JP4697706B2 - 高毒性髄膜炎菌系統に対する広範な防御のためのポリペプチド−ワクチン - Google Patents

Description

本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、免疫学とワクチン学の分野にある。特に、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）由来の抗原、および免疫化における抗原の使用に関する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性のヒト病原体であり、咽頭にコロニー形成し、そして髄膜炎（および、時折、髄膜炎のない敗血症）を引き起こす。これは、風土病および流行病との両方を引き起こす。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する結合体化ワクチンを導入後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、米国において細菌性髄膜炎の主な原因である。

生物体の莢膜多糖に基づき、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの種々の血清群が同定されている。血清群Ａは、サハラ以南のアフリカにおける流行病に最も頻繁に関係する病原体である。血清群Ｂおよび血清群Ｃは、米国およびほとんどの先進国における症例の大部分の原因である。血清群Ｗ１３５および血清群Ｙは、米国および先進国における症例の残りの原因である。分類は、血清群の後に、血清型、血清亜型、およびその後に免疫型を含み、そしてこの標準的な命名法は、血清群、血清型、血清亜型および免疫型を列挙し、それぞれが、コロンによって分けられる（例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９）。血清群Ｂ内では、いくつかの系統は、しばしば（高侵襲性）疾患を引き起こし、いくつかの系統は、他の（高毒性）疾患よりもより重い形態の疾患を引き起こし、そして他の系統は、多少なりともまれに疾患を引き起こす。７つの高毒性系統が認知される（すなわち、亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、および亜群ＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスター、ならびに系統３）。これらは、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）により決定されるが、多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌を分類するために用いられる［参考文献１］。

血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙに対する多糖ワクチンは、長年公知であるが［２、３］、血清群Ｂに対するワクチンは理解しにくいと証明されている。外膜小胞に基づくワクチンは試験されているが［例えば、参考文献４を参照のこと］、これらのワクチンによって生じる防御は、代表的に、ワクチン作製に使用される株に制限される。従って、広範に有効な血清群Ｂワクチンの必要性が依然として残る。

髄膜炎菌性の血清群Ａ［５］および血清群Ｂ［６、７］についてのゲノム配列が報告されており、この血清群Ｂの配列は、ワクチン抗原を同定するために研究されている［例えば、参考文献８〜１３］。候補抗原は、異種発現を改善するために操作されている［参考文献１４〜１６］。

髄膜炎菌性疾患および／または髄膜炎菌性感染に対する免疫を提供するためのさらなる組成物、および改善された組成物、ならびに、特に、血清群Ｂ髄膜炎菌に対する広範な免疫を提供するためのさらなる組成物、および改善された組成物を提供することが、本発明の目的である。

（発明の開示）
Ｂ型肝炎ウイルス、ジフテリアおよび破傷風のような病原体に対するワクチンは、単一のタンパク質抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、または破傷風トキソイド）を含む。対照的に、無細胞性百日咳ワクチンは、代表的に、少なくとも三つのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓタンパク質を含み、そしてＰｒｅｖｅｎａｒ^ＴＭ肺炎球菌ワクチンは、７つの別個の結合体化糖抗原を含む。細胞性百日咳ワクチン、はしかワクチン、不活性化ポリオワクチン（ＩＰＶ）、および髄膜炎菌性ＯＭＶワクチンのような他のワクチンは、まさにこれらの性質により、多数の抗原混合物を形成する。

従って、対防御が、単一抗原、少数の規定抗原、または複雑な未規定抗原混合物により誘発され得るかどうかは、問題となる病原体に依存する。本発明は、少数の規定抗原が、髄膜炎菌感染に対する広範な防御を提供し得るという本発見に基づき、そして本発明は、被験体に投与後、この被験体における抗体応答を誘導し得る組成物を提供するのであって、ここでこの抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの高毒性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３のうちの２以上（例えば、２または３）に対して殺菌性である。

本発明の組成物は、単一抗原からなるよりむしろ、１０以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２）の精製された抗原の混合物を含有することが好ましく、この組成物は、抗原複合体および未規定の抗原混合物を含有しないことが、特に好ましく、例えば、この組成物に外膜小胞を含有しないことが好ましい。

血清群Ｂ髄膜炎菌について、５つの規定タンパク質抗原の混合物は、優れた防御性免疫応答を誘発することが見出されている。従って、本発明は、以下の５つの髄膜炎菌性タンパク質抗原を含む組成物を提供する：（１）「ＮａｄＡ」タンパク質；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質。これら抗原は、「５つの基本抗原」として、本明細書中に言及される。

（ＮａｄＡタンパク質）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ由来の「ＮａｄＡ」（ナイセリア付着因子Ａ）は、参考文献１０（配列番号２９４３および２９４４）におけるタンパク質「９６１」として、ならびに参考文献６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：１１３５２９０４および７２２７２５６もまた参照のこと）における「ＮＭＢ１９９４」として開示される。このタンパク質の詳細な説明は参考文献１７において見出され得る。血清群Ａにおいて一致するタンパク質はない［５、１７］。

本発明に従って使用される場合、ＮａｄＡは、種々の形態をとり得る。ＮａｄＡの好ましい形態は、参考文献１４〜１６において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、Ｃ末端膜アンカーなしのＮａｄＡは好ましく（例えば、株２９９６について残基３５１〜４０５の欠失［配列番号１］）、これは、時折、本明細書中で、「Ｃ」の上付き添え字の使用（例えば、ＮａｄＡ^（Ｃ））により区別される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける膜アンカードメインなしのＮａｄＡ（例えば、配列番号１）の発現は、この２３マーのリーダーペプチドの随伴性除去（例えば、株２９９６について３２７マーを残すこと［配列番号２］）を伴って、培養上清内へこのタンパク質の分泌をもたらす。リーダーペプチドのないポリペプチドは、時折、本明細書中で、「ＮＬ」の上付き添え字の使用（例えば、ＮａｄＡ^（ＮＬ）またはＮａｄＡ^{（Ｃ）（ＮＬ）}）により区別される。

好ましいＮａｄＡ配列は、配列番号２に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する。これはＮａｄＡ変異体（例えば、対立遺伝子変異体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。ＮａｄＡの対立遺伝子形態は参考文献１８の図９において示される。

他の好ましいＮａｄＡ配列は、配列番号１由来の少なくともｎの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。好ましいフラグメントは、ＮａｄＡ由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号１のＣ末端および／またはＮ末端（例えば、ＮａｄＡ^（Ｃ）、ＮａｄＡ^（ＮＬ）、ＮａｄＡ^{（Ｃ）（ＮＬ）}）由来の１以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失する。Ｎ末端残基が欠失する場合、この欠失が、ＮａｄＡがヒト上皮細胞に接着する能力を失わせないことが好ましい。配列番号１の好ましいフラグメントは、配列番号２である。

分泌されたＮａｄＡは、好都合なことに、以下の工程を包含するプロセスによって培養培地から、高度に純粋な形態で調製され得る：限外濾過による緩衝液に対する濃縮工程およびダイアフィルトレーション工程；陰イオンカラムクロマトグラフィー工程；疎水性カラムクロマトグラフィー工程；ヒドロキシルアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー工程；緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程；および濾過滅菌工程。このプロセスのさらなる詳細は、実施例において示される。

好ましくは、ＮａｄＡはオリゴマー形態（例えば、３量体形態）において使用される。

（７４１タンパク質）
血清群Ｂ由来の「７４１」タンパク質は、参考文献１０（配列番号２５３５および２５３６）において開示され、そして参考文献６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７１２８もまた参照のこと）における「ＮＭＢ１８７０」として開示される。血清群Ａ［５］において一致するタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９３２２を有する。７４１は、天然にリポタンパク質である。

本発明に従って使用される場合、７４１タンパク質は種々の形態をとり得る。７４１の好ましい形態は、参考文献１４〜１６において開示される改変体のような、切断改変体または欠損改変体である。特に、７４１のＮ末端は、このポリグリシン配列まで欠失され得（例えば、株ＭＣ５８について残基１〜７２の欠失［配列番号３］）、これは、時折本明細書中で、「ΔＧ」の接頭語の使用により区別される。この欠失は発現を上昇させ得る。この欠失はまた、７４１の脂質付加部位を除去する。

好ましい７４１配列は、配列番号３に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する。これは７４１改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。７４１の対立遺伝子形態は、参考文献１６の配列番号１〜２２において見出され得、そして参考文献１９の配列番号１〜２３において見出され得る。参考文献２０の配列番号１〜２９９は、さらなる７４１配列を示す。

他の好ましい７４１配列は、配列番号３由来の少なくともｎの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。好ましいフラグメントは、７４１由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号３のＣ末端および／またはＮ末端からの一以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失する。

タンパク質７４１は、抗髄膜炎菌性抗体応答の誘発にとって、極めて有効な抗原であり、全ての髄膜炎菌性血清群にわたり発現される。系統発生解析は、このタンパク質は２つの群に分かれ、そしてこれらのうち１つはさらに分かれ、合計で３つの改変体を生じる［２１］ことを示し、そして、ある改変体に対して産生される血清は、同一の改変体群内に対して殺菌性である一方で、この血清は、この他の２つの変異体のうちの１つを発現する株に対して活性でない（すなわち、改変体内の交差防御はあるが、改変体間の交差防御はない）。従って、最大の交差株の効力のためには、組成物は、タンパク質７４１の１つの変異体より多くの変異体を含有することが好ましい。各改変体由来の例示配列は、本明細書中の配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２において示され、これは、脂質が７４１のリポタンパク質形態に共有結合的に付着されるＮ末端のシステイン残基で始まる。

従って、この組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有することが好ましい：（１）配列番号１０に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１０由来の少なくともｘの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第一のタンパク質；（２）配列番号１１に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１１由来の少なくともｙの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第二のタンパク質；および（３）配列番号１２に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１２由来の少なくともｚの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第三のタンパク質。

ａの値は少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ｂの値は少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ｃの値は少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５以上）である。ａ、ｂ、およびｃの値は、互いに本質的に関連しない。

ｘの値は少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙ、およびｚの値は、内因的に、相互に関連しない。

任意の所定の７４１アミノ酸配列は、カテゴリー（１）、（２）、および（３）のうちの一より多くに該当しないことが好ましい。従って、任意の所定の７４１アミノ酸配列は、カテゴリー（１）、（２）、および（３）のうちの一つだけに該当する。従って、以下であることが好ましい：タンパク質（１）はタンパク質（２）に対してｉ％未満の配列同一性を有する；タンパク質（１）はタンパク質（３）に対してｊ％未満の配列同一性を有する；そしてタンパク質（２）はタンパク質（３）に対してｋ％未満の配列同一性を有する。ｉの値は６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、そして大きくてもａである。ｊの値は６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、そして大きくてもｂである。ｋの値は６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、そして大きくてもｃである。ｉ、ｊ、およびｋの値は、内因的に、相互に関連しない。

（「９３６」タンパク質）
血清群Ｂ由来の「９３６」タンパク質は、参考文献１０（配列番号２８８３および２８８４）において開示され、参考文献６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３５３もまた参考のこと）において「ＮＭＢ２０９１」として開示される。血清群Ａ［５］に一致する遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０９３を有する。

本発明に従って使用される場合、９３６タンパク質は種々の形態をとり得る。９３６の好ましい形態は、参考文献１４〜１６において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、９３６のＮ末端リーダーペプチドは、欠失され得（すなわち、株ＭＣ５８における残基１〜２３の欠失［配列番号４］）、９３６^（ＮＬ）を生じさせる。

好ましい９３６配列は、配列番号４に対して、５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する。これは改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。

他の好ましい９３６配列は、配列番号４由来の少なくともｎの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。好ましいフラグメントは、９３６由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号４のＣ末端および／またはＮ末端からの一以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失する。

