JP4796227B2 - パラジウム置換バクテリオクロロフィル誘導体およびその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、パラジウム置換バクテリオクロロフィル誘導体、その製造方法および中間体、ならびにこれらを含む医薬組成物、さらにはインビボ光動力学的療法および診断、ならびにウイルスおよび微生物のインビトロ光動力学的死滅の分野におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
（略語の定義）
ＢＣｈｌ＝バクテリオクロロフィルａ（１７3位にフィチルまたはゲラニルゲラニル基、１３2位にＣＯＯＣＨ3基、１３2位にＨ原子、３位にアセチル基、そして８位にエチル基を有する、Ｍｇ含有７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン）。
ＢＣｈｌｉｄｅ＝バクテリオクロロフィリドａ（ＢＣｈｌａから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
ＢＰｈｅ＝バクテリオフェオフィチンａ（中心Ｍｇ原子が、２個のＨ原子により置換されている、ＢＣｈｌ）。
ＢＰｈｅｉｄ＝バクテリオフェオホルビドａ（ＢＰｈｅから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ＝Ｐｄ−バクテリオフェオホルビドａ（中心Ｐｄ原子、１３2位にＣＯＯＣＨ3基、１３2位にＨ原子、３位にアセチル基、そして８位にエチル基を有する、ＢＰｈｅから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
【０００３】
明細書を通して、バクテリオクロロフィル誘導体のＩＵＰＡＣの番号付けが使用される。この命名法を使用すると、天然バクテリオクロロフィルは、１３2位と１７2位に２個のカルボン酸エステルを有するが、１３3位と１７3位でエステル化されている。
【０００４】
（発明の背景）
癌治療のための光増感剤の利用への関心が高まってきている。光動力学的療法（photodynamic therapy）（ＰＤＴ）として知られている、この方法により、例えば、光増感剤を腫瘍に適用して、インサイチューの光感作によって、悪性細胞を中毒させる化合物が生じる。
【０００５】
ポルフィリンおよび関連化合物を使用する光動力学的療法は、かなり長い歴史を有する。１９４０年代の初期の研究は、ポルフィリンによって、照射腫瘍組織が蛍光を発光できたことを証明した。ポルフィリンは、これらの組織に蓄積してインサイチューで光を吸収でき、従って蛍光の位置から腫瘍を検出する手段が与えると思われた。検出と治療の両方に光動力学的処置の初期段階において広く使用された調製物は、ヘマトポルフィリン誘導体のＨｐＤ、またはリプソン（Lipson）と共同研究者らによりＪ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９６１）２６：１−８に報告されたように調製されるリプソン（Lipson）誘導体とも呼ばれる、ヘマトポルフィリンの粗誘導体であった。この調製物を使用して熱心に研究が行われ、ドアティー（Dougherty）と共同研究者らは、悪性腫瘍の治療におけるこの誘導体の使用を報告した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９７８）３８：２６２８−２６３５；Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９７９）６２：２３１−２３７）。
【０００６】
ドアティー（Dougherty）と共同研究者らは、凝集重量＞１０kdであるＨｐＤの一部である、より有効な型のヘマトポルフィリン誘導体を調製した。光動力学的療法において有用なこの型の薬物は、米国特許第４，６４９，１５１号の主題であり、市販されており、そして臨床試験中である。
【０００７】
光吸収性化合物（特にポルフィリンに関連する化合物）の使用の一般的原則は、全身投与されるときの腫瘍の治療法として十分に確立している。正常組織ではなく腫瘍を破壊するこれらの試料の鑑別能力は、この悪い細胞に対するこれらの調製物のホーミング効果によっている。（例えば、ドアティー，ティー・ジェイ（Dougherty, T.J.）ら、「癌：腫瘍学の原理と実際」（"Cancer: Principles and Practice of Oncology"）（１９８２）、ブイ・ティー・デヴィータ・ジュニア（V.T. de Vita, Jr.）ら編、１８３６−１８４４頁を参照のこと）。抗体にヘマトポルフィリンを結合させて、ホーミング能力を改善する試みが行われている。（例えば、ミュー，ディー（Mew, D.）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）１３０：１４７３−１４７７を参照のこと）。細胞を死滅させるこれらの薬物の機序は、照射による一重項酸素の形成に関与していると考えられる（ワイスハウプト，ケー・アール（Weishaupt, K.R.）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７６）ｐｐ．２３２６−２３２９）。
【０００８】
局所投与を利用する皮膚疾患の治療においてヘマトポルフィリン誘導体またはその活性成分を使用することも、米国特許第４，７５３，９５８号に記載されている。さらに、細菌やウイルスのような感染性生物を含む生物学的試料を滅菌するために、この薬物が使用されている（マシューズ，ジェイ・エル（Matthews, J.L.）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（１９８８）：８１−８３）。例えば、米国特許第４，７２７，０２７号に記述されているように、種々の他の光増感性化合物もこの目的に使用されている。
【０００９】
一般に、インビボとインビトロの両方で生物学的基質の機能を選択的に傷害するために、種々の構造の放射線増感剤を使用する方法は、当該分野において理解されている。これらの方法に有用な化合物は、傷害または破壊すべき標的である生物学的基質に対する鑑別的親和性を有する必要があり、かつ照射された薬物は、近接した組成物および物質に有害な作用を有する方法で活性化されるように、光を吸収できる必要がある。
【００１０】
治療薬および診断薬の性能を最適化することは常に望ましいため、治療および診断において伝統的に使用されるポルフィリン薬物の改変が探求されている。フタロシアニン類、ソラレン関連化合物、および一般に共鳴系を伴う多環式化合物を含む多くの一般的分類の光増感剤が指摘されている。本明細書に開示される化合物と最も類似しているものは、その光動力学的療法における使用が、日本メタフィジックス社（Nihon Metaphysics Company）のＥＰＯ出願２２０６８６号に記載されている種々のフェオホルビド誘導体；タマセイカヤク株式会社（Tama Seikayaku, K.K.）の日本出願Ｊ８５／０００９８１号に記載されている、この目的のためのフェオホルビドのエチレンジアミン誘導体、および１０−ヒドロキシフェオホルビド−ａに関する日本出願Ｊ８８／００４８０５号である。さらに、ビームズ，イー・エム（Beems, E.M.）らは、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）４６：６３９−６４３において、光増感剤としてのバクテリオクロロフィル−ａの２つの誘導体：バクテリオクロロフィリン−ａ（バクテリオクロロフィル−ａにおいて誘導体化されるフィチルアルコールを欠いている、バクテリオフェオホルビド−ａとしても知られている）およびバクテリオクロリン−ａ（フィチル基とＭｇイオンの両方を欠いている）の使用を開示している。著者らは、これらの誘導体はバクテリオクロロフィル−ａに比較して水溶性が増強されていて有利であるため、注目している。
【００１１】
ＥＰ５８４５５２およびＷＯ９７／１９０８１（両方とも、イェダ研究開発社（Yeda Research and Development Co. Ltd.））は、クロロフィルおよびバクテリオクロロフィル誘導体、ならびにこれらのＰＤＴ薬物としての使用、ならびに金属化バクテリオクロロフィル、およびそれぞれ対応するＣｄ−ＢＣｈｌ誘導体の金属交換反応によるこれらの製造法を記載している。
【００１２】
特定の標的および特定の情況に最適な、光動力学的療法および診断に有用な適切な光増感剤を見い出すための問題が残っている。すなわち、本発明は、特別な治療および診断情況で使用するための候補群の一部となる、追加的な一群の光増感性化合物を提供する。
【００１３】
（発明の要約）
本発明により、以下の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”（ここで、以下に定義されるＡは、効率的な血漿移行および細胞膜貫通を可能にする置換基を表す）の化合物は、ＰＤＴ薬物として有用であり、そして既知化合物に比較して、溶解度、安定性および／または効力が増強しているという利点を示す。
すなわち、本発明は、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”：
【００１４】
［式中、
Ａは、ＯＨ、
ＯＲ1、
−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−ＮＨ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−Ｏ−（ＣＨ 2 ） 2 −ＯＨ、
−ＮＨ−（ＣＨ 2 ） 2 −ＮＨ−ＢＯＣまたは
−Ｎ−（ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）2を表し、
Ｒ1は、Ｎａ+、Ｋ+、（Ｃａ2+）0.5、（Ｍｇ2+）0.5、Ｌｉ+、ＮＨ4 +、
+ＮＨ3−Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3、+ＮＨ3−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨ、
+ＮＨ2（ＣＨ3）−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは
+Ｎ（Ｃn'Ｈ2n'+1）4を表し；
Ｒ2は、化合物が式Ｉの場合はＨ、ＯＨまたはＣＯＯＲ4を表し、ここでＲ4は、Ｃ1−Ｃ12アルキルまたはＣ3−Ｃ12シクロアルキルであり、あるいは化合物が式Ｉ’の場合はＨを表し；
Ｒ3は、化合物が式Ｉの場合はＨ、ＯＨまたはＣ1−Ｃ12アルキルもしくはアルコキシを表し、あるいは化合物が式Ｉ’の場合はＨまたはＣ 1 −Ｃ 12 アルキルを表し；
ｎは、１、２、３、４、５または６であり、
Ｙは、−ＮＲ'1Ｒ'2または−+ＮＲ'1Ｒ'2Ｒ'3、Ｘ-であり、ここでＲ'1、Ｒ'2およびＲ'3は、それぞれ他と独立に、−ＣＨ3または−Ｃ2Ｈ5を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
ｎ'は、１、２、３または４であり、そして
＊は、不斉炭素を意味し、かつ---は、飽和単結合または不飽和二重結合を表す］の化合物に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記の新しい化合物の製造方法に関する。
すなわち、１つの側面において、本明細書には、標的生物学的基質を傷害または破壊するための方法が記述されており、この方法は、標的基質を該基質を、該基質を光感作するのに有効な量の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物で処理し、次に該標的基質を、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物により吸収される波長バンドの放射線で、基質を傷害または破壊するのに有効な時間、照射することを含んでなる。
【００１６】
従って他の側面において、本発明は、活性成分として少なくとも１つの式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物を、薬剤学的に許容される担体と一緒に含んでなる医薬組成物に関する。本組成物は、腫瘍のインビボ光動力学的療法および診断のため、ならびに周知の光動力学的方法による、試料中および生体組織中の細胞、ウイルスおよび細菌、寄生虫および真菌を死滅させるのに有用である。
【００１７】
さらに本発明は、光動力学的療法において有用な医薬組成物の製造のための、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物の使用に関する。
【００１８】
本発明はさらに、細菌、寄生虫、ウイルスおよび真菌の診断およびエクスビボの死滅において有用な組成物の製造のための、発明化合物の使用に関する。
【００１９】
本発明はさらに、中間体としての、それぞれ本明細書で後述する式IIおよびIIIの酸塩化物および無水物に関する。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
好ましい実施態様において、本発明の化合物は、以下の光学的立体配置をもつ下記式：
【００２１】
［式中、Ａは、上記と同義である］を有する。
【００２２】
上記構造中、Ｃ７とＣ８の間の結合とＣ１７とＣ１８の間の結合を示す点線が、飽和単結合であるとき、番号７、８、１７および１８の炭素原子は、不斉炭素原子である。Ｒ2またはＲ3がＨであるとき、Ｃ１３2は不斉炭素原子である。
【００２３】
酸素の存在下で、または周囲空気および光作用下で、上記Ｃ７−Ｃ８およびＣ１７−Ｃ１８結合の酸化が起こり、該位置Ｃ７−Ｃ８およびＣ１７−Ｃ１８に二重結合を有する化合物が生じてもよい。
【００２４】
本発明の式Ｉ'およびＩ”の化合物は、式Ｉの化合物の酸化型であり、そして「クロロフィル」、シアー・エイチ（Scheer H.）（編）、ＣＲＣ出版、１９９１年、１４７−２０９頁に記載される方法により得ることができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、本化合物は、ＡがＯＲ1であるものである。
最も好ましい実施態様において、本発明の化合物は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ（本明細書では時にＰｄ−ＢＣｈｌ−ＣＯＯＨとも称される）、すなわち下記構造：
を有する、ＡがＯＨである式Ｉの化合物である。
【００２６】
ＡがＯＨである式Ｉの化合物の製造方法の１つは、少なくとも、
ａ）Ｍ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ化合物（ここで、Ｚはフィチル、ゲラニルゲラニル（ｇｇ）またはＳｅｒＯＭｅ（セリルＯ−メチルエステル）であり、そしてＭは、Ｍｇ、Ｃｄ、およびＺｎから選択される金属である）の脱金属反応と加水分解を組合せる工程；
ｂ）（ａ）で得られる化合物に、Ｐｄ試薬を用いてＰｄを取り込む（こうしてＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが得られる）工程、および、所望であれば、
ｃ）次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄと式Ａ−Ｈの対応する化合物を反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成させる工程、
とを含んでなる。
【００２７】
１つの好ましい実施態様において、本方法は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ製造法に関し、そしてバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で脱金属および加水分解され、そして得られるバクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）は、工程（ｂ）でＰｄ試薬と反応して、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる。
【００２８】
式Ｉの化合物の別の製造方法は、少なくとも、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚの金属交換反応により、対応するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチル、ｇｇまたはＳｅｒＯＭｅである）を得る工程、；
ｂ）得られる化合物の加水分解工程、および
ｃ）場合により、次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを式Ａ−Ｈの対応する化合物と反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成する工程
とを含んでなる。
【００２９】
１つの好ましい実施態様において、本方法は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ製造法に関し、そしてバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で金属交換されて、本来の中心Ｍｇ原子がＰｄで置換され、そして得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルである）は、工程（ｂ）で加水分解されて、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる。
【００３０】
式Ｉの化合物の別の製造方法は、少なくとも、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルまたはゲラニルゲラニルである）を酵素的加水分解して、ＢＣｈｌｉｄｅを得る工程；
ｂ）（ａ）の該ＢＣｈｌｉｄｅの酸性脱金属反応工程；
ｃ）（ｂ）の脱金属化ＢＰｈｅｉｄへ、Ｐｄ試薬を用いてＰｄを取り込む工程；および
ｄ）場合により、次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを式Ａ−Ｈの対応する化合物と反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成させる工程
とを含んでなる。
【００３１】
式Ｉの化合物の製造のための上記方法において、Ｐｄ試薬は、例えば酢酸Ｐｄまたは塩化Ｐｄのような構造でＰｄを提供する、任意の便利な反応性化合物であってよい。
【００３２】
上記方法におけるＰｄの取り込みは、アスコルビン酸Ｎａまたはアスコルビン酸を使用する２工程法、あるいは６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸を使用する１工程法により行うことができる。
【００３３】
Ａが、ＯＨおよびＯＲ1とは異なる、本発明の化合物は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ（Ｐｄ−ＢＣｈｌ−ＣＯＯＨ）と対応するＡ−Ｈ化合物との反応により得られる。
【００３４】
上記式IIおよびIIIの化合物は、本発明の式Ｉの化合物の中間体である。式IIの酸塩化物であるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＣＯＣｌは、例えばＳＯＣｌ2のような酸塩化物を形成するのに適した任意の物質を使用することにより得られる。
式IIIの酸無水物は、式Ｉ、Ｉ'、Ｉ”の化合物を無水酢酸で脱水することにより得られる。
これらの中間体IIおよびIIIを対応する化合物ＡＨと反応させて、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物が得られる。
【００３５】
本発明はさらに、式Ｉ、Ｉ'およびＩ”の遊離酸の薬剤学的に許容される塩を含んでなる。この塩は、遊離酸またはその塩と、特に問わないが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、カルシウムまたはマグネシウムの適切な塩、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、水酸化テトラアルキルアンモニウム、例えば、水酸化テトラエチルアンモニウム、またはＮ−メチルグルカミン、グルカミンおよびトリエタノールアミンのような、無機または有機試薬とを反応させる、当該分野において周知の方法により形成することができる。
【００３６】
本発明の化合物は、標的生物学的基質に関する光動力学的療法および診断において使用される。「標的生物学的基質」とは、環境に好ましくないため治療または他の矯正処置（例えば滅菌）が用いられるか、あるいは診断が適用される環境においてその位置を知ることが望まれる、任意の細胞、ウイルスまたは組織を意味する。
【００３７】
本発明により、薬物は被験者に注入されて、標的基質は最適濃度に達することができる。次に標的基質は、投与された化合物の吸光スペクトルに適した波長の放射線に暴露される。化合物の作用は、標的基質の温度を同時に上昇させることにより増強することができる。
【００３８】
