JPH01232264A - 酵素免疫学的測定方法に基づくヒト血漿中のヒトプロテインｓの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、医学的、診断学的に有用なヒトプロティンＳ
の定量法に関する。

〔背景技術〕

近年、脳梗塞や心筋梗塞などの血栓症の発症要因の一つ
として血液凝固制御因子の量的あるいは質的な変化があ
ることが明らかにされ、この血液凝固制御因子としての
、プロティンＣおよびその関連因子のプロティンＳにつ
いての研究がなされている。

プロティンＳは、分子量的ａｏｏｏｏの−木鎖糖タンパ
ク質であり、ビタミンに依存性血漿タンパク質の一つで
、活性化プロティンＣのコファクターとして機能する生
理的凝固制御因子である。プロティンＳは、血液中では
、Ｃ４ｂ結合タンパク質（以下Ｃ４ｂｐと記す）と複合
体を形成しているプロティンＳ（以下複合体型プロティ
ンＳと記す）および、Ｃ４ｂｐと複合体を形成していな
いプロティンＳ（以下遊離型プロティンＳと記す）とし
て存在し、この複合体型プロティンＳは、血液凝固制御
作用を有せず、遊離型プロティンＳが、この作用を有す
ることが、明らかにされている（Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　
　Ｉｎｖｅｓｔ、　　７４．　２０８４−２０８８、１
９８４）。

また、多発性の血栓塞栓症を呈する先天性プロティンＳ
欠乏症と、血栓形成傾向を呈する種種の生理的、病的状
態や、薬物投与時における後天的なプロティンＳ欠乏症
が知られている。

この後天的なプロティンＳ欠乏症の原因としては、妊娠
、ネフローゼ症候群、自己免疫疾患、敗血症、抗ビタミ
ンに剤の投与、経口避妊薬の投与などがあげられている
。

プロティンＳ欠乏の形態は、血漿中の全プロティンＳ量
の低下だけではなく、Ｃ４ｂｐとの結合性の変化により
、全プロティンＳに占める複合体型プロティンＳの割合
が増し、血液凝固制御作用をもつ遊離型プロティンＳが
減少するために、血栓症および血栓形成傾向が現れたと
考えられる症例が、数多く報告されている。

プロティンＳに関するこれらの研究報告から明らかなよ
うに、血液中における遊離型プロティンＳならびに全プ
ロティンＳを正確に定量することは、医学的診断を行う
上で極めて重要な手段であり、かねてからこれらの優れ
た定量法の開発が要請されていた。

従来、免疫学的測定方法によるヒトプロティンＳの定量
は、種々行なわれているが、簡便で精度良く、かつ同一
原理に基づいて、全プロティンＳおよび遊離型プロティ
ンＳのそれぞれを、確実に、定量する方法は見出されて
いない。

一方、プロティンＳの生物活性測定法として、活性化プ
ロティンＣの測定を通じて、プロティンＳの活性化プロ
ティンＣに対するコファクター活性を測定する方法があ
るが、それらは、直接プロティンＳを定量する方法では
ないので、プロティンＳの欠乏もしくは過剰の程度と形
態を把握するために、免疫学的測定方法による全プロテ
ィンＳおよび遊離型プロティンＳのそれぞれについての
確実な定量と、それらの生物活性測定を行なう方法の開
発が強く望まれている。

〔発明の開示〕

本発明者らは、Ｃ４ｂｐと複合体を形成しているヒトプ
ロティンＳ（以下複合体型ヒトプロティンＳと記す）お
上びＣ４ｂｐと複合体を形成していないヒトプロティン
Ｓ（以下遊離型ヒトプロティンＳと記す）に対して結合
性を有する抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を用
いることにより、サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的
測定法によってヒト血漿中の全ヒトプロティンＳを精確
に測定する方法を提供することに成功した。また、本発
明者らは、遊離型ヒトプロティンＳのみに特異的に結合
する抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体を用いるこ
とにより、サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的測定法
によって、ヒト血漿中の遊離型ヒトプロティンＳを精確
に測定する方法を提供することに成功しＩこ　。