（９５３タンパク質）
血清群Ｂ由来の「９５３」タンパク質は、参考文献１０（配列番号２９１７および２９１８）において開示され、参考文献６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２６２６９もまた参照のこと）において「ＮＭＢ１０３０」として開示される。血清群Ａ［５］に一致するタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３８０１０８を有する。

本発明に従って使用される場合、９５３タンパク質は種々の形態をとり得る。９５３の好ましい形態は、参考文献１４〜１６において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、９５３のＮ末端リーダーペプチドは、欠失され得（すなわち、株ＭＣ５８について残基１〜１９の欠失［配列番号５］）、９５３^（ＮＬ）を生じさせる。

好ましい９５３配列は、配列番号５に対して、５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する。これは、９５３改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、改変体など）を含む。９５３の対立遺伝子変異体は、参考文献１２の図１９において見られ得る。

他の好ましい９５３配列は、配列番号５由来の少なくともｎの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。好ましいフラグメントは、９５３由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号５のＣ末端および／またはＮからの一以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失する。

（２８７タンパク質）
血清群Ｂ由来の「２８７」タンパク質は、参考文献１０（配列番号３１０３および３１０４）において開示され、参考文献６において「ＮＭＢ２１３２」として開示され、そして参考文献１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３８８もまた参照のこと）において「ＧＮＡ２１３２」として開示される。血清群Ａ［５］に一致するタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０５７を有する。

本発明に従って使用される場合、２８７タンパク質は種々の形態をとり得る。２８７の好ましい形態は、参考文献１４〜１６において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、２８７のＮ末端は、このポリグリシン配列まで欠失され得（例えば、株ＭＣ５８における残基１〜２４の欠失［配列番号６］）、これは、時折本明細書中で、「ΔＧ」の接頭語の使用により区別される。この欠失は発現を上昇させ得る。

好ましい２８７配列は、配列番号６に対して、５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する。これは、２８７改変体（例えば、対立遺伝子変異体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。２８７の対立遺伝子形態は、参考文献１２の図５および図１５において見られ得、そして参考文献１０（配列番号３１７９〜３１８４）の実施例１３および図２１において見られ得る。

他の好ましい２８７配列は、配列番号６由来の少なくともｎの連続するアミノ酸を含み、ここでｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。好ましいフラグメントは、２８７由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号６のＣ末端および／またはＮ末端由来の一以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠失する。

（融合タンパク質）
５つの抗原は、５つの別個のタンパク質として組成物内に存在し得るが、この抗原のうちの少なくとも二つが単一ポリペプチド鎖（「ハイブリッド」タンパク質（参考文献１４〜１６））として発現され、その結果、例えば、５つの抗原が５未満のポリペプチドを形成することが好ましい。ハイブリッドタンパク質は、二つの主要な利点を提供する：第一に、そのままでは、不安定または不十分に発現され得るタンパク質は、適したハイブリッドパートナーを付加することによって補助され得、この問題を克服する；第二に、営業生産は、たった一つの発現として単純化され、そして精製は、二つの別個に有用なタンパク質を作製するために用いられることが必要である。

本発明の組成物に含有されるハイブリッドタンパク質は、５つの基本抗原のうちの二つ以上（すなわち、２、３、４または５）を含み得る。５つの基本抗原のうちの二つからなるハイブリッドが好ましい。

５つの基本抗原の組合わせ内で、抗原は、一より多いハイブリッドタンパク質内に存在し得、そして／または非ハイブリッドタンパク質として存在し得る。しかしながら、抗原は、ハイブリッドとしてかまたは非ハイブリッドとしてのいずれかで示され、その両方では示されないことが好ましいが、一方で抗原は、ハイブリッド抗原として、および非ハイブリッド（好ましくは、リポタンパク質）抗原としての両方で、タンパク質７４１を含むことが有用であり得、その際、特に、７４１のうちの一より多くの改変体が使用される。

本発明における使用について、二抗原ハイブリッドは以下のものを含む：ＮａｄＡおよび７４１；ＮａｄＡおよび９３６；ＮａｄＡおよび９５３；ＮａｄＡおよび２８７；７４１および９３６；７４１および９５３；７４１および２８７；９３６および９５３；９３６および２８７；９５３および２８７。好ましい二抗原ハイブリッドは以下のものを含む：７４１および９３６；９５３および２８７。

ハイブリッドタンパク質は、式ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨにより表され得るのであって、ここで：Ｘは５つの基本抗原のうちの一つのアミノ酸配列であり；Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり；Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり；そしてｎは２、３、４、または５である。

−Ｘ−部分が、野生型形態において、リーダーペプチド配列を有する場合、これはハイブリッドタンパク質において含まれ得るか、または除かれ得る。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて、欠失される（すなわち、Ｘ_１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ_２〜Ｘ_ｎのリーダーペプチドは除かれる）。これは、全てのリーダーペプチドの欠失に相当し、そしてＸ_１のリーダーペプチドを部分−Ａ−としての使用に相当する。

［−Ｘ−Ｌ−］の各ｎの場合、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在し得るかまたは非存在であり得る。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨなどである。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的に短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実施例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＧｌｙ_ｎを含むこと）、およびヒスチジンタグ（すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＨｉｓ_ｎ）を含む。他の適したリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号９）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限酵素認識部位から形成され、従ってクローニングと操作を補助し、そして（Ｇｌｙ）_４テトラペプチドは代表的なポリグリシンリンカーである。Ｘ_ｎ＋１がΔＧタンパク質であり、Ｌ_ｎがグリシンリンカーである場合、これは、Ｘ_ｎ＋１がΔＧタンパク質なく、Ｌ_ｎは欠失していることに相当する。

−Ａ−は任意のＮ末端アミノ酸配列である。これは代表的に短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実施例は、タンパク質輸送を方向付けるための配列、またはクローニングおよび精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＨｉｓ_ｎ）を含む。他の適したＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ_１がそれ自体のＮ末端のメチオニンを欠失している場合、好ましくは、−Ａ−は、（例えば、１つの、２つの、３つの、４つの、５つの、６つの、７つの、または８つのアミノ酸を有する）オリゴペプチドであり、Ｎ末端のメチオニンを提供する。

−Ｂ−は任意のＣ末端アミノ酸配列である。これは代表的に短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。実施例は、タンパク質輸送を方向付けるための配列、クローニングおよび精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上の場合のＨｉｓ_ｎ）、またはタンパク質安定性を増強する配列を含む。他の適したＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。

最も好ましくは、ｎは２である。この型の二つの好ましいタンパク質は以下である：Ｘ_１は９３６であり、Ｘ_２は７４１である；Ｘ_１は２８７であり、Ｘ_２は９５３である。

本発明の二つの特に好ましいハイブリッドタンパク質は、以下である：

これら二つのタンパク質は、ＮａｄＡとの（特に、配列番号２との）組合わせで使用され得る。

好都合なことに、９３６−ΔＧ７４１ハイブリッドは、以下の工程を包含するプロセスによって、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現から、高純度で調製され得る：均質化工程；遠心分離工程；陽イオンカラムクロマトグラフィー工程；陰イオンカラムクロマトグラフィー工程；疎水性カラムクロマトグラフィー工程；緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程；および濾過滅菌工程。このプロセスのさらなる詳細は、実施例において示される。

（配列）
本発明は、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。上記に記載されるように、好ましくは、配列同一性の程度は、５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。

本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＮａｄＡ配列のフラグメントを含むポリペプチドを提供するのであって、ここで上記フラグメントは、ＮａｄＡがヒト上皮細胞に接着する能力を保持する。従って、全長ＮａｄＡのアミノ酸２４〜８７を保持するフラグメントは好ましい。好ましいフラグメントは、上記ＮａｄＡのＮ末端リーダーペプチドおよび／または上記ＮａｄＡのＣ末端膜アンカードメインを欠失する。本発明は、この範囲において、先行技術（例えば、参考文献６〜１８）において開示される、いかなるＮａｄＡフラグメントをも含まない。全長ＮａｄＡ［１７］に関して、配列番号１は、膜アンカードメインを欠失し、そして配列番号２はリーダーペプチドを欠失する。

本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、この核酸に対して、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下で（例えば、６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液で）、ハイブリダイズし得る核酸を提供する。

本発明のポリペプチドは、種々の手段（例えば、組換え発現手段、細胞培養からの精製手段、化学合成（少なくとも部分的に）手段など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、天然の形態、融合形態、非グリコシル化形態、脂質付加形態など）で調製され得る。好ましくは、これらは、実質的に純粋形態で調製される（すなわち、実質的に、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたは宿主細胞タンパク質と無関係）。

本発明に従う核酸は、多くの方法（例えば、化学合成による方法（少なくとも部分的に）、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーによる方法、生物体それ自身からの方法など）で調製され得、種々の形態（例えば、一本鎖形態、二本鎖形態、ベクター形態、プローブ形態など）をとり得る。好ましくは、これらは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、実質的に、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたは宿主細胞核酸と無関係）。

用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、これらの類似体（修飾された骨格（例えば、ホスホロチオネートなど）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む類似体など）を含む。本発明は、上記に記載される（例えば、アンチセンスまたは探索目的のための）核酸に対して相補的な配列を含む核酸を含む。

本発明はまた、本発明のポリペプチドを作製するためのプロセスを提供し、ポリペプチド発現を誘導する条件下で、本発明の核酸を用いて形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。

本発明は、本発明のポリペプチドを作製するためのプロセスを提供し、化学的手段によってポリペプチドの少なくとも一つを合成する工程を包含する。

本発明は、本発明の核酸を作製するためのプロセスを提供し、プライマーに基づく増幅方法（例えば、ＰＣＲ）を用いて、核酸を増幅する工程を包含する。

本発明は、本発明の核酸を作製するためのプロセスを提供し、化学的手段によって核酸の少なくとも一部を合成する工程を包含する。

（株）
本発明の好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂにおいて見られるアミノ酸配列を含む。血清群Ｂ内の好ましい株は、２９９６、ＭＣ５８、９５Ｎ４７７、および３９４／９８である。３９４／９８は、ニュージーランド株であることから、時折、本明細書中で「ＮＺ」として言及される。

タンパク質２８７は、好ましくは、株２９９６由来であり、または、より好ましくは、株３９４／９８由来である。

タンパク質７４１は、好ましくは、血清群Ｂ株ＭＣ５８、血清群Ｂ株２９９６、血清群Ｂ株３９４／９８、または血清群Ｂ株９５Ｎ４７７由来であり、あるいは血清群Ｃ株９０／１８３１１由来である。株ＭＣ５８はより好ましい。

好ましくは、タンパク質９３６、タンパク質９５３、およびタンパク質ＮａｄＡは、株２９９６由来である。

株は、下付き添え字として示され得、例えば、７４１_ＭＣ５８は、株ＭＣ５８由来のタンパク質７４１である。別段記載されない限り、本明細書中で言及されるタンパク質（例えば、下付き添え字のないタンパク質）は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６由来であり、「参照」株としてみなされ得る。しかしながら、本発明は、概して、株によって限定されないことは、理解される。上記に記載されるように、タンパク質（例えば、「２８７」、「９１９」など）に対する一般的参照は、任意の株由来のタンパク質を含むと捉えられる。これは、代表的に、２９９６に対して、９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する。

組成物が特定のタンパク質抗原（例えば、７４１または２８７）を含有する場合、この組成物は、一より多い変異体形態（例えば、同一タンパク質）内の抗原を含有し得るが、一より多くの株由来の抗原を含有し得る。これらのタンパク質は、直列型タンパク質または分離型タンパク質として含まれ得る。

