子の拡散係数は、ほぼ、１０−５ｃｍ２／秒のオーダーである（例えば、スクロースについて０．５２・１０−５ｃｍ／秒、そしてグリシンについて１．０６・１０−５ｃｍ／秒）。従って、１００μｍ（すなわち、０．０１ｃｍ）の距離だけ離れた反応中心、空洞、またはウェルについて、これらのような低分子量溶質に対するＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅは、約１０μｍ／秒（０．００１ｃｍ／秒）より大きい流れ速度について、一であることを超える。わずか１０μｍ（すなわち、０．００１ｃｍ）だけ離れた空洞については、低分子量溶質に対するＰｅｃｌｅｔ数Ｐｅは、約１００μｍ／秒（０．０１ｃｍ／秒）より大きい流れ速度について、一であることを超える。従って、対流輸送は、非常に遅い流れ速度を除くすべて、および／または非常に短い拡散距離について拡散輸送に対して優勢であるように見える。
拡散種の分子量が実質的により大きい場合−−例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド、タンパク質、および前者の構築物のような大きな生体分子であるとき−−種の拡散度は、対応してより小さく、そして対流が、両方の機構を含む輸送プロセスにおいて、拡散に対してより重要な役割を演じる。例えば、タンパク質の水相拡散係数は、約１０倍の範囲に入る（Ｔａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９６１）。タンパク質拡散度は、リボヌクレアーゼ（１３，６８３ダルトンの分子量をもつ小タンパク質）について１．１９×１０−６ｃｍ２／秒の値で階層付けられ、そしてミオシン（４９３，０００ダルトンの分子量をもつ大タンパク質）について１．１６×１０−７ｃｍ２／秒の値で階層付けられている。なおより大きな物質（例えば、４０６０万ダルトンのタバコモザイクウイルスまたはＴＭＶ）は、より低い拡散度（特に、ＴＭＶについて４．６×１０−８ｃｍ２／秒）（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、１９７５）により特徴付けられる。対流と拡散とがほぼ等しく輸送に寄与する流体速度（すなわち、一であることのオーダーのＰｅ）は、種拡散度に直接比例して測定される。
Ｐｅｃｌｅｔ数の形式の助けにより、反応チャンバー、空洞またはウェルに供給される反応物−−およびそれから除去される生成物に対する対流のインパクトを測定することが可能である。その一方、最も穏やかな対流でさえ、アレイまたはＦＯＲＡ中の空洞の内部に反応物が送達される速度を認識し得るほど増大することは明らかである。特に、単純化のために、ほぼ等しい対流および拡散流れに対する規準がＰｅ＝１であると考えられると仮定する。そのときは、ほんの０．００４ｃｍ／秒のオーダーの対流流れ速度は、反応物拡散度が１×１０−５ｃｍ２／秒の推定値を仮定すると、拡散単独によりウェルの底に反応物が供給され得るのとほぼ同じ速度で、反応物を２５μｍ深さのウェル中に運ぶために十分であることが推定され得る。２．５μｍ深さのマイクロウェルの底から頂部までのこのような種の拡散の速度に一致するために必要な対応する流れ速度は、０．０４ｃｍ／秒のオーダーであると推定される。これよりかなり高いＦＯＲＡを通る流れ速度が可能であり、それによって、最も穏やかな対流流れが、ＦＯＲＡ反応中心、空洞またはウェルへの反応物の拡散的供給を増強し得る程度を例示する。
好ましくは、灌流チャンバーは、イメージングシステムが準備される間それから離脱されており、そして配列決定分析が実施されるときのみイメージングシステム上に配置される。１つの実施形態では、固体支持体（すなわち、ＤＮＡチップまたはスライドグラス）が、金属またはプラスチックハウジングにより適所に保持され、これは、前記固体支持体の再配置を可能にするようにアセンブルまたは脱アセンブルされ得る。灌流チャンバーの固体支持体の下側は、反応チャンバーアレイを保持し、そして伝統的な光学を基礎にした焦点システム、高開口数対物レンズを用いて反応中心アレイのイメージをＣＣＤイメージングシステム上に集める。
分析のための代替システムは、サンプルが、表面、例えば、微細製作されたチップ上に分配され、そしてそれによって、配列されたサンプルのセットが２次元フォーマットで固定化され得るアレイフォーマットを用いることである。多くのサンプルがそれによって並行して分析され得る。本発明の方法を用い、多くの固定化されたテンプレートがこの中で分析され得、これは、酵素および１つのヌクレオチドを含む溶液を、上記表面上で流すことを可能すること、次いで各サンプルについて生成されるシグナルを検出することによった。次いでこの手順は繰り返され得る。あるいは、テンプレートに相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを、上記表面上に分配し、次いでテンプレートとハイブリダイズする。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルにより各オリゴヌクレオチドについてモニターされ得る。上記表面の異なる領域からのシグナルを組み合わせることにより、配列を基礎にした分析が、種々のジデオキシヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応の４つのサイクルにより実施され得る。
上記支持体が空洞化されたアレイの形態、例えば、ＦＯＲＡの末端、またはマイクロウェルのその他のアレイであるとき、試薬のための適切な送達手段は、流すことおよび洗浄すること、そしてまた、例えば、流すこと、スプレーすること、エレクトロスプレーすること、インクジェット送達、スタンプすること、超音波微粒化（Ｓｏｎｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｔｏｎ、ＮＹ）およびローリングを含む。好ましくは、すべての試薬溶液は、１０−２０％エチレングリコールを含み、蒸発を最小にする。スプレーすることが用いられる場合、試薬は、工業タイプのスプレーノズル（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏ．、Ｗｈｅａｔｏｎ、ＩＬ）またはＣＡＭＡＧ ＴＬＣ Ｓｐｒａｙｅｒ（Ｃａｍａｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）のような薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で用いられるアトマイザーにより生成される均一な薄層中のＦＯＲＡ表面に送達される。これらの噴霧器は、０．３〜１０μｍのサイズ範囲のエアロゾルスプレー粒子に試薬を微粒化する。
タンパク質溶液およびＤＮＡ溶液のエレクトロスプレー沈着（ＥＳＤ）は、現在、これら分子の質量スペクトル分析のためのイオンを生成するために用いられている。静電力の制御下でＦＯＲＡ基板の特定領域上への荷電したエレクトロスプレー生成物の沈着が示唆されている。ＥＳ沈着されたタンパク質およびＤＮＡは、それぞれ、抗体に特異的に結合し、そしてＤＮＡプローブにマッチするそれらの能力を保持し、ドットイムノ結合（ＤＩＢ）中およびＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ中で、ＥＳＤ製造されたマトリックスの使用を可能にする（ＭｏｒｏｚｏｖおよびＭｏｒｏｚｏｖａ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（１５）：３１１０−７（１９９９））。
インクジェット送達は、文献中に記載されているように（例えば、Ｒｏｄａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８（３）：４９２−６（２０００））、タンパク質溶液およびその他の生体高分子に適用可能である。これはまた、例えば、ＭｉｃｒｏＦａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌａｎｏ、ＴＸ）から市販されている。
あるいは、試薬溶液は、リソグラフィーに類似の方法によりＦＯＲＡ表面に送達され得る。ローラー（スタンプ；親水性材料が用いられるべきである）は、最初、リザーバー中で湿潤スポンジを用いて試薬層で覆われ、そして次にＦＯＲＡ表面上にロールされる（それに対して押し付けられる）。
好ましくは、連続的な試薬送達ステップは、当該分野で従来公知の技法を用いて洗浄ステップと分離されている。これらの洗浄は、例えば、高速流れ噴霧器またはＦＯＲＡもしくはマイクロウェルアレイ表面上の液体流れによることを含む、上記に記載の方法を用いて実施され得る。これらの洗浄は、出発物質が試薬と反応し、各反応チャンバーで生成物を形成した後であるが、任意の１つの反応チャンバーに送達された試薬がその反応チャンバーから他の任意の反応チャンバー中に拡散する前の任意の時間に生じ得る。１つの実施形態では、任意の１つの反応チャンバーは、他の任意の反応チャンバー中で形成されるが、１つ以上の共通試薬を用いて生成される生成物とは独立している。
完全な装置の実施形態は図２に示されている。この装置は、離脱可能な灌流チャンバー２２６と連通する入口導管２００を備える。この入口導管２００は、複数のチューブ２０２−２１２を経由して配列決定試薬の侵入を可能にし、この複数のチューブは、それぞれ、複数の配列決定調合試薬ベッセル２１４−２２４と連通している。
試薬は、能動流れを駆動するために加圧システムまたはポンプのいずれかを用い、導管２００を通じて灌流チャンバー２２６中に導入される。代表的には、この試薬の流速は、０．０５〜５０ｍｌ／分（例えば、１〜５０ｍｌ／分）であり、０．１００ｍｌ〜連続流れ（洗浄のため）の容量である。バルブは、ヌクレオチドおよび洗浄試薬のサイクリングを可能にするコンピューター制御下にある。配列決定試薬、例えば、ポリメラーゼは、ヌクレオチドと予備混合され得るか、または流れに添加され得る。多岐管は、６つのチューブ２０２−２１２のすべてを、灌流チャンバー供給のために１つにする。従って、いくつかの試薬送達ポートが灌流チャンバーへのアクセスを可能にする。例えば、ポートの１つを利用して水性配列決定試薬のインプットを可能にし得、その一方、別のポートが、これら試薬（および任意の反応生成物）を灌流チャンバーから引き抜かれることを可能にする。
灌流チャンバー２２６は、複数の反応チャンバーを備える基板を備える。この灌流チャンバーは、増幅された核酸上に、要求される水溶液中の配列決定試薬の均一な直線状流れを可能にし、そしてこれら試薬の迅速かつ完全な交換を可能にする。従って、これは、ピロリン酸を基礎にした配列決定反応を実施するために好適である。灌流チャンバーはまた、アンカープライマーを調製し、増幅反応、例えば、本明細書に記載のＲＣＡ反応を実施するために用いられ得る。
本発明はまた、アレイに、核酸配列決定酵素を送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸配列決定酵素の１つは、スルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）活性をもつポリペプチドであり得るか、またはこの核酸配列決定酵素は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドであり得る。別の実施形態では、この核酸配列決定酵素の１つは、スルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつポリペプチドであり得る。より好適な実施形態では、この試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切であり得る。
好適な実施形態では、１つ以上の試薬が移動可能な固体支持体の集団、例えば、ビーズまたはマイクロスフェアに固定化または付着されたアレイに送達される。このビーズまたはマイクロスフェアは、球状である必要はなく、不規則形状のビーズが用いられ得る。代表的には、これらは多くの物質、例えば、プラスチック、ガラスまたはセラミックから構築され、そしてビーズのサイズは、ナノメーターからミリメーターの範囲にあり、これは反応チャンバーの幅に依存する。好ましくは、各移動固体支持体の直径は、各空洞の幅の０．０１〜０．１倍の間であり得る。種々のビーズ化学物質、例えば、メチルスチレン、ポリスチレン、アクリルポリマー、ラテックス、常磁性体、トリアゾル、炭素グラファイトおよび二酸化チタンを用い得る。ビーズの構築または化学は、所望の試薬の付着を容易にするように選択され得る。
別の実施形態では、最初に生体活性試薬が合成され、そして次にビーズに共有結合で付着される。当業者に認識されるように、これは、生体活性試薬およびビーズの組成に依存してなされ得る。チオール、アミン、カルボキシルなどのような化学的に反応性の基を用いる特定のポリマーのような固体支持体表面の官能化は当該分野で一般に公知である。従って、ユーザーにより所望の官能性の付着を容易にする表面化学を有する「ブランク」ビーズが用いられ得る。ブランクビーズのこれらの表面化学のさらなる例は、制限されずに、脂肪族アミンおよび芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびスルフェートを含む。
これらの官能基は、一般に、公知の化学物質を用い、ビーズに任意の数の異なる候補薬剤を付加するために用いられ得る。例えば、炭化水素を含む候補薬剤は、アミノ官能化支持体に付着され得る；炭化水素のアルデヒドを、標準的な技法を用いて作成し、そして次にこのアルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。代替の実施形態では、スルフヒドリルリンカーが用いられ得る。ＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドのような、当該分野で公知の多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり（例えば、本明細書に参考として援用される、１９９４年のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、架橋リンカーの技術セクション、１５５−２００頁を参照のこと。）、これを用い、システインを含有するタンパク質の試薬を支持体に付着し得る。あるいは、候補試薬上のアミノ基を、表面上のアミノ基への付着のために用い得る。例えば、多数の安定な二官能性基が当該分野で周知であり、これにはホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーが含まれる（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１５５−２００頁を参照のこと）。さらなる実施形態では、カルボキシル基（表面由来であるか、または候補薬剤由来のいずれか）を、周知のリンカー（Ｐｉｅｒｃｅカタログを参照のこと）を用いて誘導体化し得る。例えば、カルボジイミドは、アミンなどの良好な求核試薬による攻撃のためにカルボキシル基を活性化する（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、７（４）：２７５−３０８（１９９１）を参照のこと）。タンンパク質の候補試薬はまた、当該分野で公知である、例えば、ポリマーへの抗体の付着のための他の技法を用いて付着され得る；Ｓｌｉｎｋｉｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：３４２−３４８（１９９１）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、前述；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１７６−６１８５（１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：２２０−２３５（１９９４）を参照のこと。候補薬剤は、上記に列挙したようなものを含む種々の方法で付着され得ることが理解されるべきである。好ましくは、付着の様式は、候補試薬の官能性を有意に改変しない；すなわち、候補試薬は、標的とのその相互作用を可能にするような柔軟な様式で付着されるべきである。
ビーズ上に酵素を固定化する特別の技法は先行技術で公知である。１つの事例では、ＮＨ２表面化学ビーズが用いられる。表面活性化は、ｐＨ６．９を提供する（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）リン酸緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ）中の２．５％グルタルアルデヒドで達成される。この混合物は、攪拌ベッド上で、約２時間、室温で攪拌される。次いで、ビーズを超純水＋０．０１％−０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）ですすぎ、そしてｐＨ７．７ ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で再びすすぐ。最後に、酵素を、好ましくは、０．４５μｍのアミコンマイクロポアフィルターを用いて予備濾過した後、溶液に添加する。
移動固体支持体の集団は、反応チャンバー中に配置される。いくつかの実施形態では、５％〜２０％の反応チャンバーが、移動固体支持体を、その上に少なくとも１つの試薬を固定化して有し得るか、２０％〜６０％の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも１つの試薬を固定化して有し得るか、または５０％〜１００％の反応チャンバーが、試薬移動固体支持体を、その上に少なくとも１つの試薬を固定化して有し得る。好ましくは、少なくとも１つの反応チャンバーが、その上に固定化された少なくとも１つの試薬を有する移動固体支持体を有し、そしてこの試薬は、核酸配列決定反応における使用に適切である。
いくつかの実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は、スルフリラーゼ活性をもつポリペプチド、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドまたはスルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方をもつキメラポリペプチドであり得る。１つの実施形態では、それは、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ融合タンパク質であり得る。スルフリラーゼ反応の生成物はルシフェラーゼにより消費されるので、これら２つの酵素間の近接は、２つの酵素を融合タンパク質の形態に共有結合することにより達成され得る。本発明は、基板チャネリングにおけるのみならず、生産コストを低減すること、およびストレプトアビジンでコートされたビーズ上の結合部位の数を潜在的に倍にすることにおいて有用である。
別の実施形態では、スルフリラーゼは、熱安定性ＡＴＰスルフリラーゼである。好適な実施形態では、この熱安定性スルフリラーゼは、室温を超える温度で活性である（少なくとも５０℃まで）。１つの実施形態では、このＡＴＰスルフリラーゼは好熱菌由来である。さらなる実施形態では、移動固体支持体は、その上に固定化された第１の試薬および第２の試薬を有し得、この第１の試薬はスルフリラーゼ活性をもつポリペプチドであり、そしてこの第２の試薬は、ルシフェラーゼ活性をもつポリペプチドである。
別の実施形態では、移動固体支持体に固定化された試薬は核酸であり得；好ましくは、この核酸は一本鎖のコンカタマーである。好適な実施形態では、この核酸は、核酸の配列決定、例えば、熱配列決定反応のために用いられ得る。
本発明はまた、移動固体支持体を用いてＡＴＰ活性を検出または定量する方法を提供する；好ましくは、ＡＴＰは、核酸配列決定反応の一部として検出または定量され得る。
核酸または試薬酵素のいずれかが付着した移動固体支持体で「じゅうたんをひかれた（ｃａｒｐｅｔｅｄ）」ＦＯＲＡを図７に示す。
固体支持体は、従来の光学的バンドルまたは光ファイバーバンドルと合わせたＣＣＤシステムを備える画像化システム２３０に必要に応じて連結される。１つの実施形態において、灌流チャンバー基板としては、水性インターフェース付近で発生した光が、直接光ファイバーを通って基板またはチャンバーに伝達されるような光ファイバーアレイウェファーが挙げられる。ＣＣＤシステムが、光ファイバーコネクターを備える場合、画像化は、
灌流チャンバー基板を、コネクターと直接接触して配置することによって達成され得る。あるいは、従来の光学が、例えば、Ｉ−Ｉ拡大複数孔レンズシステム（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ ｌｅｎｓ ｓｙｓｔｅｍ）を用いることによって、光ファイバー基板の外側からの直接ＣＣＤセンサーへの光を画像化するために用いられ得る。この基板が光ファイバーとの組み合わせを提供しない場合、レンズシステムはまた、上記のように使用され得、この場合、基板または灌流チャンバーカバーのいずれかは、光学的に透明である。例示的なＣＣＤ画像化システムは、上記の通りである。
画像化システム２３０は、基板表面上のリアクタからの光を収集するために使用される。光は、例えば、当該分野において公知の高感度、低ノイズの装置を用いてＣＣＤ上で画像化され得る。光ファイバーに基づく画像化のためには、光ファイバーを直接カバースリップに組み込むことが好ましく、また、マイクロウェルを形成する光ファイバーを有するＦＯＲＡのためには、検出器に光を伝達する光ファイバーもまた好ましい。
画像化システムは、コンピュータ制御およびデータ収集システム２４０に連結される。一般的に、任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが用いられ得る。コンピュータ制御およびデータ収集システムはまた、試薬の送達を制御するためのコンジット２００に連結されている。
ピロリン酸配列反応により発生した光子は、それらが収束デバイス（例えば、光学的レンズまたは光ファイバー）を通過し、そしてＣＣＤ素子に収束される場合のみ、ＣＣＤによって捕捉される。しかし、出力された光子は、全ての方向に均等に飛び出す。二次元アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）を利用した場合の、これらの続く「捕捉」をおよび量を最大限にするために、光子が発生する点に可能な限り近くで（例えば、二次元の固体支持体に直接）それを収集することが好ましい。これは、（ｉ）カバースリップと従来の光学レンズもしくは光ファイバーバンドルとの間に光学的浸漬オイルを利用すること、または、好ましくは、（ｉｉ）光ファイバーを直接カバースリップ自体に組み込むこと、のいずれかにより達成される。同様に、薄く、光学的に透明な二次元の表面が用いられる場合、光ファイバーバンドルはまた、その背面表面に対して配置され、反応／灌流チャンバー全体の深さを通して「画像化」する必要性を除外する。
