ES2277454T3

ES2277454T3 - Derivados de bacterioclorofila sustituidos con paladio y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2277454T3
Application number: ES99958470T
Authority: ES
Inventors: Avigdor Scherz; Yoram Salomon; Alexander Brandis; Hugo Scheer
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: WO2000033833A1; EP1137411B1; NO331426B1; JP4796227B2; EP1137411A4; PT1137411E; NZ512093A; US6569846B1; PL348201A1; DE69934328T2; JP2002531497A; CY1106450T1; NO20012807D0; HK1040638B; AU1583400A; HUP0105411A2; BR9916096B1; BR9916096A; ATE347554T1; RU2234508C2

Abstract

Un compuesto de fórmula I, I'' o I'''', en la que A representa OH, OR1, -O-(CH2)n-Y, -S-(CH2)n-Y, -NH-(CH2)n-Y, -O-(CH2)2-OH, -NH-(CH2)2-NH-BOC o -N-(CH2-CH=CH2)2 en la que R1 representa Na+, K+, (Ca2+)0, 5, (Mg2+)0, 5, Li+, NH4+ +NH3-C(CH2OH)3, +NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, +NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH o +N(CnuH2n''+1)4, y en la que * representa un carbono asimétrico y ¿ representa una unión saturada sencilla o una unión insaturada doble. en la que A representa OH, OR1, -O-(CH2)n-Y, -S-(CH2)n-Y, -NH-(CH2)n-Y, -O-(CH2)2-OH, -NH-(CH2)2-NH-BOC o -N-(CH2-CH=CH2)2 en la que R1 representa Na+, K+, (Ca2+)0, 5, (Mg2+)0, 5, Li+, NH4+ +NH3-C(CH2OH)3, +NH3-CH2-(CHOH)4-CH2OH, +NH2(CH3)-CH2-(CHOH)4-CH2OH o +N(CnuH2n''+1)4; R2 representa H, OH o COOR4, en la que R4 es alquilo C1-C2 o cicloalquilo C2-C12; R3 representa H, OH o alquilo o alcoxi C1-C12; n es 1, 2, 3, 4, 5, o 6, Y es -NR''1R''2 o -+NR''1R''2R''3, X, en la que R''1, R''2 y R''3 representan, independientemente entre sí -CH3 o -C2H5; X es F, Cl, Br o I, n'' es 1, 2, 3 o 4, y en la que * representa un carbono asimétrico y - representa una unión saturada sencilla o una unión insaturada doble.

Description

Derivados de bacterioclorofila sustituidos con paladio y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a derivados de bacterioclorofila sustituidos con paladio, procesos e intermediarios para su preparación y composiciones farmacéuticas que los comprenden, así como su uso en el campo de la terapia fotodinámica y diagnóstico in vivo y destrucción fotodinámica in vitro de virus y microorganismos.

Definiciones y abreviaturas

BChl = bacterioclorofila a (7,8,17,18-tetrahidroporfirina que contiene Mg, con un grupo fitilo o geranil-geranilo en posición 17^{3}, un grupo COOCH_{3} en posición 13^{2}, un átomo de H en posición 13^{2}, un grupo acetilo en posición 3 y un grupo etilo en posición 8).

BChilide = bacterioclorofilida a (el ácido carboxílico exento de C-17^{2}, derivado de BChl a).

BPhe = bacteriofeofitina a (BChl en la que el átomo de Mg central se reemplaza por dos átomos de H).

BPheid = bacteriofeoforbida a (el ácido carboxílico exento de C-17^{2} derivado de BPhe).

Pd-BPheid = Pd-bacteriofeoforbida a (el ácido carboxílico exento de C-17^{2} derivado de BPhe, con un átomo de Pd central, un grupo COOCH_{3} en posición 13^{2}, un átomo de H en posición 13^{2}, un grupo acetilo en posición 3 y un grupo etilo en posición 8).

A lo largo de la memoria se usa la numeración IUPAC de los derivados de bacterioclorofila. Usando esta nomenclatura, las bacterioclorofilas naturales llevan dos ésteres de ácido carboxílico en posiciones 13^{2} y 17^{2}, sin embargo están esterificados en posiciones 13^{3} y 17^{3}.