本発明の方法において使用するために、本発明の化合物は、意図する用途に適した従来の賦形剤を使用して製剤化される。全身投与には一般に、十分な非毒性界面活性剤を含む緩衝化水性組成物が使用して、活性化合物を可溶化する。本発明の化合物は、一般に水にあまり溶けやすくないため、このような界面活性剤の可溶化量を使用してもよい。適切な非毒性界面活性剤は、特に問わないが、ツイーン−８０、グリココール酸ナトリウムのような種々の胆汁酸塩、フシジン酸塩のような種々の胆汁酸塩類似体を含む。別の組成物では、リポソーム担体を利用する。溶液は、ハンクス液、リンゲル液、またはリン酸緩衝液のような従来の緩衝液を使用して、所望のｐＨに緩衝化される。安定化量のタンパク質、例えば、血清アルブミン、または低密度−もしくは高密度−リポタンパク質（それぞれ、ＬＤＬおよびＨＤＬ）のような、薬物の活性を妨げない他の成分も含めてよい。
【００３９】
全身性製剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下注射のような注射により投与できるか、あるいは経膜または経皮法により投与できる。経皮または経膜投与に適した製剤には、浸透剤（これらは、しばしば上述の界面活性剤であってよい）を含有する噴霧剤および坐剤がある。
【００４０】
局所投与には、製剤は浸透剤も含んでいてよく、そして軟膏剤、膏薬、リニメント剤、クリーム剤、または油剤の剤型とする。全身性および局所投与の両方に適切な製剤化は、「レミントンの製剤科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences）、最新版、マック出版社（Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルバニア州に見い出される。
【００４１】
例えば輸注または血液製剤の製造のために血液または血漿を処理するためのエクスビボの使用には、特別な製剤は必要でないが、本発明の化合物を、照射に先立ち、適切な適合溶媒に溶解して、典型的には１〜１００μg/ml程度の適切な濃度で生物学的流体と混合する。
【００４２】
光動力学的療および診断的応用のために適切な用量範囲は、投与の様式および化合物の選択、ならびに治療または診断される症状の性質により変化する。しかし一般には、適切な用量は、０．０１〜５０mg/kg体重、好ましくは０．１〜１０mg/kg程度である。局所投与には、典型的には総量約５〜１００mgの量が使用される。
【００４３】
光動力学的エクスビボ療法のための一般的な操作は、マシューズ，ジェイ・エル（Matthews, J.L.）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（上記文献）に記載される操作と類似している。
【００４４】
簡単に述べると、全身投与には、標的生物学的基質中の本発明の化合物の最適濃度を達成するために、投与後に適切な時間、典型的には数分から２日間が経過するのを待つ。一般に、この基質は、腫瘍脈管系、腫瘍細胞または任意の他の腫瘍成分であり、化合物の局在は、バックグラウンドと比較して標的組織の吸光度を測定することにより追跡できる。最適化を達成後、標的生物学的基質を、５〜７５０mW/cm2の速度で７４０〜８００nm、または５００〜６００nmまたは７００〜９００nmの範囲で、かつ１００〜１０００J/cm2の総エネルギーで、適切なバンドの照射により照射する。
【００４５】
局所治療には、局在化が迅速であり、そして対応する照射は後で提供することができる。エクスビボの生物学的流体の処置には、放射線は、標的組織による最適結合／摂取が達成された後に適用される。放射線フルエンスは、１〜１０J/cm2のオーダーである。組織の浸透は必要ないため、低い総エネルギーを使用できる。
【００４６】
本発明の組成物は、上記と同義の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の少なくとも１つの化合物を、生理学的に許容される担体と一緒に含んでなる。これらの組成物は、液剤、脂質乳剤またはゲル剤の剤型、あるいはリポソームまたはナノ粒子の剤型であってよい。標的基質での本発明の化合物の濃度の最適化を可能にするのに適した担体が選択される。このような担体の例は、特に問わないが、「ツイーン８０」、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ４００、「クレモフォール（Cremophor）ＥＬ」、プロピレングリコール、エタノール、メボウキ油、胆汁酸塩および胆汁酸塩類似体ならびにこれらの混合物である。リポソーム製剤は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロールを基剤としてよい。担体はまた、ジパルミトイルホスファチジルコリンであってよい。
【００４７】
ナノ粒子を使用するとき、これらはＰＥＧコーティングしたポリ（乳酸）ナノ粒子の形態であってよい。脂質乳剤の剤型では、低密度リポタンパク質およびトリグリセリドが通常使用される。
本発明の組成物において、本発明化合物は、組成物総重量の０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５重量％〜５重量％の量である。
【００４８】
本発明を、以下の非限定的な例により説明する。
（例）
【００４９】
例１．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、ＢＣｈｌａから以下の３工程法により調製した。
（ａ）バクテリオクロロフィルａ（ＢＣｈｌａ）の単離
ＢＣｈｌａは、凍結乾燥細菌のロードボルム・スルフィドフィルム（Rhodovolum sulfidophilum）から抽出した。
【００５０】
凍結乾燥細胞（１００ｇ）を粉砕して粉末とし、総量１２５０mlアセトンで５回洗浄して、カロチノイドを部分的に洗浄し、混合物を濾過して、ＢＣｈｌａを無水メタノール（約１２００ml、４〜５回濾過）で固形物から抽出した。濾過後、暗青緑色の溶液を、真空下で部分的に蒸発させ、濃縮溶液（約５００ml）を石油エーテル（沸点８０〜１００℃、約１３００ml）で２〜３回抽出して、さらにカロチノイドを除去し、そして石油エーテル相をメタノール（約５５０ml）で２回抽出した。次に、この相を廃棄して、合わせたメタノール相を真空下で蒸発させ、青緑色の残渣をメタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）に再溶解して、メタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）により平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（３×１０cm）に載せた。ＢＣｈｌａをメタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）で溶出し、メタノール−アセトン混合物を蒸発させて、乾燥Ｂｃｈｌａを正確な容量（吸収スペクトル用）のエーテルに再溶解して、脱脂綿を通して濾過して、溶解したカラム物質を除去した。最後の蒸発後、この固形色素を、アルゴン下で暗所で−２０℃で貯蔵した。抽出収率：１００ｇの凍結乾燥細胞あたり約７００mg ＢＣｈｌａ。
【００５１】
ＤＥＡＥ−セファロースカラムを、以前に報告（オマタ（Omata）とムラタ（Murata）、１９８３年、「ＤＥＡＥ−セファロースＣ１−６ＢおよびセファロースＣ１−６Ｂを用いるカラムクロマトグラフィーによるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびバクテリオクロロフィルａの調製」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０９３−１１００）されたように調製した。簡単に述べると、ＤＥＡＥ−セファロースを蒸留水で洗浄し、次にこれを１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）に懸濁することにより酢酸塩型に変換した。このスラリーをアセトンで３回洗浄し、最後に５℃でメタノール−アセトン（１：３、ｖ：ｖ）に懸濁して貯蔵した。
【００５２】
（ｂ）バクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）の調製
（ａ）で得られるような粗Ｂｃｈｌａ抽出物（少量の残留カロチノイドを含む約１００mgのＢｃｈｌａ）を８０％トリフルオロ酢酸水溶液（１０分間窒素でバブリングしたもの）（約１５ml）に溶解した。この溶液を周囲温度で２時間撹拌した。次に反応混合物を水（２５０ml）に注ぎ入れ、クロロホルムで抽出した。抽出物を水で２回洗浄して、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒の留去後、残渣をシリカのクロマトグラフィー（３cm×１５cmカラム、キーゼルゲル（Kieselgel）６０、メルク（Merck））に供して、段階勾配：２％、５％、１０％、１５％によりクロロホルム中のメタノールで溶出した。最初に、カロチノイドと少量のバクテリオフェオフィチンが洗浄され、次にアロ−バクテリオフェオフィチンとカロチノイドが溶出した。クロロホルム中の１０％メタノールで、生成物が回収され始め、これをＴＬＣ（キーゼルゲル（Kieselgel）、クロロホルム−メタノール、９：１）により追跡した。生成物（６０mg）から溶媒を留去して、残渣をＣＨＣｌ3にとり、ウルトラポア（UltraPore）メンブランを通して濾過して残留シリカを除去した（そうしないと酸化を引き起こしうる）。
【００５３】
（ｃ）バクテリオフェオホルビド（Ｂｐｈｅｉｄ）へのパラジウムの取り込み
（ｂ）で得られるようなＢＰｈｅｉｄ（１００mg）と酢酸Ｐｄ（８０mg）をジクロロメタン（約１０ml）に溶解して、５０mlのメタノール中の２００mgアスコルビン酸ナトリウムの懸濁液に加えた。反応混合物を閉じたフラスコ中で室温で撹拌して、反応混合物からの試料を１５〜１２分毎に回収して、これらの吸光度を記録した。約４時間後、ほとんどの３５７nmのＢＰｈｅｉｄ吸光度が、３３０および３９０nmのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ吸光度により置換された。
【００５４】
反応混合物をクロロホルム／水溶液（２００ml；５０：５０、ｖ／ｖ）中に移して、分液ロート中で振盪した。有機相を回収し、水で洗浄し、無水塩化ナトリウムで乾燥して、蒸発させた。乾燥物質を８０mgの酢酸Ｐｄに加えて、３５７nmの残留吸光度が完全に消滅し、７６５nmの吸光度（最も赤色の転移のピーク）と３３０nmの最大吸光度の間の比が約２．４の値に到達する（クロロホルム中）まで、上記工程を反復した。
【００５５】
乾燥した反応混合物を最少量の２：１クロロホルム：アセトンに可溶化して、アセトンで前もって平衡化したＣＭ−セファロースカラム（１５０mm×２５mm）に載せた。カラムを最初にアセトンで洗浄し、溶出した最初の画分を廃棄した。次にカラムを９：１アセトン：メタノールで洗浄した。２つのバンドが顕著になり、洗い出された−第１のバンドは、主生成物であり、第２のはアロ異性化した副産物であった（廃棄した）。生成物をほぼ乾燥するまで濃縮して、分液ロート中の５０：５０クロロホルム：水系に移した。混合物を完全に振盪して、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム（または塩化ナトリウム）で乾燥して、蒸発乾固した。
【００５６】
例２．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
（ａ）Ｂｃｈｌａの単離
この工程の操作は、上記例１（ａ）と同様に行った。
【００５７】
（ｂ）Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの調製
６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸（２４６mg、５９３μmol）をＭｅＯＨ（８４ml）に溶解して、Ｎ2をこの溶液に通した。Ｂｐｈｅｉｄ（９２mg、１５１μmol）およびＰｄ（ＣＨ3ＣＯＯ）2（８３mg、３７０μmol）をＣＨＣｌ3（３４ml、Ｎ2により脱気）に溶解して、メタノール溶液に加えた。混合物を撹拌して不活性雰囲気下で保持して、数分毎に少量の反応液の吸収スペクトルを記録することにより、反応の進行を追跡した。約３０分後、反応が終了して、溶媒を留去した。
【００５８】
（ｃ）Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの精製
粗Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄをＣＨＣｌ3に溶解して、１５ｇの０．４％−シリカ−Ａｓｃを充填したカラムに載せた。少量のＣＨＣｌ3（約３０ml）をカラムに通して、次にＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（１：９９、約２５０ml）を使用して色素を溶出した。画分の純度をＴＬＣおよび吸光度分光法により測定した。質量分光分析およびＮＭＲ検出は、代表的試料について実施した。収量：８２．５mgの純粋なＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（７６％）。
【００５９】
０．４％−シリカ−Ａｓｃの調製には、アスコルビン酸（２４０mg）を２４０ccのＥｔＯＨ：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（６０：６０：１２０）混合物に溶解した。シリカゲル６０（６０ｇ、メルク（Merck）、カタログ番号１０７７３４、７０〜２３０メッシュ）を加え、このスラリー混合物を１０分間撹拌し、次にポンプで濾過した。帯黄色のシリカ−Ａｓｃ．を最後に約１時間約５０℃で乾燥した。この０．４％−シリカ−Ａｓｃ．は通常のシリカゲルと同様にすぐに使用できる；その性質は極性が低く、わずかに抗酸化性を有する。
【００６０】
例３．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
（ａ）Ｂｃｈｌａの単離
この工程は、上記例１（ａ）と同様に行った。
【００６１】
（ｂ）クロロフィラーゼ（Ｃｈｌａｓｅ）の調製
クロロフィラーゼ（Ｃｈｌａｓｅ）は、メリア・アゼダラク・エル（Melia azedarach L.）、センダンの葉のクロロプラストから調製した。新鮮な葉（５０ｇ）を、−２０℃に冷却した３５０mlのアセトンを含むブレンダー中で２分間粉砕した。このホモジェネートを４層のガーゼで濾過し、濾液を回収して、４℃で一晩放置してさらに沈殿させた。濾過してアセトンを除去し、濾液が無色になるまで、残った粉末を冷アセトンで数回洗浄して、痕跡量のＣｈｌａｓｅとカロチノイドを除去した。Ｃｈｌａｓｅアセトン粉末を最後に凍結乾燥機で乾燥して、−２０℃でさらに貯蔵した。このような条件下で、この酵素調製物は、目立つ活性の消失なしに１年以上安定であった。収率：１kgの葉あたり２０ｇ Ｃｈｌａｓｅを得た。
【００６２】
（ｃ）バクテリオクロロフィリド（ＢＣｈｌｉｄｅ）の合成と精製
アスコルビン酸（７０mg、メルク（Merck））を水（９ml）に溶解し、１０Ｍ ＫＯＨ水溶液を使用して溶液のｐＨを７．７に調整して、１mlの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）を加えて反応中のｐＨを維持した。トリトンＸ−１００（約８０μl）を加えて、０．８％（ｖ／ｖ）の最終界面活性剤濃度を達成した。Ｃｈｌａｓｅアセトン粉末（２００mg）を、この溶液６ml中で、ポリトロン（Polytron）ホモジェナイザーを使用してホモジェナイズした。残った溶液を使用してこの装置を洗浄し、次いでホモジェネートと合わせた。酵素溶液を、アルゴンで飽和した２０mgの固形ＢＣｈｌａと共に音波処理して、暗所で３７℃で６時間撹拌しながらインキュベートした。
【００６３】
精製するために、６時間の反応後、反応物質を直接凍結（−２０℃）し、続いて凍結乾燥した。乾燥残渣をアセトンに溶解して音波処理し、次に溶液を、アセトン中で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに供した。カラムをアセトンで洗浄して、未反応物質を溶出し、次にアセトン中の５％および７％メタノール（ｖ／ｖ）で洗浄して、バクテリオクロロフィリド（Ｂｃｈｌｉｄｅ）およびバクテリオフェオホルビド（Ｂｐｈｅｉｄ）を溶出した。生成物をアセトン中の２５％メタノールで溶出した。溶媒を留去して、固形色素をアルゴン下で−２０℃で暗所で貯蔵した。反応収率：３０〜５５％。
【００６４】
クロマトグラフィーのためのＣＭ−セファロースは、最初にＣＭ−セファロースを水で洗浄し、次にアセトンで３回洗浄し、次いでカラムに充填してアセトン中で平衡化することにより調製した。クロマトグラフィー物質は、無色になるまで２Ｍ ＮａＣｌ水溶液で完全に洗浄し、水で洗浄してアセトン中に再懸濁後、再使用することができた。
【００６５】
（ｄ）バクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）へのパラジウムの取り込み
操作は、上記例１（ｃ）と同じである。乾燥物質のＨＰＬＣにより、２つのエピマー（化学的に同一のもの（全混合物の８８％）と残りのアロ異性体）の形の主生成物が示された。また出発物質ＢＰｈｅｉｄのわずかな（０．５％）混入もあった。
【００６６】
例４．化合物Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
（ａ）吸収スペクトル
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸収スペクトルは、基線に対して標準化したＰＭ検出機を使用するユビコン（UVICON）分光光度計（光路長１cm）により測定した。感度は０．０５である。
【００６７】
アセトンおよびメタノール／リン酸Ｋ緩衝液の混合物中のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの吸収スペクトルは、表１および図１に報告する。
血漿中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸収スペクトルは、７６３nmに赤色側にシフトした。
【００６８】
【００６９】
ｐｉｃ検出では、図１により以下のピークが明らかになった：７５８nm：１．２５０２；５３７nm：０．３２３９；３８４nm：０．５３５１；および３２９nm：０．７７６６。
【００７０】
（ｂ）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄのＨＰＬＣ検出
不純物プロフィールおよびパラジウム−ＢＰｈｅｉｄの量を性状解析するために、逆相ＨＰＬＣ法を開発した。
固相：Ｃ8イナートシル（Inertsil）５μm、２５０×４．６mm
液相：メタノール：リン酸カリウム緩衝液２０mM、ｐＨ＝６．５９（７０％：３０％）
流量：１ml/分
注入量：１００μl
検出：１−スペクトロフロー（Spectroflow）７８３、重水素ランプ：３８５nm
２−スペクトロフロー（Spectroflow）７５７、タングステンランプ：７５３nm
【００７１】
表２に示すように、例３で得られるような生成物Ｐｄ−ＢｐｈｅｉｄのＨＰＬＣ分析は、７個のピークを示した。主要なピークは、全生成物の６４〜７０％に相当した。
【００７２】
−２０℃でアセトン中に貯蔵したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの溶液は、少なくとも２ヶ月間安定であった。ストック溶液を室温で１８時間維持したとき、ＨＰＬＣプロフィールには変化が観察されず、これは、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄが安定な化合物であることを示している。
【００７３】
【００７４】
（ｃ）ＮＭＲによるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
例３により調製したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの精製工程後、主要ピークの百分率は９０％以上であった。この精製は、分取ＨＰＬＣ Ｃ８により行った。この精製した化合物は、ＮＭＲおよび質量スペクトル法による生成物の性状解析のために使用した。
【００７５】
ＮＭＲによるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの分析を行って、化学シフトを表３に列挙した：
−1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲ
−２Ｄ1Ｈ ＮＭＲ（ＣＯＳＹおよびＮＯＥＳＹ）
−２Ｄ1Ｈ−13Ｃ ＮＭＲ（ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ：逆検出）。
【００７６】
【００７７】
（ｄ）質量スペクトル法によるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの質量スペクトル解析により、図２および３に示すスペクトルを得た。これは、低および高分解能で高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）により行った。分光計は、「ザブスペックＴＯＦマイクロマス（ZabSpec TOF Micromass）」分光計；イオン化モード：Ｃｓ+によるＬＳＩＭＳ、ポジティブ、加速：８kV；光源温度：４０℃；使用溶媒：ｍＮＢＡ（メタ−ニトロベンジルアルコール）；入力：ラテラル。
【００７８】