すなわち、本発明は抗ヒトプロティンＳモノクローナル
抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免疫学的測定
法によるヒト血漿中のヒトプロティンＳの定量法であっ
て、固相担体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
る抗体として、複合体型ヒトプロティンＳおよび遊離型
ヒトプロティンＳに対して結合性を有する抗ヒトプロテ
ィンＳモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒ
ト血漿中の全ヒトプロティンＳの定量法を提供するもの
であり、また、抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体
および抗ヒトプロティンＳ余りクローナル抗体を用いた
サンドイッチ法に基づく、酵素免疫学的測定方法による
ヒト血漿中のヒトプロティンＳの定量法であって、固相
担体に結合させる抗体および酵素標識を付与する抗体と
して、それらの少なくとも一方に、遊離型プロティンＳ
のみに特異的に結合する抗ヒトプロティンＳモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とするヒト血漿中の遊離型
ヒトプロティンＳの定量法を提供するものである。

以下に、実施例を掲げ、本発明の詳細な説明するＯ　・ 実施例　ｌ 抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原−ヒトプロティンＳの調製 ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　Ｎυ＝、　２．　３７
７−３８１（１９７９）に記載の５ｔｅｎｆｌｏらの方
法を、改変して行った。すなわち、ヒト凍結血漿からク
エン酸バリウム沈渣を得、これを緩衝液に溶解させ、３
０〜７０％硫安分画、透析を行った後、Ｊ、　　Ｂｉｏ
ｌ、　　Ｃｈｅｗ、。

２５８、　１９１４−１９２０　（１９８３）　　に記
載のプロティンＣの精製について用いた方法に従い、Ｄ
ＥＡＥ−３ｅｐｈａｃｅｌｌ（ファルマシア）カラムク
ロマトグラフィー法を２回行って、単離、精製した。

精製ヒトプロティンＳは、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ
、。

１７、８３５−８５１．（１９７５）に記載のＢｌｏｂ
ｅｌｌ　＆　Ｄｏｂｂｅ−ｒｓｔｅｉｎの方法に従い、
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ、非還元状態
では、分子量約８０キロダルトン（ＫＤ）の１本のバン
ドを示し、還元状態では分子量約８０キロダルトン（Ｋ
Ｄ）および７５ＫＤの２本のバンドを示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまず７０インド完
全アジユバント中で、前記（ａ）で記述した精製ヒトプ
ロティンＳで初回免疫する。マウスにそれぞれ８８Ｍｇ
のヒトプロティンＳを０．５ｍ（２の混合液として腹腔
内投与する。さらに１６日目に０．１１Ｍの食塩を含む
４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した
８８μ９のヒトプロティンＳを追加免疫する。最終免疫
として５７日目に０．１１Ｍ食塩含有４０ｍＭ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したヒトプロティン
５（８８μ９／３００μＱ）を腹腔内投与することによ
り補助免疫し、３日後にマウス肺臓を取り出し、肺細胞
を調製する。

（ｃ）　ＭＪ胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ｎｏ　１６４０
　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）に重
炭酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（
１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカ
リウム（５００／ｍＱ）、硫酸ストレプトマイシン（５
０Ｍｇ／　ｍ１２）、および硫酸アミカシン（１００μ
ｇ／　ｍ（１）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２に
し、０．２ａｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過す
る。

Ｎ５−１培地：上記ＲＰＭＩ　　１６４０培地に除菌ろ
過した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ　４．０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４．０００　（ＰＥ０４．００
０．　Ｍｅｒｃｋ　＆Ｇｏ、、　Ｉｎｃ、）　５０％（
ｗ／ｖ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミニローフｍ胞Ｎ５−１　（Ｐ３
−ＮＳＩ−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
（ｅｄ、Ｂ、Ｂ、旧５ｈａｌｌａｎｄ　Ｓ、Ｍ、Ｓｈｉ
ｉｇｉ）、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ（１９８０）　３５１−３７２に記載のＯｉらの
方法を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核肺臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５
＝１の割合で融合する。肺臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭ［１６４０培地で洗浄する。次に同じ
培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合する
。容量５０ａｍの円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗ
ａｋｉＧｌａｓｓ）を用い、４０ｍＱのＲＰ旧１６４０
培地中４００Ｘｙ、１０分間遠心し、上清を完全に吸出
する。沈澱細胞に３７℃加温ＰＥＧ　４，０００溶液１
．１ｍＱを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さら
に１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に３７
°Ｃ加温ＲＰＭＩ　１６４０培地１．ＬｍＱを１分間で
滴下する。この操作をさらに１回繰り返した後、同培地
７．８ｍＱを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞
を分散させる。これを４００Ｘ９．７分間遠心分離し、
上清を完全に吸引除去する。