Antecedentes de la invención

Se ha producido un interés creciente en la utilización de sustancias fotosensibilizadoras para terapia del cáncer. Según esta técnica, conocida como terapia fotodinámica (PDT), las sustancias fososensibilizadoras se aplican por ejemplo a un tumor, y la fotosensibilización in situ produce compuestos que intoxican las células malignas.

La terapia fotodinámica que usa porfirinas y compuestos relacionados tiene, actualmente, una historia bastante larga. Los primeros trabajos, en los años 40, demostraron que la porfirina podía producir fluorescencia en tejido tumoral irradiado. Las porfirinas parecían acumularse en esos tejidos, y eran capaces de absorber luz in situ, proporcionando un medio para detectar el tumor mediante la localización de la fluorescencia. Una preparación ampliamente usada en las etapas tempranas del tratamiento fotodinámico, tanto para detección como para terapia, era un derivado bruto de hematoporfirina, también llamado derivado de hematoporfirina, HpD, o derivado de Lipson, preparado según se describe por Lipson y colaboradores en J. Natl. Cancer Inst. (1961) 26:1-8. Se ha realizado un trabajo considerable usando esta preparación, y Dougherty y colaboradores describieron el uso de este derivado en el tratamiento de las malignidades (Cancer Res. (1978) 38:2628-2635; J. Natl. Cancer Inst. (1979) 62:231-237).

Dougherty y colaboradores prepararon una forma más efectiva del derivado de hematoporfirina, que comprende una porción de HpD que tiene un peso de agregado > 10 kD. Esta forma de fármaco útil en la terapia fotodinámica es el objeto de la patente de EE.UU. 4.649.151, está disponible en el comercio y está en fase de ensayos
clínicos.

Los principios generales del uso de compuestos absorbedores de luz, especialmente los relacionados con las porfirinas, se han establecido totalmente como tratamiento para tumores, cuando se administran sistemáticamente. La capacidad diferencial de estas preparaciones para destruir el tumor, en contraposición al tejido normal, se debe al efecto orientador de estas preparaciones hacia las células inconvenientes. (Véase, por ejemplo, Dougherty, T.J., et al, "Cancer: Principles and practice of oncology" (1982), compiladores V.T. de Vita, Jr., et al, págs. 18361844). Se han realizado esfuerzos para mejorar la capacidad orientadora conjugando el derivado de hematoporfirina con anticuerpos (Véase, por ejemplo, Mew, D., et al., J. Immunol. (1983) 130:1473-1477). El mecanismo de estos fármacos en la destrucción de las células parece implicar la formación de oxígeno singlete tras la irradiación (Weishaupt, K. R., et al., Cancer Research (1976), págs. 1326-2329).

El uso del derivado de hematoporfirina o sus componentes activos en el tratamiento de enfermedades cutáneas, usando administración tópica, se ha descrito también en la patente de EE.UU. 4.753.958. Además, los fármacos se han usado para esterilizar muestras biológicas que contienen organismos infecciosos, como bacterias y virus (Matthews, J.L., et al., Transfusion (1988), 81-83). Otros compuestos fotosensibilizadores diversos se han usado para este propósito, como se indica, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.727.027.

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En general, los métodos para usar los sensibilizadores de radiación de diversas estructuras, para impedir selectivamente el funcionamiento de sustratos biológicos tanto in vivo como in vitro, se encuentran comprendidos en el estado de la técnica. Los compuestos útiles en estos procedimientos tienen que tener una afinidad diferencial para el sustrato biológico elegido como diana destinado a ser alterado o destruido, y tienen que ser capaces de absorber luz, de forma que el fármaco irradiado se transforma en activado, de modo que tenga un efecto deletéreo sobre las composiciones y materiales adyacentes.