ハイブリッドタンパク質が使用される場合、ハイブリッド内の個々の抗原（すなわち、個々の−Ｘ−部分）は、一以上の株由来であり得る。例えば、ｎ＝２の場合、Ｘ_２は、Ｘ_１と同一の株由来であり得るか、または異なる株由来であり得る。ｎ＝３の場合、株は（ｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２＝Ｘ_３（ｉｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２≠Ｘ_３（ｉｉｉ）Ｘ_１≠Ｘ_２＝Ｘ_３（ｉｖ）Ｘ_１≠Ｘ_２≠Ｘ_３または（ｖ）Ｘ_１＝Ｘ_３≠Ｘ_２などであり得る。

（高毒性系統および殺菌性抗体応答）
概して、本発明の組成物は、被験体に投与後、血清殺菌性抗体応答を誘導し得る。好都合なことに、これらの応答は、マウスにおいて測定され、ワクチン効力の標準指標である［例えば、参考文献１３の巻末の注１４を参照のこと］。血清殺菌性活性（ＳＢＡ）は、補体によって仲介される細菌殺傷を測定し、ヒト補体または子ウサギ補体を使用してアッセイされ得る。ＷＨＯ標準は、９０％より多くのレシピエントにおけるＳＢＡにおいて、少なくとも４倍の上昇を誘導するワクチンを必要とする。

狭い範囲の防御の提供よりむしろ、本発明の組成物は、血清群Ｂの一より多くの高毒性系統に対して、殺菌性抗体応答を誘導し得る。特に、これら組成物は、以下の三つの高毒性系統のうちの二つまたは三つに対して殺菌性抗体応答を誘導し得る：（ｉ）クラスターＡ４；（ｉｉ）ＥＴ５複合体；および（ｉｉｉ）系統３。さらに、これら組成物は、一以上の高毒性系統血清群Ｉ、血清群ＩＩＩ、血清群ＩＶ−１、またはＥＴ−３７複合体に対して殺菌性抗体応答を誘導し得、そして他の系統（例えば、高侵襲性系統）に対して殺菌性抗体応答を誘導し得る。

これは、必ずしも、この組成物が、これら高毒性系統内の血清群Ｂ髄膜炎菌の各株およびあらゆる株に対し、殺菌性抗体を誘導し得ることを意味するのではなく、例えば、特定の高毒性系統内の血清群Ｂ髄膜炎菌のより多くの株うち所望の四つの群について、この組成物によって誘導される抗体は、この群のうちの少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％以上）に対して殺菌性である。株の好ましい群は、以下の国うちの少なくとも四つにおいて単離される株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ、およびＣＵ。好ましくは、血清は、少なくとも１０２４の殺菌性力価（例えば、２^１０、２^１１、２^１２、２^１３、２^１４、２^１５、２^１６、２^１７、２^１８以上、好ましくは、少なくとも２^１４）を有する（すなわち、この血清は、参考文献１３に記載されるように、１／１０２４に希釈される場合、特定の株の試験細菌のうちの少なくとも５０％を殺傷し得る）。

好ましい組成物は、血清群Ｂ髄膜炎菌の以下の株に対して殺菌性応答を誘導し得る：（ｉ）クラスターＡ４由来の株９６１−５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／または株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来の株ＭＣ５８（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／または株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、株９６１−５９４５、株４４／７６、および株３９４／９８に対し、殺菌性応答を誘導し得る。

株９６１−５９４５および株Ｇ２１３６は、ともにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ参照株［参考文献２２におけるｉｄ ６３８および１００２］である。株ＭＣ５８は広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５）、参考文献６において配列決定された株であった。株４４／７６は広く使用され、そして特徴付けられており（例えば、参考文献２３）、これは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ参考株の一つである［参考文献２２におけるｉｄ ２３７；参考文献１における表２の３２行目］。株３９４／９８は、もともとは１９９８年にニュージーランドにおいて単離され、この株を使用したいくつかの発表された研究（例えば、参考文献２４および２５）がある。株ＢＺ１９８は、別のＭＬＳＴ参考株である［参考文献２２におけるｉｄ ４０９；参考文献１における表２の４１行目］。

さらに組成物は、ＥＴ−３７複合体由来の血清群Ｗ１３５株ＬＮＰ１７５９２（Ｗ１３５：２ａ：Ｐ１．５，２）に対して殺傷性応答を誘導し得る。これは、２０００年にフランスで単離されたＨａｊｉ株である。

（異種宿主）
本発明のタンパク質の発現はＮｅｉｓｓｅｒｉａにおいて起こり得るが、本発明は、好ましくは、異種宿主を利用する。この異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）または真核生物であり得る。それは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉであるが、他の適した宿主は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などを含む。

従って、本発明は、被験体に投与後、この被験体内において抗体応答を誘導し得る組成物を提供する。この抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの高毒性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３のうちの２以上（例えば、２または３）に対して殺菌性であって、この抗体応答を起こす組成物の免疫原は、非ナイセリア宿主における組換え発現によって得られる。従って、本発明の組成物における免疫原は、好ましくは、組換え免疫原である。従って、ＯＭＶ調製物を含有しない組成物が好ましくあり得る。

（免疫原性組成物および免疫原性医薬）
本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従ったワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）、または治療的（すなわち、感染の処置のため）のいずれかであり得るが、代表的には予防的である。

この組成物のｐＨは、好ましくは６と８との間であり、好ましくは約７である。安定なｐＨは緩衝液の使用によって維持され得る。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［２６］。この組成物は滅菌されていても発熱物質を含有しなくてもよい。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。

組成物は、バイアルで提供され得るか、または事前充填シリンジで提供され得る。このシリンジは、針ありか、または針なしで提供され得る。シリンジは、この組成物の単回用量を含むのに対して、バイアルは単回用量または複数回用量を含み得る。注射用の組成物は、通常、液体溶液または懸濁液である。あるいは、それらは、注射前に、溶液または液体溶媒における懸濁液のために、固形形態（例えば、凍結乾燥）で提供され得る。

本発明の組成物は、単回用量形態で、または複数回用量形態でパッケージされ得る。複数回用量形態については、事前充填シリンジよりバイアルが好ましい。有効的投薬量は、慣例的に確立され得るが、注入するための組成物の代表的なヒトの用量は、０．５ｍｌの量である。

本発明の組成物が、使用前に、準備なしで調製され（例えば、成分が、凍結乾燥形態で提供される場合）、そしてキットとして提供される場合、このキットは二つのバイアルを含み得るか、または、キットは、シリンジの内容物が、注入前にバイアルの内容物を再活性化するために使用されるようにして、一つの事前充填シリンジおよび一つのバイアルを含み得る。

本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を起こし得（すなわち、それは、免疫原性組成物）、より好ましくは、ワクチンである。

本発明はまた、哺乳動物で免疫応答を起こすための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。本発明はまた、哺乳動物で免疫応答を起こすための医薬の製造における「ＮａｄＡ」タンパク質、「７４１」タンパク質、「９３６」タンパク質、「９５３」タンパク質、および「２８７」タンパク質（および他の任意の抗原）の使用を提供する。この医薬は、好ましくは、ワクチンである。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を起こすための方法を提供し、この方法は、本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。免疫応答は、好ましくは、防御性であり、そして好ましくは、抗体を含む。この方法は、追加免疫応答を起こし得る。

哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。ワクチンが予防的使用である場合、ヒトは、好ましくは、子供である（例えば、幼児または乳児）；ワクチンが治療的使用である場合、ヒトは、好ましくは成人である。子供を対象としたワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。

これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎、敗血症、菌血症、淋病など）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のためである。細菌性髄膜炎または髄膜炎菌性髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。

治療的処置の効力を調べる一つの方法は、本発明の組成物を投与後、ナイセリア感染のモニタリングを含む。予防的処置の効力を調べる一つの方法は、組成物を投与後、５つの基本抗原に対する免疫応答のモニタリングを含む。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体（例えば、子供１２ヵ月〜１６ヵ月、または動物モデル［２７］）にそれらを投与すること、次いで、全抗莢膜ＩｇＧおよび高結合性抗莢膜ＩｇＧの血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含める標準パラメータを決定することによって決定され得る。概して、これらの免疫応答は、組成物の投与後、約４週で決定され、この組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ上昇が好ましい。一より多い用量の組成物が投与される場合、一より多い次の投与の決定がなされ得る。

本発明の好ましい組成物は、容認できる割合のヒト被験体について、各抗原性成分に対する血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の判定基準より優る患者に抗体力価を与え得る。宿主が抗原に対して血清変換されるとみなされる、上記の関連した抗体力価を有する抗原は周知であり、このような力価はＷＨＯのような組織によって公開される。好ましくは、被験体の統計学的に有意性のあるサンプルのうちの８０％より多くが血清変換され、より好ましくは、９０％より多くが血清変換され、さらにより好ましくは、９３％より多くが血清変換され、そして最も好ましくは９６％〜１００％が血清変換される。

概して、本発明の組成物は、患者に直接投与される。直接送達は、非経口的注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、または組織内腔への注射）によって成し遂げられ得るか、または経直腸投与、経口投与、経膣投与、局所的投与、経皮投与、鼻腔内投与、経眼投与、経耳投与、肺投与、または他の粘膜投与によって成し遂げられ得る。大腿または上腕への筋肉内注射が好ましい。注射は針（例えば、皮下注射針）を介し得るが、あるいは針なし注射も使用され得る。代表的な筋肉内注射用量は０．５ｍｌである。

本発明は全身免疫および／または粘膜免疫を誘発するために使用され得る。

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。一次免疫用量スケジュールの後に追加免疫用量スケジュールが行われ得る。初回抗原刺激用量の間の適した期間（例えば、４〜１６週間）、および初回抗原刺激と追加免疫の間の適した期間は、慣例的に決定され得る。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの感染は身体の種々の領域に影響を及ぼす。そのため、本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製され得る。注射前に、液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適した固形形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥組成物）。この組成物は、局所的投与のために、例えば、軟膏として、クリームとして、または粉末として、調製され得る。この組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤として、カプセルとして、または（必要に応じて、味のついた）シロップとして調製され得る。この組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末または噴霧を利用しての吸入剤として、調製され得る。この組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。この組成物は、経鼻投与、経耳投与、経眼投与のために、例えば、噴霧、滴下、ゲル、粉末として調製され得る［例えば、参考文献２８および２９］。肺炎球菌の糖［３０、３１］、肺炎球菌のポリペプチド［３２］、Ｈｉｂ糖［３３］、ＭｅｎＣ糖［３４］、およびＨＩｂ糖およびＭｅｎＣ糖結合体［３５］の混合物の経鼻投与についての成功が報告されている。

ワクチンとして使用される免疫原性の組成物は、抗原、および必要に応じて、任意の他の成分の免疫学的有効量を含有する。「免疫学的有効量」によって、単回用量、または一連の用量の一部としてのいずれかにおいて、個体へのこの有効量の投与は、処置または予防において有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態と身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系能力、要求される防御の程度、ワクチンの処方物、処置する医師による医学的状態評価、および他の関連要因次第で変動する。この量は、慣習的試行を通じて決定され得る比較的広い範囲に集合し、一用量当たりの代表的な各髄膜炎菌性糖抗原量は、１μｇと２０μｇの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ（糖として表示））であることが期待される。

（組成物のさらなる非抗原成分）
本発明の組成物は、上記で言及される成分に加え、代表的に、一以上の「薬学的に許容可能なキャリア」を含有し、このキャリアは、それ自体が、この組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアを含有する。適したキャリアは、代表的には、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖［３６］、トレハロース［３７］、ラクトース、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど））である。このようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンはまた、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含有する。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が示され得る。滅菌の発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水は、代表的なキャリアである。薬学的に許容可能な賦形剤の詳細な議論は、参考文献３８において入手可能である。