次にこの沈澱細胞に３７°Ｃ加温ＮＳ−１培地１１ｍ１
２をすみやかに加え、細胞の大きい塊りをＩＯ＋ＩＩＱ
のピペットを用いて注意深くピペッティングして分散す
る。さらに同培地２２ｍＱを加えて希釈し、ポリスチレ
ン製９６穴マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）
にウェル当り６．ＯＸ　１０’個１０．１ｍＱの細胞を
加える。なお、この時使用する９６六マイクロウエルは
前処理として０　、２ｍＱのＮ５−１培地を加え、炭酸
ガス培養器中（３７℃）で−晩保温し、使用時に培地を
吸引除去しておく。

細胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／９
３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下に培゛養に付
する。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＮ５−１培地にさらに
ヒボキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１回目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍ１２
）をカロえる。２．３．５．８、ｌ１日日目培地の半分
（０，１ｍ１２）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４
日日目培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。以降
３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える
。通常２〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が°観
察される（融合率６２％）。ハイブリドーマ生育全ウェ
ルについて次項（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（
ＥＬＩＳＡ）により陽性ウェルをチエツクする。次にフ
ィーダーとして１０’個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培
地１　ｍＱをポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｖａ
ｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に加えたものを用い、上記で検出さ
れた各陽性ウェルの全内容物を移す。これを前記（ｃ）
におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３７℃で約１週
間培養に付する。その間１〜２回各ウェルの上清０．５
１を新しいＨＴ培地０．５ｍＱと交換する。ハイブリド
ーマの充分生育した時点でＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により陽性
を再確認し、それぞれについて次項（ｆ）記載の限界希
釈法によるクローニングを行う。

なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製２
５ｃｍ”組織培養フラスコ（ＩｗａｋｉＧｌａｓｓ）に
移し、凍結保存用試料を調製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）による抗
ヒトプロティンＳ抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４−１２０５−２１
４　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若
干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ
抗体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレージヨ
ンプレー　）　（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、Ｉｎｃ、）を０．５〜１．０μｇのヒトプロティンＳ
でコートし、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）でブロックする。これに前記（ｄ）で得ら
れたハイプリドーマ生育ウェルの上溝の一部を加えて室
温で約１時間インキュベートする。２次抗体として西洋
わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識−ヤギ抗マウス
イムノグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え、
さらに室温で約１時間インキュベートする。次に、過酸
化水素と基質である０−フ二二レンジアミンを加え、生
成した褐色の程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ
−Ａ４、東洋曹達工業）を用いて４９２ｎｍの吸光度を
測定する。

（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イプリドーマを取得する。Ｎ５−１培地ｍＱ当りフィー
ダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエル、
３６ウェルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１個お
よび０．５個のハイブリドーマを力Ｕえる。５日目と１
２２日目全ウェルに各約０．１ｍＱのＮ５−１培地を追
加する。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハイ
プリドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェル
が５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。テ
ストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中
のコロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認さ
れたウェルを４〜６個選び再クローニングする。最終的
にヒトプロティンＳに対するモノクローナル抗体産生ハ
イプリドーマ１２株（第１表参照）が得られＩ；。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをＮ５
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白濃度は１０〜１００μｇ／ｍＱである）。一方
、大量に抗体を得るためには肺細胞とミエローマ細胞の
由来動物と同系の動物（Ｂａ１ｂ／ｃ、マウス）に腫瘍
形成促進剤プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、）をマウス−匹当り０．５ｍｆｆ腹
腔内投与し、１〜３週間後に、各ハイブリドーマｌＸｌ
０’個を同じく腹腔内投与する。それにより１〜２週間
後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｒｎｇ／ｍ
ρの腹水を得ることができる（生体内増殖）。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖及びアイソタイ
プ 前記（ｇ）で得られた各々の腹水を、ヒトプロティンＳ
をコートしたミクロタイトレージョンプレートを用いて
前述したＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に従って各腹水中のモノクロ
ーナル抗体をそのヒトプロティンＳに結合させる。ＰＢ
Ｓによる洗浄後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウスＩ
ｇ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａ　ｔｏｒ　１ｅｓ）を
加える。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基
質として２，２′−アジノージ（３−エチルベンゾチア
ゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した。