（検出手段）
この反応事象（例えば、ルシフェラーゼにより発生された光子）は、種々の検出装置（例えば、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、吸収光計（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）、ルミノメーター、電荷注入デバイス（ｃｈａｒｇｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（ＣＩＤ）、または他の固体状態検出器および本明細書中に記載される装置）を用いて検出および定量され得る。好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、融合された光ファイバーバンドルに適合したＣＣＤカメラの使用によって達成される。別の好ましい実施形態において、出力された光子の定量は、マイクロチャネルプレート増強装置に適合したＣＣＤカメラの使用によって達成される。背部を薄くした（ｂａｃｋ−ｔｈｉｎｎｅｄ）ＣＣＤが、感度を増加させるために用いられ得る。ＣＣＤ検出器は、例えば、Ｂｒｏｎｋｓら、１９９５．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２７５０−２７５７に記載される。
例示的なＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ ＬＭ４８５ ＣＣＤチップおよび６〜８μｍの個々の光ファイバーの直径を有する１−１光ファイバーコネクター（バンドル）を有するＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）Ｓｅｒｉｅｓ ６００ ４ポートカメラである。このシステムは、４０９６×４０９６（すなわち１６００万ピクセルより多い）を有し、１０％〜４０％を超える範囲までの量子効率を有する。従って、波長に依存して、ＣＣＤセンサ上に画像化される光子の４０％程度の多さのものが、検出可能な電子に変換される。
他の実施形態において、蛍光部分が、標識として用いられ得、そして反応事象の検出は、アレイの表面を走査する共焦走査顕微鏡を用いて実施され得るか、またはより小さい光学分割が可能であり、それにより「より稠密な」アレイの使用を可能とする近視野光学顕微鏡（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＳＮＯＭ）が利用可能である。例えば、ＳＮＯＭを用いて、個々のポリヌクレオチドが、１００ｎｍ未満（例えば、１０ｎｍ×１０ｎｍ）の距離、離れた場合に、区別され得る。さらに、走査性トンネル顕微鏡（Ｂｉｎｎｉｎｇら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、５５：７２６−７３５、１９８２）および原子力顕微鏡（Ｈａｎｓｗａら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ ＢｉｏＰｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ、２３：１１５−１３９、１９９４）が使用され得る。
本発明は、反応チャンバーのアレイを、反応が特定の部位で起こっていることを示す光について、同時にモニターするための装置を提供する。これらの装置は、複数の空洞化された表面を有する平面基板から形成される反応チャンバーのアレイを備え得、各々の空洞化された表面は、分析物を含むように適合された反応チャンバーを形成する。これらの反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、４００，０００より多い個々のチャンバーを有し得る。これらの装置はまた、使用の際に特定の反応チャンバーからの光が、この光学的に高感度なデバイスの特定の予め決定された領域に衝突するように構成された光学的に高感度なデバイスを備え得る。これらの装置は、各々の予め決定された領域上で衝突した光のレベルを決定するための手段およびこの反応チャンバーの各々について、経時的に、種々の光を記録するための手段をさらに備え得る。
本発明はまた、光ファイバーのバンドルの一端に複数の空洞化した表面を有する、第一のバンドルの光ファイバーから形成されるアレイを備え得る分析センサを提供し、各々の空洞化表面は、分析物を含有するように適合された反応チャンバーを形成する。反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有し得、そしてこのアレイは、４００，０００より多い個々のチャンバーを有し得る。この分析センサはまた、反応チャンバー内で光を発生させるための酵素的手段または蛍光手段を有し得る。この分析センサは、光捕捉手段を備える光検出手段およびこの光検出手段に光を伝達するための第二の光ファイバーバンドルをさらに備え得る。この第二の光ファイバーバンドルは、個々の反応チャンバーで発生した光が光捕捉手段への光の伝達のために第二の光ファイバーバンドルの別々のファイバーまたは別々の光ファイバーの群により捕捉されるように、このアレイと光学的に接触され得る。光捕捉手段は、本明細書中で記載されるＣＣＤカメラであり得る。反応チャンバーは、その上に生物活性薬剤と有する１つ以上の移動式固体支持体を備え得る。いくつかの実施形態において、分析センサは、生化学的アッセイにおける使用に適するか、または細胞ベースのアッセイにおける使用に適する。
（核酸の配列決定法）
本発明はまた、核酸の配列決定をするための方法を提供し、この方法は、一般的に、以下：（ａ）複数の反応チャンバーまたは空洞内に配置された、１つ以上の核酸アンカープライマーおよび複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｂ）少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートに有効量の核酸アンカープライマーをアニーリングして、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する工程；（ｃ）プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体と、ポリメラーゼを組み合わせて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸を共有結合された伸長アンカープライマーを形成する工程；（ｄ）１コピー以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングする工程；（ｅ）ポリメラーゼおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長し、配列決定産物、および予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物、を生成する工程；および（ｆ）配列決定反応副産物を同定する工程であって、これにより核酸の配列を決定する工程、を包含する。１つの実施形態において、配列決定副産物は、ＰＰｉである。別の実施形態において、ｄＡＴＰアナログまたはｄｄＡＴＰアナログがデオキシアデノシン三リン酸またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに用いられ得る。このアナログは、ポリメラーゼの基質としての役割を果たし得るが、ＰＰｉ検出酵素の基質としての役割を果たし得ない。この方法は、水性環境における、別々の並行する一般的な反応において実施され得る。
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は、一般的に、以下：（ａ）平面表面上の複数の空洞内に配置された複数のサンプルＤＮＡを提供する工程；（ｂ）各々の反応チャンバー中の反応混合物に、既知の窒素を含む既知の塩基の活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体を添加する工程であって、各々の反応混合物は、テンプレートに指向されるヌクレオチドポリメラーゼおよび一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、このテンプレートは、プライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の３’末端で少なくとも１つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である、工程；（ｃ）ヌクレオシド５’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かを決定する工程であって、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す、工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を連続的に繰り返す工程であって、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の１つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する工程；ならびに（ｅ）ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、を包含する。
本発明の１つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結している。このアンカープライマーは、伸長アンカープライマーの形成の前または後に、粒子に連結され得る。配列決定副産物は、ＰＰｉであり得、そしてスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応の組み合わせは、検出のための光を発生させるために用いられる。スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたはそれらの両方が、各々の反応部位に配置された１つ以上の移動性固体支持体上に固定化され得る。
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法に関連する。この方法は、複数のサンプルＤＮＡを提供する工程を包含し、これらの各々のサンプルＤＮＡは、平面表面上の複数の空洞内に配置され、これらの空洞の各々は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有する。次いで、既知の窒素を含む塩基の活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体が、各々の反応チャンバーに反応混合物に添加される。各々の反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼおよびテンプレートより少なくとも１ヌクレオチド残基一本鎖ポリヌクレオチド残基を含み、このテンプレートは、プライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、このテンプレートより少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされて、各々のテンプレートにおいてプライマー鎖の３’末端で少なくとも１つの対形成しないヌクレオチド残基を形成するが、ただし、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素を含む塩基が、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の窒素を含む塩基である。次いで、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体がプライマー鎖に組み込まれたか否かが決定され、ここで、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の組み込みは、テンプレートの対形成しないヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の塩基に相補的な、窒素を含む塩基の組成を有すること示す。次いで、これらの工程が連続的に繰り返され、ここで各々の連続的な反復は、既知の窒素を含む塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の１つの型を付加し、そしてその組み込みを検出する。次いで、各々の反応チャンバーにおけるテンプレートの対形成しないヌクレオチド残基の塩基配列が、ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、決定される。
別の局面において、本発明は、テンプレート核酸重合体中の核酸配列を決定するための方法に関連する。この方法は、１つの平面表面上の複数の空洞に複数のテンプレート核酸重合体を導入する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこれらの反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有する。各々の反応チャンバーはまた、核酸重合体が、ヌクレオチドが添加されたときに相補的核酸重合体の合成のためのテンプレート重合体としての役割を果たす重合環境を有する。一連の供給原料が、重合環境に連続的に提供され、各々の供給原料は、相補的核酸重合体が形成されるヌクレオチドの中から選択されるヌクレオチドを有し、その結果、供給原料中のヌクレオチドが配列決定されるテンプレート重合体中の次のヌクレオチドに相補的である場合、そのヌクレオチドが、相補的重合体中に組み込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される。次いで、無機ピロリン酸の形成が、相補的重合体中の各々のヌクレオチド（従ってテンプレート重合体の配列）の正体を決定するために検出される。
別の局面において、本発明は、サンプルＤＮＡのＤＮＡ配列における標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、１つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたＤＮＡのサンプルを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有し、ＤＮＡは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。次いで、標的位置に直ぐに隣接する位置で固定化一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる、伸長プライマーが、提供される。固定化された一本鎖ＤＮＡは、予め決定されたヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供され、ここでこの予め決定されたヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物が形成される。次いで、この配列決定反応副産物が、同定され、これにより、標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する。
別の局面において、本発明は、サンプルＤＮＡ配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、１つの平面表面上の複数の空洞内に配置されたサンプルＤＮＡを提供する工程を包含し、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここでこの反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有し、ＤＮＡは、反応チャンバー中に配置される前または後のいずれかに一本鎖にされ、そして標的位置に直ぐに隣接してサンプルＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する。次いで、サンプルＤＮＡ配列および伸長プライマーは、ヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼ反応に供され、これにより、ヌクレオチド三リン酸は、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ、組み込まれ、そしてピロリン酸（ＰＰｉ）を放出し、このヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかで添加される。次いで、ヌクレオチドが組み込まれたことを示すＰＰｉの放出が、検出される。
別の局面において、本発明は、一本鎖サンプルＤＮＡ配列中の標的位置の塩基を同定する方法に関連する。この方法は、標的位置に直ぐに隣接してサンプルＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程を包含し、このサンプルＤＮＡは、１つの平面表面上の複数の空洞内に配置され、各々の空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで、反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間距離を有し、ＤＮＡは、反応チャンバーに配置される前または後のいずれかに一本鎖にされる。このサンプルＤＮＡおよび伸長プライマーは、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供され、これによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、標的位置における塩基に相補的である場合にのみ組み込まれ、そしてピロリン酸（ＰＰｉ）を放出し、予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別々のアリコートにか、または同じサンプル−プライマー混合物に連続的にかのいずれかに添加される。ＰＰｉの任意の放出は、酵素的に検出されて、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが組み込まれているかを示す。これは、ＰＰｉ検出酵素は、ポリメラーゼ反応工程に含まれ、そしてデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはジデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、ＰＰｉ検出酵素の基質としての役割を果たさないｄＡＴＰアナログまたはｄｄＡＴＰアナログが用いられるという点で特徴付けられる。
別の局面において、本発明は、核酸の配列決定をするための方法に関連する。この方法は、１つ以上の核酸アンカープライマー；および上記のアレイ上の複数の空洞内に配置された複数の核酸テンプレートを提供する工程を包含する。有効量の核酸アンカープライマーが、少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングされて、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を産生する。次いで、プライマーが結合されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体は、ポリメラーゼと合わされて、環状核酸テンプレートに相補的な複数コピーの核酸に共有結合した伸長したアンカープライマーを形成する；次いで、１コピー数以上の共有結合された相補的核酸に有効量の配列決定プライマーをアニーリングさせる。次いで、この配列決定プライマーは、プライマーおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて伸長されて、配列決定産物および、予め決定された三リン酸が、配列決定プライマーの３’末端上に組みこまれる場合、配列決定副産物を産生する。次いで、配列決定反応副産物が、同定され、これにより核酸の配列を決定する。
（アンカープライマーの構造）
本発明のアンカープライマーは、一般的に、軸領域および少なくとも１つのアダプター領域を含む。好ましい実施形態において、このアンカープライマーは、少なくとも２つの連続するアダプター領域を含む。軸領域は、アンカープライマーの５’末端に存在し、そして固体基材にアンカープライマーを付着させるためのヌクレオチドの領域を含む。
アダプター領域は、複数の核酸配列の１つ以上のメンバー中に存在する相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、２つの隣接するアダプター領域を含み、これらの領域は、標的核酸配列の別々の末端に連結される相補的領域にハイブリダイズする。この実施形態は、図１に例示され、これは、以下でより詳細に議論される。さらなる実施形態において、アンカープライマー中のアダプター領域は、第二の核酸配列中に存在する配列の非連続的領域に相補的である。例えば、各々のアダプター領域は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により産生されるフラグメントの各々の末端に相同であり得る。このフラグメントは、例えば、配列多型を含むことが既知または予想される配列を含み得る。さらに、アンカープライマーは、標的核酸配列のギャップの開いた（ｇａｐｐｅｄ）領域（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの欠失に起因して非連続的である領域）に相同である２つのアダプター領域を含み得る。これらの配列を有するアダプター領域が用いられる場合、ギャップの開いた配列に対応する整列するオリゴヌクレオチドが、テンプレート核酸分子集団に沿ってアンカープライマーにアニーリングされ得る。
アンカープライマーは、必要に応じて、更なるエレメント（例えば、１つ以上の制限酵素認識部位、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えば、Ｔ７プロモーター部位）、同定されたＤＮＡ配列中に存在する配列（例えば、既知の遺伝子中に存在する配列））を含み得る。アダプター領域はまた、配列多型に隣接することが知られている配列を含み得る。配列多型は、ヌクレオチドの置換、挿入、欠損、または２つの別の同一の核酸配列の間の配列の差異を生じる他の再構成を含む。配列多型の例は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。