結果：イオンタイプ：Ｍ+；式：Ｃ35Ｈ36Ｎ4Ｏ6 106Ｐｄ；理論：７１４．１６７０ Ｚ：１m/z 理論値７１４．１６７０m/z 実測値７１４．１６８９。
これらの結果により、ＮＭＲ試験：ｍ／ｅ＝７１４を確認し、かつパラジウム金属の挿入を確認した。
ＮＭＲおよび質量スペクトル法により分析される化学構造は、ＢＣｈｌの遊離酸型のパラジウム誘導体であるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄである。
【００７９】
例５．マウスＬ１２１０およびヒトＨＴ２９細胞に対するＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの生物学的活性
（ｉ）細胞株。マウス白血病細胞株（Ｌ１２１０）を、１０％ウマ血清、１mMグルタミン、１mMメルカプトエタノールおよびゲンタマイシンを補足したフィッシャー培地を使用して、懸濁培養で維持した。ＲＩＦ（放射線誘導性線維肉腫（Radiation induced Fibrosarcoma））腫瘍をトウェンティーマン（Twentyman）らにより明記（１９８０年、「終点試験の比較のための新しいマウス腫瘍モデル系（ＲＩＦ−１）」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，６４，５９５−６０４）されたように維持した。培養物は、１０％ウシ胎仔血清およびゲンタマイシンを含むウェイマス（Weymouth's）培地で増殖させた。
ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞は、フェノールレッドを含まず１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。細胞は、０．０２％ ＥＤＴＡ中の０．２５％トリプシンの分散させて継代培養して、１：５分割で再培養した。
【００８０】
（ ii ）インビトロ光毒性。Ｌ１２１０およびＲＩＦ細胞が関与する光毒性の試験のために、１０cmのウォーターフィルタと８５０nmカットオフフィルターで濾過してＩＲを除去した６００ワット石英ハロゲン光源により、光を提供した。干渉フィルター（オリエル（Oriel））により、バンド幅をさらに６６０±５nmまで制限した。懸濁液中（Ｌ１２１０）または直径２４mmのカバーガラスに接着した細胞を、増殖培地（緩衝化能を加えるために、ＮａＨＣＯ3の代わりに２０mMヘペスｐＨ７を含む）中で、記載されたレベルの増感剤の存在下で１５分間インキュベートした。次に細胞を、洗浄して増感剤を含まないようにして、新鮮培地に移した。照射は１０℃で行った。一部の試験用に、次に細胞を蛍光プローブで標識して、光損傷の部位を評価した。他の試験では、次に細胞を新鮮培地中で３７℃で６０分間インキュベートして、アポトーシスを進行させた。生存活性試験は、９６ウェルプレートと７２時間ＭＴＴ測定法を使用して４重測定で行った。
ＨＴ２９モデルでは、細胞を異なる濃度のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄと共に１時間インキュベートして、ハロゲンランプまたはチタンサファイアレーザーにより３００mW/cm2で１０および２５J/cm2で照射した。
【００８１】
（ iii ）細胞生存活性。生存細胞は、９６ウェルプレートに１，０００〜５０，０００個の細胞を塗布した３日後に、ＭＴＴ反応により評価した。色強度は、可変数の対照細胞を含む標準曲線と比較した。ｘ nmでの吸光度は、バイオラッド（BioRad）プレートリーダーにより測定した。Ｌ１２１０では、次の３日間も新鮮培地中の増殖が可能であり、ＭＴＴ測定法を使用して細胞数を同様に推定した。
【００８２】
（ iv ）リポタンパク質結合：対照ヒト血漿のタンパク質およびリポタンパク質へのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの結合を測定した。２５０μl血漿試料を３μMの化合物と３７℃で３０分間のインキュベーション。次に、リポタンパク質およびタンパク質成分を密度勾配遠心分離機により分離した。勾配を分画し、画分を３mlの１０mMトリトンＸ−１００界面活性剤中に希釈するか、または７５０〜８００nmの蛍光を４００nmで励起して測定した。
【００８３】
結果
（ｖ）Ｌ１２１０細胞に及ぼすＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性効果
Ｌ１２１０マウス白血病細胞を、１μＭ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄと共に３７℃で３０分間インキュベートすると、７６０±５ｎｍで７５ｍＪ／ｃｍ2線量の光を使用して５０％の細胞死滅が起きた。ＲＩＦ株中の同程度の細胞死滅には、２１５ｍＪ／ｃｍ2の光量を必要とした。
【００８４】
（ vi ）ＨＴ２９細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性作用
ＨＴ２９細胞を、光無しでＰｄ−ＢＰｈｅｉｄと共にインキュベートするとき、生存率は１００％と７９％の間で変化した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの濃度が高くかつ供給エネルギーの量が上昇したとき、細胞の生存率は低下した。５０％死亡率（ＬＤ50とも呼ばれる）を引き起こすＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ光増感剤用量は、２５Ｊ／ｃｍ2の照射下では４８μＭであった。最も重要な光毒性を誘導する励起波長は、７７３nmであった。
【００８５】
（ vii ）光損傷の部位。マウス白血病Ｌ１２１０細胞を使用すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、非常に特異的なミトコンドリアの光増感剤であり、原形質膜やリソソームに対する光損傷は検出されなかった。このような結果は、迅速なアポトーシスの開始に関係付けられている。
（ viii ）血漿リポタンパク質結合。実施した試験は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが、ヒト血清のＨＤＬ＞ＬＤＬ＞＞＞アルブミン画分に結合したことを示しており、ＰＤＴ選択性の１つの決定因子であると考えられた。
【００８６】
例６．Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの製剤：動物実験に使用される溶媒中のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの溶解度と安定性
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの溶液は、０．０５〜２％の濃度をうるために異なる製剤に調製した。
【００８７】
（ａ）クレモフォール製剤は、以下のように調製した：溶液が完全に粒子を含まなくなるまでバイアルをゆっくり回転するか、あるいは音波発振器プローブの短いパルスを使用して、４０ｍｇのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを、乾燥チューブ中で２mlのクレモフォールＥＬに溶解した。温度が３０℃を超えないように、チューブを冷却した。薬物を可溶化後、０．６ｍｌのプロピレングリコールを加え、再度ゆっくり回転するかまたは音波プローブを用いて混合した。次に等張性ＮａＣｌを０．１ｍｌずつ、総量４ｍｌになるまで加えた。混合物は、各添加後、沈殿の形跡なく清澄である。温度を２５〜３０℃より低く保持するように注意しながら、各ＮａＣｌ ０．９％の添加後、組成物を音波プローブで処理した。薬物の濃度は、エタノールへの希釈後、７５７ｎｍの吸光度を測定して評価した。
２０ｍｇ／ｋｇのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを実験に使用するとき、これは２０グラムのマウスでは０．４ｍｇであった。０．１ｍｌを超えるクレモフォールを尾静脈には注入できないため、薬物濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。
【００８８】
（ｂ）修飾クレモフォール製剤を以下のとおり調製した：５ｍｇ／ｍｌのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．４ｍｌのクレモフォールＥＬと混合した。溶解後、０．１２ｍｌのプロピレングリコールを加えた。次に等張性食塩水（１．４８ｍｌ）を少量ずつ加え、各添加後にこれを混合した。最終溶液は完全に清澄であり、粒子を含まなかった。必要に応じて氷浴で冷却することにより溶液を２５℃未満に保持しながら、薬物の溶解を助けるために超音波プローブを使用した。
クレモフォール溶液中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ濃度の測定は、メタノールへの希釈により行った。吸収スペクトルは、７４０〜７８０ｎｍにわたって測定した。ピーク値は、既知濃度のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄからの結果と比較した。
（ｃ）ツイーン８０とエタノールを使用してＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを可溶化（１ｍｇ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ／ｍｌ溶液）して、追加の製剤を調製した。
【００８９】
例７．インビボ毒性試験−マウス腫瘍モデルに対するＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの作用
マウス腫瘍モデルを含む２セットの実験を使用して、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの光毒性を評価した。
【００９０】
（ａ）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの光動力学的応答性は、最初に２つのマウス腫瘍モデルで評価した：ＢＡ−乳腺腫および放射線誘導性線維肉腫（ＲＩＦ−１）。
光動力学的治療パラメーター：直径５〜７mmの腫瘍をもつマウスをＰＤＴ実験に参加させた。３種のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ薬物用量（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ）および２種の光量（１００および３００ジュール／ｃｍ2）を評価した。クレモフォールに溶解したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの製剤は、尾静脈内注射により投与した。ＰＤＴ光暴露は、注射の１５分、１時間または４時間後のいずれかに開始した。当初の結果が、致死毒性または不応答を示さなければ、３匹のマウスを各処理条件下で処理した。７５７ｎｍに合わせたチタンサファイアレーザーを、ＰＤＴの光源として使用した。レーザー発生光は、腫瘍への光の送達のために水晶繊維中にカップリングさせた。７５mW/cm2の光出力密度を使用した。ＰＤＴ処理後１週間に３日、腫瘍のサイズを測定して、腫瘍治癒（処理後４０日間腫瘍再発が無いとして定義）の百分率を測定した。
【００９１】
インビボＰＤＴ応答：本明細書に後述の表４および５は、ＢＡ乳癌またはＲＩＦ−１繊維肉腫のいずれかを移植したＣ３Ｈマウスに関するＰＤＴ処理結果を要約する。各表は、以下のパラメーターを示す：１）ｍｇ／ｋｇで表される静脈内投与薬物用量；２）総光量（Ｊ／ｃｍ2）、波長（７５７ｎｍ）、光量率（ｍＷ／ｃｍ2）、および時間間隔（各群の処理の間）を含む、レーザー処理パラメーター、４）毒性（処理後まもなく４匹のマウスが死亡）、５）腫瘍再生（ＰＤＴ処理と腫瘍再発の間の日数からなる）、および６）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ＰＤＴが誘導した腫瘍治癒のマウスの数（および百分率）。
【００９２】
本明細書に示されるように、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴは、２つのマウス腫瘍モデルにおいて、古典的および効率的な殺腫瘍性応答を誘導することが見い出された。ＰＤＴが介在する腫瘍応答性は、薬物用量、光量および薬物投与と光処理の間の時間間隔に、正相関した。具体的には、高薬物用量および／または高光量により応答が増強した。ＢＡ乳癌は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴに対して、ＲＩＦ−１繊維肉腫の同等なＰＤＴ処理よりも応答性が高いことが見い出された。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴは、薬物投与の１時間以内に光処理を開始したときに有効であり、薬物投与と光処理の間に４時間の間隔をあけると有効でなかった。
【００９３】
（ｂ）第２セットの実験では、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性を、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌を移植したマウス腫瘍モデルにおいて評価した。
動物と腫瘍モデル：死亡直後にドナーマウスから取り出した固形腫瘍組織（直径２ｃｍ）を、１ｍｌの０．９％食塩水中で機械的に破砕して、この溶液（０．１ml）を各マウスの一方の後肢に皮下注射した。腫瘍直径が８〜１０ｍｍであるときマウスを実験に含めた。腫瘍は、実験の１０日前に８週齢のスイスヌードマウスに皮下移植した。
【００９４】
光毒性試験：０．１５ｍｌ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを１５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。マウスを、照射直前に４０ｍｇ／ｋｇのチオペンタールで麻酔した。注射の３０分、１時間、４時間または２４時間後、マウスをチタンサファイアレーザーで３００ｍＷ／ｃｍ2で照射して、２００または３００Ｊ／ｃｍ2を得るように照射時間を調整するため平均直径を測定した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを注射しなかった対照マウスも同じ条件下で照射した。ＰＤＴにより誘導される腫瘍増殖の遅延を、実験的放射線療法において実現した試験との同等性により分析した。インビボ試験および各別個の実験について、全ての結果は、２回または３回の別個の実験の平均であり、そして各別個の実験、各実験条件につき２匹のマウスを使用した。
【００９５】
腫瘍増殖試験に関して、結果は腫瘍指数変動として表し、標準（＝１）は非処理細胞の腫瘍指数に対応する。腫瘍指数は、以下のように計算した：
腫瘍指数＝（最大腫瘍直径＋垂直な反対側の直径）／２
温度変動試験：熱作用が過度でないことを確信するために、ハロゲンランプおよびチタンサファイアレーザー照射について、非吸収性アルミン埋め込みマイクロ熱電対を使用して温度変動を測定した。
【００９６】
この実験の結果は、以下のとおりである：
（ｉ）２００Ｊ／ｃｍ2での７６３ｎｍ照射
腫瘍増殖の低下（対照との比較）が、注射の３０分および４時間後の条件について観察された。腫瘍指数の低下は、注射の１時間および２４時間後の条件について７日目まで観察された。
（ii）３００Ｊ／ｃｍ2での７６３ｎｍ照射
腫瘍増殖低下が、注射の３０分および２４時間後の条件について観察された（対照との比較）。腫瘍指数の低下は、注射の１時間および４時間後の条件について７日目まで観察された。
（iii）注射の１時間後３００Ｊ／ｃｍ2照射
腫瘍増殖低下が、７７３ｎｍの条件について５日目まで、そして７５３ｎｍおよび７６３ｎｍの条件について１２日目まで観察された（対照との比較）。最大腫瘍増殖低下は、７６３ｎｍについて観察された。
（iv）注射の２４時間後３００Ｊ／ｃｍ2照射
腫瘍増殖低下が、７５３ｎｍの条件について４日目まで、そして７６３ｎｍおよび７７３ｎｍの条件について１２日目まで観察された（対照との比較）。最大腫瘍増殖低下が、７７３ｎｍについて観察された。
マウスのハロゲンランプまたはチタンサファイア照射の間中、過度の温度変動は観察されなかった。
【００９７】
本試験を要約すると、照射の最適な波長は、７７３ｎｍであることが見い出された。注射と照射の間の遅延は、腫瘍応答に影響を及ぼした。７６４ｎｍでは、１時間の遅延が最も有効であることがわかった。７７３ｎｍ波長を使用するとき、最も有効な遅延は２４時間であった。
【００９８】
【００９９】
【０１００】
例８．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒベースのＰＤＴ後のＡ４３１ヒト 上皮カルチノイド細胞の形態学的評価
この実験は、Ａ４３１ヒト上皮カルチノイド細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−Ｓｅｒベースを用いるＰＤＴ後に起きる時間非依存性形態学的変化を調べるために行った。
【０１０１】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは上記例１のように調製し、セリンメチルエステルＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅは、ＥＰ５８４５５２のように調製した。
【０１０２】
（ ii ）光源：ハロゲンランプ（オスラム（Osram）、ドイツ、１００Ｗ）、４．５cmのウォーターフィルタと＞６５０nmのカットオフフィルターを有する。１５mW/cm2で９J/cm2の総エネルギーフルエンスで、細胞に１０分間照射した。照射のために、培養プレートをガラステーブルの上に置いて、下から光をあてた。
【０１０３】
（ iii ）光毒性試験：３cmのプレートに二重測定でＡ４３１細胞（５×１０4 細胞）を接種し、ヘペス（２５mM、ｐＨ７．４）で緩衝化し、胎児牛血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（０．０６mg/ml）とストレプトマイシン（０．１mg/ml）を有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋Ｆ１２（１：１）中で７５％コンフルエンスになるまで培養した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−Ｓｅｒを、対応するＬＤ90濃度（それぞれ０．１と１μＭ）で細胞に加えた。４時間後、細胞を培地で洗浄し、上記光源で細胞に照射した。コンタックス（Contax）３５mmＳＬＲカメラと取り付けたツァイスアキシオベルト（Zeiss Axiovert）−３５光学顕微鏡（倍率×３２０）を使用して、照射後の異なる時点（ＰＤＴ後０，０．５、４および２４時間）で位相差顕微鏡観察を行った。二重測定の２枚目のプレートで、ニュートラルレッド生存アッセイ（ザング・エス・ゼット（Zhang SZ）、１９９０， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ６（２）：２１９−２３４）を使用して、ＰＤＴの２４時間後に、細胞の生存活性を評価した。
【０１０４】
（ iv ）結果：両方の増感剤は、細胞形態に大きな変化を引き起こした。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、細胞膜を急速に（３０分）変化させ、細胞は急速に縮み、繊維性結合が形成され、細胞膜を元々の局所的接着点（繊維性表現型）と接続した。４時間後に、細胞の９０％はその内容量のほとんどを失い、その大部分はプレートから離れ、２４時間以後はそれ以上の変化は観察されなかった（図４、右欄）。ＢＣｈｌ−Ｓｅｒは、異なるパターンの時間依存性形態変化を示し、これは４時間以後にのみ観察することができた。膜ブラビング（blabbing）は、細胞膜から出芽する黒い小胞として見られた。２４時間を超えて大きな容量の低下は観察されず、この期間の後ほとんどの細胞はプレートに結合していたが、中空に見えた（ブラビング（blabbing）表現型、図４、左欄）。照射の２４時間後、ニュートラルレッド生存アッセイを行って、両方の実験群で９０±７％の細胞死滅を確認した。図４では、右欄に繊維性表現型を示し、左欄にブラビング（blabbing）表現型を示す。実線の白い矢印は、繊維またはブラブ（blab）の形成を示す。
【０１０５】
例９．ヒト膀胱癌細胞株ＥＣＶ３０４に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光細胞毒性
この実験は、ＥＣＶ３０４ヒト膀胱癌細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光細胞毒性の作用を評価するために行った。
【０１０６】
（ｉ）材料：例８（ｉ）と同じ。
（ ii ）光源：例８（ii）と同じ。
【０１０７】