その結果は第１表に示されている。得られた抗ヒトプロ
ティンＳモノクローナル抗体の内１０個が免疫グロブリ
ン鎖γ１／にを、１個がγ２ｂ／にを、そして、１個が
μ／にを有していた。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水のうち、ＩｇＧクラスはア
フィゲルプロティンＡ　ＭＡＰＳ−ｎキット（バイオラ
ッド）を用いて精製した。１ｇＭクラスは、硫安分画（
４０％飽和）後、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有、４０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ−
３ｅｐｈａｃｅ　ｌ　ｌカラムクロマトグラフィーにお
いて、塩化ナトリウムＯ，１Ｍから１．ＯＭまでの直線
的濃度勾配で溶出し、含有画分を集め、単離精製した。

（ＤプロティンＳに対する抗ヒトプロティンＳモノクロ
ーナル抗体の親和定数 前記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体のプロティ
ンＳに対する親゛和定数を、５　ｍＭ　ＣａＣＱｚ存在
下および０．５＋ｎＭ　ＥＤＴＡ存在下においてＥＬＩ
ＳＡ法を用いて求めた。先述のＥＬＩＳＡ法に従って、
ミクロタイトレージョンプレートにヒトプロティンＳを
コートし、ｌＯ％ＢＳＡでブロックした。

前記（ｉ）で得られた各モノクローナル抗体を、５　ｍ
Ｍ　ＣａＣｌ２２または０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の緩
衝液に溶解し、５００ｎｇ／ｍＱに調製したものを段階
希釈し、各々１００μＱを前述で調製したミクロタイト
レージョンプレートの各ウェルに添加し、室温で約１時
間インキュベートした。以下、二次抗体反応と発色反応
を、前記（ｅ）のＥＬＩＳＡ法に従って行ない、得られ
た測定値から常法に従って親和定数（Ｋｄ）を求めた。

その結果は、第１表に示されている。

実施例　２ 複合体形成に対する効果の検討 ９６ウエルミクロタイトレーシヨンプレート（Ｆｌｏｗ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を、Ｏ，１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解したＣ、ｂｐ　（
１０ｕｇ／ｍＱ）　５０μｉ２でコートし、次に未コー
ト部分を１０％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロック
した。一方、別の試験管にヒトプロティンＳ　（３００
ｎｉ？／　ｍＱ）６０μαト実施例１（ｉ）で得られた
各モノクローナル抗体を含有するリン酸緩衝液（１０μ
ｙ／ｍＱ”）　６０μａを加え、３７°Ｃで６０分間反
応させた。この反応混合液から５０μＱを予めＣ４ｂｐ
をコートしておいたプレートの各ウェルに加え、３７℃
で６０分間反応させた。プレートを帆１％ＢＳＡ含有ト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄した後、Ｐ
ＯＤ標識ポリクローナル抗ヒトプロティンＳ　　［ｇＧ
（０，４μｇ／１１２）　５０μＯを加え、３７°０６
０分間反応させ、上記の緩衝液で２回洗浄した。次に過
酸化水素と、基質である０−フェニレンジアミンを加え
、生成した褐色の程度を、マイクロプレートリーダー（
ＭＰＲ−Ａ４、東洋曹達工業）を用いて４９２ｎｍの吸
光度を測定し、結合したヒトプロティンＳを測定した。

その結果、第１表に示されているモノクローナル抗体Ｎ
ｏ、ＭＦＳ−５８よびＭＦＳ−７がプロティンＳと０４
ｂｐの複合体の形成を阻害した。

実施例　３ 血漿中の全ヒトプロティンＳの定量法（ＥＩＡ法）（ａ
）酵素標識モノクローナル抗体（ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
）の調製 実施例１（ｉ）で得られたモノクローナル抗体の緩衝溶
液を、ｌＱｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に
対して一夜透析した。これとは別に、ｌ＋１１ｇのＰＯ
Ｄを２５０μｇの蒸留水に溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム５０μａを加え、室温で２０分間酸化処理後
、１　ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）に対し
一夜透析した。

得られたアルデヒドＰＯＤに０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，５）を５μＱ加え、ｐＨを９〜９．５に
すると同時に、前述のようにあらかじめ透析したモノク
ローナル抗体２＋＋１ｇを添加した。室温で２時間反応
後、４１１９／Ｉ！＜１の水素化ホ９素ナトリウム２５
μＱを加え、４°Ｃで２時間静置した。