一般的に、塩基対形成し得る任意の核酸は、アンカープライマーとして用いられ得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーは、オリゴヌクレオチドである。本明細書中に使用される場合、用語オリゴヌクレオチドは、モノマー対モノマーの相互作用の通常のパターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変されたモノマーまたは連結（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）の直鎖状のオリゴマーを含む。これらの型の相互作用としては、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成などが挙げられ得る。一般的に、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結して、例えば、３〜２００、８〜１５０、１０〜１００、２０〜８０、または２５〜５０のモノマー単位の大きさの範囲をとるオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字列により表現される場合はいつも、そのヌクレオチドは、左から右へ５’→３’方向に方向付けられており、そして本明細書中で他に示されない限り、文字「Ａ」が、デオキシアデノシンを示し、文字「Ｔ」が、チミジンを示し、文字「Ｃ」が、デオキシシトシンを示し、そして文字「Ｇ」が、デオキシグアノシンを示すことが理解される。本発明のオリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。しかし、例えば、酵素によるプロセシングが必要とされる場合などは、天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、一般的に生物学的機能の保持に必要とされる。
（固体基材へのプライマーの連結）
アンカープライマーは、増感部位で固体基材に連結される。連結されたプライマーを含む固体基材の領域は、本明細書中で、アンカーパッドと呼ばれる。従って、固体支持体上での増感状態を特定することによって、アンカーパッドのアレイまたはマトリクスを形成することが可能である。これらのアンカーパッドは、例えば、固体支持体上に等間隔でエッチングされた小さい直径のスポットであり得る。アンカーパッドは、この基材が空洞作成されているか、エッチングされているか、または上で議論されるような他のミクロ機械加工されている場合、空洞またはウェルの底部に配置され得る。
１つの実施形態において、アンカープライマーは、粒子に連結される。アンカープライマーは、伸長したアンカープライマーの形成の前または伸長アンカープライマーの形成の後にその粒子に連結され得る。
このアンカープライマーは、共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して固体支持体に付着され得る。一般的に、当該分野において認識されている任意の連結が、使用され得る。当該分野において一般的なそのような連結の例としては、任意の適切な金属（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋）−ヘキサヒスチジン複合体、ビオチン結合タンパク質（例えば、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮＴＭ改変アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））、ストレプトアビジン／ビオチン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、モノクローナル抗体／抗原、およびマルトース結合タンパク質／マルトース、およびプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）カップリング技術が挙げられる。適切なタグを含むサンプルが、増感された基板と共にインキュベートされて、その結果、０、１つ、または複数の分子が、各々の増感部位に付着する。
あるビオチン−（ストレプト−）アビジン−ベースのアンカー方法は、固体表面上で乾燥された光活性ビオチン可能なアナログの薄層を使用する（ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：２４９〜２５４）。次いで、ビオチンアナログは、活性化ビオチンの規定された領域を作成するように、マスクを介して白色光に曝露される。次いで、アビジン（またはストレプトアビジン）が、添加され、そして活性化ビオチンに結合される。アビジンは、遊離ビオチン結合部位を保有し、これは、ビオチン−（ストレプト−）アビジン結合を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを「アンカー」するために利用され得る。
あるいは、アンカープライマーは、光除去可能な保護基を有するビオチン誘導体を用いて固体支持体に付着され得る。この部分は、固体支持体（例えば、ガラス表面）に付着されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に共有結合される。ＰｉｒｒｕｎｇおよびＨｕａｎｇ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：３１７〜３２１を参照のこと。ついで、マスクが、規定された照射領域内で活性化ビオチンを作製するために使用される。次いで、アビジンが、ＢＳＡ−ビオチン−アビジン−ビオチン結合を介して実質的に付着されたビオチン化ＤＮＡと共に照射範囲に配置され得る。所望される場合、シランの中間層は、規定された領域におけるＢＳＡ結合を位置づけるためにパターン化され得るシリコンジオキシドシラン表面上の自己アセンブリした単層に沈着される。例えば、Ｍｏｏｎｅｙら、１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１２２８７〜１２２９１を参照のこと。
プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ベースの付着において、アンカープライマーは、プルロニック化合物としても公知であるまずポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマーの末端に付着される。プルロニック部分は、アンカープライマーを固体基材に付着するために使用され得る。プルロニックは、疎水性表面とポリプロピレンオキシドとの間の反応によって疎水性表面に付着する。残りのポリエチレンオキシド基は、表面から伸長し、これによって疎水性の環境を作る。ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）は、ポリエチレンオキシド鎖の末端に結合体化して、ヘキサヒスチジンタグ化アンカープライマーの付着を可能にし得る。別の実施形態において、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）は、ポリエチレン鎖の末端に結合体化して、ジスルフィド結合を介したチオール化アンカープライマーの付着を可能にし得る。１つの好ましい実施形態において、プルロニックＦ１０８（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）が、付着のために使用される。
固体支持体上の各感光性部位は、潜在的に複数のアンカープライマーを付着し得る。従って、各アンカーパッドは、１つ以上のアンカープライマーを含み得る。単一の生産性反応中心のみを有するパッドの数（例えば、アンカープライマーから伸長された単一配列のみを有する、伸長反応後のパッドの数）を最大化することが好ましい。これは、以下を含むがそれらに限定されない技術によって達成され得る：（ｉ）表面上で洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希釈を変化させること；（ｉｉ）ビオチン化プライマーがアビジン表面と接触するインキュベーション時間を変化させること；（ｉｉｉ）平均で、各パッド上の１つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを作成するような、開環または閉環テンプレートの濃度を変化させること；あるいは（ｉｖ）単一分子の直径（＜１μｍ）に接近するためにアンカーパッドのサイズを減少させ、その結果、１つのアンカーの結合が、別のアンカーの結合を阻害するか、または遮断すること（例えば、小さいスポットでの光活性化によって）；あるいは（ｖ）アンカーパッドのサイズを減少させて、その結果、１つの環状テンプレートの結合が、第２の環状テンプレートの結合を阻害または遮断すること。
いくつかの実施形態において、それぞれ個々のパッドは、１個の連結したアンカープライマーのみを含む。１つのアンカープライマーのみを有するパッドは、固体支持体上で、選択されたアンカープライマーの限界希釈を実行することによって作成され得、その結果、平均で、１つのアンカープライマーのみが、各パッド上に沈着される。パッドに適用されるアンカープライマーの濃度は、例えば、ポアソン分布モデルを用いて計算され得る。
単一のアンカープライマーを含む反応パッドの数を最大化するために、１連の希釈実験が実行され、ここで、アンカープライマー濃度または環状テンプレート濃度の範囲が変更される。高度に希釈されたプライマーの濃度について、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布は、任意の１つのパッド上て伸長したアンカープライマーの数を特徴づける。実際に伸長されるプライマーの数は変化し得るが、最大３７％のパッドが、単一の伸長したアンカープライマーを有する（単一のアンカーオリゴヌクレオチドを有するパッドの数）。この数は、以下のように得られ得る。
Ｎｐを、パッド上のアンカープライマーの平均数とし、そしてｆを、アンカープライマーが環状テンプレートで伸長される確率とする。次いで、１パッドあたりの伸長アンカープライマーの平均数は、Ｎｐｆであり、これらは、量ａとして規定される。実際に伸長されるプライマーの数は変化可能である。低濃度の限界において、同じパッドに結合しているプライマーおよび環状テンプレートは、互いに独立しており、そしてポアソン分布Ｐ（ｎ）は、任意のパッド上で伸長したアンカープライマーの数ｎを特徴づける。この分布は、以下によって数学的に規定され得る：Ｐ（ｎ）＝（ａｎ／ｎ！）ｅｘｐ（−ａ）、Ｐ（１）＝ａ ｅｘｐ（−ａ）。確率Ｐ（１）は、ａ＝１についてのその最大値ｅｘｐ（−１）のをパッドの３７％が、仮定し、単一の伸長されたアンカープライマーを有する。
アンカープライマー濃度および環状テンプレート濃度の範囲は、１に最も近いＮｐｆの値を見出すために引き続いてスキャンされ得る。この分布を最適化する好ましい方法は、各反応パッド上の複数のアンカープライマーを可能にするが、環状テンプレートの限界希釈を使用し、その結果、平均で、各パッド上の１つのプライマーのみが伸長して配列決定テンプレートを生成する。
あるいは、低濃度のアンカープライマーで、最大で１つのアンカープライマーは、各反応パッドにおそらく結合する。高濃度の環状テンプレートが使用され得、その結果、各プライマーがおそらく伸長される。
反応パッドが平らな表面または光ファイバーアレイ上に整列される場合、個々のパッドは、１面が約１０μｍであり、隣接するパッド間で１００μｍの間隔を有する。故に、１ｃｍ２の表面上に、合計約１０，０００個のマイクロリアクターが沈着され得、そしてポアソン分布に従って、これらのうち約３７００は、単一のアンカープライマーを含む。特定の実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドが、固体支持体に付着された後、改変（例えば、ビオチン化）酵素が沈着されて、この表面上の残りの使用されていないアビジン結合部位に結合する。
他の実施形態において、複数のアンカープライマーが、アレイ中の任意の１つの個々のパッドに付着される。複数の環状核酸テンプレート（以下により詳細に記載される）の限界希釈は、このように固定化されたアンカープライマーにハイブリダイズされ得、その結果、平均で、各パッド上の１つのプライマーのみが核酸テンプレートにハイブリダイズされる。使用されるライブラリー濃度は、例えば、限界希釈およびＰｏｉｓｓｏｎ分布モデルを利用して計算され得る。
（核酸テンプレート）
本発明に従って配列決定され得る核酸テンプレート（例えば、核酸ライブラリー）は、一般に開環核酸分子または閉環核酸分子を含み得る。「閉環」は、共有結合的に閉じられた環状核酸分子（例えば、環状ＤＮＡ分子または環状ＲＮＡ分子）である。「開環」は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル基を有する線状一本鎖核酸分子である。１つの実施形態において、一本鎖核酸は、少なくとも１００コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端と末端で共有結合している。いくつかの実施形態において、開環は、線状の２本鎖核酸分子からインサイチュで形成される。所定の開環核酸分子の末端は、ＤＮＡリガーゼによって連結され得る。開環分子の５’末端および３’末端での配列は、第２の核酸分子中の隣接するヌクレオチドの２つの領域（例えば、アンカープライマーのアダプター領域、または第２のＤＮＡ分子に密接に隣接している２つの領域）に相補的である。従って、開環分子の末端は、ＤＮＡリガーゼを用いて連結され得るか、またはギャップ充填反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。開環は、Ｌｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号に詳細に記載される。開環は、ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ用）またはＲＮＡリガーゼの存在下で、例えば、アンカープライマーへの開環のアニーリング後に閉環に転換され得る。
所望の場合、核酸テンプレートは、南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブとして提供され得る。南京錠プローブは、線状オリゴヌクレオチドであり、各末端に配置される標的−相補的配列を含み、そしてこれらはリンカー配列によって分離されている。このリンカーは、核酸配列のライブラリーのメンバーの末端に連結され得、この核酸配列は、例えば、物理学的に剪断されるか、制限エンドヌクレアーゼで消化されている。標的配列へのハイブリダイゼーションの際、これらの線状オリゴヌクレオチドの５’末端領域および３’末端領域は、近位に運ばれる。この近位は、２つのプローブセグメントが（適切にハイブリダイズする場合）酵素的ライゲーション（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いる）によって共有結合されることを可能にし、従って、プローブを、特異的標的配列に連結させた閉環分子に転換する（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５〜２０８８を参照のこと）。得られたプローブは、遺伝子配列改変体に対するその特異性および選択性（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５〜２３２；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５２〜２５５を参照のこと）、ならびに得られた反応産物が、特定の標的配列に局在したままであるという事実の両方に起因して、多くの遺伝子配列の同時分析に適切である。さらに、多くの異なるプローブの分子内連結は、多重ＰＣＲベースの方法論よりも非特異的交差反応性に対する感受性が低いと予測され、ここでプライマーの非同族対は、不適切な増幅産物を生じ得る（例えば、ＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＮｉｌｓｓｏｎ，１９９７．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２９９：５８５〜５９０を参照のこと）。
出発ライブラリーは、一本鎖核酸分子、または二本鎖核酸分子のいずれかを含むように構築され得、但し、この核酸配列は、ライブラリー中に存在する場合、アニーリングのために利用可能な領域を含むか、またはアンカープライマー配列へのアニーリングのために利用可能にされ得る。例えば、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして使用する場合、二本鎖テンプレートの領域は、アンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして作用するために、少なくとも過渡的に一本鎖である必要がある。
ライブラリーのテンプレートは、複数のエレメントを含み得、このエレメントとしては、アンカープライマーに相補的な１つ以上の領域が挙げられるが、これに限定されない。例えば、テンプレートライブラリーは、配列決定プライマーに相補的な領域、コントロールヌクレオチド領域、および引き続いて特徴づけられる配列決定テンプレートから構成される挿入配列を含み得る。以下により詳細に説明されるように、コントロールヌクレオチド領域は、副産物の量と組み込まれたヌクレオチドの数との間の関連を較正するために使用される。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、一致した二重鎖を形成し得るヌクレオチド配列をいう。
１つの実施形態において、ライブラリーのテンプレートとしては、以下が挙げられる：（ｉ）アンカープライマーに相補的な２つの別個の領域、（ｉｉ）配列決定プライマーに相同な１つの領域、（ｉｉｉ）１つの任意のコントロールヌクレオチド領域、（ｉｖ）配列決定される、例えば、３０〜５００、５０〜２００、または６０〜１００ヌクレオチドの挿入配列。当然、このテンプレートは、２つ、３つ、または４つ全てのこれらの特徴を備え得る。
テンプレート核酸は、核酸の任意の供給源（例えば、任意の細胞、組織、または生物）から構築され得、そして当該分野で認識されている任意の方法によって生成され得る。適切な方法としては、例えば、ゲノムＤＮＡの超音波処理、および核酸分子の最初の集団から所望の範囲の長さのフラグメントを生成するための１種以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）での消化が挙げられる。好ましくは、１種以上の制限酵素は、別個の４塩基の認識配列を有する。このような酵素の例としては、例えば、Ｓａｕ３Ａ１、Ｍｓｐ１、およびＴａｑ１が挙げられる。好ましくは、この酵素は、対応する制限酵素についての認識配列を含む領域を有するアンカープライマーとの結合体化において使用される。いくつかの実施形態において、アンカープライマーの１つのアダプター領域または両方のアダプター領域は、既知の制限酵素認識配列に隣接しているさらなる配列を含み、これによって、アンカープライマーへの目的の特定の制限フラグメントのアンカープライマーへの捕捉またはアニーリングを可能にする。他の実施形態において、制限酵素が、ＩＩＳ型制限酵素と共に使用される。
あるいは、テンプレートライブラリーは、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを生成することによって作製され得る。所望される場合、ｃＤＮＡライブラリーは、特定のＲＮＡ、内部フラグメント、または単離されたＲＮＡの３’末端を含むフラグメントの３’末端特徴を得るために、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに処理される。アンカープライマー中のアダプター領域は、テンプレートライブラリー中に存在すると考えられる目的の配列（例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるフラグメント内の既知または疑われる配列多型）に相補的であり得る。
１つの実施形態において、索引オリゴヌクレオチドは、テンプレートライブラリーのメンバーに付着して、テンプレート核酸とこのテンプレート核酸が由来する核酸集団との実質的な相関を可能にし得る。例えば、出発ＤＮＡ集団の１つ以上のサンプルは、任意の以前に開示された方法（例えば、制限消化、超音波処理）を用いて別々にフラグメント化され得る。各サンプルに特異的な指示オリゴヌクレオチド配列は、フラグメント化集団のメンバーの末端に付着、例えば、連結される。指示オリゴヌクレオチドは、環状化、増幅、および必要に応じて配列決定のための領域として作用し得、これは核酸を指示またはコード化するために使用され得るのを可能にし、これが由来する出発サンプルを同定する。
複数の識別可能な指示プライマーを用いて作製される別個のテンプレートライブラリーは、実質的な反応のために一緒に混合され得る。ライブラリーのメンバーの配列決定は、指示オリゴヌクレオチドに対応する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、任意の所定のフラグメントの起源が、推測され得る。
（プライマー−テンプレート核酸複合体のアニーリングおよび増幅）
核酸のライブラリーは、認識された技術を用いてアンカープライマー配列にアニーリングされる（例えば、Ｈａｔｃｈら、１９９９，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５〜４０；Ｋｏｏｌ，米国特許第５，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号を参照のこと）。一般に、アンカープライマーをテンプレート核酸配列にアニーリングさせるための任意の手順は、アダプター領域、またはアンカープライマー配列中の領域とテンプレートライブラリーに特異的（すなわち、完全、またはほぼ完全）な相補性の形成を生じる限り、適切である。
多数のインビトロでの核酸増幅技術を利用して、アンカープライマー配列を伸長し得る。増幅されたＤＮＡのサイズは、好ましくは、アンカーパッドのサイズよりも小さく、そしてまたアンカーパッド間の距離よりも小さい。