特に、複数回用量型式でパッケージされる場合、本発明の組成物は、抗菌剤を含有し得る。

本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート））を含有し得る。界面活性剤は、概して、低レベル（例えば、＜０．０１％）で存在する。

本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有し得る。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が代表的である。

本発明の組成物は、概して、緩衝液を含有する。リン酸緩衝液が代表的である。

本発明の組成物は、特に、この組成物が、凍結乾燥されている場合、または、凍結乾燥物質から再構成されている物質を含む場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、ショ糖またはトレハロース）を、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で含有し得る。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に、約６．１に調整され得る。

本発明のワクチンは、他の免疫調節性薬剤とともに投与され得る。特に、組成物は、通常、アジュバントを含有する。本発明の組成物に使用され得るアジュバントは、以下のものがあげられるが、これらに限定されない。

（Ａ．ミネラル含有組成物）
本発明においてアジュバントの使用に適したミネラル含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩のようなミネラル塩を含有する。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩などのようなミネラル塩［例えば、参考文献３９の第８章および第９章を参照のこと］、または異なるミネラル化合物の混合物を、この化合物が任意の適した形態（例えば、ゲル形態、結晶性形態、無定形形態など）をとる状態、および吸着が好ましい状態で含む。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る［４０］。

アルミニウムホスフェートは、特に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖抗原を含有する組成物において、好ましく、そして代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ_４／Ａｌのモル比で、かつ０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含有される無定形なアルミニウムヒドロキシホスフェートである。アルミニウムホスフェートの低用量での吸着が使用され得る（例えば、一用量当たり一結合体当たり、５０μｇと１００μｇの間のＡｌ^３＋）。組成物において一より多くの結合体がある場合、全ての結合体が、吸着に必要とは限らない。

（Ｂ．油乳濁液）
本発明において、アジュバントとしての使用に適した油乳濁液組成物は、ＭＦ５９［参考文献３９の第１０章；参考文献４１も参照のこと］（５％スクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、および０．５％のＳｐａｎ ８５をマイクロフリューダイザを使用して、μｍ未満の粒子に処方されるもの）のようなスクアレン−水乳濁液を含有する。完全フロイトアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）もまた、使用され得る。

（Ｃ．サポニン処方物［参考文献３９の第２２章］）
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、ステロールグリコシド、およびトリテルペノイドグリコシドの異種な群であり、これは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根および花においてさえ、見出される。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から市販されている。サポニンアジュバント処方物は、精製された処方物（ＱＳ２１など）および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）を含有する。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして市販される。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを利用して精製されている。これらの技術を利用して、特定の精製された画分は、同定されており、これらは、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含める。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献４２において開示される。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含有し得る［４３］。

サポニンとコレステロールの組合わせは、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成するために使用され得る［参考文献３９の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、代表的にホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、一以上のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣを含む。ＩＳＣＯＭは、さらに、参考文献４３〜４５において記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を含まない［４６］。

サポニンに基づくアジュバントの開発の概説は、参考文献４７および４８において見出され得る。

（Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子）
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、概して、必要に応じて、リン脂質とともに併用されるかまたは処方されるウイルス由来の一以上のタンパク質を含む。それらは、概して、非病原性、非複製性であり、概して、いかなる天然のウイルスゲノムを含まない。ウイルスのタンパク質は、組換え的に、全体のウイルスから精製され得、単離され得る。ビロゾームまたはＶＬＰにおける使用に適したこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）由来のタンパク質を含む。ＶＬＰは、さらに参考文献４９〜５４において議論される。ビロゾームは、さらに、例えば、参考文献５５において議論される。

（Ｅ．細菌性派生体または微生物派生体）
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌性派生体または微生物派生体（腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性派生体、脂質Ａ派生体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド毒素およびＡＤＰ−リボシル化毒素、およびこの解毒性派生体など）を含む。

ＬＰＳの無毒性派生体は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４アシル化鎖、５アシル化鎖または６アシル化鎖を有する３ 脱Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３ 脱Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は参考文献５６において開示される。このような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、十分に小さく、０．２２μｍ膜を介して濾過滅菌され得る［５６］。他の無毒性ＬＰＳ派生体は、モノホスホリル脂質Ａ擬態（アミノアルキルグルコサミニドホスフェート派生体など、例えば、ＲＣ−５２９）を含む［５７、５８］。

脂質Ａ派生体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＯＭ−１７４など）由来の脂質Ａの派生体を含める。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献５９および６０に記載される。

本発明におけるアジュバントとして使用に適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのリン酸結合により連結される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を含む。回文構造配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活性であることが示されている。

ＣｐＧ’は、ヌクレオチド修飾／類似物（ホスホロチオネート型修飾など）を含み得、そして二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献６１、６２および６３は、可能な類似物置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、参考文献６４〜６９において議論される。

ＣｐＧ配列（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはモチーフＴＴＣＧＴＴなど）はＴＬＲ９に結合され得る［７０］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答（ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなど）の誘導に対し特異的であり得、またはＢ細胞応答（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）の誘導に対し、より特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献７１〜７３において議論される。好ましくは、このＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が、受容体認識に接近できるように構築される。必要に応じて、二つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、３’末端に付加され、「ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ」を形成し得る。例えば、参考文献７０および７４〜７６を参照のこと。

細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素およびこの解毒性派生体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）由来である。粘膜アジュバントとしての解毒性ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献７７に記載され、非経口的アジュバントとしての使用は、参考文献７８に記載される。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ホロ毒素の形態において、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方を含む。好ましくは、Ａサブユニットは、解毒する変異を含む；好ましくは、Ｂサブユニットは、変異されてない。好ましくは、このアジュバントは、解毒されるＬＴ変異（ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２など）である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化毒素およびこの解毒性派生体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献７９〜８６において見出され得る。数的なアミノ酸置換の参考は、好ましくは、参考文献８７に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列化に基づく（この全体が、本明細書中で参考として特に援用される）。

（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［８８］など［８９］）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子など）が挙げられる。

（Ｇ．生体付着剤および粘膜付着剤）
生体付着剤および粘膜付着剤もまた、本発明において、アジュバントとして使用され得る。適した生体付着剤としては、エステル化ヒアルロン酸微粒子［９０］、または粘膜付着剤（ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖体およびカルボキシメチルセルロースの交差結合性派生体など）が挙げられる。キトサンおよびこの派生体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る［９１］。

（Ｈ．微粒子）
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。ポリ（ラクチド共グリコリド）を有する生分解性でありかつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの粒子、より好ましくは、直径が約２００〜約３０μｍの粒子、最も好ましくは、直径が約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、負電荷を帯びた表面を有するように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正電荷を帯びた表面を有するように（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤で）処置される。

（Ｉ．リポソーム（参考文献３９の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用に適したリポソームの処方物の例は、参考文献９２〜９４において記載される。

（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［９５］。このような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性物質［９６］、およびオクトキシノールのような少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性物質と組合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性物質またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性物質［９７］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献９８および９９に記載される。

（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したイミダゾキノロン化合物の例は、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびこの類似体（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）を含み、さらに、参考文献１００および１０１に記載される。

本発明はまた、上記で確認された一以上のアジュバントの局面の組合わせを含む。例えば、以下のアジュバント組成物は、本発明で使用され得る：（１）サポニンおよび水中油乳濁液［１０２］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ派生体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１０３］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ派生体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［１０４］；（５）例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳濁液との３ｄＭＰＬの組合わせ［１０５］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、μｍ未満の乳濁液へのマイクロ流動化されるか、またはより大きい粒子サイズの乳濁液を生成するためにボルテックスされるかいずれかによるＳＡＦ；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリ脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の一以上の細菌性細胞壁成分を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）；および（８）一以上のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性派生体（３ｄＭＰＬなど）。

免疫賦活性薬剤として機能する他の物質は参考文献３９の第７章において開示される。

水酸化アルミニウムアジュバントの使用またはリン酸化アルミニウムアジュバントの使用が、特に好ましく、そして抗原は、概して、これらの塩に吸着される。この組成物がＨｉｂ抗原を含有する場合、水酸化アルミニウムは、好ましくは、アジュバントとして回避される。アジュバントにリン酸化アルミニウムが使用され、かつ抗原がアジュバントに吸着しないことが望まれる場合、これは、溶液中に遊離型のリン酸イオンを含むことにより（例えば、リン酸緩衝液の使用により）支持される。吸着の防止はまた、抗原／アジュバントの混合する間、正しいｐＨを選択すること、アジュバントを、適切な電荷ゼロの点を有するアジュバントを選択すること、および組成物内の異なる抗原にとって適切な混合順序を選択することによって、成し遂げられ得る［１０６］。

リン酸化カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。

（さらなる抗原）
本発明の組成物は、５つの基本髄膜炎菌性タンパク質抗原を含有する。これらの組成物はまた、５つの基本抗原以外の髄膜炎菌性タンパク質抗原は含有し得ないにもかかわらず、さらなる抗原を含有し得る。封入用のさらなる抗原は、例えば、以下のものであり得る：
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５ならびに／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ由来の糖抗原（参考文献１０７に開示される血清群Ｃ由来のオリゴ糖または参考文献１０８のオリゴ糖など）。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、１５５、１５６ １５７］。

Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（不活性化ウイルスなど）［例えば、１０９、１１０］。

Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（表面抗原および／またはコア抗原など）［例えば、１１０、１１１］。

ジフテリア抗原（ジフテリアトキソイドなど）［例えば、参考文献１１２の第３章］（例えば、ＣＲＭ_１９７変異体［例えば、１１３］）。

破傷風抗原（破傷風トキソイドなど［例えば、参考文献１１２の第４章］）。

必要に応じて、またパータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）および／または凝集原２および凝集原３との組合わせで、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ハロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ））［例えば、参考文献１１４および１１５］。細胞性百日咳抗原は使用され得る。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（参考文献４、参考文献１１６、参考文献１１７、参考文献１１８などに開示される調製物など）
ポリオ抗原［例えば、１１９、１２０」（ＯＰＶまたは、好ましくはＩＰＶなど）。

この組成物は、一以上のこれらさらなる抗原を含有し得る。抗原は、毎回、代表的に、少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で示される。概して、あらゆる特定の抗原のこの濃度は、十分であり、この抗原に対する免疫応答を誘発する。実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少し得るにもかかわらず、個々の糖抗原の防御効果が、これらの結合によって除去されないことが好ましい。

ジフテリア抗原がこの組成物に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含有することもまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含有することもまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含有することもまた、好ましい。このようなＤＴＰ組合わせは、凍結乾燥された結合体の再構成に使用され得る。

糖抗原または炭水化物抗原が使用される場合、この抗原は、好ましくは、免疫原性を増強するためにキャリアタンパク質に結合される（以下を参照のこと）。

有毒性タンパク質抗原は、必要に応じて、解毒され得る（例えば、化学的手法および／または遺伝子的手法による百日咳毒素の解毒［１１５］）。

本発明の組成物において、タンパク質抗原を使用する別の方法として、この抗原をコードする核酸が使用され得る［例えば、参考文献１２１〜１２９］。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、このタンパク質をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ、例えば、プラスミド形態のＤＮＡ）によって取って代わり得る。同様に、本発明の組成物は、糖抗原を模倣するタンパク質（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）［１３０］または抗イディオタイプ抗体）を含有し得る。これらは、個々の糖成分を取って代わり得るか、または個々の糖成分を追加し得る。例として、ワクチンは、糖それ自体の代わりに、ＭｅｎＣ［１３１］莢膜多糖のペプチド擬態、またはＭｅｎＡ［１３２］莢膜多糖のペプチド擬態を含み得る。

特に好ましい本発明の組成物は、以下の一つ、二つ、または三つを含有する：（ａ）髄膜炎菌血清群Ｙ、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５、髄膜炎菌血清群Ｃ、および（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ由来の糖抗原；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型由来の糖抗原；ならびに／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原。血清群Ｂ抗原およびＨｉｂ結合体を含有する組成物は、特に好ましい。