以上のようにして得られたＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を０．
１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ　４４
カラム（ＬＫＢ製）を用いたゲルか過により、ＩｇＧ−
ＰＯＤ画分を分取した。

（ｂ）コーティングおよびブロッキング実施例１（ｉ）
で得られた抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体（Ｍ
ＦＳ−２）を炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，２）
に溶解し、その濃度を５μ９７ｍＱに調製した。この抗
体溶液を９６ウエルミクロタイトレーシヨンプレート（
Ｆ　ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、
）にｌウェル当り、１ｏＯｕｆｆ添加し、コートした。

次にＰＢＳ溶解ｌＯ％ＢＳＡ　３００μｇでプレートを
ブロックした後、緩衝液Ａ　（０，２Ｍ塩化ナト　　リ
　　ウ　ム　、　　０．１　％　Ｔｗｅｅｎ　　　２０
、　０．５ｍＭ　　　ＥＤＴＡ、　　　０．５％ＢＳＡ
、　０．０２％マーチオレイト含有０．０５Ｍトリス−
塩酸緩衝液、ｐＨ７，５）で洗浄した。

（ｃ）試料の調製 （１）標準試料の調製 正常プール血漿の全ヒトプロティンＳ濃度を、Ｂｌｏｏ
ｄ、　６７、２．４０６　４１０　（１９８６）記載の
Ｌａｕ−ｒｅｌｌ　ｒｏｃｋｅｔ法により確認した後、
緩衝液Ａで希釈して、全ヒトプロティンＳ濃度を２７０
ｎｇ／ｍ（＋に調製し、これを段階希釈した。

（２）血漿試料の調製 健常者の血漿５例を、各々、緩衝液Ａで２００倍に希釈
した。

（ｄ）測　　定 （ｃ）で調製した試料を、各々、ｌウェル当り１００μ
α添加し、室温で１時間インキュベート（免疫反応）後
、反応溶液を除去し、緩衝液Ａで２回洗浄した。さらに
緩衝液Ｂ　（０，２Ｍ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｖｅ
ｅｎ　２０．５ｍＭ塩化カルシウム、０．５％Ｂ５Ａ１
０．０２％マーチオレイト含有０．０５Ｍトリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ７，５）で１回洗浄した。

次にＩｇＧ　（ＮＦＳ−１１）　−ＰＯＤ複合体を緩衝
液Ｂで１１００ｎ／＋Ｑに調製した標識抗体溶液をｌウ
ェル当り１００μＱずつ添加し、室温にて１時間インキ
ュベーション（免疫反応）後、反応溶液を除去し、緩衝
液Ｂでプレートを２回洗浄した。

次に、０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）に０−フェニレンジアミン・２塩酸塩
を溶解し、その濃度を２ｍｇ／ｍＱに調製した溶液を１
００μａ加え室温で１０分間インキュベート（発色反応
）後、２Ｎ硫酸１００μａを添加し、反応を停止させた
。反応停止後、マイクロプレートリーダー（ＭＲ−６０
０，ダイナチック）を用いて、波長４９０ｎｍの吸光度
を測定し、盲検と試料の吸光度差を求めた。標準試料よ
り作成した検量線より、試料中の全ヒトプロティンＳ濃
度を求めた。

その結果、健常者血漿５例の全ヒトプロティンＳ濃度の
平均値（ｍｅａｎ±ＳＤ）は、３１．３±５．６μ９／
ｍΩでありた。

実施例　４ 血漿中の遊離型ヒトプロティンＳの定量法（ＥＩＡ法） （ａ）コーティングおよびブロッキング実施例１（ｉ）
で得られた抗ヒトプロティンＳモノクローナル抗体（Ｎ
ＦＳ−５）を炭醜水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，２）
に溶解し、その濃度を５μ９７ｍＱに調製した。この抗
体溶液を９６ウエルミクロタイトレーシヨンプレートに
ｌウェル当り、１００μＱ添加し、コートした。次にＰ
ＢＳ溶解１０％ＢＳＡ　　３００１１（２で／Ｖ−トを
ブロックした後、前記の緩衝液Ａで洗浄した。