（ iii ）光毒性試験：ＥＣＶ３０４細胞（２×１０4 細胞／ウェル）を、９６ウェル中のペニシリン（０．０６mg/ml）とストレプトマイシン（０．１mg/ml）を有するＭ−１９９、１０％ＦＣＳ中でコンフルエンス（約２×１０5 細胞／ウェル）になるまで培養した。増加する濃度のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅを細胞とともに４時間インキュベートし、次に新鮮な培地で洗浄し、上記セクション１に記載のように照射した。照射の２４時間後、ニュートラルレッド生存アッセイを用いて細胞の生存活性を評価した。以下の対照を使用した：光対照：照射したが増感剤で処理しなかった細胞。暗対照：非照射細胞であり、暗所で増感剤で処理した細胞。未処理対照：増感剤で処理しない非照射の細胞を、１００％生存活性の計算のために使用した（ローゼンバッハ−ベルキン・ブイ（Rosenbach-Belkin Ｖ)ら、１９９６，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ６４（１）：１７４−１８１)。
【０１０８】
（ iv ）結果：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅは両方とも、ＥＣＶ３０４細胞に対して用量依存性かつ光依存性の細胞毒性を示した（図５）。対応するＬＤ50は１９および１０００nMであった。ＰＤＴ後の形態変化は、Ａ４３１細胞を用いて観察されたものと一致した（データは示していない）。
【０１０９】
例１０．Ｍ２Ｒマウス黒色腫細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルのＰＤＴ：
この実験の目的は、Ｍ２Ｒ細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルの作用を試験することであった。
【０１１０】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは上記例１のように調製し、Ｐｄ−バクテリオフェオフォルビドａエチルエステル（Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステル）は、ＷＯ９７／１９０８１に記載のように調製した。
【０１１１】
（ ii ）光源：上記例８（ii）と同じであるが、細胞は、１２mV/cm2で全部で７J/cm2のエネルギーフルエンスで１０分間照射した。
【０１１２】
（ iii ）光毒性試験：Ｍ２Ｒ細胞は、ヘペス（２５mM、ｐＨ７．４）で緩衝化したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋Ｆ１２（１：１）中で単層として培養した。胎児牛血清（ＦＢＳ）（１０％）、グルタミン（２mM）、ペニシリン（０．０６mg/ml）およびストレプトマイシン（０．１mg/ml）を含有させ、細胞を８％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気で３７℃で増殖させた。光毒性解析のために細胞（１×１０4細胞／ウェル）を、９６ウェル中で２４時間培養して、約２×１０4細胞／ウェルの濃度にした。色素を直接、培地または９５％エタノール中に溶解し、培地中でさらに希釈して最終濃度を１％エタノールとした。希釈した色素を加え、細胞を暗所で４時間３７℃でインキュベートした。照射の前に、細胞を１回洗浄し、新鮮な培地で置換した。次にプレートに底から１０分間室温で照射し、３７℃で暗所で培養インキュベーター中に入れた。２４時間後に細胞生存活性を測定した。以下の対照系を使用した：暗対照：暗所に維持した未処理細胞；光対照−増感剤で処理しなかったが照射した細胞。暗毒性：色素で処理したが、暗所に維持した細胞。細胞生存活性は、既に記載されているように（ＷＯ９７／１９０８１）［3Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。
【０１１３】
（ iv ）結果：図６Ａから明らかなように、色素を９５％エタノールに溶解すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄはＬＤ50が０．０３μＭになり、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルはＬＤ50が０．０７μＭになった。色素を、１０％血清含有培地に直接溶解すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄのみが充分な活性があり、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルは１μＭ（試験した最高濃度）までまったく活性が無かった（図６Ｂ）。
【０１１４】
例１１．Ｍ２Ｒマウス黒色腫とヒトＨＴ２９結腸癌細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄのＰＤＴ
これらの実験は、２つの細胞株（Ｍ２Ｒマウス黒色腫とヒトＨＴ２９結腸癌細胞）に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性作用を測定することが目的であった。
【０１１５】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、上記例１のように調製した。
（ ii ）光源：光源は、１０cmのウォーターフィルタと７２０〜８５０nmの光バンドを有するキセノンフッ素ＬＳ３−ＰＤＴランプ（バイオスペック（Bio-Spec)、ロシア）であった。１２mW/cm2で７J/cm2の総エネルギー量で、細胞に１０分間照射した。
【０１１６】
（ iii ）光毒性試験：上記と同じプロトコール（例１０）に以下の変更を加えて解析を行った：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、１０％血清含有培地中に直接溶解し、次に細胞に加えた。Ｍ２Ｒ細胞の生存は、［3Ｈ］−チミジン取り込みにより測定し、ＨＴ２９細胞の生存はＭＴＴアッセイ（マーリン，ジェイ・エル（Merlin JL）ら、１９９２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２８Ａ：１４５２−１４５８）により測定した。
【０１１７】
（ iv ）結果：図７から明らかなように、ヒト結腸ＨＴ−２９細胞は、この色素に対して低い感受性（ＬＤ50が０．５μＭ）を示し、一方Ｍ２Ｒ細胞は、約１０倍感受性が高かった（ＬＤ50が０．０３μＭ）。
【０１１８】
例１２．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のインビボＰＤＴ
この実験の目的は、２．５mg/kgのＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄを用いてＣＤ１ヌードマウス中のＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを試験することであった。
【０１１９】
（ｉ）材料：Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄは、上記例１のように調製した。
（ ii ）マウス：ＣＤ１ヌードマウス（２５〜３０ｇ）。
（ iii ）麻酔：５０μlのケタミン／ルンポン（Rumpon）の腹腔内注入（容量／容量＝８５／１５）。
（ iv ）腫瘍移植：マウスの背中に１０6 個のＭ２Ｒ細胞を移植すると、２〜３週間以内に腫瘍は治療サイズ（７〜８mm）まで増大した。
（ｖ）光源：λ＝６５０〜９００mnスペクトルウィンドウを取り付けたオスラム（Osram）１５０Ｗハロゲン写真感光ランプ６４６４３（ディー・ケー・ケラー（D.K. Keller）ら、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ １５， ４６７−４７４）。照射は３０分間行った。
（ vi ）ＰＤＴプロトコール：麻酔したマウスに、色素を静脈内注射し、腫瘍に直ちに照射した。治療の最後にマウスをケージに戻した。記載の時間前およびその時間に腫瘍の写真を撮った。
【０１２０】
実験１：
増感剤の調製：２mgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．２５mlのクレモフォール（cremophor）ＥＬに溶解し、次に２０分間音波処理した。０．０７５mlの１，２−プロピレングリコールを加え、さらに１５分間音波処理を続けた。試料を１３，０００rpmで１２分間遠心分離した（エッペンドルフ）。クロロホルム中のスペクトルベースのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの最終計算濃度は、０．５mg/mlであった。
【０１２１】
腫瘍のＰＤＴ：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ２．５mg/kgを、Ｍ２Ｒ黒色腫を有するＣＤ１−ヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍に、３００mWcm-2で３０分間照射した。マウスの皮膚腫瘍領域の温度は、３７．７〜３８℃であった。腫瘍の応答は、治療後１日および４日間追跡した。結果を図８に示す。
【０１２２】
実験２：
増感剤の調製：２mgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．１mlのメタノール、０．１mlの０．１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4 （ｐＨ＝８．０）、および０．９mlのＰＢＳに溶解し、１０分間音波処理した。メタノールをアルゴンで蒸発させ、２０％のクレモフォール（cremophor）ＥＬ：１，２−プロピレングリコール（３：１）を加え、１５分間音波処理した。試料を１３，０００rpmで８分間遠心分離し、クロロホルム中のスペクトルベースのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの最終計算濃度は、０．５mg/mlであった。
【０１２３】
腫瘍のＰＤＴ：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ２．５mg/kg（１２０μl）を、Ｍ２Ｒ黒色腫を有するＣＤ１−ヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍組織に、３００mWcm-2で３０分間照射した。マウスの皮膚腫瘍領域の温度は、３７．７〜３８℃であった。腫瘍の応答は、治療後１日および４日間追跡した。結果を図９に示す。
【０１２４】
結果：図８と図９に示すように、上記した２．５mg/kgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＭ２Ｒ黒色腫のＰＤＴは、２４時間以内に腫瘍の壊死を伴う重症の炎症応答を誘導する。
【０１２５】
例１３．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄベースのＰＤＴはマウスのＣ６神経膠腫転移形成速度を低下させる：手術に対する利点
これらの実験は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅベースのＰＤＴの治療可能性と、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅベースのＰＤＴによる転移拡大の確率を比較するために行った。
【０１２６】
（ i ）材料：２０％クレモフォール（cremophor）ＥＬ中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（例１と同様に調製した）またはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ ５mg/kg。
（ ii ）光源：光源は、１０cmのウォーターフィルタと７２０〜８５０nmの光バンドを有するキセノンフッ素ＬＳ３−ＰＤＴランプ（バイオスペック（Bio-Spec)、ロシア）であった。
（ iii ）マウス：ＣＤ１ヌードマウス。
（ iv ）腫瘍：マウスの後ろ足に１０6 個のＣ６神経膠腫細胞を移植した。７〜８mmの大きさになった時、腫瘍を治療した。
（ｖ）麻酔：５０μlのベタラール（Vetalar）／ルンポン（Rumpon）（容量／容量＝８５／１５）。
（ vi ）鎮痛薬：治療（切断またはＰＤＴ）の１週間、５％ショ糖飲料水にオキシコドン（１２mg/l）を加えた。
【０１２７】
（ vii ）プロトコール：３群（各群１０匹のマウス）に、５mg/kgの増感剤（Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ）を静脈内注射し、直ちに２００mW/cm2で３０分間照射し、動物をケージに戻した。第１群と第２群：それぞれ、ＰＤＴ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを投与した動物。鼠径部の腫瘍応答と転移形成を、４週間追跡した。第３群：足根関節で切断した動物（第１群と対）で、鼠径部の転移形成を４週間追跡した。ＰＤＴに対する応答のパラメータは、処理した動物の総数のうちで、腫瘍の壊死と消失を有する動物のパーセントである。転移は鼠径部または他の部位で腫瘍が出現することにより明らかになった。終点と考えたものは、４週間の追跡、自然の死亡、腫瘍の直径が２cmに達した、転移のうちの、いずれか最初のもの。
【０１２８】
（ viii ）結果：腫瘍の平坦化（消失）の結果を、図１０に示す。１１日目は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄに対する応答は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅに対する応答より大きく（それぞれ１００％と８０％の腫瘍平坦化）、以後（２８日目）は、応答パーセントは約６０％で同様であった。長期間の腫瘍平坦化の減少は、おそらく光の領域と腫瘍領域が一致しないことにより、処理した動物の一部で腫瘍が再生したためである。転移出現の結果は、図１１に示す。足の切断手術は、ＰＤＴに比較して実質的に高い転移のパーセントを示した（７８％まで）。さらに切断後は、転移がはるかに早く現れた。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＰＤＴ後の転移の頻度は、最も低かった（２３％まで）。この結果は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを用いて得られたものに類似しており、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの主要な利点は、転移出現が遅延することである。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを用いるＰＤＴは、Ｃ６神経膠腫に対して治療的である。ＰＤＴ後の転移形成は、手術と比較すると実質的に低い。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アセトンとメタノールの混合物／リン酸Ｋ緩衝液中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸光スペクトルを示す。
【図２】 高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）（ＦＡＢ−ＭＳ）により行われたＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの低分解能質量スペクトルを示す。
【図３】 高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）（ＦＡＢ−ＭＳ）により行われたＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの高分解能質量スペクトルを示す。
【図４】 ＰＤＴ後のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅによる、Ａ４３１細胞の時間依存性の形態変化を示す［図において、Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒは、ＢＣＨＬ−ＳｅｒＯＭｅ、ＢＣｈｌのセリルメチルエステルを表す］。
【図５】 ＥＣＶ−３０４細胞について試験したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光毒性を示す。
【図６】 Ｍ２Ｒマウス黒色腫培養細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルの光毒性を示す。（Ａ）９５％エタノールに溶解し、さらに培地＋１０％血清で、１％エタノールまでの表示される濃度まで希釈した色素。（Ｂ）培地＋１０％血清に直接溶解した色素。
【図７】 Ｍ２Ｒマウス黒色腫培養細胞およびヒトＨ２９結腸癌培養細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性を示す。
【図８】 クレモフォール（Cremophor）に溶解して塩溶液で希釈したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（２．５mg/kg）を用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを示す。
【図９】 塩溶液に溶解してクレモフォール（Cremophor）で希釈したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（２．５mg/kg）を用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを示す。
【図１０】 Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ［図では、Ｐｄ−Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒ］を用いるＰＤＴ後の原発性Ｃ６神経膠腫の治癒を図解する。
【図１１】 手術（切断）後またはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄもしくはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ［図では、Ｐｄ−Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒ］を用いるＰＤＴ後の、ＣＤ１ヌードマウスにおけるＣ６神経膠腫転移の出現を示す。
（発明の分野）
本発明は、パラジウム置換バクテリオクロロフィル誘導体、その製造方法および中間体、ならびにこれらを含む医薬組成物、さらにはインビボ光動力学的療法および診断、ならびにウイルスおよび微生物のインビトロ光動力学的死滅の分野におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
（略語の定義）
ＢＣｈｌ＝バクテリオクロロフィルａ（１７3位にフィチルまたはゲラニルゲラニル基、１３2位にＣＯＯＣＨ3基、１３2位にＨ原子、３位にアセチル基、そして８位にエチル基を有する、Ｍｇ含有７，８，１７，１８−テトラヒドロポルフィリン）。
ＢＣｈｌｉｄｅ＝バクテリオクロロフィリドａ（ＢＣｈｌａから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
ＢＰｈｅ＝バクテリオフェオフィチンａ（中心Ｍｇ原子が、２個のＨ原子により置換されている、ＢＣｈｌ）。
ＢＰｈｅｉｄ＝バクテリオフェオホルビドａ（ＢＰｈｅから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ＝Ｐｄ−バクテリオフェオホルビドａ（中心Ｐｄ原子、１３2位にＣＯＯＣＨ3基、１３2位にＨ原子、３位にアセチル基、そして８位にエチル基を有する、ＢＰｈｅから誘導されたＣ−１７2−遊離カルボン酸）。
【０００３】
明細書を通して、バクテリオクロロフィル誘導体のＩＵＰＡＣの番号付けが使用される。この命名法を使用すると、天然バクテリオクロロフィルは、１３2位と１７2位に２個のカルボン酸エステルを有するが、１３3位と１７3位でエステル化されている。
【０００４】
（発明の背景）
癌治療のための光増感剤の利用への関心が高まってきている。光動力学的療法（photodynamic therapy）（ＰＤＴ）として知られている、この方法により、例えば、光増感剤を腫瘍に適用して、インサイチューの光感作によって、悪性細胞を中毒させる化合物が生じる。
【０００５】
ポルフィリンおよび関連化合物を使用する光動力学的療法は、かなり長い歴史を有する。１９４０年代の初期の研究は、ポルフィリンによって、照射腫瘍組織が蛍光を発光できたことを証明した。ポルフィリンは、これらの組織に蓄積してインサイチューで光を吸収でき、従って蛍光の位置から腫瘍を検出する手段が与えると思われた。検出と治療の両方に光動力学的処置の初期段階において広く使用された調製物は、ヘマトポルフィリン誘導体のＨｐＤ、またはリプソン（Lipson）と共同研究者らによりＪ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９６１）２６：１−８に報告されたように調製されるリプソン（Lipson）誘導体とも呼ばれる、ヘマトポルフィリンの粗誘導体であった。この調製物を使用して熱心に研究が行われ、ドアティー（Dougherty）と共同研究者らは、悪性腫瘍の治療におけるこの誘導体の使用を報告した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９７８）３８：２６２８−２６３５；Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９７９）６２：２３１−２３７）。