（髄膜炎菌血清群Ｙ、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５、髄膜炎菌血清群Ｃおよび（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ）
上記のように、血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する多糖ワクチン、長年知られてきた。これらのワクチン（ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹ^ＴＭおよびＭＥＮＯＭＵＮＥ^ＴＭ）は、生物の莢膜多糖に基づき、青年および成人において有効であるにもかかわらず、そしてそれらは、乏しい免疫応答および短期間防御を生じさせ、そしてそれらは、乳児において使用され得ない。

これらのワクチンにおいて、結合されていない多糖抗原とは対照的に、最近認可された血清群Ｃワクチン（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ［１３３、１０７］、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭ）は結合された糖を含有する。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭは、ＣＲＭ_１９７キャリアに結合されたオリゴ糖抗原を有し、一方で、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭは、破傷風トキソイドキャリアに結合された完全な多糖（脱Ｏ−アセチル化多糖）を使用する。

本発明の組成物は、好ましくは、一以上の髄膜炎菌血清群Ｙ、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５、髄膜炎菌血清群Ｃおよび（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ由来の莢膜糖抗原を含有する。ここでこの抗原はキャリアタンパク質に結合されるか、そして／または、オリゴ糖である。

一用量当たりの各髄膜炎菌性糖の代表的量は、１μｇと２０μｇの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ（糖として表示））である。

混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きく（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）あり得る。混合物が、血清群Ｙならびに血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５の一方、あるいは両方の血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５に由来する莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きく（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１以上）あり得、そして／または、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より小さく（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５未満）あり得る。血清群Ａ由来の糖：血清群Ｃ由来の糖：血清群Ｗ１３５由来の糖：血清群Ｙ由来の糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、以下である：１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１。血清群Ｃ由来の糖：血清群Ｗ１３５由来の糖：血清群Ｙ由来の糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、以下である：１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１；および２：１：１。実質的に各糖の同等の質量を使用することが好ましい。

莢膜糖は、概して、オリゴ糖形態で使用される。これらは、精製された莢膜多糖のフラグメント化によって（例えば、加水分解によって）、都合よく形成され、その後に、通常、所望のサイズのフラグメントの精製が続く。

多糖のフラグメント化は、好ましくは、３０より小さい（例えば、血清群Ａについて１０と２０の間、好ましくは、約１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて１５と２５の間；好ましくは約１５〜２０；血清群Ｃについて１２と２２の間など）オリゴ糖において、最終的な平均重合度（ＤＰ）を生じさせることによって成し遂げられる。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによってかまたは比色アッセイによって、都合よく測定され得る［１３４］。

加水分解が行われる場合、この加水分解産物は、概して、短い長さのオリゴ糖を除去するために大きさで選別され（ｂｅ ｓｉｚｅｄ）得る［１３５］。これは、種々の方法（限外濾過引き続くイオン交換クロマトグラフィーなど）において、成し遂げられ得る。好ましくは、血清群Ａについて、約６以下の重合度を有するオリゴ糖は除去され、そして好ましくは、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて、約４より少ない重合度を有するオリゴ糖は除去される。

好ましいＭｅｎＣ糖抗原は、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭにおいて使用されたように、参考文献１３３に開示される。

この糖抗原は、化学的に修飾され得る。これは、特に、血清群Ａの加水分解の減少に有用である［１３６；以下を参照のこと］。髄膜炎菌性糖の脱Ｏ−アセチル化が、行われ得る。修飾は、オリゴ糖については、脱重合の前または脱重合の後に起こり得る。

本発明の組成物が、ＭｅｎＡ糖抗原を含有する場合、この抗原は、好ましくは、修飾された糖であって、この修飾された糖はネイティブ糖の一以上のヒドロキシル基が、保護基によって置換されている［１３６］。この修飾は、加水分解に対する抵抗を改善し、血清群Ａ抗原は、凍結乾燥を必要とするよりむしろ、液剤で、貯蔵および使用され得ることを意味する。

保護基を有する単糖単位の数は、変動し得る。例えば、全単糖単位または実質的な全単糖単位は、保護基を有し得る。あるいは、単糖ユニットのうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は保護基を有し得る。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の単糖単位は、保護基を有し得る。

同様に、単糖単位上の保護基の数は、変動し得る。例えば、単糖単位上の保護基の数は、１または２であり得る。この保護基は、概して、単糖単位の４位および／または３位である。

末端の単糖単位は、天然のヒドロキシル基のあるいは保護基を有するかもしれないし、有さないかもしれない。さらなる反応（例えば、結合体化）のための柄を提供するため、末端の単糖単位上に遊離型アノマーのヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーのヒドロキシル基は、還元的アミノ化（例えば、ＮａＢＨ_３ＣＮ／ＮＨ_４Ｃｌを使用する）によって、アミノ基（−ＮＨ_２または−ＮＨ−Ｅ、ここでＥは窒素保護基である）に変換され得、次いで、他のヒドロキシル基が保護基に変換された後に、アノマーのヒドロキシル基は、再生され得る。

ヒドロキシル基を置換する保護基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して（すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基に置換することによって）、直接接触可能であり得る。保護基として働くヒドロキシル基の適した誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カルボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）、およびアセタールである。このような保護基のいくつかの特定の例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接接触可能でなく、かつ完全にヒドロキシル基を置換する他の保護基は、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_３−１２アルキル、Ｃ_５−１２アリール、Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキル、ＮＲ^１Ｒ^２（Ｒ^１およびＲ^２は以下の段落で規定される）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３などを含む。好ましい保護基は電子吸引性基である。

好ましい保護基は、式：−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ^３のものであって、ここで：ＸはＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ_２であり；ＹはＣ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、Ｃ_３−１２シクロアルキル、Ｃ_５−１２アリール、またはＣ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルであり、これらの各々は、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立的に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換され得るか；あるいは、ＹはＮＲ^１Ｒ^２であり；Ｒ^１およびＲ^２は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_３−１２シクロアルキル、Ｃ_５−１２アリール、Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルから独立的に選択されるか；あるいはＲ^１およびＲ^２は結合され、Ｃ_３−１２飽和複素環式基を形成し得；Ｒ^３はＣ_１−１２アルキルまたはＣ_３−１２シクロアルキルであり、これらのそれぞれは、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立的に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換され得るか；あるいはＲ^３は、Ｃ_５−１２アリールまたはＣ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルであり、これらのそれぞれが、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３またはＣＣｌ_３から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの基で置換され得る。Ｒ^３がＣ_１−１２アルキルまたはＣ_３−１２シクロアルキルである場合、それは代表的に、上記で規定されるような１つ、２つ、または３つの基で置換される。Ｒ^１およびＲ^２が結合され、Ｃ_３−１２飽和複素環式基を形成する場合、それは、窒素原子とともに、Ｒ^１およびＲ^２が、３と１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含む飽和複素環式基を形成することを意味する。この複素環式基は、上記窒素原子以外の１つまたは２つのヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、またはＳなど）を含み得る。Ｃ_３−１２飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル、およびアジリジニルである。

保護基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ_３は、標準的な誘導体化手順（ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニルなどとのヒドロキシル基の反応など）によって、−ＯＨ基から調製され得る。従って、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける酸素原子は、好ましくは、ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける−Ｘ−Ｙ基は、好ましくは、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。

あるいは、この保護基は、置換反応（ミツノブ（Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ）型置換など）を介して、直接接触可能であり得る。ヒドロキシル基から保護基を調製する、これらの方法および他の方法は周知である。

より好ましくは、保護基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ_３［１３７］、またはカルバメート基−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であって、ここでＲ^１およびＲ^２は、Ｃ_１−６アルキルから独立に選択される。より好ましくは、Ｒ^１およびＲ^２は両方ともメチルである（すなわち、保護基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ_２である）。カルバメート保護基は、グリコシド結合に対して安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製され得る。

好ましい、修飾されるＭｅｎＡ糖は、ｎ個の単糖単位を含み、単糖単位のうちの少なくともｈ％は３位および４位の両方に−ＯＨ基を有さない。ｈの値は２４以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００）であり、好ましくは、５０以上である。非存在の−ＯＨ基は、好ましくは、上記で規定されるような保護基である。

他の好ましい修飾されるＭｅｎＡ糖は、単糖単位を含むのであって、ここで単糖単位のうちの少なくともｓは、３位に−ＯＨを有さず、そして４位にも−ＯＨを有さない。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。非存在の−ＯＨ基は、好ましくは、上記で規定されるように、保護基である。

本発明の使用に適した修飾されるＭｅｎＡ糖は、以下の式を有する：

ｎは１〜１００の整数（好ましくは、１５〜２５の整数）であり；
Ｔは式（Ａ）または式（Ｂ）であって：

ここで各Ｚ基は、独立して、上記で規定されるようなＯＨまたは保護基から選択され；そして
各Ｑ基は、独立して、上記で規定されるようなＯＨまたは保護基から選択され；
Ｙは、ＯＨまたは上記で規定されるような保護基から選択され；
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり；
そして、ここでＱ基のうち約７％よい多く（例えば、８％、９％、１０％以上）は保護基である。

各ｎ＋２のＺ基は、相互に同一または異なり得る。同様に、各ｎ＋２のＱ基は、相互に同一または異なり得る。全てのＺ基はＯＨであり得る。あるいは、Ｚ基のうち少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％はＯＡｃであり得る。好ましくは、Ｚ基の約７０％はＯＡｃであり、Ｚ基の残部は上記で規定されるようなＯＨまたは保護基である。Ｑ基のうち少なくとも約７％は保護基である。好ましくは、Ｑ基のうち、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％でさえ、保護基である。

好ましい本発明の組成物は、３７℃で２８日間にわたり貯蔵され得、そしてこの期間後、結合されるＭｅｎＡ糖の初期全体量のうちのｆ％未満は非結合体であって、ここでｆは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５であるか、またはそれより小さい。

髄膜炎菌性莢膜多糖は、代表的に、（例えば、陽イオン性界面活性剤を用いた）多糖沈殿、エタノール分画、（タンパク除去のための）冷フェノール抽出、および（ＬＰＳ除去のための）超遠心の工程を包含するプロセスによって調製される［例えば、参考文献１３８］。しかしながら、より好ましいプロセス［１０８］は、多糖沈殿後に続く低級アルコールを用いる沈殿した多糖の可溶化を包含する。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化塩）、または臭化ヘキサジメチリン塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩のような陽イオン性界面活性剤を使用して成し遂げられ得る。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）は特に好ましい［１３９］。沈殿した物質の可溶化は、低級アルコール（メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）の使用により成し遂げられ得るが、しかし、エタノールは、ＣＴＡＢ−多糖複合体の可溶化に特に適している。エタノールは、好ましくは、５０％と９５％の間の終濃度（エタノールおよび水の全体量をベースとして）を与えるように、沈殿した多糖に加えられる。

再可溶化後、この多糖はさらに、夾雑物を除去するためにさらに処理され得る。これは、微量な夾雑物ですら、許容されない状況（例えば、ヒトワクチン作製のため）において、特に重要である。これは、代表的に、濾過（例えば、デプス濾過、活性炭を通じた濾過、サイズ濾過および／または限外濾過）の一以上の工程を包含する。一旦夾雑物を除去するために濾過されると、多糖は、さらなる処理、および／またはプロセスのために沈殿され得る。これは、好都合なことに、陽イオン交換（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加）によって成し遂げられ得る。

精製に代わる手段として、本発明の莢膜糖は、全合成または部分合成によって得られ得る（例えば、Ｈｉｂ合成は参考文献１４０において開示され、ＭｅｎＡ合成は参考文献１４１において開示される）。