増幅は、代表的に、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ、そして１つ、２つ、３つまたは４つの型のヌクレオチド三リン酸、そして必要に応じて補助的な結合タンパク質）の存在下で実行される。一般に、プライムされた３’−ＯＨ基を伸長し得る任意のポリメラーゼは、これが３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠損する限り使用され得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４およびＴ７、ならびにＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントが挙げられる。適切なＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素、およびヒト免疫不全ウイルス−Ｉ由来の逆転写酵素が挙げられる。
多数のインビトロでの核酸増幅技術が、記載されている。これらの増幅方法論は、以下の方法に区別され得る：（ｉ）熱循環ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｓａｉｋｉら、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０〜１３５４を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎｙ，１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：１８９〜１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０．Ｇｅｎｅ ８９：１１７〜１２２を参照のこと）、および転写ベースの増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７を参照のこと）を必要とする方法、ならびに（ｉｉ）等温増幅系−自己維持、配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８を参照のこと）；ＱＢレプリカーゼ系（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７〜１２０２を参照のこと）；鎖置換増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ａｐｒ １１；２０（７）：１６９１〜６）；ならびにＰＮＡＳ １９９２ Ｊａｎ １；８９（１）：３９２〜６；およびＮＡＳＢＡ Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９１ Ｄｅｃ；３５（３）：２７３〜８６に記載される方法。
等温増幅はまた、ローリングサークルベースの増幅（ＲＣＡ）を含む。ＲＣＡは、例えば、Ｋｏｏｌ，米国特許第５，７１４，３２０号、およびＬｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号；Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５〜４０で考察される。ＲＣＡの結果は、アンカープライマーの３’末端から伸長された単独のＤＮＡ鎖であり（従って、固体支持体マトリクスに連結され）、そしてプライマー配列にアニーリングされた複数コピーの環状テンプレートを含むコンカテマーを含む。代表的に、それぞれ、例えば、約３０〜５００、５０〜２００、または６０〜１００のヌクレオチドサイズ範囲のサイズを有する１，０００〜１０，０００以上のコピー数の環状テンプレートが、ＲＣＡで得られ得る。
アンカープライマーへの環状核酸分子のアニーリングに続くＲＣＡ増幅の産物は、図１Ａに図式で示される。環状テンプレート核酸１０２は、アンカープライマー１０４にアニーリングされ、これはその５’末端で表面１０６に連結され、そして伸長のために利用可能な遊離３’ＯＨを有する。環状テンプレート核酸１０２は、２つのアダプター領域１０８および１１０を含み、これらは、アンカープライマー１０４中の配列の領域に相補的である。配列決定プライマーに相同な挿入物１１２および領域１１４がまた、環状テンプレート核酸１０２に含まれ、これは、以下に記載される配列決定反応で使用される。
アニーリングの際、アンカープライマー１０４上の遊離３’−ＯＨは、テンプレート核酸１０２内の配列を用いて伸長され得る。アンカープライマー１０２は、複数回、テンプレートに沿って伸長され得、各々の反復は、アンカープライマーから伸長した配列に、環状テンプレート核酸に相補的な配列を添加する。４回の反復または４回のローリングサークル複製は、伸長されたアンカープライマー増幅産物１１４として図１Ａに示される。アンカープライマーの伸長は、基材１０６に共有結合しているか、または別々の方法で物理学的に付着している増幅産物を生じる。
環状テンプレートおよびアンカープライマーのさらなる実施形態は、図１Ｂ〜１Ｄ中に、より詳細に示される。図１Ｂは、ライゲーションの際にアンカープライマーの伸長のためのテンプレートとして働き得るアニーリングした開環線状基質へのアニーリングを例示する。配列５’−ＴＣｇ ＴｇＴ ｇＡｇ ｇＴＣ ＴＣＡ ｇＣＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ｇＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ｇＴＴ ｇＣＣ ＴＡＡ ｇＣＴ ｇＣＡ ｇＣＣ Ａ−３’（配列番号１）を有するテンプレート分子は、その５’末端にビオチンリンカーおよび配列５’−ｇＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣｇＡ Ｔｇｇ ＣＴｇ ＣＡｇ ＣＴＴ−３’（配列番号２）を有するアンカープライマーにアニーリングする。テンプレートのアニーリングは、テンプレート分子の５’末端および３’末端を隣接させる。アンカープライマーの３’ＯＨは、環状テンプレートを用いて伸長され得る。
１ヌクレオチド多型の同定のための環状テンプレートおよびアンカープライマーの使用は、図１Ｃに示される。配列５’−ｇＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣｇＡ Ｔｇｇ ＣＴｇ ＣＡｇ ＣＴＴ−３’（配列番号３）を有する一般的アンカープライマーが示される。このアンカープライマーは、配列５’−ＴＴＴ ＡＴＡ ＴｇＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣｇＡ ＣＴＣ Ｔｇｇ ＡｇＴ ｇＴｇ ＣＴＡ ＣＣｇ ＡＣｇ ＴＣｇ ＡＡＴ ＣＣｇ ＴＴｇ ＡＣＴ ＣＴＴ ＡＴＣ ＴＴＣ Ａ−３’（配列番号４）を有するＳＮＰプローブにアニーリングする。次に、このＳＮＰプローブは、配列５’−ＣＴＡ ｇＣＴ ＣｇＴ ＣｇＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＡＡＡ ＴｇＡ ＡｇＡ ＴＡＡ ｇＡＴ ＣＣＴ ｇ−３’（配列番号５）を有する遺伝子のＳＮＰ含有領域のある領域にハイブリダイズする。ＳＮＰプローブ複合体への多型含有核酸配列のハイブリダイゼーションは、ＳＮＰプローブの引き続くライゲーションおよび環状化を可能にする。図１Ｃに示されるように、ＳＮＰプローブは、多型部位の領域に接触するように、その５’末端および３’末端がゲノム領域にアニーリングするように設計される。環状化ＳＮＰプローブは、本明細書中に記載される方法を用いて引き続いて伸長および配列決定され得る。多型を欠く核酸は、ＳＮＰプローブの５’末端および３’末端を隣接させるようにハイブリダイズしない。この場合、ＳＮＰプローブは、引き続く伸長のために必要な環状基質を形成するようにはライゲーションされ得ない。
図１Ｄは、環状テンプレート分子に沿ったギャップオリゴヌクレオチドの使用を例示する。配列５’−ｇＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣｇＡ ｇＴＡ ｇＣＡ Ｔｇｇ ＣＴｇ ＣＡｇ ＣＴＴ−３’（配列番号６）を有するアンカープライマーは、ビオチンリンカーを介して表面に付着される。配列５’−ＴＣｇ ＴｇＴ ｇＡｇ ｇＴＣ ＴＣＡ ｇＣＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ｇＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ｇＴＴ ｇＣＣ ＴＡＡ ｇＣＴ ｇＣＡ ｇＣＣ Ａ−３’（配列番号７）を有するテンプレート分子は、アンカープライマーにアニーリングして、二本鎖領域が隣接したアンカープライマー中の部分的一本鎖領域、またはギャップ領域を生じる。次いで、配列５’−ＴｇＣ ＴＡＣ−３’を有するギャップ分子は、アンカープライマーにアニーリングする。テンプレート分子へのギャップオリゴヌクレオチドの両方の末端のライゲーションは、ローリングサークル増幅のためのテンプレートとして作用し得る環状核酸分子の形成を生じる。
ポリメラーゼ媒介ＤＮＡ複製の間に生成される環状オリゴヌクレオチドは、テンプレートと複製開始部位との間の関係に依存する。二本鎖ＤＮＡテンプレートにおいて、重要な特徴としては、天然でテンプレートが線状であるか、または環状であるかどうか、および複製の開始部位（すなわり、複製「フォーク」）が、ＤＮＡの両方の鎖の合成に関与するか、または単一の鎖の合成のみに関与するかどうかが挙げられる。従来の二本鎖ＤＮＡ複製において、複製フォークは、ＤＮＡの新しい鎖が合成される部位として処理される。しかし、線状分子（一方向または二方向のいずれかで複製される）において、複製フォークの移動は、特定の型の構造モチーフを生成する。テンプレートが環状である場合、複製分子の１つの可能な空間的配向は、θ構造の形態をとる。
あるいは、二本鎖分子の複製が起点で始まる場合、ＲＣＡが生じ得る。続いて、ニックが鎖の１方を開き、そしてニックによって生成される遊離３’−末端ヒドロキシル部分は、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長される。新しく合成された鎖は、実質的に元の親ＤＮＡ鎖を置換する。この前述の型の複製は、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）として公知である。なぜならば、複製点が、環状テンプレート鎖のまわりを「回転する」と想定され得、そして理論的に、これは無制限に続き得るからである。さらに、新しく合成されたＤＮＡ鎖は、元のテンプレートに共有結合するので、置換された鎖は、その５’末端で元のゲノム配列（例えば、目的の遺伝子、または他の配列）を保有する。ＲＣＲにおいて、元のゲノム配列の後に、元のテンプレート配列に相補的な任意の数の「複製単位」が続き、ここで、各複製単位は、元のテンプレート配列の連続的な回転によって合成される。故に、各々の引き続く回転は、その前の複製サイクルで合成されたＤＮＡを置換する。
インビボで、ＲＣＲは、いくつかの生物学的系において利用される。例えば、いくつかのバクテリオファージのゲノムは、一本鎖の環状ＤＮＡである。複製の間に、この環状ＤＮＡは、最初に二重鎖形態に転換され、この二重鎖形態は、次いで、上記のローリングサークル（ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ）複製機構によって複製される。置換された末端は、切断されてファージ粒子中に挿入され得る一連のゲノム単位を生じる。従って、置換された一本鎖のローリングサークルは、相補的ＤＮＡ鎖の合成によって二重鎖ＤＮＡに転換され得る。この合成は、特定のファージＤＮＡの成熟のために必要なコンカテマー二重鎖分子を生成するために使用され得る。例えば、これは、λバクテリオファージが成熟する基本的経路を提供する。ＲＣＲはまた、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において増幅されたｒＤＮＡを生成するためにインビボで使用され、そしてこの事実は、増幅されたｒＤＮＡが、多数の同一の反復単位からなる理由を説明することに役立ち得る。この場合、単一のゲノム反復単位は、ローリングサークルに転換される。次いで、置換された末端は、二重鎖ＤＮＡに転換され、引き続いてこの二重鎖ＤＮＡは環から切断されて、その結果、２つの末端は、増幅されたｒＤＮＡ環を生成するように、一緒に連結され得る。
ＲＣＡ反応の使用によって、環状化分子と相補的な多くのタンデムコピーを提示する鎖が生成され得る。例えば、ＲＣＡは、最近、ヒトゲノムＤＮＡサンプル中の単一コピー遺伝子を検出するために、インビトロの環状化パッドロックプローブの等温カスケード増幅反応物を得るために利用されている（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参照のこと）。さらに、ＲＣＡはまた、固相ベースのアッセイにおいて単一のＤＮＡ分子を検出するために利用されているが、この技術がインサイチュハイブリダイゼーションに適用される場合には、困難が生じる（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２を参照のこと）。
所望の場合、ＲＣＡは、高い温度（例えば、３７℃、４２℃、４５℃、５０℃、６０℃または７０℃より高い温度）で、実施され得る。さらに、ＲＣＡは、より低い温度（例えば、室温）で最初に実施され得、次いで、高い温度に移行される。高い温度のＲＣＡは、好ましくは、熱安定性核酸ポリメラーゼおよび高い温度で安定かつ特異的にアニールし得るプライマーを用いて実施される。
ＲＣＡはまた、天然に存在しないオリゴヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）を用いて実施され得る。さらに、ＲＣＡは、一本鎖結合タンパク質のような補助的タンパク質の存在下で実施され得る。
固体支持体に固定されている短いＤＮＡ分子を増幅する方法（ＲＣＡと称される）の開発は、最近文献中に記載されている（例えば、Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｚｈａｎｇら、１９９８．Ｇｅｎｅ ２１１：２７７−８５；Ｂａｎｅｒら、１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：５０７３−５０７８；Ｌｉｕら、１９９５．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４；ＦｉｒｅおよびＸｕ、１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４６４１−４６４５；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと）。ＲＣＡは、特異的ＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡリガーゼ反応によって標的化する。次いで、この環状産物は、ローリングサークル複製反応においてテンプレートとして引き続き使用される。
ＤＮＡポリメラーゼによって駆動されるＲＣＡは、等温条件下で、線形または幾何学的な反応速度論のいずれかで、環状化オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。２つのプライマー（１つはＤＮＡの＋鎖にハイブリダイズし、そして他方はＤＮＡの−鎖にハイブリダイズする）の存在下で、短時間（すなわち、９０分未満）に、ヒトゲノム内の単一点変異の検出を可能にする、１ｘ１０９コピー以上の各サークルを生成する能力を有する複雑なパターンのＤＮＡ鎖置換が続く。単一のプライマーを使用して、ＲＣＡは、数分で共有結合的に閉じたサークルの、数百のランダムに連結したコピーを生じる。固体支持体マトリックス結合の場合、このＤＮＡ産物は、合成部位に結合したままであり、ここで、これは標識され、縮合され、そして点光源として画像化され得る。例えば、ＲＣＡシグナルを生じ得る線状オリゴヌクレオチドプローブは、ガラス表面上に共有結合されている。これらのプローブによって発生したシグナルの色は、特異的標的指向性の連結事象の結果に依存して、標的の対立遺伝子状態を示す。ＲＣＡにより、数百万の個々のプローブ分子の計数および分類が可能であるので、ＲＣＡは、まれな体細胞変異の分析のために、特に許容される。ＲＣＡはまた、細胞学的調製物中の単一コピーの遺伝子に結合したパッドロックプローブの検出についての展望を示す。
さらに、固相ＲＣＡ方法論もまた、溶液内の成分を検出する有効な方法を提供するために開発されている。最初に、認識工程を使用して、環状テンプレートが表面に結合した複合体ｈを生成する。次いで、ポリメラーゼ酵素を使用して、結合複合体を増幅する。ＲＣＡは、検出方法（これには、以下により詳細に記載される方法が挙げられる）を用いて、増幅される小さいＤＮＡ分子を使用して、強いシグナルを提供する。
等温増幅系の他の例としては、例えば、（ｉ）自己持続性の配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、（ｉｉ）Ｑβ複製系（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２を参照のこと）、および（ｉｉｉ）核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡＴＭ；Ｋｉｅｖｉｔｓら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：２７３−２８６を参照のこと）。
（増幅産物のヌクレオチド配列を決定するための方法）
上記のような核酸テンプレートの増幅は、アンカープライマーに共有結合した複数コピーのテンプレート核酸配列を生じる。１つの実施形態において、配列決定産物のある領域は、テンプレート核酸のある領域に対する配列決定プライマーのアニーリング、次いで、ＤＮＡポリメラーゼおよび既知のヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはこれらのヌクレオチドの１つのアナログ）と、配列決定プライマーとを接触させることによって決定される。この配列は、以下に記載されるような配列決定反応副産物を検出することによって決定され得る。
配列決定プライマーは、増幅された核酸テンプレートのある領域に特異的にアニールし得る限り、任意の長さまたは塩基組成であり得る。配列決定プライマーは、増幅されたテンプレート核酸上のある領域を特異的にプライムし得る限り、特定の構造を必要としない。好ましくは、この配列決定プライマーは、特徴付けられるべき配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列との間にあるテンプレートのある領域に対して相補的である。配列決定プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、配列決定産物を形成する。この伸長は、１種以上の型のヌクレオチド三リン酸、および所望の場合、補助的結合タンパク質の存在下で実施される。
ｄＮＴＰの取り込みは、好ましくは、配列決定産物の存在についてアッセイすることによって決定される。好ましい実施形態において、配列決定産物のヌクレオチド配列は、ｄＮＭＰが、伸長した配列決定プライマーに取り込まれる場合にヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から遊離した無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を測定することによって決定される。ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ技術（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と称されるこの配列決定方法は、溶液中（液相）技術または固相技術で実施され得る。ＰＰｉベースの配列決定方法は、一般に、例えば、ＷＯ９８１３５２３Ａ １、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９、およびＲｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５（１９９８）において記載される。ＰＰｉ配列決定のこれらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
これらの条件下で放出されるピロリン酸は、（例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の発生によって）酵素的に検出され得る。このような方法は、所定の標的部分においてヌクレオチドが同定されるのを可能にし、そしてＤＮＡが、電気泳動および潜在的に危険な放射性標識の使用を必要とせずに単純かつ迅速に配列決定されることを可能にする。
ＰＰｉは、多数の異なる方法論によって検出され得、そして種々の酵素的方法が以前に記載されている（例えば、Ｒｅｅｖｅｓら、１９６９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２８２−２８７；Ｇｕｉｌｌｏｒｙら、１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１７０−１８０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９６８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：２７３；Ｃｏｏｋら、１９７８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：５５７−５６５；およびＤｒａｋｅら、１９７９．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１７−１２０を参照のこと）。
ポリメラーゼによるｄＮＴＰの取り込みの結果として遊離したＰＰｉは、例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）を使用して、ＡＴＰに転換され得る。この酵素は、硫黄代謝に関与するとして同定された。還元形態および酸化形態の両方の硫黄は、植物および動物の成長に必須の無機栄養素である（例えば、ＳｃｈｍｉｄｔおよびＪａｇｅｒ、１９９２．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：３２５−３４９を参照のこと）。植物および微生物の両方において、硫黄は能動的に取り込まれた後、硫化物に還元される。硫化物は、利用可能な細胞還元剤と比較して、非常に低い酸化／還元能を有するので、同化におけるその最初の工程は、ＡＴＰ依存的反応を介したその活性化を必要とする（例えば、Ｌｅｙｈ，１９９３．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：５１５−５４２を参照のこと）。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；ＥＣ ２．７．７．４）は、無機硫酸（ＳＯ４ −２）の代謝の最初の反応を触媒する；例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＬｉｐｍａｎｎ、１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：６８６−６９０；ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ、１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０を参照のこと。この反応において、ＳＯ４ −２は、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）に活性化される。