【０００６】
ドアティー（Dougherty）と共同研究者らは、凝集重量＞１０kdであるＨｐＤの一部である、より有効な型のヘマトポルフィリン誘導体を調製した。光動力学的療法において有用なこの型の薬物は、米国特許第４，６４９，１５１号の主題であり、市販されており、そして臨床試験中である。
【０００７】
光吸収性化合物（特にポルフィリンに関連する化合物）の使用の一般的原則は、全身投与されるときの腫瘍の治療法として十分に確立している。正常組織ではなく腫瘍を破壊するこれらの試料の鑑別能力は、この悪い細胞に対するこれらの調製物のホーミング効果によっている。（例えば、ドアティー，ティー・ジェイ（Dougherty, T.J.）ら、「癌：腫瘍学の原理と実際」（"Cancer: Principles and Practice of Oncology"）（１９８２）、ブイ・ティー・デヴィータ・ジュニア（V.T. de Vita, Jr.）ら編、１８３６−１８４４頁を参照のこと）。抗体にヘマトポルフィリンを結合させて、ホーミング能力を改善する試みが行われている。（例えば、ミュー，ディー（Mew, D.）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）１３０：１４７３−１４７７を参照のこと）。細胞を死滅させるこれらの薬物の機序は、照射による一重項酸素の形成に関与していると考えられる（ワイスハウプト，ケー・アール（Weishaupt, K.R.）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７６）ｐｐ．２３２６−２３２９）。
【０００８】
局所投与を利用する皮膚疾患の治療においてヘマトポルフィリン誘導体またはその活性成分を使用することも、米国特許第４，７５３，９５８号に記載されている。さらに、細菌やウイルスのような感染性生物を含む生物学的試料を滅菌するために、この薬物が使用されている（マシューズ，ジェイ・エル（Matthews, J.L.）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（１９８８）：８１−８３）。例えば、米国特許第４，７２７，０２７号に記述されているように、種々の他の光増感性化合物もこの目的に使用されている。
【０００９】
一般に、インビボとインビトロの両方で生物学的基質の機能を選択的に傷害するために、種々の構造の放射線増感剤を使用する方法は、当該分野において理解されている。これらの方法に有用な化合物は、傷害または破壊すべき標的である生物学的基質に対する鑑別的親和性を有する必要があり、かつ照射された薬物は、近接した組成物および物質に有害な作用を有する方法で活性化されるように、光を吸収できる必要がある。
【００１０】
治療薬および診断薬の性能を最適化することは常に望ましいため、治療および診断において伝統的に使用されるポルフィリン薬物の改変が探求されている。フタロシアニン類、ソラレン関連化合物、および一般に共鳴系を伴う多環式化合物を含む多くの一般的分類の光増感剤が指摘されている。本明細書に開示される化合物と最も類似しているものは、その光動力学的療法における使用が、日本メタフィジックス社（Nihon Metaphysics Company）のＥＰＯ出願２２０６８６号に記載されている種々のフェオホルビド誘導体；タマセイカヤク株式会社（Tama Seikayaku, K.K.）の日本出願Ｊ８５／０００９８１号に記載されている、この目的のためのフェオホルビドのエチレンジアミン誘導体、および１０−ヒドロキシフェオホルビド−ａに関する日本出願Ｊ８８／００４８０５号である。さらに、ビームズ，イー・エム（Beems, E.M.）らは、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）４６：６３９−６４３において、光増感剤としてのバクテリオクロロフィル−ａの２つの誘導体：バクテリオクロロフィリン−ａ（バクテリオクロロフィル−ａにおいて誘導体化されるフィチルアルコールを欠いている、バクテリオフェオホルビド−ａとしても知られている）およびバクテリオクロリン−ａ（フィチル基とＭｇイオンの両方を欠いている）の使用を開示している。著者らは、これらの誘導体はバクテリオクロロフィル−ａに比較して水溶性が増強されていて有利であるため、注目している。
【００１１】
ＥＰ５８４５５２およびＷＯ９７／１９０８１（両方とも、イェダ研究開発社（Yeda Research and Development Co. Ltd.））は、クロロフィルおよびバクテリオクロロフィル誘導体、ならびにこれらのＰＤＴ薬物としての使用、ならびに金属化バクテリオクロロフィル、およびそれぞれ対応するＣｄ−ＢＣｈｌ誘導体の金属交換反応によるこれらの製造法を記載している。
【００１２】
特定の標的および特定の情況に最適な、光動力学的療法および診断に有用な適切な光増感剤を見い出すための問題が残っている。すなわち、本発明は、特別な治療および診断情況で使用するための候補群の一部となる、追加的な一群の光増感性化合物を提供する。
【００１３】
（発明の要約）
本発明により、以下の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”（ここで、以下に定義されるＡは、効率的な血漿移行および細胞膜貫通を可能にする置換基を表す）の化合物は、ＰＤＴ薬物として有用であり、そして既知化合物に比較して、溶解度、安定性および／または効力が増強しているという利点を示す。
すなわち、本発明は、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”：
［式中、
Ａは、ＯＨ、
ＯＲ1、
−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−Ｓ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−ＮＨ−（ＣＨ2）n−Ｙ、
−Ｏ−（ＣＨ 2 ） 2 −ＯＨ、
−ＮＨ−（ＣＨ 2 ） 2 −ＮＨ−ＢＯＣまたは
−Ｎ−（ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）2を表し、
Ｒ1は、Ｎａ+、Ｋ+、（Ｃａ2+）0.5、（Ｍｇ2+）0.5、Ｌｉ+、ＮＨ4 +、
+ＮＨ3−Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3、+ＮＨ3−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨ、
+ＮＨ2（ＣＨ3）−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは
+Ｎ（Ｃn'Ｈ2n'+1）4を表し；
Ｒ2は、化合物が式Ｉの場合はＨ、ＯＨまたはＣＯＯＲ4を表し、ここでＲ4は、Ｃ1−Ｃ12アルキルまたはＣ3−Ｃ12シクロアルキルであり、あるいは化合物が式Ｉ’の場合はＨを表し；
Ｒ3は、化合物が式Ｉの場合はＨ、ＯＨまたはＣ1−Ｃ12アルキルもしくはアルコキシを表し、あるいは化合物が式Ｉ’の場合はＨまたはＣ 1 −Ｃ 12 アルキルを表し；
ｎは、１、２、３、４、５または６であり、
Ｙは、−ＮＲ'1Ｒ'2または−+ＮＲ'1Ｒ'2Ｒ'3、Ｘ-であり、ここでＲ'1、Ｒ'2およびＲ'3は、それぞれ他と独立に、−ＣＨ3または−Ｃ2Ｈ5を表し；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
ｎ'は、１、２、３または４であり、そして
＊は、不斉炭素を意味し、かつ---は、飽和単結合または不飽和二重結合を表す］の化合物に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記の新しい化合物の製造方法に関する。
すなわち、１つの側面において、本明細書には、標的生物学的基質を傷害または破壊するための方法が記述されており、この方法は、標的基質を該基質を、該基質を光感作するのに有効な量の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物で処理し、次に該標的基質を、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物により吸収される波長バンドの放射線で、基質を傷害または破壊するのに有効な時間、照射することを含んでなる。
【００１６】
従って他の側面において、本発明は、活性成分として少なくとも１つの式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物を、薬剤学的に許容される担体と一緒に含んでなる医薬組成物に関する。本組成物は、腫瘍のインビボ光動力学的療法および診断のため、ならびに周知の光動力学的方法による、試料中および生体組織中の細胞、ウイルスおよび細菌、寄生虫および真菌を死滅させるのに有用である。
【００１７】
さらに本発明は、光動力学的療法において有用な医薬組成物の製造のための、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物の使用に関する。
【００１８】
本発明はさらに、細菌、寄生虫、ウイルスおよび真菌の診断およびエクスビボの死滅において有用な組成物の製造のための、発明化合物の使用に関する。
【００１９】
本発明はさらに、中間体としての、それぞれ本明細書で後述する式IIおよびIIIの酸塩化物および無水物に関する。
（発明の詳細な説明）
好ましい実施態様において、本発明の化合物は、以下の光学的立体配置をもつ下記式：
［式中、Ａは、上記と同義である］を有する。
【００２２】
上記構造中、Ｃ７とＣ８の間の結合とＣ１７とＣ１８の間の結合を示す点線が、飽和単結合であるとき、番号７、８、１７および１８の炭素原子は、不斉炭素原子である。Ｒ2またはＲ3がＨであるとき、Ｃ１３2は不斉炭素原子である。
【００２３】
酸素の存在下で、または周囲空気および光作用下で、上記Ｃ７−Ｃ８およびＣ１７−Ｃ１８結合の酸化が起こり、該位置Ｃ７−Ｃ８およびＣ１７−Ｃ１８に二重結合を有する化合物が生じてもよい。
【００２４】
本発明の式Ｉ'およびＩ”の化合物は、式Ｉの化合物の酸化型であり、そして「クロロフィル」、シアー・エイチ（Scheer H.）（編）、ＣＲＣ出版、１９９１年、１４７−２０９頁に記載される方法により得ることができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様において、本化合物は、ＡがＯＲ1であるものである。
最も好ましい実施態様において、本発明の化合物は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ（本明細書では時にＰｄ−ＢＣｈｌ−ＣＯＯＨとも称される）、すなわち下記構造：
【００２６】
ＡがＯＨである式Ｉの化合物の製造方法の１つは、少なくとも、
ａ）Ｍ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ化合物（ここで、Ｚはフィチル、ゲラニルゲラニル（ｇｇ）またはＳｅｒＯＭｅ（セリルＯ−メチルエステル）であり、そしてＭは、Ｍｇ、Ｃｄ、およびＺｎから選択される金属である）の脱金属反応と加水分解を組合せる工程；
ｂ）（ａ）で得られる化合物に、Ｐｄ試薬を用いてＰｄを取り込む（こうしてＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが得られる）工程、および、所望であれば、
ｃ）次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄと式Ａ−Ｈの対応する化合物を反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成させる工程、
とを含んでなる。
【００２７】
１つの好ましい実施態様において、本方法は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ製造法に関し、そしてバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で脱金属および加水分解され、そして得られるバクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）は、工程（ｂ）でＰｄ試薬と反応して、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる。
【００２８】
式Ｉの化合物の別の製造方法は、少なくとも、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚの金属交換反応により、対応するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチル、ｇｇまたはＳｅｒＯＭｅである）を得る工程、；
ｂ）得られる化合物の加水分解工程、および
ｃ）場合により、次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを式Ａ−Ｈの対応する化合物と反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成する工程
とを含んでなる。
【００２９】
１つの好ましい実施態様において、本方法は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ製造法に関し、そしてバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で金属交換されて、本来の中心Ｍｇ原子がＰｄで置換され、そして得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルである）は、工程（ｂ）で加水分解されて、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる。
【００３０】
式Ｉの化合物の別の製造方法は、少なくとも、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルまたはゲラニルゲラニルである）を酵素的加水分解して、ＢＣｈｌｉｄｅを得る工程；
ｂ）（ａ）の該ＢＣｈｌｉｄｅの酸性脱金属反応工程；
ｃ）（ｂ）の脱金属化ＢＰｈｅｉｄへ、Ｐｄ試薬を用いてＰｄを取り込む工程；および
ｄ）場合により、次に、得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを式Ａ−Ｈの対応する化合物と反応させて、対応するＲ1塩またはＡがＯＨでない化合物を形成させる工程
とを含んでなる。
【００３１】
式Ｉの化合物の製造のための上記方法において、Ｐｄ試薬は、例えば酢酸Ｐｄまたは塩化Ｐｄのような構造でＰｄを提供する、任意の便利な反応性化合物であってよい。
【００３２】
上記方法におけるＰｄの取り込みは、アスコルビン酸Ｎａまたはアスコルビン酸を使用する２工程法、あるいは６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸を使用する１工程法により行うことができる。
【００３３】
Ａが、ＯＨおよびＯＲ1とは異なる、本発明の化合物は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ（Ｐｄ−ＢＣｈｌ−ＣＯＯＨ）と対応するＡ−Ｈ化合物との反応により得られる。
【００３４】
上記式IIおよびIIIの化合物は、本発明の式Ｉの化合物の中間体である。式IIの酸塩化物であるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＣＯＣｌは、例えばＳＯＣｌ2のような酸塩化物を形成するのに適した任意の物質を使用することにより得られる。
式IIIの酸無水物は、式Ｉ、Ｉ'、Ｉ”の化合物を無水酢酸で脱水することにより得られる。
これらの中間体IIおよびIIIを対応する化合物ＡＨと反応させて、式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の化合物が得られる。
【００３５】
本発明はさらに、式Ｉ、Ｉ'およびＩ”の遊離酸の薬剤学的に許容される塩を含んでなる。この塩は、遊離酸またはその塩と、特に問わないが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、カルシウムまたはマグネシウムの適切な塩、ＬｉＯＨ、ＮＨ4ＯＨ、水酸化テトラアルキルアンモニウム、例えば、水酸化テトラエチルアンモニウム、またはＮ−メチルグルカミン、グルカミンおよびトリエタノールアミンのような、無機または有機試薬とを反応させる、当該分野において周知の方法により形成することができる。
【００３６】
本発明の化合物は、標的生物学的基質に関する光動力学的療法および診断において使用される。「標的生物学的基質」とは、環境に好ましくないため治療または他の矯正処置（例えば滅菌）が用いられるか、あるいは診断が適用される環境においてその位置を知ることが望まれる、任意の細胞、ウイルスまたは組織を意味する。
【００３７】
本発明により、薬物は被験者に注入されて、標的基質は最適濃度に達することができる。次に標的基質は、投与された化合物の吸光スペクトルに適した波長の放射線に暴露される。化合物の作用は、標的基質の温度を同時に上昇させることにより増強することができる。
【００３８】
本発明の方法において使用するために、本発明の化合物は、意図する用途に適した従来の賦形剤を使用して製剤化される。全身投与には一般に、十分な非毒性界面活性剤を含む緩衝化水性組成物が使用して、活性化合物を可溶化する。本発明の化合物は、一般に水にあまり溶けやすくないため、このような界面活性剤の可溶化量を使用してもよい。適切な非毒性界面活性剤は、特に問わないが、ツイーン−８０、グリココール酸ナトリウムのような種々の胆汁酸塩、フシジン酸塩のような種々の胆汁酸塩類似体を含む。別の組成物では、リポソーム担体を利用する。溶液は、ハンクス液、リンゲル液、またはリン酸緩衝液のような従来の緩衝液を使用して、所望のｐＨに緩衝化される。安定化量のタンパク質、例えば、血清アルブミン、または低密度−もしくは高密度−リポタンパク質（それぞれ、ＬＤＬおよびＨＤＬ）のような、薬物の活性を妨げない他の成分も含めてよい。
【００３９】
全身性製剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下注射のような注射により投与できるか、あるいは経膜または経皮法により投与できる。経皮または経膜投与に適した製剤には、浸透剤（これらは、しばしば上述の界面活性剤であってよい）を含有する噴霧剤および坐剤がある。
【００４０】
局所投与には、製剤は浸透剤も含んでいてよく、そして軟膏剤、膏薬、リニメント剤、クリーム剤、または油剤の剤型とする。全身性および局所投与の両方に適切な製剤化は、「レミントンの製剤科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences）、最新版、マック出版社（Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルバニア州に見い出される。
【００４１】
例えば輸注または血液製剤の製造のために血液または血漿を処理するためのエクスビボの使用には、特別な製剤は必要でないが、本発明の化合物を、照射に先立ち、適切な適合溶媒に溶解して、典型的には１〜１００μg/ml程度の適切な濃度で生物学的流体と混合する。
【００４２】
光動力学的療および診断的応用のために適切な用量範囲は、投与の様式および化合物の選択、ならびに治療または診断される症状の性質により変化する。しかし一般には、適切な用量は、０．０１〜５０mg/kg体重、好ましくは０．１〜１０mg/kg程度である。局所投与には、典型的には総量約５〜１００mgの量が使用される。
【００４３】
光動力学的エクスビボ療法のための一般的な操作は、マシューズ，ジェイ・エル（Matthews, J.L.）ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（上記文献）に記載される操作と類似している。
【００４４】
簡単に述べると、全身投与には、標的生物学的基質中の本発明の化合物の最適濃度を達成するために、投与後に適切な時間、典型的には数分から２日間が経過するのを待つ。一般に、この基質は、腫瘍脈管系、腫瘍細胞または任意の他の腫瘍成分であり、化合物の局在は、バックグラウンドと比較して標的組織の吸光度を測定することにより追跡できる。最適化を達成後、標的生物学的基質を、５〜７５０mW/cm2の速度で７４０〜８００nm、または５００〜６００nmまたは７００〜９００nmの範囲で、かつ１００〜１０００J/cm2の総エネルギーで、適切なバンドの照射により照射する。
【００４５】
局所治療には、局在化が迅速であり、そして対応する照射は後で提供することができる。エクスビボの生物学的流体の処置には、放射線は、標的組織による最適結合／摂取が達成された後に適用される。放射線フルエンスは、１〜１０J/cm2のオーダーである。組織の浸透は必要ないため、低い総エネルギーを使用できる。
【００４６】