（ｂ）試料の調製 （１）標準試料の調製 実施例１　（ａ）で得られた精製ヒトプロティンＳを緩
衝液Ａで４４０ｎｇ／ｍＱに調製し、これを段階希釈し
た。

（２）血漿試料の調製 健常者の血漿５例及び正常プール血漿（実施例３と同一
検体）を、緩衝液Ａで、各々を２００倍に希釈した。

（ｃ）測　定 （ｂ）で調製した試料を、各々１ウエル当り１００μＱ
添加し、室温で１時間インキュベート（免疫反応）後、
反応溶液を除去し、緩衝液Ａで２回洗浄した。さらに、
前記の緩衝液Ｂで１回洗浄した。

次ニ実施例３　（ａ）テ調製Ｌ　ｆ：　ＩｇＧ（ＩＪＦ
ｓ−１１）−ＰＯＤ複合体を緩衝液Ｂで１１００ｎ／ｍ
Ｑｊ、：調製した標識抗体溶液をｌウェル当り、１００
μαずつ添加し、室温にて１時間インキュベート（免疫
反応）後、反応液を除去し、緩衝液Ｂでプレートを２回
洗浄した。

次に０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸８１　
？ｔｒ　Ｈ（ｐＨ６，０）に０−フェニレンジアミン・
２塩酸塩を溶解し、その濃度を２ｍｇ／ｒａＱに調製し
た溶液を、１００μｇ加え、室温で１０分間インキュベ
ート（発色反応）後、２Ｎ硫酸１００μＱを添加し、反
応を停止させた。反応停止後、前記マイクロプレートリ
ーダーを用いて波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、盲検
と試料の吸光度差を求めた。標準試料より作成した検量
線より、試料中の遊離型ヒトプロティンＳ濃度を求めた
。

その結果、健常者血漿５例の遊離型ヒトプロティンＳ濃
度の平均値（ｍｅａｎ±ＳＤ）は１４．１±３．７μｇ
／ｍｕ、正常プール血漿の遊離型プロティンＳ濃度は１
２．２μｇ／ｍＱであった。

実施例　５ （ａ）血漿中の全ヒトプロティンＳの定量法におけるＣ
、ｂｐの測定値への影響の検討 実施例１　（ａ）で得られた精製ヒトプロティンＳと、
下記の方法に従って調製したヒトＣ４ｂｐを緩衝液Ａで
溶解し、一定濃度のヒトプロティンＳ　（２７，５Ｂｇ
／　ｍＱ）に対し、各濃度ノ０４ｂｐヲ加工、そのモル
比を段階的に変化させた混合溶液を調製し、これを、試
料として、各々ｌウェル当り１００μＱ用いて、実施例
３の方法に従って、全ヒトプロティンＳを定量した。

その結果を、第２表と第１図に示した。

抗１原−ヒトＣ４ｂｐの調製 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、ηリー、８３７−８４６及び８
４７−８５６（１９８３）に記載のＤａｈｌｂａｃｋら
の方法に従い４Ｑの健常者新鮮血漿をクエン酸バリウム
に吸着させ、さらにその溶出液中のＣ４ｂｐをＤＥＡＥ
　−５ｅｐｈａｃｅｌ、ヘパリン−３ｅｐｈａｒｏｓｅ
（Ｋａｂｉ製）及びＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（Ｐ
ｈａｒｍａｃ　ｉａ）カラムクロマトグラフィー法で単
離、精製した。精製したヒトｃ、ｂｐは、Ｊ。

Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　８０．５７９−５９９　（
１９７３）　　に記載のＬａｅｍｍ　ｌ　ｉ　らの方法
に従い還元剤存在下硫酸ナトリウムーポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ分
子量約７０，０００ダルトン（Ｄ）の単一バンドを示し
た。

第２表と第１図に示すとおり、Ｃ４ｂｌ）／全ヒトプロ
ティンＳ　ＣｍｏＱ／　ｍｏＱ）が１以上においては、
測定値の変動は見られず、Ｃ４ｂｐの存在による測定値
への影響は見られなかった。

（ｂ）血漿中の遊離型ヒトプロティンＳの定量法におけ
るＣ４ｂｐの測定値への影響の検討前記（ａ）の方法と
同様に試料を調製し、各々ｌウェル当り１００μα用い
て、実施例４の方法に従って遊離型プロティンＳを定量
し、その結果を第３表と第２図に示した。ｃ＜ｂｐ添加
量の増加に伴なって、実測値曲線は、Ｃａｂｐ／全プロ
テ全プロティン上き、全プロティンＳの６０％がＣ４ｂ
ｐの複合体すなわち複合体型プロティンＳとして存在す
ると仮定した場合の理論値曲線とよく一致した曲線を示
した。