ＡＴＰスルフリラーゼは、いくつかの供給源（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例えば、ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０を参照のこと）；Ｐｅｎｉｃｉｌ１ｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（例えば、Ｒｅｎｏｓｔｏら、１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０３００−１０３０８を参照のこと）；ラット肝臓（例えば、Ｙｕら、１９８９．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：１６５−１７４を参照のこと）；および植物（例えば、ＳｈａｗおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９７２．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２７：２３７−２４７；Ｏｓｓｌｕｎｄら、１９８２．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５を参照のこと）から高度に精製されている。さらに、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物（例えば、Ｌｅｙｈら、１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０４０５−１０４１０；ＳｃｈｗｅｄｏｃｋおよびＬｏｎｇ，１９８９．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ２：１８１−１９４；ＬａｕｅおよびＮｅｌｓｏｎ，１９９４．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：３７２３−３７２９を参照のこと）；真核生物（例えば、Ｃｈｅｒｅｓｔら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：３０７−３１３；ＭｏｕｎｔａｉｎおよびＫｏｒｃｈ，１９９１．Ｙｅａｓｔ７：８７３−８８０；Ｆｏｓｔｅｒら、１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９７７７−１９７８６を参照のこと）；植物（例えば、Ｌｅｕｓｔｅｋら、１９９４．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：８９７−９０２１６を参照のこと）；および動物（例えば、Ｌｉら、１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９４５３−２９４５９を参照のこと）からクローニングされている。この酵素は、特定の供給源に依存して、ホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである（例えば、ＬｅｙｈおよびＳｕｏ，１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５４２−５４５を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼが使用される。熱安定性スルフリラーゼは、例えば、ＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．から獲得され得る。熱安定性スルフリラーゼの配列は、データベーズにおいて、登録番号０２８６０６、登録番号Ｑ９ＹＣＲ４および登録番号Ｐ５６８６３で入手可能である。
ＡＴＰスルフリラーゼは、多くの異なる適用（例えば、高濃度のＡＴＰでのＡＤＰの生体光度（ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）検出（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９３．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５：３０２−３０４を参照のこと）；ＤＮＡポリメラーゼ活性の連続的モニタリング（例えば、Ｎｙｒｂｎ，１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：２３５−２３８を参照のこと）；およびＤＮＡ配列決定（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：３６３−３６５；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６５−７１を参照のこと））のために使用されてきた。
いくつかのアッセイが、順方向のＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために開発されてきた。比色モリブデン溶解（ｍｏｌｙｂｄｏｌｙｓｉｓ）アッセイは、リン酸検出に基づく（例えば、ＷｉｌｓｏｎおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ，１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：９７５−９８１を参照のこと）が、連続的分光光度モリブデン溶解アッセイは、ＮＡＤＨ酸化の検出に基づく（例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１；Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）。後者のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要とする。さらに、いくつかの放射活性アッセイもまた、文献中に記載されてきた（例えば、Ｄａｌｅｙら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５を参照のこと）。例えば、１つのアッセイは、３２Ｐ標識ＡＴＰから放出された３２ＰＰｉの検出に基づき（例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）、そして別のアッセイは、［３５Ｓ］標識ＡＰＳへの３５Ｓの取り込みに基づく（このアッセイはまた、カップリング酵素として精製されたＡＰＳキナーゼを必要とする；例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１を参照のこと）；そして第三の反応は、［３５Ｓ］標識ＡＰＳからの３５ＳＯ４ −２の放出に依存する（例えば、Ｄａｌｅｙら、１９８６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：３８５−３９５を参照のこと）。
逆方向ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために、連続的分光光度アッセイ（例えば、Ｓｅｇｅｌら、１９８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：３３４−３４９を参照のこと）；生体光度検出アッセイ（例えば、ＢａｌｈａｒｒｙおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７１．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：１−１７を参照のこと）；３５ＳＯ４ −２放出アッセイ（例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）；および３２ＰＰｉ取り込みアッセイ（例えば、Ｏｓｓｌｕｎｄら、１９８２．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７０：３９−４５を参照のこと）が、以前に記載されている。
ＡＴＰスルフリラーゼによって生成されるＡＴＰは、酵素反応を使用して加水分解されて、光を発し得る。光放射化学反応（すなわち、化学発光）および生物学的反応（すなわち、生体発光）は、種々の代謝物の高感度の測定のために、分析的生化学において広く使用されている。生体発光反応において、光の放射を導く化学反応は、酵素触媒される。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系は、ＡＴＰの特異的アッセイを可能にし、そして細菌性ルシフェラーゼ−オキシドレダクターゼ系は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモニタリングのために使用され得る。両方の系は、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成または利用に関与する組み合わされた反応によって、多数の物質の分析に拡張されている（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，１９９１．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：１４７２−１２８１を参照のこと）。
新規試薬の開発は、ＡＴＰ濃度（例えば、Ｌｕｎｄｉｎ，１９８２．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙｓ（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度（例えば、Ｌｏｖｇｒｅｎら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＮＡＤＨ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１０３−１１１を参照のこと）に比例する安定な光放射を獲得することを可能にする。このような適切な光放射試薬を使用して、終点アッセイを行い、そして既知の量のＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの添加によって各個々のアッセイを較正することを可能にする。さらに、安定な光放射系はまた、ＡＴＰ転換系またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ転換系の連続的モニタリングを可能にする。
ＡＴＰを光に転換するために適切な酵素としては、ルシフェラーゼ（例えば、昆虫ルシフェラーゼ）が挙げられる。ルシフェラーゼは、触媒の最終産物として光を発生する。最も知られた光放射酵素は、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ））の酵素である。対応する遺伝子は、クローニングされ、そして細菌（例えば、ｄｅ Ｗｅｔら、１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７８７０−７８７３を参照のこと）および植物（例えば、Ｏｗら、１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６−８５９を参照のこと）、ならびに昆虫細胞（例えば、Ｊｈａら、１９９０．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７４：２４−２６を参照のこと）および哺乳動物細胞（例えば、ｄｅ Ｗｅｔら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７３；Ｋｅｌｌｅｒら、１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３２６４−３２６８を参照のこと）において発現されている。さらに、Ｊａｍａｉｃａｎ ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅ（Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ））由来の多数のルシフェラーゼ遺伝子が、最近、クローニングされ、そして部分的に特徴付けられている（例えば、Ｗｏｏｄら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：２８９−３０１；Ｗｏｏｄら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７００−７０２を参照のこと）。別個のルシフェラーゼは、しばしば、異なる波長の光を発し得、このことは、異なる波長での光放射の同時モニタリングを可能にし得る。従って、これらの前述の特徴は、独自であり、そして現在のレポーター系の有用性に関して新たな次元を加える。
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下で生体発光を触媒し、０．８８の量子収量を生じる（例えば、ＭｃＥｌｒｏｙおよびＳｅｌｉｎｇｅｒ，１９６０．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８：１３６−１４５を参照のこと）。ホタルルシフェラーゼの生体発光反応は、約１ｘ１０−３Ｍの検出限界を有する、ＡＴＰの検出のためのアッセイとして利用され得る（例えば、Ｌｅａｃｈ，１９８１．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：４７３−５１７を参照のこと）。さらに、ルシフェラーゼ媒介性の検出系の感受性および簡便性の全体的な程度は、ホタルルシフェラーゼベースのバイオセンサの開発において、かなりの興味をかきたてた（例えば、ＧｒｅｅｎおよびＫｒｉｃｋａ，１９８４．Ｔａｌａｎｔａ ３１：１７３−１７６；Ｂｌｕｍら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：５４３−５５０を参照のこと）。
上記の酵素を使用して、この配列決定プライマーは、ポリメラーゼおよび既知のｄＮＴＰに曝露される。ｄＮＴＰがプライマー配列の３’末端に取り込まれる場合、このｄＮＴＰは切断され、そしてＰＰｉ分子が遊離する。次いで、ＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに転換される。好ましくは、ＡＴＰスルフリラーゼは、ＰＰｉの転換がＰＰｉに関して一次の反応速度論で進行する、十分に高い濃度で存在する。ルシフェラーゼの存在下で、ＡＴＰは、加水分解されて光子を生じる。この反応は、好ましくは、反応混合物内に存在する十分な濃度のルシフェラーゼを有し、その結果、この反応（ＡＴＰ→ＡＤＰ＋ＰＯ４ −３＋光子（光））は、ＡＴＰに関して一次の反応速度論で進行する。光子は、以下に記載される方法および装置を使用して測定され得る。１実施形態において、ＰＰｉおよびカップリングされたスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応を使用して、検出のための光を発生させる。いくつかの実施形態において、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのいずれかまたは両方は、各反応部位に配置された１以上の可動性固体支持体に固定化される。
従って、本発明は、リアルタイムの信号を与えるポリメラーゼ反応の間に、ＰＰｉ放出が検出されることを可能にする。配列決定反応は、リアルタイムで連続的にモニタリングされ得る。従って、ＰＰｉ放出の迅速な検出のための手順は、本発明によって可能となる。これらの反応は、２秒未満で生じると概算されている（ＮｙｒｅｎおよびＬｕｎｄｉｎ、前出）。律速段階は、ＡＴＰスルフリラーゼによるＰＰｉのＡＴＰへの転換であるが、一方、ルシフェラーゼ反応は迅速であり、かつ０．２秒未満で生じると概算されている。ポリメラーゼについての取り込み速度はまた、種々の方法によって概算されており、そして例えば、クレノウポリメラーゼの場合には、１塩基の完全な取り込みが０．５秒未満で生じ得ることが見出されている。従って、１塩基の取り込みおよびこの酵素アッセイによる検出についての概算された総時間は、約３秒である。従って、リアルタイムの検出を可能にする、非常に速い反応時間が可能であることが理解される。この反応時間は、より熱安定性のルシフェラーゼを使用することによって、さらに減少され得る。
ほとんどの適用について、ＡＴＰおよびＰＰｉのような混入物を含まない試薬を使用することが所望される。これらの混入物は、樹脂に結合したアピラーゼおよび／またはピロホスファターゼを含むプレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）に試薬を流すことによって除去され得る。あるいは、アピラーゼまたはピロホスファターゼは、磁気ビーズに結合され得、そして試薬中に存在する混入しているＡＴＰおよびＰＰｉを除去するために使用され得る。さらに、拡散性の配列決定試薬（例えば、未取り込みｄＮＴＰ）を、洗浄緩衝液で洗浄することが所望である。ピロリン酸配列決定において使用される任意の洗浄緩衝液が使用され得る。
いくつかの実施形態において、配列決定反応中の反応物の濃度は、０．２ｍｌの緩衝液中に１ｐｍｏｌのＤＮＡ、３ｐｍｏｌのポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌのｄＮＴＰを含む。Ｒｏｎａｇｈｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９（１９９６）を参照のこと。
配列決定反応は、所望の場合、４種の所定のヌクレオチドを用いて実施され得る。「完全」サイクルは、一般に、所定の順序で、ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ））の各々についての配列決定試薬を連続的に投与する工程を包含する。取り込まれていないｄＮＴＰは、各ヌクレオチド添加の間に洗浄される。あるいは、取り込まれていないｄＮＴＰは、アピラーゼによって分解される（以下を参照のこと）。このサイクルは、所望される場合、配列決定産物の所望の量の配列が得られるまで繰り返される。いくつかの実施形態において、約１０〜１０００、約１０〜１００、約１０〜７５、約２０〜５０または約３０ヌクレオチドの配列情報が、１つのアニールした配列決定プライマーの伸長から得られる。
いくつかの実施形態において、このヌクレオチドは、ビオチンのようなハプテンのジスルフィド誘導体を含むように改変される。アンカー基材にアニールした新生プライマーへの改変ヌクレオチドの付加は、以下を含む重合後の工程によって分析される：ｉ）この改変がビオチンである例における、酵素分子に連結されたアビジン結合体化部分またはストレプトアビジン結合体化部分の連続的結合、ｉｉ）過剰なアビジン連結酵素またはストレプトアビジン連結酵素の洗浄、ｉｉｉ）酵素活性を受けやすい条件下で適切な酵素基質を流すこと、およびｉｖ）酵素基質反応産物の検出。ハプテンは、還元剤の添加によって、この実施形態において除去される。このような方法は、電気泳動および潜在的に危険な放射性標識の使用の必要性を回避しつつ、所定の標的部分においてヌクレオチドが同定され、そしてそのＤＮＡが単純かつ迅速に配列決定されることを可能にする。
ハプテンの検出に好ましい酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。所望の場合、本明細書中の種々の反応物の添加の間に、洗浄緩衝液が使用され得る。アピラーゼは、配列決定プライマーを伸長するために使用された、未反応のｄＮＴＰを除去するために使用され得る。この洗浄緩衝液は、必要に応じてアピラーゼを含み得る。
例示的なハプテン（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素分子ｃｙ３およびｃｙ５、ならびにフルオレセイン）は、伸長したＤＮＡ分子中に、種々の効率で取り込まれる。ハプテンの結合は、ヌクレオチド上の糖、塩基を介する連結によって、そしてリン酸部分を介して、生じ得る。シグナル増幅のための例示的手段としては、蛍光手段、電気化学的手段および酵素的手段が挙げられる。酵素的増幅を用いる好ましい実施形態において、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）としては、発光基質が既知である酵素が挙げられ得、そしてこれらの発光（化学発光）基質の検出のための手段としては、ＣＣＤカメラが挙げられ得る。
好ましい様式において、改変塩基が付加され、欠失が生じ、そしてハプテン結合体化部分は、切断剤または不活化剤のいずれかの使用によって除去または不活化される。例えば、切断可能なリンカーがジスルフィドである場合、この切断剤は還元剤（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノールなど）であり得る。不活化の他の実施形態としては、加熱、冷却、化学的変性、界面活性剤、疎水性試薬および自殺インヒビターが挙げられる。
ルシフェラーゼは、プロトンの同時放出と共にｄＡＴＰを直接加水分解し得る。加水分解は、伸長した配列決定プライマーへのｄＡＴＰの取り込みとは独立して生じるので、これは、偽陽性シグナルを生じる。この問題を回避するために、ＤＮＡ中に取り込まれる、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない、ｄＡＴＰアナログが使用され得る。１つのこのようなアナログは、α−チオ−ｄＡＴＰである。従って、α−チオ−ｄＡＴＰの使用は、成長する核酸鎖へと取り込まれることなくｄＡＴＰが加水分解される場合に生じ得る、偽の光子発生を回避する。
代表的に、ＰＰｉベースの検出は、配列決定プライマーの添加の直後の、配列決定反応混合物へのコントロールヌクレオチドの付加後に放出される光を測定することによって、較正される。これは、反応条件の正規化を可能にする。連続した２以上の同一のヌクレオチドの取り込みは、放出された光の量の対応する増加によって明らかになる。従って、放出された光における、コントロールヌクレオチドに対する２倍の増加は、伸長されたプライマーへの２つの連続的ｄＮＴＰの取り込みを明らかにする。