本発明の組成物は、上記と同義の式Ｉ、Ｉ'またはＩ”の少なくとも１つの化合物を、生理学的に許容される担体と一緒に含んでなる。これらの組成物は、液剤、脂質乳剤またはゲル剤の剤型、あるいはリポソームまたはナノ粒子の剤型であってよい。標的基質での本発明の化合物の濃度の最適化を可能にするのに適した担体が選択される。このような担体の例は、特に問わないが、「ツイーン８０」、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ４００、「クレモフォール（Cremophor）ＥＬ」、プロピレングリコール、エタノール、メボウキ油、胆汁酸塩および胆汁酸塩類似体ならびにこれらの混合物である。リポソーム製剤は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロールを基剤としてよい。担体はまた、ジパルミトイルホスファチジルコリンであってよい。
【００４７】
ナノ粒子を使用するとき、これらはＰＥＧコーティングしたポリ（乳酸）ナノ粒子の形態であってよい。脂質乳剤の剤型では、低密度リポタンパク質およびトリグリセリドが通常使用される。
本発明の組成物において、本発明化合物は、組成物総重量の０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５重量％〜５重量％の量である。
【００４８】
本発明を、以下の非限定的な例により説明する。
（例）
【００４９】
例１．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、ＢＣｈｌａから以下の３工程法により調製した。
（ａ）バクテリオクロロフィルａ（ＢＣｈｌａ）の単離
ＢＣｈｌａは、凍結乾燥細菌のロードボルム・スルフィドフィルム（Rhodovolum sulfidophilum）から抽出した。
【００５０】
凍結乾燥細胞（１００ｇ）を粉砕して粉末とし、総量１２５０mlアセトンで５回洗浄して、カロチノイドを部分的に洗浄し、混合物を濾過して、ＢＣｈｌａを無水メタノール（約１２００ml、４〜５回濾過）で固形物から抽出した。濾過後、暗青緑色の溶液を、真空下で部分的に蒸発させ、濃縮溶液（約５００ml）を石油エーテル（沸点８０〜１００℃、約１３００ml）で２〜３回抽出して、さらにカロチノイドを除去し、そして石油エーテル相をメタノール（約５５０ml）で２回抽出した。次に、この相を廃棄して、合わせたメタノール相を真空下で蒸発させ、青緑色の残渣をメタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）に再溶解して、メタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）により平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（３×１０cm）に載せた。ＢＣｈｌａをメタノール−アセトン（１：３、ｖ／ｖ）で溶出し、メタノール−アセトン混合物を蒸発させて、乾燥Ｂｃｈｌａを正確な容量（吸収スペクトル用）のエーテルに再溶解して、脱脂綿を通して濾過して、溶解したカラム物質を除去した。最後の蒸発後、この固形色素を、アルゴン下で暗所で−２０℃で貯蔵した。抽出収率：１００ｇの凍結乾燥細胞あたり約７００mg ＢＣｈｌａ。
【００５１】
ＤＥＡＥ−セファロースカラムを、以前に報告（オマタ（Omata）とムラタ（Murata）、１９８３年、「ＤＥＡＥ−セファロースＣ１−６ＢおよびセファロースＣ１−６Ｂを用いるカラムクロマトグラフィーによるクロロフィルａ、クロロフィルｂおよびバクテリオクロロフィルａの調製」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０９３−１１００）されたように調製した。簡単に述べると、ＤＥＡＥ−セファロースを蒸留水で洗浄し、次にこれを１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）に懸濁することにより酢酸塩型に変換した。このスラリーをアセトンで３回洗浄し、最後に５℃でメタノール−アセトン（１：３、ｖ：ｖ）に懸濁して貯蔵した。
【００５２】
（ｂ）バクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）の調製
（ａ）で得られるような粗Ｂｃｈｌａ抽出物（少量の残留カロチノイドを含む約１００mgのＢｃｈｌａ）を８０％トリフルオロ酢酸水溶液（１０分間窒素でバブリングしたもの）（約１５ml）に溶解した。この溶液を周囲温度で２時間撹拌した。次に反応混合物を水（２５０ml）に注ぎ入れ、クロロホルムで抽出した。抽出物を水で２回洗浄して、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。溶媒の留去後、残渣をシリカのクロマトグラフィー（３cm×１５cmカラム、キーゼルゲル（Kieselgel）６０、メルク（Merck））に供して、段階勾配：２％、５％、１０％、１５％によりクロロホルム中のメタノールで溶出した。最初に、カロチノイドと少量のバクテリオフェオフィチンが洗浄され、次にアロ−バクテリオフェオフィチンとカロチノイドが溶出した。クロロホルム中の１０％メタノールで、生成物が回収され始め、これをＴＬＣ（キーゼルゲル（Kieselgel）、クロロホルム−メタノール、９：１）により追跡した。生成物（６０mg）から溶媒を留去して、残渣をＣＨＣｌ3にとり、ウルトラポア（UltraPore）メンブランを通して濾過して残留シリカを除去した（そうしないと酸化を引き起こしうる）。
【００５３】
（ｃ）バクテリオフェオホルビド（Ｂｐｈｅｉｄ）へのパラジウムの取り込み
（ｂ）で得られるようなＢＰｈｅｉｄ（１００mg）と酢酸Ｐｄ（８０mg）をジクロロメタン（約１０ml）に溶解して、５０mlのメタノール中の２００mgアスコルビン酸ナトリウムの懸濁液に加えた。反応混合物を閉じたフラスコ中で室温で撹拌して、反応混合物からの試料を１５〜１２分毎に回収して、これらの吸光度を記録した。約４時間後、ほとんどの３５７nmのＢＰｈｅｉｄ吸光度が、３３０および３９０nmのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ吸光度により置換された。
【００５４】
反応混合物をクロロホルム／水溶液（２００ml；５０：５０、ｖ／ｖ）中に移して、分液ロート中で振盪した。有機相を回収し、水で洗浄し、無水塩化ナトリウムで乾燥して、蒸発させた。乾燥物質を８０mgの酢酸Ｐｄに加えて、３５７nmの残留吸光度が完全に消滅し、７６５nmの吸光度（最も赤色の転移のピーク）と３３０nmの最大吸光度の間の比が約２．４の値に到達する（クロロホルム中）まで、上記工程を反復した。
【００５５】
乾燥した反応混合物を最少量の２：１クロロホルム：アセトンに可溶化して、アセトンで前もって平衡化したＣＭ−セファロースカラム（１５０mm×２５mm）に載せた。カラムを最初にアセトンで洗浄し、溶出した最初の画分を廃棄した。次にカラムを９：１アセトン：メタノールで洗浄した。２つのバンドが顕著になり、洗い出された−第１のバンドは、主生成物であり、第２のはアロ異性化した副産物であった（廃棄した）。生成物をほぼ乾燥するまで濃縮して、分液ロート中の５０：５０クロロホルム：水系に移した。混合物を完全に振盪して、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウム（または塩化ナトリウム）で乾燥して、蒸発乾固した。
【００５６】
例２．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
（ａ）Ｂｃｈｌａの単離
この工程の操作は、上記例１（ａ）と同様に行った。
【００５７】
（ｂ）Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの調製
６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸（２４６mg、５９３μmol）をＭｅＯＨ（８４ml）に溶解して、Ｎ2をこの溶液に通した。Ｂｐｈｅｉｄ（９２mg、１５１μmol）およびＰｄ（ＣＨ3ＣＯＯ）2（８３mg、３７０μmol）をＣＨＣｌ3（３４ml、Ｎ2により脱気）に溶解して、メタノール溶液に加えた。混合物を撹拌して不活性雰囲気下で保持して、数分毎に少量の反応液の吸収スペクトルを記録することにより、反応の進行を追跡した。約３０分後、反応が終了して、溶媒を留去した。
【００５８】
（ｃ）Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの精製
粗Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄをＣＨＣｌ3に溶解して、１５ｇの０．４％−シリカ−Ａｓｃを充填したカラムに載せた。少量のＣＨＣｌ3（約３０ml）をカラムに通して、次にＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3（１：９９、約２５０ml）を使用して色素を溶出した。画分の純度をＴＬＣおよび吸光度分光法により測定した。質量分光分析およびＮＭＲ検出は、代表的試料について実施した。収量：８２．５mgの純粋なＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（７６％）。
【００５９】
０．４％−シリカ−Ａｓｃの調製には、アスコルビン酸（２４０mg）を２４０ccのＥｔＯＨ：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（６０：６０：１２０）混合物に溶解した。シリカゲル６０（６０ｇ、メルク（Merck）、カタログ番号１０７７３４、７０〜２３０メッシュ）を加え、このスラリー混合物を１０分間撹拌し、次にポンプで濾過した。帯黄色のシリカ−Ａｓｃ．を最後に約１時間約５０℃で乾燥した。この０．４％−シリカ−Ａｓｃ．は通常のシリカゲルと同様にすぐに使用できる；その性質は極性が低く、わずかに抗酸化性を有する。
【００６０】
例３．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの調製
（ａ）Ｂｃｈｌａの単離
この工程は、上記例１（ａ）と同様に行った。
【００６１】
（ｂ）クロロフィラーゼ（Ｃｈｌａｓｅ）の調製
クロロフィラーゼ（Ｃｈｌａｓｅ）は、メリア・アゼダラク・エル（Melia azedarach L.）、センダンの葉のクロロプラストから調製した。新鮮な葉（５０ｇ）を、−２０℃に冷却した３５０mlのアセトンを含むブレンダー中で２分間粉砕した。このホモジェネートを４層のガーゼで濾過し、濾液を回収して、４℃で一晩放置してさらに沈殿させた。濾過してアセトンを除去し、濾液が無色になるまで、残った粉末を冷アセトンで数回洗浄して、痕跡量のＣｈｌａｓｅとカロチノイドを除去した。Ｃｈｌａｓｅアセトン粉末を最後に凍結乾燥機で乾燥して、−２０℃でさらに貯蔵した。このような条件下で、この酵素調製物は、目立つ活性の消失なしに１年以上安定であった。収率：１kgの葉あたり２０ｇ Ｃｈｌａｓｅを得た。
【００６２】
（ｃ）バクテリオクロロフィリド（ＢＣｈｌｉｄｅ）の合成と精製
アスコルビン酸（７０mg、メルク（Merck））を水（９ml）に溶解し、１０Ｍ ＫＯＨ水溶液を使用して溶液のｐＨを７．７に調整して、１mlの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）を加えて反応中のｐＨを維持した。トリトンＸ−１００（約８０μl）を加えて、０．８％（ｖ／ｖ）の最終界面活性剤濃度を達成した。Ｃｈｌａｓｅアセトン粉末（２００mg）を、この溶液６ml中で、ポリトロン（Polytron）ホモジェナイザーを使用してホモジェナイズした。残った溶液を使用してこの装置を洗浄し、次いでホモジェネートと合わせた。酵素溶液を、アルゴンで飽和した２０mgの固形ＢＣｈｌａと共に音波処理して、暗所で３７℃で６時間撹拌しながらインキュベートした。
【００６３】
精製するために、６時間の反応後、反応物質を直接凍結（−２０℃）し、続いて凍結乾燥した。乾燥残渣をアセトンに溶解して音波処理し、次に溶液を、アセトン中で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに供した。カラムをアセトンで洗浄して、未反応物質を溶出し、次にアセトン中の５％および７％メタノール（ｖ／ｖ）で洗浄して、バクテリオクロロフィリド（Ｂｃｈｌｉｄｅ）およびバクテリオフェオホルビド（Ｂｐｈｅｉｄ）を溶出した。生成物をアセトン中の２５％メタノールで溶出した。溶媒を留去して、固形色素をアルゴン下で−２０℃で暗所で貯蔵した。反応収率：３０〜５５％。
【００６４】
クロマトグラフィーのためのＣＭ−セファロースは、最初にＣＭ−セファロースを水で洗浄し、次にアセトンで３回洗浄し、次いでカラムに充填してアセトン中で平衡化することにより調製した。クロマトグラフィー物質は、無色になるまで２Ｍ ＮａＣｌ水溶液で完全に洗浄し、水で洗浄してアセトン中に再懸濁後、再使用することができた。
【００６５】
（ｄ）バクテリオフェオホルビド（ＢＰｈｅｉｄ）へのパラジウムの取り込み
操作は、上記例１（ｃ）と同じである。乾燥物質のＨＰＬＣにより、２つのエピマー（化学的に同一のもの（全混合物の８８％）と残りのアロ異性体）の形の主生成物が示された。また出発物質ＢＰｈｅｉｄのわずかな（０．５％）混入もあった。
【００６６】
例４．化合物Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
（ａ）吸収スペクトル
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸収スペクトルは、基線に対して標準化したＰＭ検出機を使用するユビコン（UVICON）分光光度計（光路長１cm）により測定した。感度は０．０５である。
【００６７】
アセトンおよびメタノール／リン酸Ｋ緩衝液の混合物中のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの吸収スペクトルは、表１および図１に報告する。
血漿中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸収スペクトルは、７６３nmに赤色側にシフトした。
【００６８】
ｐｉｃ検出では、図１により以下のピークが明らかになった：７５８nm：１．２５０２；５３７nm：０．３２３９；３８４nm：０．５３５１；および３２９nm：０．７７６６。
【００７０】
（ｂ）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄのＨＰＬＣ検出
不純物プロフィールおよびパラジウム−ＢＰｈｅｉｄの量を性状解析するために、逆相ＨＰＬＣ法を開発した。
固相：Ｃ8イナートシル（Inertsil）５μm、２５０×４．６mm
液相：メタノール：リン酸カリウム緩衝液２０mM、ｐＨ＝６．５９（７０％：３０％）
流量：１ml/分
注入量：１００μl
検出：１−スペクトロフロー（Spectroflow）７８３、重水素ランプ：３８５nm
２−スペクトロフロー（Spectroflow）７５７、タングステンランプ：７５３nm
【００７１】
表２に示すように、例３で得られるような生成物Ｐｄ−ＢｐｈｅｉｄのＨＰＬＣ分析は、７個のピークを示した。主要なピークは、全生成物の６４〜７０％に相当した。
【００７２】
−２０℃でアセトン中に貯蔵したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの溶液は、少なくとも２ヶ月間安定であった。ストック溶液を室温で１８時間維持したとき、ＨＰＬＣプロフィールには変化が観察されず、これは、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄが安定な化合物であることを示している。
【００７３】
（ｃ）ＮＭＲによるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
例３により調製したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの精製工程後、主要ピークの百分率は９０％以上であった。この精製は、分取ＨＰＬＣ Ｃ８により行った。この精製した化合物は、ＮＭＲおよび質量スペクトル法による生成物の性状解析のために使用した。
【００７５】
ＮＭＲによるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの分析を行って、化学シフトを表３に列挙した：
−1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲ
−２Ｄ1Ｈ ＮＭＲ（ＣＯＳＹおよびＮＯＥＳＹ）
−２Ｄ1Ｈ−13Ｃ ＮＭＲ（ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ：逆検出）。
【００７６】
（ｄ）質量スペクトル法によるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの性状解析
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの質量スペクトル解析により、図２および３に示すスペクトルを得た。これは、低および高分解能で高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）により行った。分光計は、「ザブスペックＴＯＦマイクロマス（ZabSpec TOF Micromass）」分光計；イオン化モード：Ｃｓ+によるＬＳＩＭＳ、ポジティブ、加速：８kV；光源温度：４０℃；使用溶媒：ｍＮＢＡ（メタ−ニトロベンジルアルコール）；入力：ラテラル。
【００７８】
結果：イオンタイプ：Ｍ+；式：Ｃ35Ｈ36Ｎ4Ｏ6 106Ｐｄ；理論：７１４．１６７０ Ｚ：１m/z 理論値７１４．１６７０m/z 実測値７１４．１６８９。
これらの結果により、ＮＭＲ試験：ｍ／ｅ＝７１４を確認し、かつパラジウム金属の挿入を確認した。
ＮＭＲおよび質量スペクトル法により分析される化学構造は、ＢＣｈｌの遊離酸型のパラジウム誘導体であるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄである。
【００７９】
例５．マウスＬ１２１０およびヒトＨＴ２９細胞に対するＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの生物学的活性
（ｉ）細胞株。マウス白血病細胞株（Ｌ１２１０）を、１０％ウマ血清、１mMグルタミン、１mMメルカプトエタノールおよびゲンタマイシンを補足したフィッシャー培地を使用して、懸濁培養で維持した。ＲＩＦ（放射線誘導性線維肉腫（Radiation induced Fibrosarcoma））腫瘍をトウェンティーマン（Twentyman）らにより明記（１９８０年、「終点試験の比較のための新しいマウス腫瘍モデル系（ＲＩＦ−１）」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，６４，５９５−６０４）されたように維持した。培養物は、１０％ウシ胎仔血清およびゲンタマイシンを含むウェイマス（Weymouth's）培地で増殖させた。
ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞は、フェノールレッドを含まず１０％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。細胞は、０．０２％ ＥＤＴＡ中の０．２５％トリプシンの分散させて継代培養して、１：５分割で再培養した。
【００８０】
（ ii ）インビトロ光毒性。Ｌ１２１０およびＲＩＦ細胞が関与する光毒性の試験のために、１０cmのウォーターフィルタと８５０nmカットオフフィルターで濾過してＩＲを除去した６００ワット石英ハロゲン光源により、光を提供した。干渉フィルター（オリエル（Oriel））により、バンド幅をさらに６６０±５nmまで制限した。懸濁液中（Ｌ１２１０）または直径２４mmのカバーガラスに接着した細胞を、増殖培地（緩衝化能を加えるために、ＮａＨＣＯ3の代わりに２０mMヘペスｐＨ７を含む）中で、記載されたレベルの増感剤の存在下で１５分間インキュベートした。次に細胞を、洗浄して増感剤を含まないようにして、新鮮培地に移した。照射は１０℃で行った。一部の試験用に、次に細胞を蛍光プローブで標識して、光損傷の部位を評価した。他の試験では、次に細胞を新鮮培地中で３７℃で６０分間インキュベートして、アポトーシスを進行させた。生存活性試験は、９６ウェルプレートと７２時間ＭＴＴ測定法を使用して４重測定で行った。
ＨＴ２９モデルでは、細胞を異なる濃度のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄと共に１時間インキュベートして、ハロゲンランプまたはチタンサファイアレーザーにより３００mW/cm2で１０および２５J/cm2で照射した。
【００８１】
（ iii ）細胞生存活性。生存細胞は、９６ウェルプレートに１，０００〜５０，０００個の細胞を塗布した３日後に、ＭＴＴ反応により評価した。色強度は、可変数の対照細胞を含む標準曲線と比較した。ｘ nmでの吸光度は、バイオラッド（BioRad）プレートリーダーにより測定した。Ｌ１２１０では、次の３日間も新鮮培地中の増殖が可能であり、ＭＴＴ測定法を使用して細胞数を同様に推定した。
【００８２】