実施例　６ ヒトプロティンＳ欠乏症家系者のヒトプロティンＳの定
量 先天性ヒトプロティンＳ欠乏症の一家系（１２例）の血
漿を、実施例３および実施例４の方法に従って、全ヒト
プロティンＳおよび遊離型ヒトプロティンＳを定量した
結果を第４表に示す（表中Ｎｏ、７−　Ｎｏ、　１８）
。

検体Ｎｏ、９、Ｎｏ、１１、Ｎｏ、１４、Ｎｏ、１７の
ように全ヒトプロティンＳ濃度の低下と、全ヒトプロテ
ィンＳに占める遊離型ヒトプロティンＳの比率の両方が
低下している例、また検体Ｎｏ、１０のように全ヒトプ
ロティンＳ濃度は正常範囲の下限にあるが、遊離型ヒト
プロティンＳが正常プール血漿のそれに比べ約４０％に
低下している例、さらに、検体Ｎｏ、１５のように、全
ヒトプロティンＳ１遊離型ヒトプロテインＳの濃度がと
もに低下している例などがあることが判明し、これによ
り、ＥＩＡ法による全ヒトプロティンＳ定量法と、遊離
型ヒ！・プロティンＳ定量法を併用することによって、
ヒトプロティンＳの欠乏もしくは過剰の程度と形態およ
びヒトプロティンＳ欠乏症の病態を簡便に把握すること
ができる。

第２表 ＰＳ＝ヒトプロティンＳ 第３表 理論（％）は、Ｃ４ｂｐ／ＰＳが１のとき全ヒトプロテ
ィンＳの６０％が０４ｂｐとの複合体すなわち複合体型
ヒトプロティンＳとして存在すると仮定した値である。

第４表 正常プール血漿の全ヒトプロティンＳ及び遊離型ヒトプ
ロティンＳ濃度を１００％とした場合の相対濃度で表示
した。

Ｎ００２〜６の結果は、実施例３および実施例４によっ
て得られた健常者５名の測定値をもとに、上記の相対濃
度で示した値である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例５（ａ）の結果を示すグラフであり、 第２図は、実施例５（ｂ）の結果を示すグラフである。 特許出願人　富士薬品工業株式会社 第１図 Ｃ４ｂｐ／全ｐｓ（ｍｏｌ／ｍｏｌ） 第２図 Ｃ４ｂＰ／　ＰＳ　　　（ｍｏｌ／ｍｏｂ）手　　続　
　補　　正　　書 昭和６３年６月７日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １　事件の表示 昭和６３年特許願第５８４３９号 ２　発明の名称 酵素免疫学的測定方法に基づくヒト血漿中のヒトプロテ
ィンＳの定量法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 住所　富山県高岡市長慶寺５３０番地 名称　富士薬品工業株式会社 ４、代理人 住所　東京都千代田区麹町３丁目２番地相互第一ビル ６　補正の対象　　　明細書の発明の詳細な説明の欄７
８補正の内容

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトプロテインＳモノクローナル抗体を用いた
   サンドイッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒト
   血漿中のヒトプロテインＳの定量法であって、固相担体
   に結合させる 抗体および酵素標識を付与する抗体として、Ｃ＿４ｂ結
   合タンパク質と複合体を形成しているヒトプロテインＳ
   およびＣ＿４ｂ結合タンパク質と複合体を形成していな
   いヒトプロテインＳに対して結合性を有する抗ヒトプロ
   テインＳモノクローナル抗体を用いることを特徴とする
   ヒト血漿中のヒトプロテインＳの定量法。
2. （２）抗ヒトプロテインＳモノクローナル抗体および抗
   ヒトプロテインＳポリクローナル抗体を用いたサンドイ
   ッチ法に基づく、酵素免疫学的測定方法によるヒト血漿
   中のヒトプロテインＳの定量法であって、固相担体に結
   合させる抗体および酵素標識を付与する抗体として、そ
   れらの少なくとも一方に、Ｃ＿４ｂ結合タンパク質と複
   合体を形成していないヒトプロテインＳのみに特異的に
   結合する抗ヒトプロテインＳモノクローナル抗体を用い
   ることを特徴とするヒト血漿中の遊離型ヒトプロテイン
   Ｓの定量法。