本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも二つの血清群由来の莢膜糖を含有する。糖は、好ましくは、（任意の断片化、結合、修飾などを含めて）別々に調製され、次いで本発明の組成物を生じさせるために混合される。

しかしながら、この組成物が、血清群Ａ由来の莢膜糖を含有する場合、加水分解の可能性を最小限に抑えるために、血清群Ａの糖は、使用直前まで、この他の糖に混合されないことが好ましい。これは、好都合なことに、使用準備が整った場合、液体成分が、この凍結乾燥ＭｅｎＡ成分を再構成することに使用されるようにして、血清群Ａ成分（代表的には適切な賦形剤とともに）を凍結乾燥形態にさせ、そして他の血清群成分（これもまた適切な賦形剤とともに）を液体形態にさせることによって、成し遂げられ得る。アルミニウム塩アジュバントが使用される場合、液体ワクチンを含むバイアル内にアジュバントを含むこと、およびＭｅｎＡ成分をアジュバントなしで凍結乾燥させることが好ましい。

従って、本発明の組成物は、以下のものを含むキットから調製され得る：（ａ）凍結乾燥形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の莢膜糖；および（ｂ）液体形態の、この組成物由来のさらなる抗原。本発明はまた、本発明の組成物を調製する方法を提供するのであって、この方法は凍結乾燥されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の莢膜糖をさらなる抗原と混合する工程を含み、ここで前記のさらなる抗原は液体形態である。

本発明はまた、以下を含めるキットを提供する：（ａ）全ての凍結乾燥形態の、２以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ由来の莢膜糖を含む第一の容器；ならびに（ｂ）液体形態の（ｉ）被験体に投与後、被験体内で抗体応答を誘導し得る組成物であって、この抗体応答は、高毒性系統Ａ４、ＥＴ−５およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ系統３のうちの２以上（例えば２または３）に対して殺菌性である組成物、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうち一つもないか、または一つ由来の莢膜糖、ならびに必要に応じて（ｉｉｉ）髄膜炎菌性莢膜糖を含まないさらなる抗原（以下を参照のこと）である、さらなる抗原、を含む第二の容器、ここで容器（ｂ）の内容物による容器（ａ）の内容物の再構築は、本発明の組成物を提供する。

各用量内で、個々の糖抗原の量は、概して、（糖の質量として測定して）１〜５０μｇの間になり、各抗原の約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇが好ましい。従って、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１であるＡ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙの重量比で、図１によって表される量は、好ましくは、約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇである。従って、１：１：１：１比のＡ：Ｃ：Ｗ：Ｙの組成物および一つの糖当たり１０μｇについては、４０μｇの糖が、一用量当たり投与される。好ましい組成物は、一用量当たり、およそ、以下のμｇの糖を有する：

好ましい本発明の組成物は、一用量当たり、５０μｇ未満の髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦４０μｇの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦３０μｇの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦２５μｇの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦２０μｇの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦１０μｇの髄膜炎菌性糖を含有するが、しかし、理想的には、本発明の組成物は、一用量当たり少なくとも１０μｇの髄膜炎菌性糖を含有する。

Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ^ＴＭのＭｅｎＣ結合体は、水酸化物アジュバントを使用し、一方Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭはリン酸塩を使用する。本発明の組成物内に、水酸化アルミニウムにいくつかの抗原を吸着する可能性はあるが、リン酸化アルミニウムに関連する他の抗原を有する可能性もある。例えば、四価の血清群の組合わせについては、以下の順列が利用可能である：

四価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群の組合わせについては、以下の順列が利用可能である：

（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型）
この組成物が、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型抗原を含有する場合、それは、代表的に、Ｈｉｂ莢膜糖抗原である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の糖抗原は周知である。

有利に、Ｈｉｂ糖は、この免疫原性を増強するため、とりわけ子供において、キャリアタンパク質に共有結合される。概して、多糖結合体の調製、および特にＨｉｂ莢膜多糖の調製は、よく実証される［例えば、参考文献１４２〜１５０など］。本発明は、任意のＨｉｂ結合体を使用し得る。適したキャリアタンパク質は、以下に記載され、Ｈｉｂ糖にとっての好ましいキャリアはＣＲＭ_１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。

この結合体の糖部分は多糖であり得る（例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））が、しかしオリゴ糖（例えば、分子量約１〜約５ｋＤａ）を形成するために多糖を加水分解することは好ましい。

好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ_１９７に共役結合したＨｉｂオリゴ糖を含む［１５１、１５２］。破傷風トキソイドはまた、好ましいキャリアである。

Ｈｉｂ抗原の投与は、好ましくは≧０．１５μｇ／ｍｌ、およびより好ましくは≧１μｇ／ｍｌの濃度の抗ＰＲＰ抗体を生じる。

本発明の組成物は、一より多くのＨｉｂ抗原を含み得る。

組成物が、Ｈｉｂ糖抗原を含有する場合、この組成物は水酸化アルミニウムアジュバントも含有しないことが好ましい。この組成物が、リン酸化アルミニウムアジュバントを含有する場合、Ｈｉｂ抗原はアジュバントに吸着され得るか［１５３］、またはＨｉｂ抗原は吸着されなくてもよい［１５４］。

Ｈｉｂ抗原は、（例えば、髄膜炎菌性抗原とともに）凍結乾燥され得る。

（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
この組成物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を含有する場合、これは、代表的に、好ましくは、キャリアタンパク質に結合される莢膜糖抗原である［例えば、参考文献１５５〜１７７］。一より多くのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型由来の糖を含有することが好ましい。例えば、２３の異なる血清型由来の多糖混合物は広く使用される。なぜなら、５と１１との間の異なる血清群由来の多糖との結合体化ワクチンであるからである［１５８］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ^ＴＭ［１５９］は、各糖が還元的アミノ化によりＣＲＭ_１９７に個々に結合される状態で、各糖が０．５ｍｌの用量当たり２μｇ（４μｇの血清型６Ｂ）で、かつ、結合体がリン酸化アルミニウムアジュバントに吸着される状態で、７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）由来の抗原を含む。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する。結合体は、リン酸化アルミニウム上に吸着され得る。

肺炎球菌由来の糖抗原の使用に代わる手段として、この組成物は、一以上のポリペプチド抗原を含有し得る。肺炎球菌のいくつかの株のゲノム配列は入手可能であり［１６０、１６１］、ワクチン学を覆す対象となり［１６２〜１６５］、適したポリペプチド抗原を同定し得る［１６６、１６７］。例えば、この組成物は、以下の抗原のうち一以上を含有し得る：参考文献１６８で規定されるような、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０。この組成物は、一より多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９１０、１１、１２、１３、または１４）のこれら抗原を含み得る。

いくつかの実施形態において、この組成物は、肺炎球菌由来の糖抗原およびポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単純な混合で使用され得るか、または肺炎球菌の糖抗原は、肺炎球菌のタンパク質に結合され得る。このような実施形態にとって適したキャリアタンパク質は、前の段落において収載される抗原を含む［１６８］。

肺炎球菌抗原は（例えば、肺炎球菌抗原および／またはＨｉｂ抗原とともに）凍結乾燥され得る。

（共有結合的結合）
本発明の組成物における莢膜糖は、通常、キャリアタンパク質に結合される。結合は、糖をＴ非依存性抗原からＴ依存性高原へ転換し、よって、免疫学的記憶のための初回抗原刺激を可能とすることから、一般に、結合は、糖の免疫原性を増強する。結合は、小児科ワクチンにとって特に有用であり、周知の技術である［例えば、参考文献１６９および１４２〜１５０で概説される］。

好ましいキャリアタンパク質は、細菌性毒素または細菌性トキソイド（ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ_１９７ジフテリアトキソイド［１７０〜１７２］は特に好ましい。他の適したキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［１７３］、合成ペプチド［１７４、１７５］、熱ショックタンパク質［１７６、１７７］、百日咳タンパク質［１７８、１７９］、サイトカイン［１８０］、リンホカイン［１８０］、ホルモン［１８０］、増殖因子［１８０］、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１８１］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［１８２、１８３］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［１８４］、鉄取り込みタンパク質［１８５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａ、または毒素Ｂ［１８６］などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、およびＣＲＭ_１９７である。

本発明の組成物内で、（例えば、キャリア抑制の危険を減少させるため）一より多くのキャリアタンパク質を使用することが好ましい。従って、異なるキャリアタンパク質は、異なる血清群に使用され得る（例えば、血清群Ａの糖はＣＲＭ_１９７に結合され得、一方で血清群Ｃの糖は破傷風トキソイドに結合され得る）。特定の糖抗原に一より多くのタンパク質を使用することもまた可能である（例えば、血清群Ａの糖は、いくつかの糖がＣＲＭ_１９７に結合され、他の糖が破傷風トキソイドに結合されるような二つの群であり得る）。しかしながら、概して、同一のキャリアタンパク質を全ての糖に使用することが好ましい。

単一キャリアタンパク質は一より多くの糖抗原を保有し得る［１８７］。例えば、単一キャリアタンパク質は、そのキャリアタンパク質に結合された血清群Ａおよび血清群Ｃ由来の糖を有し得る。この目的を成し遂げるため、糖は結合反応の前に混合され得る。しかしながら、概して、各血清群のための別個の結合体を有することが好ましい。

１：５（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち、過剰の糖）の間の糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）での結合が好ましい。１：２と５：１の間の比が好ましく、１：１．２５と１：２．５の比はより好ましい。過剰のキャリアタンパク質は、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて好ましくあり得る。

結合体は、遊離のキャリアタンパク質との結合において使用され得る［１８８］。ある所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中に遊離型形態および結合体化形態の両方おいて存在する場合、非結合体化形態は、好ましくは、全体として、その組成物中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは、２重量％以下で与える。

任意の適した結合反応は、必要な場合、任意の適したリンカーとともに使用され得る。

糖は、典型的に、結合の前に活性化されるか、または官能化される。例えば、活性化は、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジウムテトラフルオロボレート［１８９、１９０など］）のようなシアン化試薬を含む。他の適した技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献１４８への序論をまた参照のこと）。

リンカー基を介した連結は、任意の公知のプロセス（例えば、参考文献１９１および１９２に記載された手順）を利用して作られ得る。一つの型の連結は、多糖の還元的アミノ化、アジピン酸リンカー基の一端と、結果として生じるアミノ基とのカップリング、およびその後、アジピン酸リンカー基の他の一端へのタンパク質のカップリングを含む［１４６、１９３、１９４］。他のリンカーは、Ｂ−プロピオンアミド［１９５］、ニトロフェニル−エチルアミン［１９６］、ハロゲン化ハロアシル［１９７］、グリコシド結合［１９８］、６−アミノカプロン酸［１９９］、ＡＤＨ［２００］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［２０１］などを含む。リンカーの使用に代わる手段として、直接的結合が使用され得る。そのタンパク質への直接的結合は、例えば、参考文献２０２および参考文献２０３に記載されるような多糖の酸化とその後のタンパク質との還元的アミノ化を含み得る。

糖へのアミノ基の導入（例えば、−ＮＨ_２で末端＝Ｏ基の交換による導入）およびその後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導化、ならびにキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスは、好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤキャリア（例えば、ＭｅｎＡまたはＭｅｎＣのためのキャリア）でのＣＤＡＰ活性化を使用する。

結合後、遊離型糖および結合体化糖は、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを包含する多くの適した方法がある［参考文献２０４および２０５などをまた参照のこと］。

本発明の組成物が結合されたオリゴ糖を含有する場合、オリゴ糖の調製は結合に先行することが好ましい。

（さらなるかつ代わりの血清群Ｂポリペプチド抗原）
本発明は、被験体に投与後、その被験体内において抗体反応を誘導し得る組成物であって、ここでその抗体反応は、高病原性系統Ａ４、ＥＴ−５およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの系統３のうちの二または三に対して殺菌性である組成物を提供する。