所望の場合、アピラーゼは、配列決定反応混合物内のいずれの残留非取り込みｄＮＴＰの分解をも促進するように、固体支持体の表面上で、「洗浄」または「流され」得る。アピラーゼはまた、生じたＡＴＰを分解し、従って、この反応から生じる光を「消す」。アピラーゼでの処理の際に、任意の残留反応物は、後のｄＮＴＰインキュベーション工程および光子検出工程のための調製において、洗い流される。あるいは、アピラーゼは、固体または可動性固体支持体に結合され得る。
支持体が平面である場合、好ましくは、ピロリン酸配列決定反応は、必要に応じて、１つの透明な固相支持体表面および必要に応じて透明なカバーを包含する薄層反応チャンバ上で生じる。いくつかの実施形態において、アレイは、平面状上面および平面状下面を有し、この平面状上面は、その上に少なくとも１，０００の空洞を有し、各空洞が、反応チャンバを形成する。さらなる実施形態において、平面状下面は、必要に応じて導電性であり、その結果、反応チャンバからの光学的シグナルは、平面状下面を介して検出され得る。好ましい実施形態において、上面と下面との距離は、１０ｃｍ以下である。従って、配列決定試薬は、基材表面にわたるこの試薬の流れによって送達され得る。より好ましくは、空洞は、核酸またはタンパク質を分析するために試薬を含む。さらなる実施形態において、アレイは、平面状アレイから空間を空けて、そのアレイの反対側に接触する第２の表面を有し、それによって、流れチャンバがアレイの上に形成される。支持体が平面状でない場合、試薬は、固体支持体を任意の所定の試薬の浴に浸すことによって送達され得る。
好ましい実施形態において、アレイを使用し、水性環境下で分離平行共通反応を実施し得る。アレイは、試薬と反応し得る開始物質を含有する少なくとも１，０００の別々の反応チャンバを有する基材を有し得、各反応チャンバは寸法決めされており、その結果、少なくとも１つの試薬を包含する１つ以上の流体が、各反応チャンバに送達された場合、試薬がウェルから外に拡散するための拡散時間は、開始物質が試薬と反応して生成物を形成するために必要な時間を超える。この反応チャンバは、基材上に複数の空洞が生成されることによって形成され得る。複数の空洞は、エッチング技術、成型技術またはミクロ機械加工技術によって形成され得る。空洞は、平面状底部または凹状底部を有し得る。好ましい実施形態において、基材は、ファイバーオプティックバンドル（ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ｂｕｎｄｌｅ）である。さらなる実施形態において、平面状表面に分散したパッチを作製することによって反応チャンバが形成される。このパッチは、周囲の平面状表面とは異なる表面化学を有し得る。
種々の実施形態において、反応のいくつかの構成成分が固定化されるのに対して、他の構成成分は、溶液として提供される。例えば、いくつかの実施形態において、ピロリン酸配列決定反応において使用される酵素（例えば、スルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）、ルシフェラーゼ）は、所望される場合、固体支持体上に固定され得る。同様に、ピロリン酸配列決定反応において使用される酵素（例えば、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ）の１つ以上は、ファイバーオプティックリアクタアレイの末端に固定され得る。ルシフェラーゼが固定される場合、このルシフェラーゼは、アンカープライマーから５０μｍ未満に存在する。反応の他の構成成分（例えば、ポリメラーゼ（例えば、クレノーフラグメント）、核酸テンプレート、およびヌクレオチド）は、流すこと、スプレーすること、または回転することによって、添加され得る。なおさらなる実施形態において、配列決定反応において使用される１つより多くの試薬は、ビーズ上に送達される。
いくつかの実施形態において、試薬は、試薬を分配するための拡大可能な可撓性の膜を使用して分配され、伸長反応の間にＦＯＲＡ表面上でリアクタを密封する。試薬は、ＦＯＲＡ表面上または可撓性の膜上いずれかにスプレーされ得るか回転され得る。次いで、可撓性の膜は、迅速に拡大されるかまたはＦＯＲＡのごく近傍に物理的に移動され、それによってウェルを密封し得、その結果、ＰＰｉは，ウェルからウェルに拡散することができない。好ましくは、データ収集は、反応開始後の適当な時間に生じ、最大のシグナルを生成する。
伸長されたアンカープライマー中の配列はまた、配列決定副生成物を検出する以外の配列決定方法を使用することによって同定され得る。例えば、配列決定は、標識ヌクレオチドまたは他のヌクレオチドアナログの取り込みを測定することによって実施され得る。これらの方法は、蛍光または電気化学蛍光ベースの方法と共に使用され得る。
あるいは、配列決定副生成物は、３’炭素上に標識を有するジデオキシヌクレオチドを使用して産生され得る。好ましくは、この標識は、切断され、３’水酸基を現し得る。この方法において、所定のヌクレオチドの付加は、ポジティブまたはネガティブとしてスコアリングされ、１つの塩基が、各試行で決定される。この実施形態において、固相の酵素は、必要ではなく、複数回の測定が為され得る。
別の実施形態において、伸長されたアンカープライマー生成物の正体は、標識化されたデオキシヌクレオチドを使用して決定される。標識されたデオキシヌクレオチドは、例えば、蛍光ヌクレオチドであり得る。好ましくは、蛍光ヌクレオチドは、レーザー照射の後、検出され得る。好ましくは、蛍光標識は、長期間の照射に対して不安定である。所望される場合、蛍光シグナルは、クエンチ（例えば、フォトブリーチ（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ））され、次の塩基の付加の前にバックグラウンドレベルまでシグナルを復帰させる。好ましい電気化学蛍光標識は、ルテニウム−トリス−ビ−ピリジルである。
１つの実施形態において、一本鎖環状核酸は、反応チャンバに固定され；好ましくは、各反応チャンバは、その中に配置された１つを超えない一本鎖環状核酸を有する。より好ましくは、一本鎖環状核酸は、反応チャンバ中に配置された移動可能性固体支持体上に固定される。別の実施形態において、各一本鎖環状核酸は、少なくとも１００コピーの核酸配列を含み、各コピーは、末端から末端に共有結合される。
本発明はまた、本発明の方法の使用のためのキットを包含し、このキットは、１つ以上の以下の構成要素を包含する：（ａ）サンプルＤＮＡへとハイブリダイズし、その結果、標的位置がプライマーの３’末端に直接隣接する、特異的試験プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ＰＰｉ放出を同定するための検出酵素手段；（ｄ）ｄＡＴＰの代わりの、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、上記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することができない、ｄＡＴＰアナログ；および（ｅ）必要に応じて、ｄｄＡＴＰの代わりの、ジデオキシヌクレオチド、必要に応じて、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、上記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することができない、ｄｄＡＴＰアナログ。このキットが、最初のＰＣＲ増幅と共に使用される場合、このキットはまた、以下の構成要素を含み得る：（ｉ）少なくとも１つのプライマーが、このプライマーを固定化可能な手段を有する、ＰＣＲのためのプライマー対；（ｉｉ）好ましくは、熱安定性である、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ１ポリメラーゼ）；（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応のための緩衝液；および（ｉｖ）デオキシヌクレオチド。酵素標識が、ＰＣＲを評価するために使用される場合、このキットは、有利には、酵素の基質および検出系の他の構成要素を包含する。
（ピロリン酸配列決定反応の最適化の基礎をなす数学的解析）
理論による束縛を所望しないが、反応条件の最適化は、以下の分析の基礎をなす仮定を使用して実施され得ると考えられる。
固相ピロリン酸配列決定は、最初は、固相技術と生物発光を使用した合成技術による配列決定との組合せによって発達された（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。この固相方法論において、固定化されプライマー結合された（ｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、およびルシフェラーゼと共にインキュベートされる。段階的にヌクレオチドを付加し（中間で洗浄する）、連続的な重合の事象が実施され得る。ＳＮ比は、系でα−チオｄＡＴＰを使用することによって増加された。このｄＡＴＰアナログは、ＤＮＡポリメラーゼによって効率的に組込まれるが、ルシフェラーゼの基質として作用しない。このことは、バックグラウンド生物発光を減少し、リアルタイムの配列決定反応の実施を容易にする。これらの初期の反応において、固相支持体として、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用したＰＣＲ産物の配列決定が示された。しかし、洗浄の間のビーズの損失が、この洗浄が各ヌクレオチドの添加と各酵素の添加との間に実施されるために、この技術は短い配列に限定されることが見出された。
現在のところ、ピロリン酸配列決定方法論は、単一のＤＮＡ配列決定テンプレートの多くの同一のコピーからＤＮＡ配列を確かめる事に関する合理的に十分に確立された歴史を有する（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９；Ｎｙｒｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ，特許ＷＯ９８１３５２３Ａ１（１９９８年４月２日に発行され；１９９７年９月２６日に出願された）；Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５（１９９８）を参照のこと）。ピロリン酸（ＰＰｉ）生成反応は、生物発光に基づいた非常に高感度の技術によってモニターされ得る（例えば、Ｎｙｒｅｎら、１９９６．４６６−４９６頁Ｐｒｏｃ．第９版Ｉｎｔｅｒ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．を参照のこと）。これらの生物発光アッセイは、異なる核酸修飾反応で放出されたＰＰｉの検出による。これらのアッセイにおいて、生成されるＰＰｉは、続いて、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰへ転換され、ＡＴＰ生成は、ルシフェラーゼによって連続的にモニターされる。例えば、ポリメラーゼ媒介性反応において、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって合成される伸長する核酸鎖に組込まれる場合、ＰＰｉが生成される。一般的に、ＤＮＡポリメラーゼが、ピロリン酸配列決定反応の間、ＰＰｉを生成するために使用される場合（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと）、逆転写酵素（例えば、Ｋａｒａｍｏｈａｍａｍｅｄら、１９９６．３１９−３２９頁（Ｐｒｏｃ．第９版Ｉｎｔｅｒ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．）を参照のこと）またはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋａｒａｍｏｈａｍａｍｅｄら、１９９８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：３０２−３０６を参照のこと）を使用し、重合事象を実施することもまた可能である。
例えば、生物発光的プライマー伸長アッセイは、３’末端での単一ヌクレオチドミスマッチを試験するために使用される（例えば、Ｎｙｒｅｎら、１９９７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：３６７−３７３を参照のこと）。ファージプロモーターは、代表的には、任意のプライマーの少なくとも１つに付着し、増幅の後に、ＲＮＡポリメラーゼによる段階的な伸長に供され得る、転写単位が得られ得る。次いで、転写媒介性ＰＰｉ放出が、生物発光学的アッセイ（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ）によって、検出され得る。この戦略を使用することによって、任意のさらなる特異的な配列決定プライマーを使用せずに、二重鎖ＤＮＡを配列決定することが可能であり得ると考えられる。一連の「実行−停止」アッセイにおいて、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼによる伸長は、試験され、さらに遅いことが見出された（例えば、Ｋｗｏｋら、１９９０．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５を参照のこと）。３’−ミスマッチ末端の後に、続く正確な天然のデオキシヌクレオチドのα−チオヌクレオチドアナログでの置換は、重合速度を５倍から１３倍減少する。しかし、少しの塩基の取り込みの後、ＤＮＡ合成の速度は、通常のテンプレート／プライマーに対して観察される速度に匹敵する。
この技術による単一塩基検出は、アピラーゼの系への取り込みによって、改善され、このアピラーゼは、ＮＴＰ加水分解を触媒し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｍよりはるかに下にヌクレオチド濃度を減少し、先行する工程に由来するｄＮＴＰを効率的に除去した後に、続いてのｄＮＴＰの添加に進む上記の技術は、突然変異の検出および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析の分野における適用に対して、迅速かつリアルタイムの分析を提供する。
ピロリン酸配列決定系は、いくつかの酵素で連続的に触媒され、ＤＮＡ合成をモニターする反応を使用する。酵素の特性（例えば、安定性、特異性、感受性、ＫＭおよびｋＣＡＴ）は、系の最適な性能に関して重要である。ピロリン酸配列決定系において、検出酵素（すなわち、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）の活性は、配列決定反応の間、一般的に一定のままであり、多量の生成物によって非常に僅かにのみ、阻害される（ｓｅｅ例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））。スルフリラーゼは、約２．０秒間に、各ＰＰｉをＡＴＰに転換する（例えば、ＰｙｒｅｎおよびＬｕｎｄｉｎ，１９８５．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５０４−５０９を参照のこと）。０．２ｍｌの緩衝液中の１ｐｍｏｌ ＰＰｉ（５ｎＭ）に対する報告されている反応条件は、０．３Ｕ／ｍｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．Ａ８９５７；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および５μＭ ＡＰＳ（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）である。スルフリラーゼに関する製造業者の情報（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって、１ｍｇのタンパク質あたり、５〜２０単位の活性（すなわち、１ユニットは、３０℃、ｐＨ８．０で、ＡＰＳおよびＰＰｉから１分あたり１．０μｍｏｌのＡＴＰを生成する）が報告されるのに対して、比活性は、他では１ｍｇあたり１４０単位であると報告される（Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄら、１９９９．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，およびＬｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｏｃｃｈａｒｏｎｉｙｅｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＴ３ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １５：３８１−３８８を参照のこと）。本発明の実施において使用される反応条件が、前述の参考文献に報告される反応条件に類似するという事実に起因して、アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、４．６ｎＭと見積もられた。スルフリラーゼのＫＭ値は、［ＡＰＳ］＝０．５μＭおよび［ＰＰｉ］＝７μＭである。ルシフェラーゼによる光の生成は、０．２秒未満で生じる。最も重要な反応は、ＤＮＡ重合およびヌクレオチドの分解である。ピロリン酸配列決定方法論において使用される酵素を特徴付ける定数の値を、参考のために以下に列挙する：
Figure 0004354184
 これら４つの反応に関与する酵素は、同じ基質に対して競合する。従って、基質濃度の変化は、結びついている。最初の反応は、ｄＮＴＰの鎖伸長の間のポリメラーゼ／ＤＮＡ複合体への結合である。この工程を迅速にするために、ヌクレオチド三リン酸濃度は、ＤＮＡポリメラーゼのＫＭより高くなければならない。しかし、ヌクレオチド三リン酸の濃度が、非常に高すぎる場合、ポリメラーゼのより低い忠実度が、観察され得る（例えば、Ｃｌｉｎｅら、１９９６．ＰＣＲ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３５４６−３５５１を参照のこと）。適切な範囲の濃度が、取り込み間違いに対するＫＭによって確立され、通常は、非常により高い（例えば、Ｃａｐｓｏｎら、１９９２．Ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ４３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１０９８４−１０９９４を参照のこと）。非常に高い忠実度が、固有のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用することによって達成され得るにも関わらず、これらの使用はまた、プライマー分解が生じ得る欠点を保持する。
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（クレノー）のエキソヌクレアーゼ活性が、低いにも関わらず、プライマーの３’末端は、ヌクレオチド三リン酸の非存在下でより長いインキュベーションによって分解され得ることが実証された（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８．Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を参照のこと）。重合工程における誘導適合結合機構（ｉｎｄｕｃｅｄ−ｆｉｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が、正確なｄＮＴＰに対して非常に効率的な選択性を提供するので、忠実度は、エキソヌクレアーゼ活性を有さずに維持される。１×１０５〜１×１０６の忠実度が報告されている（例えば、Ｗｏｎｇら、１９９１．Ａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ−ｆｉｔ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｄｅｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：５２６−５３７を参照のこと）。ピロリン酸配列決定において、エキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ（例えば、エキソ−クレノーまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標））は、高い忠実度を有することが確認されている。
本発明のピロリン酸配列決定方法論における空間的制限および一時的な制限に対する評価が、計算され、ここで、この系は、全容積５μｌについて、１ｃｍ２の面積と高さ約５０μｍを有する。一時的な制限に関して、反応のカスケードにおける分子種の参入は、最初に規定され、ここで、以下のとおりである：
Figure 0004354184
 Ｎ（０）が、ヌクレオチドを添加されないＤＮＡであり、Ｎ（１）は、１個のヌクレオチドを添加され、Ｎ（２）は、２個のヌクレオチドを添加される、などということが、さらに特定される。分子種の濃度に関連する偽１次速度定数は、以下のとおりである：
Figure 0004354184
 さらに、ＰＰｉに対する拡散定数（ＤＰ）およびＡＴＰに対する拡散定数（ＤＡ）もまた、特定されなければならない。これらの値は、希釈水溶液中の生体分子に対する、以下の例示的拡散定数から、評価され得る（Ｗｅｉｓｉｇｅｒ，１９９７．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｕｐｔａｋｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓを参照のこと）。
Figure 0004354184
 ここで、オリジナルの文献Ｉは、Ｌｏｎｇｓｗｏｒｔｈ，１９５４．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．５８：７７０−７７３であり；オリジナルの文献２は、Ｇａｉｇａｌａｓら、１９９２．Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｐｈｙｖ．Ｃｈｅｍ．９６：２３５５−２３５９であり；そしてオリジナルの文献３は、Ｃｈｅｎｇ，１９９３．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｐｒｏｔｏｎ ＮＭＲ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｍａｇｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｍａｇｎｅｔ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ ＩＩ：５６９−５８３である。