（ iv ）リポタンパク質結合：対照ヒト血漿のタンパク質およびリポタンパク質へのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの結合を測定した。２５０μl血漿試料を３μMの化合物と３７℃で３０分間のインキュベーション。次に、リポタンパク質およびタンパク質成分を密度勾配遠心分離機により分離した。勾配を分画し、画分を３mlの１０mMトリトンＸ−１００界面活性剤中に希釈するか、または７５０〜８００nmの蛍光を４００nmで励起して測定した。
【００８３】
結果
（ｖ）Ｌ１２１０細胞に及ぼすＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性効果
Ｌ１２１０マウス白血病細胞を、１μＭ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄと共に３７℃で３０分間インキュベートすると、７６０±５ｎｍで７５ｍＪ／ｃｍ2線量の光を使用して５０％の細胞死滅が起きた。ＲＩＦ株中の同程度の細胞死滅には、２１５ｍＪ／ｃｍ2の光量を必要とした。
【００８４】
（ vi ）ＨＴ２９細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性作用
ＨＴ２９細胞を、光無しでＰｄ−ＢＰｈｅｉｄと共にインキュベートするとき、生存率は１００％と７９％の間で変化した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの濃度が高くかつ供給エネルギーの量が上昇したとき、細胞の生存率は低下した。５０％死亡率（ＬＤ50とも呼ばれる）を引き起こすＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ光増感剤用量は、２５Ｊ／ｃｍ2の照射下では４８μＭであった。最も重要な光毒性を誘導する励起波長は、７７３nmであった。
【００８５】
（ vii ）光損傷の部位。マウス白血病Ｌ１２１０細胞を使用すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、非常に特異的なミトコンドリアの光増感剤であり、原形質膜やリソソームに対する光損傷は検出されなかった。このような結果は、迅速なアポトーシスの開始に関係付けられている。
（ viii ）血漿リポタンパク質結合。実施した試験は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが、ヒト血清のＨＤＬ＞ＬＤＬ＞＞＞アルブミン画分に結合したことを示しており、ＰＤＴ選択性の１つの決定因子であると考えられた。
【００８６】
例６．Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの製剤：動物実験に使用される溶媒中のＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの溶解度と安定性
Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの溶液は、０．０５〜２％の濃度をうるために異なる製剤に調製した。
【００８７】
（ａ）クレモフォール製剤は、以下のように調製した：溶液が完全に粒子を含まなくなるまでバイアルをゆっくり回転するか、あるいは音波発振器プローブの短いパルスを使用して、４０ｍｇのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを、乾燥チューブ中で２mlのクレモフォールＥＬに溶解した。温度が３０℃を超えないように、チューブを冷却した。薬物を可溶化後、０．６ｍｌのプロピレングリコールを加え、再度ゆっくり回転するかまたは音波プローブを用いて混合した。次に等張性ＮａＣｌを０．１ｍｌずつ、総量４ｍｌになるまで加えた。混合物は、各添加後、沈殿の形跡なく清澄である。温度を２５〜３０℃より低く保持するように注意しながら、各ＮａＣｌ ０．９％の添加後、組成物を音波プローブで処理した。薬物の濃度は、エタノールへの希釈後、７５７ｎｍの吸光度を測定して評価した。
２０ｍｇ／ｋｇのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを実験に使用するとき、これは２０グラムのマウスでは０．４ｍｇであった。０．１ｍｌを超えるクレモフォールを尾静脈には注入できないため、薬物濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。
【００８８】
（ｂ）修飾クレモフォール製剤を以下のとおり調製した：５ｍｇ／ｍｌのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．４ｍｌのクレモフォールＥＬと混合した。溶解後、０．１２ｍｌのプロピレングリコールを加えた。次に等張性食塩水（１．４８ｍｌ）を少量ずつ加え、各添加後にこれを混合した。最終溶液は完全に清澄であり、粒子を含まなかった。必要に応じて氷浴で冷却することにより溶液を２５℃未満に保持しながら、薬物の溶解を助けるために超音波プローブを使用した。
クレモフォール溶液中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ濃度の測定は、メタノールへの希釈により行った。吸収スペクトルは、７４０〜７８０ｎｍにわたって測定した。ピーク値は、既知濃度のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄからの結果と比較した。
（ｃ）ツイーン８０とエタノールを使用してＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを可溶化（１ｍｇ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ／ｍｌ溶液）して、追加の製剤を調製した。
【００８９】
例７．インビボ毒性試験−マウス腫瘍モデルに対するＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄの作用
マウス腫瘍モデルを含む２セットの実験を使用して、Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄの光毒性を評価した。
【００９０】
（ａ）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの光動力学的応答性は、最初に２つのマウス腫瘍モデルで評価した：ＢＡ−乳腺腫および放射線誘導性線維肉腫（ＲＩＦ−１）。
光動力学的治療パラメーター：直径５〜７mmの腫瘍をもつマウスをＰＤＴ実験に参加させた。３種のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ薬物用量（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ）および２種の光量（１００および３００ジュール／ｃｍ2）を評価した。クレモフォールに溶解したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの製剤は、尾静脈内注射により投与した。ＰＤＴ光暴露は、注射の１５分、１時間または４時間後のいずれかに開始した。当初の結果が、致死毒性または不応答を示さなければ、３匹のマウスを各処理条件下で処理した。７５７ｎｍに合わせたチタンサファイアレーザーを、ＰＤＴの光源として使用した。レーザー発生光は、腫瘍への光の送達のために水晶繊維中にカップリングさせた。７５mW/cm2の光出力密度を使用した。ＰＤＴ処理後１週間に３日、腫瘍のサイズを測定して、腫瘍治癒（処理後４０日間腫瘍再発が無いとして定義）の百分率を測定した。
【００９１】
インビボＰＤＴ応答：本明細書に後述の表４および５は、ＢＡ乳癌またはＲＩＦ−１繊維肉腫のいずれかを移植したＣ３Ｈマウスに関するＰＤＴ処理結果を要約する。各表は、以下のパラメーターを示す：１）ｍｇ／ｋｇで表される静脈内投与薬物用量；２）総光量（Ｊ／ｃｍ2）、波長（７５７ｎｍ）、光量率（ｍＷ／ｃｍ2）、および時間間隔（各群の処理の間）を含む、レーザー処理パラメーター、４）毒性（処理後まもなく４匹のマウスが死亡）、５）腫瘍再生（ＰＤＴ処理と腫瘍再発の間の日数からなる）、および６）Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ＰＤＴが誘導した腫瘍治癒のマウスの数（および百分率）。
【００９２】
本明細書に示されるように、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴは、２つのマウス腫瘍モデルにおいて、古典的および効率的な殺腫瘍性応答を誘導することが見い出された。ＰＤＴが介在する腫瘍応答性は、薬物用量、光量および薬物投与と光処理の間の時間間隔に、正相関した。具体的には、高薬物用量および／または高光量により応答が増強した。ＢＡ乳癌は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴに対して、ＲＩＦ−１繊維肉腫の同等なＰＤＴ処理よりも応答性が高いことが見い出された。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄが介在するＰＤＴは、薬物投与の１時間以内に光処理を開始したときに有効であり、薬物投与と光処理の間に４時間の間隔をあけると有効でなかった。
【００９３】
（ｂ）第２セットの実験では、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性を、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌を移植したマウス腫瘍モデルにおいて評価した。
動物と腫瘍モデル：死亡直後にドナーマウスから取り出した固形腫瘍組織（直径２ｃｍ）を、１ｍｌの０．９％食塩水中で機械的に破砕して、この溶液（０．１ml）を各マウスの一方の後肢に皮下注射した。腫瘍直径が８〜１０ｍｍであるときマウスを実験に含めた。腫瘍は、実験の１０日前に８週齢のスイスヌードマウスに皮下移植した。
【００９４】
光毒性試験：０．１５ｍｌ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを１５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。マウスを、照射直前に４０ｍｇ／ｋｇのチオペンタールで麻酔した。注射の３０分、１時間、４時間または２４時間後、マウスをチタンサファイアレーザーで３００ｍＷ／ｃｍ2で照射して、２００または３００Ｊ／ｃｍ2を得るように照射時間を調整するため平均直径を測定した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを注射しなかった対照マウスも同じ条件下で照射した。ＰＤＴにより誘導される腫瘍増殖の遅延を、実験的放射線療法において実現した試験との同等性により分析した。インビボ試験および各別個の実験について、全ての結果は、２回または３回の別個の実験の平均であり、そして各別個の実験、各実験条件につき２匹のマウスを使用した。
【００９５】
腫瘍増殖試験に関して、結果は腫瘍指数変動として表し、標準（＝１）は非処理細胞の腫瘍指数に対応する。腫瘍指数は、以下のように計算した：
腫瘍指数＝（最大腫瘍直径＋垂直な反対側の直径）／２
温度変動試験：熱作用が過度でないことを確信するために、ハロゲンランプおよびチタンサファイアレーザー照射について、非吸収性アルミン埋め込みマイクロ熱電対を使用して温度変動を測定した。
【００９６】
この実験の結果は、以下のとおりである：
（ｉ）２００Ｊ／ｃｍ2での７６３ｎｍ照射
腫瘍増殖の低下（対照との比較）が、注射の３０分および４時間後の条件について観察された。腫瘍指数の低下は、注射の１時間および２４時間後の条件について７日目まで観察された。
（ii）３００Ｊ／ｃｍ2での７６３ｎｍ照射
腫瘍増殖低下が、注射の３０分および２４時間後の条件について観察された（対照との比較）。腫瘍指数の低下は、注射の１時間および４時間後の条件について７日目まで観察された。
（iii）注射の１時間後３００Ｊ／ｃｍ2照射
腫瘍増殖低下が、７７３ｎｍの条件について５日目まで、そして７５３ｎｍおよび７６３ｎｍの条件について１２日目まで観察された（対照との比較）。最大腫瘍増殖低下は、７６３ｎｍについて観察された。
（iv）注射の２４時間後３００Ｊ／ｃｍ2照射
腫瘍増殖低下が、７５３ｎｍの条件について４日目まで、そして７６３ｎｍおよび７７３ｎｍの条件について１２日目まで観察された（対照との比較）。最大腫瘍増殖低下が、７７３ｎｍについて観察された。
マウスのハロゲンランプまたはチタンサファイア照射の間中、過度の温度変動は観察されなかった。
【００９７】
本試験を要約すると、照射の最適な波長は、７７３ｎｍであることが見い出された。注射と照射の間の遅延は、腫瘍応答に影響を及ぼした。７６４ｎｍでは、１時間の遅延が最も有効であることがわかった。７７３ｎｍ波長を使用するとき、最も有効な遅延は２４時間であった。
【００９８】
例８．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒベースのＰＤＴ後のＡ４３１ヒト 上皮カルチノイド細胞の形態学的評価
この実験は、Ａ４３１ヒト上皮カルチノイド細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−Ｓｅｒベースを用いるＰＤＴ後に起きる時間非依存性形態学的変化を調べるために行った。
【０１０１】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは上記例１のように調製し、セリンメチルエステルＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅは、ＥＰ５８４５５２のように調製した。
【０１０２】
（ ii ）光源：ハロゲンランプ（オスラム（Osram）、ドイツ、１００Ｗ）、４．５cmのウォーターフィルタと＞６５０nmのカットオフフィルターを有する。１５mW/cm2で９J/cm2の総エネルギーフルエンスで、細胞に１０分間照射した。照射のために、培養プレートをガラステーブルの上に置いて、下から光をあてた。
【０１０３】
（ iii ）光毒性試験：３cmのプレートに二重測定でＡ４３１細胞（５×１０4 細胞）を接種し、ヘペス（２５mM、ｐＨ７．４）で緩衝化し、胎児牛血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（０．０６mg/ml）とストレプトマイシン（０．１mg/ml）を有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋Ｆ１２（１：１）中で７５％コンフルエンスになるまで培養した。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−Ｓｅｒを、対応するＬＤ90濃度（それぞれ０．１と１μＭ）で細胞に加えた。４時間後、細胞を培地で洗浄し、上記光源で細胞に照射した。コンタックス（Contax）３５mmＳＬＲカメラと取り付けたツァイスアキシオベルト（Zeiss Axiovert）−３５光学顕微鏡（倍率×３２０）を使用して、照射後の異なる時点（ＰＤＴ後０，０．５、４および２４時間）で位相差顕微鏡観察を行った。二重測定の２枚目のプレートで、ニュートラルレッド生存アッセイ（ザング・エス・ゼット（Zhang SZ）、１９９０， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ６（２）：２１９−２３４）を使用して、ＰＤＴの２４時間後に、細胞の生存活性を評価した。
【０１０４】
（ iv ）結果：両方の増感剤は、細胞形態に大きな変化を引き起こした。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、細胞膜を急速に（３０分）変化させ、細胞は急速に縮み、繊維性結合が形成され、細胞膜を元々の局所的接着点（繊維性表現型）と接続した。４時間後に、細胞の９０％はその内容量のほとんどを失い、その大部分はプレートから離れ、２４時間以後はそれ以上の変化は観察されなかった（図４、右欄）。ＢＣｈｌ−Ｓｅｒは、異なるパターンの時間依存性形態変化を示し、これは４時間以後にのみ観察することができた。膜ブラビング（blabbing）は、細胞膜から出芽する黒い小胞として見られた。２４時間を超えて大きな容量の低下は観察されず、この期間の後ほとんどの細胞はプレートに結合していたが、中空に見えた（ブラビング（blabbing）表現型、図４、左欄）。照射の２４時間後、ニュートラルレッド生存アッセイを行って、両方の実験群で９０±７％の細胞死滅を確認した。図４では、右欄に繊維性表現型を示し、左欄にブラビング（blabbing）表現型を示す。実線の白い矢印は、繊維またはブラブ（blab）の形成を示す。
【０１０５】
例９．ヒト膀胱癌細胞株ＥＣＶ３０４に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光細胞毒性
この実験は、ＥＣＶ３０４ヒト膀胱癌細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光細胞毒性の作用を評価するために行った。
【０１０６】
（ｉ）材料：例８（ｉ）と同じ。
（ ii ）光源：例８（ii）と同じ。
【０１０７】
（ iii ）光毒性試験：ＥＣＶ３０４細胞（２×１０4 細胞／ウェル）を、９６ウェル中のペニシリン（０．０６mg/ml）とストレプトマイシン（０．１mg/ml）を有するＭ−１９９、１０％ＦＣＳ中でコンフルエンス（約２×１０5 細胞／ウェル）になるまで培養した。増加する濃度のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅを細胞とともに４時間インキュベートし、次に新鮮な培地で洗浄し、上記セクション１に記載のように照射した。照射の２４時間後、ニュートラルレッド生存アッセイを用いて細胞の生存活性を評価した。以下の対照を使用した：光対照：照射したが増感剤で処理しなかった細胞。暗対照：非照射細胞であり、暗所で増感剤で処理した細胞。未処理対照：増感剤で処理しない非照射の細胞を、１００％生存活性の計算のために使用した（ローゼンバッハ−ベルキン・ブイ（Rosenbach-Belkin Ｖ)ら、１９９６，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ ６４（１）：１７４−１８１)。
【０１０８】
（ iv ）結果：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅは両方とも、ＥＣＶ３０４細胞に対して用量依存性かつ光依存性の細胞毒性を示した（図５）。対応するＬＤ50は１９および１０００nMであった。ＰＤＴ後の形態変化は、Ａ４３１細胞を用いて観察されたものと一致した（データは示していない）。
【０１０９】
例１０．Ｍ２Ｒマウス黒色腫細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルのＰＤＴ：
この実験の目的は、Ｍ２Ｒ細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルの作用を試験することであった。
【０１１０】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは上記例１のように調製し、Ｐｄ−バクテリオフェオフォルビドａエチルエステル（Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステル）は、ＷＯ９７／１９０８１に記載のように調製した。
【０１１１】
（ ii ）光源：上記例８（ii）と同じであるが、細胞は、１２mV/cm2で全部で７J/cm2のエネルギーフルエンスで１０分間照射した。
【０１１２】
（ iii ）光毒性試験：Ｍ２Ｒ細胞は、ヘペス（２５mM、ｐＨ７．４）で緩衝化したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋Ｆ１２（１：１）中で単層として培養した。胎児牛血清（ＦＢＳ）（１０％）、グルタミン（２mM）、ペニシリン（０．０６mg/ml）およびストレプトマイシン（０．１mg/ml）を含有させ、細胞を８％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気で３７℃で増殖させた。光毒性解析のために細胞（１×１０4細胞／ウェル）を、９６ウェル中で２４時間培養して、約２×１０4細胞／ウェルの濃度にした。色素を直接、培地または９５％エタノール中に溶解し、培地中でさらに希釈して最終濃度を１％エタノールとした。希釈した色素を加え、細胞を暗所で４時間３７℃でインキュベートした。照射の前に、細胞を１回洗浄し、新鮮な培地で置換した。次にプレートに底から１０分間室温で照射し、３７℃で暗所で培養インキュベーター中に入れた。２４時間後に細胞生存活性を測定した。以下の対照系を使用した：暗対照：暗所に維持した未処理細胞；光対照−増感剤で処理しなかったが照射した細胞。暗毒性：色素で処理したが、暗所に維持した細胞。細胞生存活性は、既に記載されているように（ＷＯ９７／１９０８１）［3Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。
【０１１３】