ＮａｄＡ、７４１、９３６、９５３、および２８７は、この広範な防御を成し遂げるための好ましい抗原であるが、本発明の組成物（必要に応じて５つの基本抗原のうちの一以上との組合わせでの組成物）内に含有され得る他のＭｅｎＢポリペプチド抗原は、以下のアミノ酸配列のうちの一つを含むものを含む：参考文献８由来の配列番号６５０；参考文献８由来の配列番号８７８；参考文献８由来の配列番号８８４；参考文献９由来の配列番号４；参考文献１０由来の配列番号５９８；参考文献１０由来の配列番号８１８；参考文献１０由来の配列番号８６４；参考文献１０由来の配列番号８６６；参考文献１０由来の配列番号１１９６；参考文献１０由来の配列番号１２７２；参考文献１０由来の配列番号１２７４；参考文献１０由来の配列番号１６４０；参考文献１０由来の配列番号１７８８；参考文献１０由来の配列番号２２８８；参考文献１０由来の配列番号２４６６；参考文献１０由来の配列番号２５５４；参考文献１０由来の配列番号２５７６；参考文献１０由来の配列番号２６０６；参考文献１０由来の配列番号２６０８；参考文献１０由来の配列番号２６１６；参考文献１０由来の配列番号２６６８；参考文献１０由来の配列番号２７８０；参考文献１０由来の配列番号２９３２；参考文献１０由来の配列番号２９５８；参考文献１０由来の配列番号２９７０；参考文献１０由来の配列番号２９８８、または（ａ）上記の配列に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）を有する；そして／または（ｂ）上記配列由来の少なくともｎの継続的アミノ酸のフラグメントを含むのであって、ここでｎは７より大きい（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。（ｂ）のための好ましいフラグメントは、関連する配列由来のエピトープを含む。これらのポリペプチドのうちの一より多く（例えば、２、３、４、５、６）が含まれ得る。

（一般）
用語「「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸから構成されるか、またはさらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含有し得る。

数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」の組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、その単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、本発明の規定から除外され得る。

二つのアミノ酸配列間の配列同一性割合の言及は、整列化された場合のアミノ酸のその割合が二つの配列を比較した際、同一であるアミノ酸の割合を意味する。この整列化および相同性パーセントまたは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェア・プログラム（例えば、参考文献２０６の第７．７．１８章に記載されるソフトウェア・プログラム）を使用して決定され得る。好ましい整列化は、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティを有するアフィンギャップ検索（６２のＢＬＯＳＵＭマトリクス）を利用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２０７において教示される。

用語「アルキル」は、直鎖状形態および分枝状形態の両方のアルキル基に言及する。そのアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子で割り込まれ得る。そのアルキル基はまた、１つ、２つ、または３つの二重結合または１つ、２つ、または３つの三重結合で割り込まれ得る。しかしながら、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込み、あるいは二重結合または三重結合の割り込みを有さないアルキル基に言及する。言及がＣ_１−１２アルキルにされる場合、それは、アルキル基が１〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。同様に、言及がＣ_１−６アルキルにされる場合、そのアルキル基は、１〜６の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を含み得ることを意味する。

用語「シクロアルキル（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）」は、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、およびシクロアルケニル基、ならびにアルキル基とのこれらの組合わせ（シクロアルキルアルキル基など）を含む。そのシクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、３つのヘテロ原子で割り込まれ得る。しかしながら、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込みを有さないシクロアルキル基に言及する。シクロアルキル基の例は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキシルメチル基、およびアダマンチル基を含む。言及がＣ_３−１２シクロアルキルにされる場合、それは、そのシクロアルキル基が、３〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。

用語「アリール」は、芳香族基（フェニル、ナフチルなど）に言及する。言及がＣ_５−１２アリールにされる場合、それは、そのアリール基が、５〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。

用語「Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキル」は、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルメチルのような基に言及する。

窒素保護基は、シリル基（ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳなど）、アシル誘導体（フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ））、スルフェニル誘導体、Ｃ_１−１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、９−フェニルフルオレニルなどを含む。好ましい窒素保護基はＦｍｏｃである。

クローニングまたは精製などを容易にするための含まれる配列は、必ずしも、本発明に寄与せず、省略されるかまたは除かれる。

糖環は、開いた形態および閉じた形態で存在し得ることは理解され、閉形態は本明細書中で構造式において示され、一方で開形態もまた、本発明により含まれる。

（発明を実施するための形態）
（ΔＧ２８７−９５３ハイブリッドタンパク質）
髄膜炎菌性血清群Ｂ菌株３９４／９８由来のタンパク質２８７をコードするＤＮＡ、および髄膜炎菌性血清群Ｂ菌株２９９６由来のタンパク質９５３をコードするＤＮＡを消化し、そして短いリンカー配列とともに結合させ、配列番号７のアミノ酸配列をコードするプラスミドを生じさせた。そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。

適切な増殖後、細菌を収集し、そのタンパク質を精製した。培養により提供される細菌を遠心し、そのペレットを、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）の存在下で１：８のペレット：緩衝液の体積比でホモジェナイズした。高圧ホモジナイザー（ＡＶＥＳＴＩＮ、１４０００ｐｓｉで４サイクル）を使用し溶解を行った。溶解後、尿素を終濃度５Ｍで加え、続いて、１時間にわたり室温で撹拌した。そのｐＨを、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ４）＋５Ｍ尿素を用いて６から５に下げた。その混合物を２〜８℃で６０分にわたり１６８００ｇで遠心した。その上清を収集し、ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ Ｐ（０．４５〜０．２２μｍ ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ）により濾過した。

濾過された上清中のタンパク質は、−２０℃で３０日以上、および２〜８℃で１５日以上安定であった。

タンパク質を、陽イオン交換カラム（ＳＰＦＦ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、３５０ｍＭ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ酢酸塩＋５Ｍ尿素ｐＨ５．００を用いた溶出でさらに精製した。不純物の大多数は、元通りに存在する。より低いＮａＣｌ濃度（１８０ｍＭ）を使用した前溶出洗浄により、二つの夾雑するＥ．ｃｏｌｉタンパク質は有利に除去された。

溶出された物質をｐＨ８に調整し（２００ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ＋５Ｍ尿素ｐＨ９を用いて）、ＱセファロースＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、５Ｍ尿素中１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ８．００を用いた溶出でさらに精製した。再び、減少した塩（９０ｍＭ）での溶出前洗浄は、不純物の除去に有用であった。

ＱＨＰカラムから濾過され、溶出された物質を、ＰＢＳ ｐＨ７．００（１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ ７．００）を用いて１：２で希釈し、次いで、タンジェント限外濾過により１０容量のＰＢＳ ｐＨ７．００に対してダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションの終わりに、その物質を約１．２ｍｇ／ｍｌの全タンパク質まで１．６倍濃縮した。３０，０００Ｄａカットオフ膜（再生セルロース膜５０ｃｍ^２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＬＣＴＫ ３０）を使用して、約９０％の収率でこの物質を透析することは可能であった。

（９３６−ΔＧ７４１ハイブリッドタンパク質）
髄膜炎菌性血清群Ｂ菌株２９９６由来のタンパク質９３６をコードするＤＮＡ、および髄膜炎菌性血清群Ｂ菌株ＭＣ５８由来のタンパク質７４１をコードするＤＮＡを消化し、そして短いリンカー配列とともに連結し、配列番号８のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。そのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。組換えタンパク質は分泌されず、細菌内で可溶性のままであった。

適切な増殖後、細菌を遠心分離し、湿性のペーストを生じさせ、そして以下のとおり処理した：
−２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ ７．００存在下において高圧システムによる均質化。

−直交濾過（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による遠心分離および清澄化。

−２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．００中の１５０ｍＭ ＮａＣｌにより溶出するカチオン性カラムクロマトグラフィー（ＳＰセファロース Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）。

−素通り収集するアニオンカラムクロマトグラフィー（ＱセファロースＸＬ）。

−２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．００により溶出する疎水性カラムクロマトグラフィー（フェニルセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）。

−１０ＫｄカットオフでＰＢＳ ｐＨ７．４に対するダイアフィルトレーション。

−最後の滅菌濾過および−２０℃での貯蔵。

最終材料におけるタンパク質は、−２０℃および２〜８℃のいずれでも少なくとも３ヵ月にわたり安定であった。

（ＮａｄＡ^{（ＮＬ）（Ｃ）}タンパク質）
髄膜炎菌性血清群Ｂ菌株２９９６由来のＮａｄＡタンパク質をコードするＤＮＡを、そのＣ末端をコードする配列を除去するため消化し、配列番号１のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。その組換えタンパク質は、培養培地中に分泌され、そしてそのリーダーペプチドは分泌されたタンパク質（配列番号２）には存在しなかった。その上清を以下のとおり処理した：
−７Ｘ濃縮およびクロスフローＵＦ（カットオフ３０Ｋｄ）により、２０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．６の緩衝液に対するダイアフィルトレーション。

−２０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．６中の４００ｍＭ ＮａＣｌにより溶出する陰イオンカラムクロマトグラフィー（ＱセファロースＸＬ）。

−ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ ７．６中の５０ｍＭ ＮａＣｌにより溶出する疎水性カラムクロマトグラフィー工程（フェニルセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）。

−２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ ７．４により溶出するヒドロキシアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー（ＨＡ Ｍａｃｒｏ．Ｐｒｅｐ）。

−ＰＢＳ ｐＨ ７．４に対するダイアフィルトレーション（カットオフ３０Ｋｄ）。

−最後の滅菌濾過および−２０℃における貯蔵。

最終材料におけるタンパク質は、−２０℃および２〜８℃のいずれでも少なくとも６ヵ月にわたり安定であった。

ＮａｄＡタンパク質は、分解を受けやすく、ＮａｄＡの先欠け形態はウェスタンブロットにより、または１０ｋＤａまでの分子量損失を指し示す質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により検出され得る。分解産物は、ゲル濾過（例えば、カラムＴＳＫ ３００ＳＷＸＬ、プレカラムＴＳＫＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨＡＡＳを用いて）によりネイティブのＮａｄＡから分離され得る。このような濾過は、三つのピークを生じさせる：（ｉ）保持時間１２．６３７分および見かけ分子量８８５．０３６Ｄａを有する第一のピーク；（ｉｉ）保持時間１３．８７１分および見かけ分子量５３０．３８８Ｄａを有する第二のピーク；（ｉｉｉ）保持時間１３．８７１分および見かけ分子量５３０．３８８Ｄａを有する第三のピーク。三つのピークの光散乱分析は、（ｉ）２０８５００Ｄａ、（ｉｉ）９８４６０Ｄａ、（ｉｉｉ）７８７６０Ｄａの実際の分子量値を示す。従って、第一ピークは、ＮａｄＡ凝集体を含み、そして第三のピークは、分解産物を含む。

ＮａｄＡ^{（ＮＬ）（Ｃ）}の推定分子量は３４．１１３Ｄａであることから、ピーク（ｉｉ）は三量体タンパク質を含み、これは所望の抗原である。

（抗原の組合わせ）
三つのタンパク質および水酸化アルミニウムアジュバントを含有する組成物でマウスを免疫した。比較目的のため、三つのタンパク質を、単独でも試験した。一グループ当たり１０匹のマウスを使用した。その混合物は種々の菌株に対し高殺菌性力価を誘導し得た：