ＰＰｉの拡散定数を評価するために、以下の例示的値が使用され得る（ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，１９８３．（Ｗ．Ｅ．Ｗｅａｓｔ．編）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照のこと）。
Figure 0004354184
 ＰＰｉの分子量は、１７４ａｍｕである。前述の例示的な値に基づけば、ＰＰｉに対して約０．７×１０−５ｃｍ２／ｓｅｃの拡散定数が予想される。
３つのピロリン酸配列決定反応を触媒する酵素は、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度論に近似すると考えられる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，１９８８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）、これは、以下のとおりに記載される：
ＫＭ＝［Ｅ］［Ｓ］／［ＥＳ］、
速度＝Ｖｍａｘ［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）、
Ｖｍａｘ＝ｋＣＡＴ［ＥＴ］
ここで、［Ｓ］は、基質の濃度であり、［Ｅ］は、遊離酵素の濃度であり、［ＥＳ］は、酵素基質複合体の濃度であり、そして［ＥＴ］（＝［Ｅ］＋［ＥＳ］）は、酵素の全濃度である。
反応時間は、文献中に記載される溶液相ピロリン酸ベースの配列決定と少なくとも同程度速いことが好ましい。基質が生成物に転換されるこの速度は、以下のとおりである：
−ｄ［Ｓ］／ｄｔ＝ｋＣＡＴ［ＥＴ］［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
基質の有効濃度は、複製されたＤＮＡ分子の大きさ（せいぜい（１０μｍ）３）およびコピー数（約１０，０００）から評価され、約１７ｎＭの濃度を得る。この値は、前に記載された酵素のＫＭより小さく、従って、この速度は、以下のように評価される：
−ｄ［Ｓ］／ｄｔ＝（ｋＣＡＴ／ＫＭ）［ＥＴ］［Ｓ］
従って、偽１次反応速度論を使用すれば、基質の消滅についての速度定数は、所定の酵素についての定数である、ｋＣＡＴおよびＫＭならびに［ＥＴ］に依存する。従って、文献中に報告されている同じ酵素濃度を使用して、同様の速度を生じる。
ここで、ピロリン酸配列決定反応における第１の工程（すなわち、新規のヌクレオチドの取り込みおよびＰＰｉの放出）は、詳細に試験される。好ましい反応条件は、０．２ｍｌ緩衝液中の１ｐｍｏｌ ＤＮＡ、３ｐｍｏｌポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰである。前に記載される好ましい反応条件下では、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントのヌクレオチド取り込みのＫＭは、０．２μＭであり、シークエナーゼ２．０ＴＭ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のＫＭは、０．４μＭであり、１塩基の完全な取り込みは、１５ｎＭのポリメラーゼ濃度で、０．２秒未満（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）である。
５μｌの反応体積中で、各１０，０００の配列決定プライマー部位、または１×１０８の全伸長部位（＝０．１７ｆｍｏｌ）を有する合計１０，０００のアンカープライマーが存在する。文献中で以前に公開された結果は、ポリメラーゼが、反応混合物中に３倍多く（すなわち、０．５ｆｍｏｌ）存在するはずであることが示唆される。次いで、ポリメラーゼの最終濃度は、０．１ｎＭである。これらの反応条件は、本発明の実施によって容易に得られる。
以前に示されるように、ヌクレオチド付加反応に必要な時間は、１ヌクレオチド当たり０．２秒以下である。従って、反応は、合計でＴ秒間進行可能であり、次いで、ヌクレオチド付加は、（Ｔ／０．２）同一のヌクレオチドまでのストレッチが、ポリメラーゼの作用として完全に埋められるほどに十分迅速であるべきである。前に考察されるように、ピロリン酸配列決定反応の律速段階は、スルフリラーゼ反応であり、このスルフリラーゼ反応は、１つのＰＰｉからＡＴＰに転換するために合計で約２秒必要である。従って、スルフリラーゼ反応の完了を可能にする反応時間は、ポリメラーゼが１０までの同一のヌクレオチドのストレッチを「埋める」ことを可能にするのに十分であるはずである。ランダムＤＮＡ種において、１０以上の同一のヌクレオチドの領域は、１ヌクレオチド当たり、約４−１０の確率で生じることが実証され、この確率は、約１×１０−６である。本発明の好ましい実施形態におけるアンカープライマーから伸長された１０，０００の配列において、各配列は、少なくとも３０ヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド伸長され、１０の同一ヌクレオチドのうち約１回の実行が存在することが望ましい。従って、同一のヌクレオチドの実行は、本発明の実施において、困難を引き起こさないはずであると結論付けられ得る。
得られたＤＮＡ分子の全体的な大きさは、好ましくは、アンカーパッドの大きさ（すなわち、１０μｍ）よりも小さく、そして個々のアンカーパッド（すなわち、１００μｍ）の間の距離より小さくなければならない。全Ｎヌクレオチドを有する一本鎖ＤＮＡコンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の旋回半径は、以下の式によて数学的に評価され得る：半径＝ｂ（Ｎ／Ｎ０）０．６、ここで、ｂは、持続長さであり、Ｎ０は、持続長さ当たりのヌクレオチドの長さであり；指数０．６は、自己回避ウォーク（ｓｅｌｆ−ａｖｏｉｄ ｗａｌｋ）の特徴である（例えば、Ｄｏｉ，１９８６．Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｆｌｏｒｙ，１９５３．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。例として単鎖ＤＮＡを使用する場合、ｂは、４ｎｍであり、Ｎ０は、１３．６ヌクレオチドである（例えば、Ｇｒｏｓｂｅｒｇ，１９９４．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ＡＩＰ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。１０，０００コピーの１００マーを使用する場合、Ｎ＝１×１０−６であり、旋回半径は、３．３μｍである。
ＰＰｉの拡散は、本明細書中で詳細に記載される。本発明で使用される反応条件において、［ＰＰｉ］は、前に記載されるように、５μｌ中に約０．１７ｆｍｏｌ（すなわち、０．０３ｎＭ）であり、［スルフリラーゼ］は、４．６ｎＭである。反応の最初の２秒において、約７％（０．００２ｎＭ）のＰＰｉが、スルフリラーゼによって消費され、ＧＥＰＡＳＩシミュレーションソフトウェアを使用する（Ｍｅｎｄｅｓ，Ｐ．（１９９３）ＧＥＰＡＳＩ：ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ， ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９，５６３−５７１を参照のこと）。シミュレーションで使用されるパラメーターは、ＫＭ（ＰＰｉ）＝７μＭ、ｋＣＡＴ＝３８ｓ−１、および［スルフリラーゼ］＝４．６ｎＭであった。従って、少なくとも９３％のＰＰｉ分子は、２秒の反応時間の間にＡＴＰに転換される前に、拡散し得る。
各々のＰＰｉが反応する平均時間は、ｌ／ｋｐ＝２秒である。各々の方向に拡散する平均空間距離は、約２Ｄｐ／ｋｐまたは２．８×１０３μｍ２である。各々の方向のＲＭＳ距離は、５３μｍである。この値は、個々のアンカープライマーの各々が５０μｍより遠く離れなければならないか、または１つのアンカーから放出されるＰＰｉがその隣りに拡散し得、そして検出され得ることを示す。
上述の現象を説明するために使用される別の方法は、第１アンカーパッドで生成されるＰＰｉの第１のアンカーパッド上方の量を、第２のアンカーパッドで生成され、次いでその第１アンカーパッドの位置に対して上側に拡散するＰＰｉの量に対して評価することである。これらの２つの質量がお互いの大きさで接近する場合、バックグラウンドのシグナルの中から「真の」シグナルを区別することが困難になる。このことは、ａをアンカーパッドの半径として、そして１／ｂ２をアンカーパッドの密度として規定することによって、数学的に記載され得る。従来の出版されたデータに基づき、ａはおよそ１０μｍに等しく、そしてｂはおよそ１００μｍに等しい。先の第１アンカーパッドの上方に存在するＰＰｉの量は、ｅｘｐ（−ｋＰｔ）［１−ｅｘｐ（−ａ２／２ＤＰｔ）］によって記載され得、そして第２パッド上方に存在するＰＰｉの量は、数学的に：
（１／３）ｅｘｐ（−ｋＰｔ）［ｐａ２／ｂ２］ｅｘｐ（−ｂ２／２ＤＰｔ）によって近似され得る。因数１／３は、１／４のＤＮＡ配列がＩヌクレオチドを組み込み、次いで１／４のＤＮＡ配列が第２ヌクレオチドを組み込むなどであり、従って、このシリーズの合計は、１／３である。第１アンカーパッドおよび第２アンカーパッドの上方のＰＰｉの量は、２ＤＰｔがおよそｂ２と等しい場合に同等の大きさになり、これにより、分子が拡散するＲＭＳ距離は、隣接のアンカーパッドの間の距離に等しいことを示す。従って、本発明の実施において利用されるアッセイ条件を基に、このアンカーパッドはおよそ５０μｍ以上離して配置されなければならず、そして好ましくは、少なくとも３倍以上さらに離して（すなわち、１５０μｍ）配置される。
上述の発見は、アンカーパッドの表面密度上に限定を設定するが、多くの異なるアプローチの使用によって、アンカーパッドの総表面濃度を同時に増加させながら、距離の必要性を低下させ得る。１つのアプローチは初期の発光のみを検出することであるが、このことは、特に、多くの連続した同一のヌクレオチドを有するＤＮＡ配列からのシグナルを喪失する欠点を有する。
アンカーパッドの間の距離を減少させる第２のアプローチは、反応混合物中のスルフリラーゼの濃度を増加することである。反応速度ｋＰは、スルフヒドリル濃度に直接比例しており、そしてｋＰ −１／２として拡散距離スケールに比例する。従って、スルフヒドリル酵素濃度が４倍の因数によって増加される場合、個々のアンカーパッド間の距離はそれに伴って２倍の因数によって低下される。
第３のアプローチは、アンカーパッドの表面に酵素を結合することによって、有効濃度のスルフリラーゼ（これはまた、本明細書中に記載される他の酵素に対しても作用する）を増加することである。このアンカーパッドは、配列決定反応中心を取り囲む立方体表面の１つの壁として概説され得る。このパッドを１０μｍ×１０μｍの表面と仮定すると、１μＭの濃度を生じるためにパッド結合される分子数は、約６００，０００個の分子である。
アッセイにおけるスルフリラーゼ濃度は、５ｎＭとして見積もられる。この有効濃度に達するための結合される分子数は、約３０００個の分子である。従って、より多くの酵素分子を結合させることによって、より高い有効濃度が得られる。例えば、１つのアンカーパッドにつき１０，０００個の分子が結合され得る。
これまでに見積もられたように、各々のスルフリラーゼ分子は、表面上で６５ｎｍ２の総面積を占める。従って、表面上の１０，０００個のスルフリラーゼ酵素分子の総面積を繋げること（ａｎｃｈｏｒ）（すなわち、放出される１０，０００ＰＰｉに等価となるように）は、１．７μｍ２を必要とする。この値は、１０μｍ×１０μｍのアンカーパッド上の利用可能な表面積のおよそ２％のみである。従って、酵素濃度は、ずっと大きな値に容易に増加され得る。
個々のアンカーパッド間の距離を減少させることを可能にする第４のアプローチは、１つ以上の薬剤を利用して水相ベースのピロリン酸配列決定試薬（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）の粘度を増加させて、ＰＰｉが拡散するためにかかる時間を著しく増加させることである。しかし、これらの試薬はまた付随して、配列決定反応物中の他の未固定の成分に対する拡散時間を増加させ、従って総反応動態を遅滞させる。さらに、これらの試薬の使用はまた、配列決定反応物自体に化学的阻害を及ぼすように機能し得る。
個々のアンカーパッド間の距離を減少させるための第５の好ましい方法論は、放出されるＰＰｉが側方へと拡散するのを物理的に妨げる、空間ジオメトリ中のピロリン酸配列決定反応を行うことである。例えば、統合した空洞またはマイクロウェル（例えば、最適な繊維束の末端の酸エッチングによって作製される）を利用して、ＰＰｉのこのような側方への拡散を妨げ得る（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９８，Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ｏｒｄｅｒｄ Ａｄｄｒｅｓｓｉｖｅ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒ Ａｒｒａｙｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１２４２−１２４８を参照のこと）。この実施形態において、重要な変数は、ＰＰｉが高さｈの空洞から出る、総拡散時間と関連し、ここで、ｈはエッチングされた空洞の深さである。この拡散時間は、等式：２ＤＰｔ＝ｈ２を利用して計算され得る。上述の計算式において本発明の好ましいピロリン酸配列決定反応条件の使用によって、この空洞からのＰＰｉの拡散を完了する前に配列決定反応が進行して完了するように、深さ５０μｍの空洞が必要とされることが、示され得る。さらに、この型のジオメトリは、隣接するアンカーパッドから放出されるＰＰｉ由来のバックグラウンドのシグナルを付随して低減させるというさらなる利点を有する。
さらに、あるパッドから別のパッドへのＰＰｉの拡散によって生じるバックグラウンドを防ぐために、パッド間の表面の領域は、固定化ホスファターゼでコーティングされ得る。
引き続いて、一旦ＡＴＰが本発明の好ましい反応条件の利用によって形成されたら、反応時間ｌ／ｋＡは、０．２秒であることが示された。この反応時間は、ＰＰｉが自由に拡散する時間よりもずっと短いので、この反応時間は、本発明において利用されるアッセイのジオメトリおよび条件に関する、任意の上述の結論を有意に変更しない。
バックグラウンドの光の生成を緩和するために、ＤＮＡ配列決定テンプレートの領域のルシフェラーゼを（例えば、固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）または結合によって）「局在させる」ことが好ましくあり得る。ＰＰｉ分子がＡＴＰを生成する前に分散し得る距離によって詳細に説明される領域に、ルシフェラーゼを配置することが最も好ましくあり得る。ルシフェラーゼを固体支持体マトリクスに結合するための方法は、文献にて周知である（例えば、Ｗａｎｇら、１９９７．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４６：１３３−１３９を参照のこと）。従って、拡散時間の２秒間に、ルシフェラーゼはＤＮＡの鎖から５０μｍの距離以内に固定される。しかし、拡散時間を減少させて、従ってルシフェラーゼの結合に必要とさせる表面領域をさらに限定することが好ましくあり得るということに留意するべきである。
さらに、あるパッドから別のパッドへのＡＴＰの拡散によって生成されるパックグラウンドを妨げるために、パッド間の表面領域を、固定化ＡＴＰａｓｅ、特にＡＴＰをＡＤＰへと加水分解するＡＴＰａｓｅ（例えば、アルカリホスファターゼ）でコーティングし得る。
結合することが必要であるルシフェラーゼ濃度を決定するために、ルシフェラーゼを０．１μｍのＡＴＰに対して２００ｍＶの応答を生じる濃度で使用する、以前に公表された条件を利用し得る（Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９を参照のこと）。より具体的には、０．２ｍｌの反応容量において、２ｎｇのルシフェラーゼが０．１μＭのＡＴＰに対して１０ｍＶの応答を生じることが文献より公知である（ＫａｒａｍｏｈａｍｅｄおよびＮｙｒｅｎ，１９９９，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：８１−８５）。従って、０．２ｍｌ総反応容量中のルシフェラーゼの２０ｎｇの濃度は、これらの以前に公表された文献の条件を再現するために必要とされる。本発明の個々のアンカーパッド周辺の１０μｍの立方体の容量において、１×１０−１６ｇのルシフェラーゼ濃度が必要とされ、そしてルシフェラーゼの７１ｋＤａの分子量に基づき、この濃度は約１０００個のルシフェラーゼ分子に匹敵する。前で言及されたように、ルシフェラーゼの表面積は５０μｍ２と計算されている。従って、ルシフェラーゼ分子がビオチン化されてそしてアンカーパッドに結合されると推定すると、１０００個の分子は、総面積０．０５μｍ２を占める。これらの計算から、各々のアンカーパッド領域の面積が１００μｍ２である場合、過剰のルシフェラーゼ分子がアンカーパッドに結合され得ることは容易に明らかになる。
再度、文献において以前に公表された結果に基づくと、各々のヌクレオチドは配列決定のために約３秒かかる（すなわち、ヌクレオチドの付加に０．２秒；ＡＴＰ生成に２秒；生物発光を取得するのに０．２秒）。従って、１ヌクレオチドにつき約６０秒のサイクル時間が妥当であり、１つの配列決定テンプレートにつき、３０ヌクレオチドの情報を作成するために、１回の実験あたり約３０分を必要とする。
上述の配列決定方法論（すなわち、ポリメラーゼ→ＰＰｉ→スルフリラーゼ→→ＡＴＰ→ルシフェラーゼ→光）に対する代替の実施形態において、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖の伸長中にヌクレオチドを取り込む場合、光を生成する能力を有するポリメラーゼを（例えば、タンパク質融合の利用などによって）開発し得る。なお別の代替の実施形態において、配列決定反応においてＰＰｉの産生を直接的に測定するセンサを開発し得る。ＰＰｉの産生が周囲の緩衝液の電位を変化させるので、この変化は、産生されたＰＰｉ濃度を定量するために測定され得、そして換算され得る。
以前に考察されたように、ピロリン酸配列決定反応におけるヌクレオチド配列中へのｄＮＴＰのポリメラーゼ媒介性の取り込みは、光子（すなわち、光）の放出を生じる。次いで、ピロリン酸配列決定反応によって生成される光子は、種々の方法によって「捕捉」されそして定量され得、これらの方法論としては：フォトマルチプライヤーチューブ、ＣＣＤ、吸光度計、ルミノメーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ピロリン酸配列決定反応によって生成された光子は、ＣＣＤによって捕捉される。焦点合わせ装置（ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、光学レンズまたは光ファイバー）を通過して、そしてＣＣＤ素子に焦点を合わせる場合、光捕捉の効率は増加する。捕捉されるこれらの光子の画分は、以下の計算によって見積もられ得る。第１に、励起された光子を集束させるレンズは固体表面（すなわち、ＤＮＡチップまたはエッチングされた光ファイバー壁）の表面から距離ｒの位置にあり、ここで、ｒ＝１ｃｍであること、そしてアレイエレメント上に集束されるように光子は直径ｂの領域（面積＝πｂ２／４）を通らねばならず、ここでｂ＝１００μｍであることが、想定される。（このことは、大気中で約０．０１の開口数を有する光学系を生じる）。励起された光子があらゆる方向に均等に逃げることもまた記すべきである。距離ｒの位置では、この光子は４πｒ２に等しい面積に渡って拡散する。従って、レンズを通過する光子の画分は：（１／２）［１−（１＋ｂ２／４ｒ２）−１／２］によって記載される。ｒの値がｂの値よりもずっと大きい場合、レンズを通過する画分は：ｂ２／１６ｒ２によって記され得る。ｒおよびｂの上述の値については、光子のこの画分は６×１０−６である。ｂの増加またはｒの低下に伴って（すなわち、画像化システムの開口数が増加するにつれて）、捕捉された光子の画分が増加することに留意のこと。マイクロウェルが光ファイバーの末端中にエッチングされ、次いでこれら光ファイバーがまたＣＣＤ上に光を集束させるように働くＦＯＲＡの使用は、多くの光ファイバーの開口数を０．７の範囲内にある状態で、上記の所定の例からの開口数を大いに増加させる。各々のヌクレオチドの添加について、約１０，０００個のＰＰｉ分子が生成されることが予想され、そして全てのＰＰｉがスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって転換される場合、これらのＰＰｉは、約１×１０４個の光子の励起を生じる。平面アレイ（例えば、ＤＮＡチップ）を利用する場合のそれら光子のその後の「捕捉」および定量を最大にするために、平面固体支持体（例えば、カバースリップ）で直ちに光子を収集することが好ましくあり得る。このことは：（ｉ）カバースリップと、慣用的な光学レンズもしくは光ファイバーの束との間に光学的な液浸（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）オイルを利用すること、または好ましくは、（ｉｉ）カバースリップ自体の中へと直接的に光ファイバーを組み込むこと、のいずれかによって達成され得る。これまでに記載の計算（この場合、ｂ＝１００μｍおよびｒ＝５０μｍ）を実施すると、収集される画分は０．１５であることが見出され、このことは、約１×１０３個の光子の捕捉に匹敵する。この値は、適切なシグナルを提供するのに十分である。
以下の実施例は、本発明の例示の手段であって、本発明を限定するものではない。
（実施例１．空洞化された末端ファイバー光学アレイに結合したアンカープライマーの構築）
薄いウェハーのファイバー光学アレイの末端を、Ｈｅａｌｅｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２２１３−２２１６（１９９７）によって記載されるように、酸の中にこの末端を入れることによって空洞化する。