（ iv ）結果：図６Ａから明らかなように、色素を９５％エタノールに溶解すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄはＬＤ50が０．０３μＭになり、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルはＬＤ50が０．０７μＭになった。色素を、１０％血清含有培地に直接溶解すると、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄのみが充分な活性があり、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルは１μＭ（試験した最高濃度）までまったく活性が無かった（図６Ｂ）。
【０１１４】
例１１．Ｍ２Ｒマウス黒色腫とヒトＨＴ２９結腸癌細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄのＰＤＴ
これらの実験は、２つの細胞株（Ｍ２Ｒマウス黒色腫とヒトＨＴ２９結腸癌細胞）に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性作用を測定することが目的であった。
【０１１５】
（ i ）材料：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、上記例１のように調製した。
（ ii ）光源：光源は、１０cmのウォーターフィルタと７２０〜８５０nmの光バンドを有するキセノンフッ素ＬＳ３−ＰＤＴランプ（バイオスペック（Bio-Spec)、ロシア）であった。１２mW/cm2で７J/cm2の総エネルギー量で、細胞に１０分間照射した。
【０１１６】
（ iii ）光毒性試験：上記と同じプロトコール（例１０）に以下の変更を加えて解析を行った：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄは、１０％血清含有培地中に直接溶解し、次に細胞に加えた。Ｍ２Ｒ細胞の生存は、［3Ｈ］−チミジン取り込みにより測定し、ＨＴ２９細胞の生存はＭＴＴアッセイ（マーリン，ジェイ・エル（Merlin JL）ら、１９９２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２８Ａ：１４５２−１４５８）により測定した。
【０１１７】
（ iv ）結果：図７から明らかなように、ヒト結腸ＨＴ−２９細胞は、この色素に対して低い感受性（ＬＤ50が０．５μＭ）を示し、一方Ｍ２Ｒ細胞は、約１０倍感受性が高かった（ＬＤ50が０．０３μＭ）。
【０１１８】
例１２．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のインビボＰＤＴ
この実験の目的は、２．５mg/kgのＰｄ−Ｂｐｈｅｉｄを用いてＣＤ１ヌードマウス中のＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを試験することであった。
【０１１９】
（ｉ）材料：Ｐｄ−Ｂｐｈｅｉｄは、上記例１のように調製した。
（ ii ）マウス：ＣＤ１ヌードマウス（２５〜３０ｇ）。
（ iii ）麻酔：５０μlのケタミン／ルンポン（Rumpon）の腹腔内注入（容量／容量＝８５／１５）。
（ iv ）腫瘍移植：マウスの背中に１０6 個のＭ２Ｒ細胞を移植すると、２〜３週間以内に腫瘍は治療サイズ（７〜８mm）まで増大した。
（ｖ）光源：λ＝６５０〜９００mnスペクトルウィンドウを取り付けたオスラム（Osram）１５０Ｗハロゲン写真感光ランプ６４６４３（ディー・ケー・ケラー（D.K. Keller）ら、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ １５， ４６７−４７４）。照射は３０分間行った。
（ vi ）ＰＤＴプロトコール：麻酔したマウスに、色素を静脈内注射し、腫瘍に直ちに照射した。治療の最後にマウスをケージに戻した。記載の時間前およびその時間に腫瘍の写真を撮った。
【０１２０】
実験１：
増感剤の調製：２mgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．２５mlのクレモフォール（cremophor）ＥＬに溶解し、次に２０分間音波処理した。０．０７５mlの１，２−プロピレングリコールを加え、さらに１５分間音波処理を続けた。試料を１３，０００rpmで１２分間遠心分離した（エッペンドルフ）。クロロホルム中のスペクトルベースのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの最終計算濃度は、０．５mg/mlであった。
【０１２１】
腫瘍のＰＤＴ：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ２．５mg/kgを、Ｍ２Ｒ黒色腫を有するＣＤ１−ヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍に、３００mWcm-2で３０分間照射した。マウスの皮膚腫瘍領域の温度は、３７．７〜３８℃であった。腫瘍の応答は、治療後１日および４日間追跡した。結果を図８に示す。
【０１２２】
実験２：
増感剤の調製：２mgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを０．１mlのメタノール、０．１mlの０．１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4 （ｐＨ＝８．０）、および０．９mlのＰＢＳに溶解し、１０分間音波処理した。メタノールをアルゴンで蒸発させ、２０％のクレモフォール（cremophor）ＥＬ：１，２−プロピレングリコール（３：１）を加え、１５分間音波処理した。試料を１３，０００rpmで８分間遠心分離し、クロロホルム中のスペクトルベースのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの最終計算濃度は、０．５mg/mlであった。
【０１２３】
腫瘍のＰＤＴ：Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ ２．５mg/kg（１２０μl）を、Ｍ２Ｒ黒色腫を有するＣＤ１−ヌードマウスに静脈内注射した。腫瘍組織に、３００mWcm-2で３０分間照射した。マウスの皮膚腫瘍領域の温度は、３７．７〜３８℃であった。腫瘍の応答は、治療後１日および４日間追跡した。結果を図９に示す。
【０１２４】
結果：図８と図９に示すように、上記した２．５mg/kgのＰｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＭ２Ｒ黒色腫のＰＤＴは、２４時間以内に腫瘍の壊死を伴う重症の炎症応答を誘導する。
【０１２５】
例１３．Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄベースのＰＤＴはマウスのＣ６神経膠腫転移形成速度を低下させる：手術に対する利点
これらの実験は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅベースのＰＤＴの治療可能性と、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅベースのＰＤＴによる転移拡大の確率を比較するために行った。
【０１２６】
（ i ）材料：２０％クレモフォール（cremophor）ＥＬ中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（例１と同様に調製した）またはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ ５mg/kg。
（ ii ）光源：光源は、１０cmのウォーターフィルタと７２０〜８５０nmの光バンドを有するキセノンフッ素ＬＳ３−ＰＤＴランプ（バイオスペック（Bio-Spec)、ロシア）であった。
（ iii ）マウス：ＣＤ１ヌードマウス。
（ iv ）腫瘍：マウスの後ろ足に１０6 個のＣ６神経膠腫細胞を移植した。７〜８mmの大きさになった時、腫瘍を治療した。
（ｖ）麻酔：５０μlのベタラール（Vetalar）／ルンポン（Rumpon）（容量／容量＝８５／１５）。
（ vi ）鎮痛薬：治療（切断またはＰＤＴ）の１週間、５％ショ糖飲料水にオキシコドン（１２mg/l）を加えた。
【０１２７】
（ vii ）プロトコール：３群（各群１０匹のマウス）に、５mg/kgの増感剤（Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ）を静脈内注射し、直ちに２００mW/cm2で３０分間照射し、動物をケージに戻した。第１群と第２群：それぞれ、ＰＤＴ Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄとＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを投与した動物。鼠径部の腫瘍応答と転移形成を、４週間追跡した。第３群：足根関節で切断した動物（第１群と対）で、鼠径部の転移形成を４週間追跡した。ＰＤＴに対する応答のパラメータは、処理した動物の総数のうちで、腫瘍の壊死と消失を有する動物のパーセントである。転移は鼠径部または他の部位で腫瘍が出現することにより明らかになった。終点と考えたものは、４週間の追跡、自然の死亡、腫瘍の直径が２cmに達した、転移のうちの、いずれか最初のもの。
【０１２８】
（ viii ）結果：腫瘍の平坦化（消失）の結果を、図１０に示す。１１日目は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄに対する応答は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅに対する応答より大きく（それぞれ１００％と８０％の腫瘍平坦化）、以後（２８日目）は、応答パーセントは約６０％で同様であった。長期間の腫瘍平坦化の減少は、おそらく光の領域と腫瘍領域が一致しないことにより、処理した動物の一部で腫瘍が再生したためである。転移出現の結果は、図１１に示す。足の切断手術は、ＰＤＴに比較して実質的に高い転移のパーセントを示した（７８％まで）。さらに切断後は、転移がはるかに早く現れた。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄを用いるＰＤＴ後の転移の頻度は、最も低かった（２３％まで）。この結果は、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを用いて得られたものに類似しており、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの主要な利点は、転移出現が遅延することである。Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅを用いるＰＤＴは、Ｃ６神経膠腫に対して治療的である。ＰＤＴ後の転移形成は、手術と比較すると実質的に低い。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アセトンとメタノールの混合物／リン酸Ｋ緩衝液中のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの吸光スペクトルを示す。
【図２】 高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）（ＦＡＢ−ＭＳ）により行われたＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの低分解能質量スペクトルを示す。
【図３】 高速原子衝撃（Fast Atom Bombardment）（ＦＡＢ−ＭＳ）により行われたＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの高分解能質量スペクトルを示す。
【図４】 ＰＤＴ後のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅによる、Ａ４３１細胞の時間依存性の形態変化を示す［図において、Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒは、ＢＣＨＬ−ＳｅｒＯＭｅ、ＢＣｈｌのセリルメチルエステルを表す］。
【図５】 ＥＣＶ−３０４細胞について試験したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＢＣｈｌ−ＳｅｒＯＭｅの光毒性を示す。
【図６】 Ｍ２Ｒマウス黒色腫培養細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄおよびＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−エチルエステルの光毒性を示す。（Ａ）９５％エタノールに溶解し、さらに培地＋１０％血清で、１％エタノールまでの表示される濃度まで希釈した色素。（Ｂ）培地＋１０％血清に直接溶解した色素。
【図７】 Ｍ２Ｒマウス黒色腫培養細胞およびヒトＨ２９結腸癌培養細胞に対するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄの光毒性を示す。
【図８】 クレモフォール（Cremophor）に溶解して塩溶液で希釈したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（２．５mg/kg）を用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを示す。
【図９】 塩溶液に溶解してクレモフォール（Cremophor）で希釈したＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ（２．５mg/kg）を用いるＭ２Ｒマウス黒色腫のＰＤＴを示す。
【図１０】 Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄまたはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ［図では、Ｐｄ−Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒ］を用いるＰＤＴ後の原発性Ｃ６神経膠腫の治癒を図解する。
【図１１】 手術（切断）後またはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄもしくはＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−ＳｅｒＯＭｅ［図では、Ｐｄ−Ｂｃｈｌ−Ｓｅｒ］を用いるＰＤＴ後の、ＣＤ１ヌードマウスにおけるＣ６神経膠腫転移の出現を示す。
Claims (25)
- 式Ｉ：
［式中、
Ａは、ＯＨまたはＯＲ 1 、
を表し、
Ｒ1は、Ｎａ+、Ｋ+、（Ｃａ2+）0.5、（Ｍｇ2+）0.5、Ｌｉ+、ＮＨ4 +、
+ＮＨ3−Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3、+ＮＨ3−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨ、
+ＮＨ2（ＣＨ3）−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）4−ＣＨ2ＯＨまたは
+Ｎ（Ｃn'Ｈ2n'+1）4を表し；
Ｒ 2 は、Ｈ、ＯＨまたはＣＯＯＲ 4 を表し、ここでＲ4は、Ｃ1−Ｃ12アルキルまたはＣ3−Ｃ12シクロアルキルであり；
Ｒ 3 は、ＨまたはＣ 1 −Ｃ 12 アルキルを表し；
ｎ'は、１、２、３または４であり、そして
＊は、不斉炭素を意味し、かつ---は、飽和単結合を表す］の化合物。 - 以下の式および光学的立体配置の、請求項１に記載の化合物：
［式中、Ａは、ＯＨまたはＯＲ1であり、そしてＲ1は請求項１と同義である］。 - 以下の式の、本明細書においてＰｄ−バクテリオフェオホルビドａ（Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄ）として特定される、ＡはＯＨである請求項２に記載の化合物：
- 請求項１〜３に記載の式Ｉの少なくとも１つの化合物を、生理学的に許容される担体と一緒に含んでなる、医薬組成物。
- 化合物は、組成物の総重量に基づき、０．０１〜２０重量％の量で存在する、請求項４に記載の医薬組成物。
- 転移腫瘍を含む腫瘍の光動力学的療法（ＰＤＴ）のための請求項４または５に記載の医薬組成物。
- 腫瘍の診断のための請求項４または５に記載の医薬組成物。
- ＡはＯＨである請求項１に記載の式Ｉの化合物の製造方法であって、
ａ）Ｍ−バクテリオフェオホルビド−１７3−Ｚ化合物（ここで、Ｚはフィチル、ゲラニルゲラニルまたはセリルメチルエステル（ＳｅｒＯＭｅ）であり、そしてＭは、Ｍｇ、Ｃｄ、およびＺｎから選択される金属である）の脱金属反応と加水分解を組合せた工程；および
ｂ）（ａ）で得られる化合物にＰｄ試薬を用いてＰｄを取り込む工程
とを含んでなる、製造方法。 - バクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で脱金属と加水分解を受け、そして得られるバクテリオフェオホルビドａ（ＢＰｈｅｉｄ）は、工程（ｂ）でＰｄ試薬と反応して、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの製造のための請求項８に記載の方法。
- ＡはＯＨである請求項１に記載の式Ｉの化合物の製造方法であって、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚの金属交換反応により、対応するＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチル、ゲラニルゲラニルまたはＳｅｒＯＭｅである）を得る工程；および
ｂ）（ａ）で得られる化合物の加水分解工程
とを含んでなる、製造方法。 - バクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で金属交換されて、本来の中心Ｍｇ原子がＰｄで置換され、そして得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルである）は、工程（ｂ）で加水分解されて、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの製造のための請求項１０に記載の方法。
- ＡはＯＨである請求項１に記載の式Ｉの化合物の製造方法であって、
ａ）ＢＣｈｌｉｄｅ−１７3−Ｚ（ここで、Ｚはフィチルまたはゲラニルゲラニルである）の酵素的加水分解により、ＢＣｈｌｉｄｅを得る工程、
ｂ）（ａ）のＢＣｈｌｉｄｅの酸性脱金属反応工程；および
ｃ）（ｂ）の脱金属化合物にＰｄ試薬を用いてＰｄを取り込む工程
とを含んでなる、製造方法。 - バクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）は、工程（ａ）で酵素的に加水分解され、工程（ｂ）で脱金属され、そして工程（ｃ）においてＰｄ試薬と反応して、所望のＰｄ−ＢＰｈｅｉｄが生じる、Ｐｄ−ＢＰｈｅｉｄの製造のための請求項１２に記載の製造方法。
- 得られるＰｄ−ＢＰｈｅｉｄ化合物と、対応するＡ−Ｈ化合物とを反応させて、式Ｉの化合物（ＡはＯＨとは異なる）を得る工程をさらに含んでなる、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- Ｐｄ試薬は、酢酸Ｐｄまたは塩化Ｐｄである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- Ｐｄの取り込みは、アスコルビン酸Ｎａまたはアスコルビン酸を使用する２工程法、あるいは６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸を使用する１工程法により行われる、請求項１５に記載の方法。
- 転移腫瘍を含む腫瘍の光動力学的療法（ＰＤＴ）において有用な、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物を含む、薬剤。
- 式Ｉの化合物はＰｄ−バクテリオフェオホルビドａである請求項１７に記載の薬剤。
- 腫瘍診断に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物を含む、薬剤。
- 式Ｉの化合物はＰｄ−バクテリオフェオホルビドａである請求項１９に記載の薬剤。
- 注射用に処方されている請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の薬剤。
- 局所投与用である請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の薬剤。
- 試料中の細菌、ウイルス、寄生虫および真菌のエクスビボ破壊において有用な、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物を含む、薬剤。
- 試料は輸注または血液製剤の製造のための血液または血漿から選択される請求項２３に記載の薬剤。
- 式Ｉの化合物はＰｄ−バクテリオフェオホルビドａである請求項２３または２４に記載の薬剤。
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