個々のマウスから判断すると、三重の混合物が、個々の抗原の由来となる三つの血清群Ｂ菌株に対し高殺菌性力価および一貫した殺菌性力価を誘導した。

（ＯＭＶとの組合わせおよび比較）
さらなる実験では、アジュバント抗原（一用量当たり２０μｇの各抗原）を、菌株Ｈ４４／７６（ノルウェー）または菌株３９４／９８（ニュージーランド）のいずれから調製された１０μｇのＯＭＶと組合わせて投与した。ポジティブコントロールは、血清群Ｂについては抗莢膜ＳＥＡＭ−３モノクローナル抗体、または他の菌株についてはＣＲＭ１９７結合莢膜糖であった。結果（殺菌性力価）は、表１に示される。その混合物は、ほとんどの場合、単一のＯＭＶより優れた力価を生じ、その上、ＯＭＶへの混合物の添加は、ほとんどの場合、そのＯＭＶの効力を有意に増強する。さらに、多くの場合、抗原混合物は、ポジティブコントロールで観察される応答に一致するか、またはその応答を上回る。

（高病原性系統試験）
以下の抗原を、種々の高病原性系統由来の種々の血清群Ｂの菌株に対し試験した：
（ａ）ＮａｄＡ^{（ＮＬ）（Ｃ）}
（ｂ）ΔＧ２８７−９５３
（ｃ）９３６−ΔＧ７４１
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の混合物
（ｅ）菌株Ｈ４４／７６（ノルウェー）から調製したＯＭＶ
（ｆ）菌株３９４／９８（ニュージーランド）から調製したＯＭＶ
（ｇ）ΔＧ２８７および（ｅ）の混合物）
（ｈ）（ｄ）および（ｅ）の混合物
（ｉ）（ｄ）および（ｆ）の混合物
ＳＥＡＭ−３をポジティブコントロールとして使用した。

結果は、以下のとおり、指し示された高病原性系統において、血清殺菌性力価が１０２４を上回った場合の、菌株の割合として表された。

特定の参考菌株に対して殺菌性力価は以下のとおりであった。

従って、組成物（ｄ）、（ｈ）および（ｉ）は、高病原性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３の中から血清群Ｂ髄膜炎菌の多種多様の菌株に対する殺菌性抗体応答を誘導する。組成物（ｈ）および（ｉ）を使用した力価は、概して、（ｄ）での力価より高いが、高病原性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３内の菌株の適用範囲は、変わりなかった。

非分類の菌株の適用範囲はまた、組成物（ｄ）、（ｈ）、および（ｉ）で高かった。

（ＮａｄＡのＮ末端ドメインの分析）
精製されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＮａｄＡタンパク質がヒト上皮細胞（例えば、Ｃｈａｎｇ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ−２細胞）に結合することは公知であり［１７］、組換えＥ．ｃｏｌｉは付着性の表現型を示す［１８］。これらのＥ．ｃｏｌｉはまた、上皮細胞を侵襲し得、そして細胞内ＮａｄＡ^＋ＶＥＥ．ｃｏｌｉは、免疫蛍光（膜透過処理後）により、および電子顕微鏡検査により、Ｃｈａｎｇ細胞において検出され得る。従って、ＮａｄＡは、上皮細胞にとって付着因子および侵襲として機能すると考えられる。

二次構造分析に基づき、成熟したＮａｄＡは、以下の三つの推定ドメインに細区画した：Ｎ末端の球状ドメイン（ａａ ２４〜８７）、高いコイルドコイル性向を有するαヘリックス内部領域（ａａ ８８〜３５０）、およびＣ末端の膜アンカー（ａａ ３５１〜４０５）。宿主細胞相互作用におけるＮ末端の球状ドメインの役割を研究した。

アミノ酸３０〜８７を欠くタンパク質をコードする、先欠けのｎａｄＡ遺伝子をｐＥＴ−２１ベクターにクローン化し（ｐＥＴ−ＮａｄＡΔ３０〜８７）、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株において発現させた。リーダーペプチドのプロセシングおよびタンパク質の正確な成熟を可能とするために、アミノ酸２４〜２９を保持した。ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳ解析により、ＮａｄＡΔ３０〜８７が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞表面において、オリゴマーを発現かつ形成することを確認した（すなわち、Ｎ末端ドメインの欠損は、ＮａｄＡの発現、輸送、および膜局在化を妨害しない）。しかしながら、その組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株は、完全に、Ｃｈａｎｇ上皮細胞への付着能力を失った。従って、そのＮ末端ドメインは、付着因子活性に関与している。

Ｎ末端ドメインのいずれの部分がその相互作用に関与するのかをさらに調査するため、その領域をさらに、以下の三つの推定のサブドメインに分けた：アミノ酸２４〜４２（疎水性残基を有する推定のαヘリックス領域を含む）；アミノ酸４３〜７０（推定の規定された二次構造なしの内部の部分）；およびアミノ酸７１〜８７（他の推定のαヘリックス構造を含む）。（単一のサブドメインが欠失したタンパク質を各々コードする）三つの構築物を生成し、次いでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し，以下の菌株を得た：ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＮａｄＡΔ２４〜４２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＮａｄＡΔ４３〜７０およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＮａｄＡΔ７１〜８７。オリゴマーの表面局在化を、ウェスタンブロットおよびＦＡＣＳ解析により確認したが、Ｃｈａｎｇ上皮細胞への付着は、コントロールＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株と変わりなかった。これらの結果はまた、免疫蛍光顕微鏡解析を用いて確認されたが、このことは、全体のＮａｄＡの球体Ｎ末端ドメインがヒト細胞との相互作用において重要であることを示す。

（髄膜炎菌性結合体およびＨｉｂ結合体との組合わせ）
三重のＭｅｎＢ組成物は、血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹについてオリゴ糖結合体の混合物と組合わされ、以下の抗原を含むワクチンを生じる。

同様のワクチンが調製され、ＭｅｎＡ結合体（１０μｇ糖＋１２．５〜３３μｇＣＲＭ_１９７）および／またはＨｂＯＣ Ｈｉｂ結合体（１０μｇ糖＋２〜５μｇＣＲＭ_１９７）を含む。

（修飾されたＭｅｎＡ糖の使用）
莢膜多糖をＭｅｎＡから精製し、そして加水分解し、ＭｅｎＡオリゴ糖を得た。多糖（２ｇ）を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７５中で、５０℃で、約４時間にわたり、１０ｍｇ／ｍＬの多糖濃度で加水分解した［１３５］。加水分解後、その溶液を、ロータリーエバポレーションにより乾燥させた。

このオリゴ糖を、以下の反応スキームを利用し活性化させた：

このオリゴ糖をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの糖濃度を得た。１：２０であるオリゴ糖：ＣＤＩのモル比に従って、２１．２６２ｇのＣＤＩを次いで加え、反応混合物を１６時間にわたり、室温で撹拌した。結果として生じるＭｅｎＡ−ＣＤＩ化合物を、８０：２０（ｖ／ｖ）のアセトン：ＤＭＳＯの混合物中で、選択的沈殿により精製し、続いて遠心分離した。活性化反応の効率は、結合したイミダゾールに対する遊離のイミダゾールの比を決定することにより約６７．９％と計算された。

第二の反応工程では、ＭｅｎＡ−ＣＤＩオリゴ糖を、ＤＭＳＯ中で、約１０ｍｇ／ｍＬの糖濃度で可溶化した。ＭｅｎＡ−ＣＤＩ単位：ＤＭＡのモル比１：１００に従って、３６．２８８ｇの９９％塩酸ジメチルアミン（すなわち、Ｒ^１およびＲ^２＝Ｍｅ）を加え、その反応混合物を、室温で１６時間にわたり撹拌した。その反応生成物を、凍結乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬの水溶液中で可溶化した。

低分子量反応試薬（特に、ジメチルアミン（ＤＭＡ））をオリゴ糖調製物から取り除くため、透析工程を、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ^ＴＭ）を通して行った。四つの透析工程を行った：（ｉ）２Ｌの１Ｍ塩化ナトリウムに対し１６時間にわたる透析工程（透析率１：２０）、（ｉｉ）２Ｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムに対し１６時間にわたる透析工程（透析率１：２０）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）２ＬのＷＦＩに対し１６時間にわたる透析工程（透析率１：２０）。精製を向上させるため、ダイアフィルトレーション工程もまた、１ｋＤａ ＭＷＣＯ膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ^ＴＭ）を通して行った。

精製されたＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ生成物を、２５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン（Ｆｌｕｋａ^ＴＭ）中で、ｐＨ ６．５にて緩衝化した。

改変されたＭｅｎＡ糖の結合体（ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ）の調製については、全プロセスは以下のとおりであった：
オリゴ糖断片を生じさせるための多糖の加水分解
オリゴ糖断片の大きさ分類の処理
大きさ分類されたオリゴ糖上の末端アルデヒド基の還元的アミノ化
ＣＤＩ反応前の、Ｆｍｏｃ基による末端−ＮＨ_２基の保護
ＤＭＡ反応の際の−ＮＨ_２基の内因的脱保護
ＳＩＥＤＡ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアジピン酸）による末端−ＮＨ_２基の活性化
ＣＲＭ_１９７タンパク質への共有結合的付着。

改変されたＭｅｎＡオリゴ糖結合体は、高温での加水分解に対して、その天然の対応物より、かなり抵抗性である。例えば、３７℃で２８日後、遊離した糖の割合は、改変されたオリゴ糖については６．４％であるのに対し、天然抗原については２３．５％である。さらに、改変されたオリゴ糖により誘導される力価は、天然の糖構造を用いて得られた力価より有意には低くない。

改変されたＭｅｎＡ結合体は、非改変のオリゴ糖の結合体の代わりとして、ＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体、およびＭｅｎＹ結合体と合わされる。この四価の混合物は、三つのＭｅｎＢポリペプチドと混合され、単回用量においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対して有効なワクチンを生じさせる。

（肺炎球菌の組合わせ）
三つの合わされたＭｅｎＢタンパク質は、肺炎球菌の糖結合体とともに混合され、最終濃度２μｇ／各肺炎球菌血清型１用量（血清型６Ｂについては二倍）を生じさせる。従って、その再構成されたワクチンは、以下の抗原を含む：

本発明は、例示として記載されているにすぎずないことが理解され、本発明の範囲と精神を保持しつつ、改変がなされ得る。

（参考文献（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される））

配列表

Claims (12)

1. 被験体に投与後、該被験体において抗体応答を誘導し得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａによって引き起こされる疾患に対する防御および／または処置のための組成物であって、ここで該抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの高毒性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３のうち二つ以上に対して殺菌性であり、
   ここで、該組成物は、以下：
   （１）配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質；
   （２）配列番号７に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質；および
   （３）配列番号８に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質を含む、組成物。
2. 請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、以下：
   （１）配列番号２に対して９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質；
   （２）配列番号７に対して９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質；および
   （３）配列番号８に対して９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質を含む、組成物。
3. 請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、以下：
   （１）配列番号２に記載のアミノ酸を含むタンパク質；
   （２）配列番号７に記載のアミノ酸を含むタンパク質；および
   （３）配列番号８に記載のアミノ酸を含むタンパク質
   を含む、組成物。
4. それぞれ異なるアミノ酸配列を有する、２〜１０のポリペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。
5. 請求項１または請求項２に記載の組成物であって、ここで前記殺菌性の抗体応答を起こす前記タンパク質は、組換え発現により得られる、組成物。
6. 髄膜炎菌血清群Ｙ、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５、髄膜炎菌血清群Ｃおよび（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ由来の糖抗原をさらに含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型由来の糖抗原をさらに含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 請求項６または請求項７に記載の組成物であって、ここで前記糖抗原は、以下：ジフテリアトキソイド、破傷風（ｔｅｔａｔｎｕｓ）トキソイド、ＣＲＭ_１９７またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄから選択されるキャリアに結合される、組成物。
9. Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原をさらに含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 医薬として使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａによって引き起こされる疾患の予防および／または処置のための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
12. 哺乳動物において抗体応答を生じるための、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物。