光活性化可能なビオチンアナログの薄層を、ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：２４９−２５４，１９９６）において記載されるように、空洞化された表面上で乾燥させて、そして規定されたパッドまたは活性なビオチンの領域を作製するために、マスクを通して白色光に曝す。次に、アビジンを添加して、そしてこのビオチンに結合させる。次いで、ビオチン化オリゴヌクレオチドを添加する。このアビジンは、ビオチン−アビジン−ビオチンの結合を介してビオチン化オリゴヌクレオチドを固定化し得る、有離のビオチン結合部位を有する。
パッドは１００μｍの間隔で約１０μｍの幅である。約３７％のパッドが１つのアンカープライマーを備えるように、オリゴヌクレオチドを添加する。１ｃｍ２の表面上に１０，０００個のパッドを配置して、単一のアンカープライマーを有する約３７００個のパッドを作製する。
（実施例２．環状核酸ライブラリーのメンバーのアニーリングおよび増幅）
開環ライブラリーテンプレートのライブラリーを、７０ｂｐのＳａｕ３Ａ１−ＭｓｐＩフラグメントの単一の核酸形態を含むと推定される核酸集団から調製する。このテンプレートは、アンカープライマーに相補的であるアダプター、配列決定プライマーに相補的である領域、および特定されるべき挿入配列を含む。ゲノムＤＮＡを消化するためのＳａｕ３Ａ１およびＭｓｐＩを使用して、ライブラリーを作製した。約６５〜７５ヌクレオチドのインサートを選択して、そして１２ヌクレオチド長のアダプターオリゴヌクレオチドにライゲーションした。アダプターオリゴヌクレオチドは、実施例１に記載されるように、基材表面に結合したアンカープライマーの配列に相補的な配列を有する。
このライブラリーをアンカープライマーのアレイとアニールする。ＤＮＡポリメラーゼをｄＮＴＰと一緒に添加して、そして巻き込みの（ｒｏｌｌｉｎｇ）環状複製を使用して、アンカープライマーを伸長させた。生じたものは、環状テンプレートの複数のコピーの連鎖である、依然として固体支持体に固定されている単一のＤＮＡ鎖である。数百ヌクレオチドのサイズ範囲の、１０，０００個またはそれ以上のコピーの環状テンプレートである。
（実施例３．ファイバー光学基材の末端に結合した核酸の配列分析）
実施例２に記載されるように、増幅された核酸を含むファイバー光学アレイのウェハーを、灌流チャンバー内に配置して、これらファイバーはそれ自体が１６００万画素のＣＣＤカメラに連結されたファイバー光学アレイの束に取り付けられる。配列決定プライマーを灌流チャンバー内に送達して、そして増幅された配列とアニールし得るようにする。次いで、スルフリラーゼ、アピラーゼおよびルシフェラーゼを、ビオチン−アビジンを使用して空洞化された基材に取り付ける。
配列決定プライマーは、図１に示されるように、多型を有すると推定されるインサート中へと延びるＤＮＡ合成を開始する。配列決定プライマーを、第１に、連続的に、洗浄溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはαチオｄＡＴＰ（ｄＡＴＰのアナログ）のうちの１つを、灌流チャンバー内へと送達することによって、伸長する。末端に結合したスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼは、配列決定反応の一部として遊離された任意のＰＰｉを、検出可能な光に変換する。アピラーゼの存在は、任意の未反応のｄＮＴＰを低下させる。光は代表的には、ファイバー画像化束（ｆｉｂｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｕｎｄｌｅ）に連結されたＣＣＤカメラによって３秒間（一方で、１〜１００秒、例えば２〜１０秒もまた適切である）回収され得、その後、追加の洗浄溶液を灌流チャンバーに添加して、過剰なヌクレオチドおよび副産物を取り除く。次いで、次のヌクレオチドをポリメラーゼと一緒に添加して、これによってサイクルを繰り返す。
洗浄中に、収集された光画像をＣＣＤカメラからコンピューターに転送する。光励起をコンピューターによって分析しそしてそれを使用して、対応するｄＮＴＰが伸長された配列プライマー中に取り込まれたかどうかを決定する。推定の多型を含むインサート領域の配列を得るまで、ｄＮＴＰおよびピロリン酸配列決定試薬の添加を繰り返す。
（実施例４．巻き込みの（ｒｏｌｌｉｎｇ）環状増幅を使用して生成されたタンデム反復テンプレートの配列分析）
配列５’−ｇＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣｇＡ Ｔｇｇ ＣＴｇ ＣＡｇ ＣＴＴ−３’（配列番号２）を有するプライマーを、配列５’−ＴＣｇ ＴｇＴ ｇＡｇ ｇＴＣ ＴＣＡ ｇＣＡ ＴＣＴ ＴＡＴ ｇＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ｇＴＴ ｇＣＣ ＴＡＡ ｇＣＴ ｇＣＡ ｇＣＣ Ａ−３’（配列番号１）を有する８８ヌクレオチドのテンプレート分子にアニールさせた。プライマーへのテンプレートのアニーリングは、テンプレート分子の５’末端および３’末端の並列を生じた。アニーリングされたテンプレートをリガーゼに曝し、この結果、環状分子を生成するために、テンプレートの５’末端および３’末端のライゲーションを生じた。
アニーリングされたプライマーは、巻き込みの環状増幅において、クレノウフラグメントおよびヌクレオチドを使用して３７℃で１２時間伸長した。生成物をＳＰＲ１技術（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して精製した。巻き込みの環状増幅は、環状テンプレート配列に相補的な配列のタンデム反復の形成を生じた。
伸長された配列中のタンデム反復の生成物を、配列５’−ＡＡｇＣＴｇＣＡｇＣＣＡＴＣｇＴｇＴｇＡｇｇ−３’（配列番号８）を有する配列決定プライマーにアニールすること、およびこのアリーリングされたプライマーを、１Ｍのベタインの存在下でＥＴターミネーター化学物（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、４０回の交互のサイクル（９５℃で１分、６０℃で２０秒）に供することによって同定した。
次いで、配列決定生成物を、１／５容量まで希釈して、そして直鎖ポリアクリルアミドを有するＭｅｇａＢＡＣＥ配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へと注入する前に、Ｇ−５０セファデックスカラムで精製した。
配列決定分析の電気泳動図を、図５に示す。追跡は、８８ｂｐの環状テンプレート分子の複数のコピーをタンデムに生成すること、そしてこれらのコピーをＤＮＡ配列決定反応において検出し得ることを、実証する。
（実施例５．ＦＯＲＡの調製）
ＤＮＡビーズ：デオキシオリゴヌクレオチド−ｇｇｇｇＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴｇｇＣ（配列番号９）をアニーリングしてプローブを捕捉し、これを５’末端でビオチン化して、次いでＤｙｎａｌ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ）またはＭＰＧビーズ（ＣＰＧ）（ビーズ濃度は１ｍｇ／ｍｌであった）のどちらかの上に固定した。ビーズを３０分間一定量のオリゴヌクレオチドとインキュベートすることによって固定化を実施した。インキュベート中に使用されるオリゴヌクレオチドの量を変化させることによって、オリゴヌクレオチドの異なる装填物（ｌｏａｄｉｎｇ）を得た。インキュベーション後、ビーズをそれぞれの容量のＴＥ緩衝液中で洗浄し、そして等容量のＴＥ中に懸濁した。
酵素ビーズ：スルフリラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＮ末端にＢＢＣＰドメインを有するルシフェラーゼ（３ｍｇ／ｍｌ）の１：１（容量／容量）の混合物を、等容量のＤｙｎａｌ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ）（濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）と４℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、このビーズをアッセイ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、５ｍＭ ＭｇＯＡｃおよび１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で４回洗浄し、次いで等容量のアッセイ緩衝液中に懸濁した。
ＦＯＲＡの調製：ＤＮＡビーズを、使用前に最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬまで１０倍に希釈した。酵素ビーズを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。ＦＯＲＡをＯ−リング（直径３ｍｍ）によって作製された１０個のスポットを有するジグ（ｊｉｇ）に設置した。５μＬのＤＮＡビーズを９個のスポット中に送達した。入口上の第１のスポットは、ＤＮＡを全く含まない、試薬中の任意のバックグラウンドを検出するためのコントロールスポットであった。ジグを遠心分離機に設置して、そして２０００ｒｐｍで５分間回転させる。遠心力は、ビーズをウェルの底に移動させる（１ウェル当たり約５〜１０個のビーズ）。このジグを遠心機から取り出し、そして５μＬのＳＬビーズを添加し、そしてジグを遠心分離機に設置して、そして２０００ｒｐｍで５分間回転させる。このプロセスを５μＬのＳＬビーズを用いて繰り返す。ＦＯＲＡをジグから除去し、そしてアッセイ緩衝液を含むｆａｌｃｏｎチューブ中に置いて、そして穏やかな揺らし動作によって３〜４回洗浄する。このようにして調製されたＦＯＲＡは、ピロリン酸配列決定による配列分析の準備用に準備する。
（実施例６．光ファイバー基材の末端に連結された核酸の配列分析）
試薬：配列分析用で、かつコントロールとしての試薬は、４つのヌクレオチドであり０．１μＭのピロリン酸（ＰＰｉ）を、基質溶液中に作製し、ここで、基質とは、３００μＭのルシフェリンおよび４μＭのアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）の混合物をいい、これらはＰＰｉ、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼを関連付ける反応のカスケードのための基質である。基質はアッセイ緩衝液中で作製される。酵素を試験して、そしてチャンバーを通る試薬のバックグラウンドのレベルを決定するために使用されるＰＰｉ濃度は、０．１μＭであった。ヌクレオチドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの濃度は、６．５μＭであり、そしてαｄＡＴＰの濃度は５０μＭであった。各々のヌクレオチドは、１００Ｕ／ｍＬの濃度のＤＮＡポリメラーゼ、クレノウと混合した。
ＦＯＲＡを具現化された装置の流動チャンバー内に設置して、そしてこの流動チャンバーをＣＣＤカメラの面板に取り付けた。このＦＯＲＡをチャンバーを介して基質を流動すること（１分間につき３ｍｌを２分間）によって洗浄した。次いで、試薬の配列を、アクチュエーターに接続したポンプによってチャンバーを介して流し、このアクチュエーターを、異なる試薬に挿入されたチューブを有する位置をスイッチするようにプログラムした。カメラを露光時間２．５ｓの高速取得モードに設定した。
パッドから出力されるシグナルは、パッド内の全ての画素上の平均のカウントである。フレーム番号は、実験中の経過時間に等しい。グラフは、異なる試薬の流動を示す。
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の記載は例示のために意図されるものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることが、理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、その特許請求の範囲の範囲内である。
図１Ａは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。 図１Ｂは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。 図１Ｃは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。 図１Ｄは、アンカープライマーを使用する回転環に基づく増幅の概略図である。 図２は、本発明に従う配列決定装置の図である。 図３は、本発明に従う潅流チャンバの図である。 図４は、本発明の空洞性の光ファイバー端の図である。 図５は、回転環増幅を用いて生成されたコンカテマー鋳型の配列生成の追跡である。 図６は、光ファイバー反応器アレイ（ＦＯＲＡ）の顕微鏡図である。 図７は、下敷きにされるＦＯＲＡの調製のために概略図である。 図８は、単一ウェルＤＮＡ送達のための顕微鏡図である。 図９は、フローチャンバおよびＦＯＲＡの概略図である。 図１０は、本発明の分析機器の図である。 図１１は、ＦＯＲＡ内での微視的な平行配列決定反応の概略図である。 図１２は、単一ウェル反応の顕微鏡図である。

Claims (39)

  1. 核酸を配列決定するためのアレイであって、
    複数の個々の光ファイバーの束から形成されている空洞性の光ファイバーウエハを含み、各個々の光ファイバーが３μｍと１００μｍの間の直径を有し、前記ウエハが上面および底面を含み、前記上面が４００，０００個より多い反応チャンバを含み、前記反応チャンバが空洞性の光ファイバーウエハの上面中にエッチングされ、且つ上面と底面の間の厚さが０．５ｍｍと５．０ｍｍの厚さの間であり；
    前記各反応チャンバの深さが個々の光ファイバーの１／２の直径と個々の光ファイバーの３倍の直径の間の範囲にあり；ならびに、
    前記空洞性のウエハの上面にある複数の反応チャンバが中に核酸を有し、且つ前記反応チャンバの５０％〜１００％が配列決定酵素が固定された可動固体支持体を有する、
    前記アレイ。
  2. 前記核酸が反応チャンバまたは可動固体支持体に固定されている、請求項１に記載のアレイ。
  3. 前記空洞性の光ファイバーウエハにおける各個々の光ファイバーの直径が６〜５０μｍの間である、請求項１または２に記載のアレイ。
  4. 前記反応チャンバが５０〜１００μｍの間の中心間距離を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレイ。
  5. 前記反応チャンバが１０〜１５０μｍの間の中心間距離を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレイ。
  6. 前記アレイが空洞性の光ファイバー表面と反対の研磨された光ファイバー表面を有し、且つ前記研磨された表面が第二の光ファイバーへの光学カップリングを可能にする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアレイ。
  7. 前記空洞性の光ファイバーウエハがコーティングされている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアレイ。
  8. 前記コーティングがプラスチック、長鎖チオールアルカンの自己アセンブリングした単層を有する金の層、オルガノシラン剤、光反応性リンカー、親水性ポリマーゲル、およびポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに特異的に吸収されるポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマーからなる群より選ばれる、請求項７に記載のアレイ。
  9. 配列決定酵素がルシフェラーゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
  10. 配列決定酵素がスルフリラーゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
  11. 核酸の配列決定のための装置であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアレイと、反応物を反応チャンバにまたは反応チャンバから送達するための手段と、ならびに配列決定反応事象を検出するための手段とを含む、装置。
  12. 前記装置が、５〜２００μｍの中心間距離を有する、請求項１に記載のアレイが配置されたフローチャンバ、
    中に配置された核酸が試薬に曝露されるように、１つ以上のリザーバーから該フローチャンバまで処理試薬を送達する流体手段；ならびに、
    該反応チャンバの各々から光学的シグナルの配列を検出するための検出手段であって、該検出手段が前記反応チャンバと連絡しており、前記配列の各光学的シグナルが処理試薬と該反応チャンバ中の核酸との間の相互作用を示す、検出手段、
    を含む、請求項１１に記載の装置。
  13. 前記空洞性の光ファイバーウエハにおける各個々の光ファイバーの直径が６〜５０μｍの間である、請求項１１または１２に記載の装置。
  14. 前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項１１、１２、または１３に記載の装置。
  15. 前記空洞性の光ファイバーウエハがコーティングされている、前記請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
  16. 前記コーティングがプラスチック、金の層、オルガノシラン剤、光反応性リンカー、親水性ポリマーゲル、およびポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに特異的に吸収されるポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマーからなる群より選ばれる、請求項１５に記載の装置。
  17. 配列決定酵素がルシフェラーゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
  18. 配列決定酵素がスルフリラーゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
  19. 前記核酸が反応チャンバまたは可動固体支持体に固定されている、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
  20. 前記反応チャンバが５０〜１００μｍの間の中心間距離を有する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
  21. 前記反応チャンバが１０〜１５０μｍの間の中心間距離を有する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
  22. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアレイおよび／または請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の装置を使用することを含む、核酸を配列決定するための方法。
  23. 前記アレイがフローチャンバに配置され、前記反応チャンバが５〜２００μｍの間の中心間距離を有し、ならびに
    前記方法が、中に配置された核酸が試薬に曝露されるように１つ以上のリザーバーから前記フローチャンバまで処理試薬を送達すること、および前記反応チャンバと連絡しており、前記配列の各光学的シグナルが処理試薬と該反応チャンバ中の核酸との間の相互作用を示す検出手段を用いて、反応チャンバの各々から光学的シグナルの配列を検出すること、を含む、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 前記核酸が反応チャンバまたは可動固体支持体に固定されている、請求項２４または２３に記載の方法。
  25. ピロリン酸が配列決定の副産物として生成する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ピロリン酸が、ＡＴＰの形成が可能な条件下で配列決定の副産物をスルフリラーゼと接触させることにより検出される、請求項２５に記載の方法。
  27. スルフリラーゼが熱安定性スルフリラーゼである、請求項２６に記載の方法。
  28. 未反応のヌクレオチド三リン酸を分解するためにアピラーゼを加えることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記配列決定試薬の送達後に拡散性の配列決定試薬を洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記緩衝液がアピラーゼを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記空洞性の光ファイバーウエハにおける各個々の光ファイバーの直径が６〜５０μｍの間である、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記反応チャンバが１０〜１５０μｍの間の中心間距離を有する、請求項２２または２３に記載の方法。
  33. 前記反応チャンバが５０〜１００μｍの間の中心間距離を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記アレイが空洞性の光ファイバー表面と反対の研磨された光ファイバー表面を有し、且つ前記研磨された表面が第二の光ファイバーへの光学カップリングを可能にする、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記空洞性の光ファイバーウエハがコーティングされている、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記コーティングがプラスチック、金の層、オルガノシラン剤、光反応性リンカー、親水性ポリマーゲル、およびポリスチレンまたはシラン処理されたガラス表面のいずれかに特異的に吸収されるポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマーからなる群より選ばれる、請求項３６に記載の方法。
  38. ピロリン酸配列決定酵素がルシフェラーゼである、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記配列決定酵素がスルフリラーゼである、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
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