Debido a que siempre es deseable optimizar el funcionamiento de las sustancias terapéuticas y de diagnóstico. se han buscado variaciones en los fármacos de porfirina usados tradicionalmente en el tratamiento y diagnóstico. Se han sugerido diversas clases generales de fotosensibilizadores, incluyendo ftalocianinas, compuestos relacionados con psoralen, y compuestos multicíclicos con sistemas resonantes en general. Los más similares a los compuestos aquí descritos son varios derivados de feoforbida, cuyo uso en terapia fotodinámica se ha descrito en la solicitud de patente europea 220686 de Nihon Metaphysics Company; derivados etilen-diamina de feoforbida para este propósito se describieron en la solicitud de patente japonesa J85/000981, de Tama Seikayaku, K.K., y en la solicitud de patente japonesa J88/004805, que se refiere a 10-Hydroxifeoforbida-a. Además, Beems, E.M., et al., en Photochemistry and Photobiology (1987) 46:639-643, describen el uso como fotosensibilizadores de dos derivados de bacterioclorofila-a-
bacterioclorofilina a (también conocida como bacteriofeoforida-a, que carece del alcohol fitilo derivatizado de la bacterioclorofila-a) y bacterioclorina-a (que carece tanto del grupo fitilo como del ión Mg). Estos autores dirigen su atención a estos derivados, ya que son ventajosos basándose en su hidrosolubilidad incrementada, comparados con la bacterioclorofila-a.

Los documentos EP-584552 y WO97/19081, ambas de Yeda Research and Development Co. Ltd., describen los derivados de clorofila y bacterioclorofila, y su uso como sustancias PDT, y bacterioclorofilas metalizadas y su preparación mediante transmetalización de los derivados Cd-BChl correspondientes, respectivamente.

El problema que queda es encontrar fotosensibilizadores adecuados en terapia fotodinámica y diagnóstico, que sean óptimos para objetivos particulares y contextos particulares. Por tanto, la invención proporciona un grupo adicional de compuestos fotosensibilizadores, que pasa a formar parte del repertorio de candidatos para uso en situaciones terapéuticas y diagnósticas específicas.

Sumario de la invención

Se ha descubierto ahora, según la presente invención, que los compuestos de fórmula I, I' o I'' debajo, en los que A, según se define abajo, representa un sustituyente capaz de permitir una transferencia de plasma y penetración en la membrana celular eficientes, son útiles como agentes de PDT y presentan las ventajas de una solubilidad, estabilidad y/o eficiencia incrementadas, comparados con los compuestos conocidos.

La invención se refiere, por tanto, a los compuestos de fórmula I, I' o I''

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1

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en las que,

A representa OH,

: \hskip0,1cm OR_{1},

: \hskip0,1cm -O-(CH_{2})_{n}-Y,

: \hskip0,1cm -S-(CH_{2})_{n}-Y,

: \hskip0,1cm -NH-(CH_{2})_{n}-Y,

: \hskip0,1cm -O-(CH_{2})_{2}-NH_{2},

: \hskip0,1cm -O-(CH_{2})_{2}-OH,

: \hskip0,1cm -NH-(CH_{2})_{n}-^{+}N o, X^{-},

: \hskip0,1cm -NH-(CH_{2})_{2}-NH=BOC o

: \hskip0,1cm -N-(CH_{2}-CH=CH_{2})_{2}

en la que

R_{1} representa Na^{+}, K^{+}, (Ca^{2+})_{0,5}, (Mg^{2+})_{0,5}, Li^{+}, NH_{4}^{+}

: \hskip0,15cm^{+}NH_{3}-C(CH_{2}OH)_{3}, ^{+}NH_{3}-CH_{2}-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH,

: \hskip0,15cm^{+}NH_{2}(CH_{3})-CH_{2}-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH o

: \hskip0,15cm^{+}N(C_{n}·H_{2n+1})_{4};

: \hskip0,15cm R_{2} representa H, OH o COOR_{4}, en la que R_{4} es alquilo C_{1}-C_{12} o cicloalquilo C_{3}-C_{12};

: \hskip0,15cm R_{3} representa H, OH, alquilo C_{1}-C_{12} o alcoxi;

: \hskip0,15cm n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6,

: \hskip0,15cm Y es -NR'_{1},R'_{2} O -^{+}NR'_{1}R'_{2}R'_{3}, X-, en la que R'_{1}, R'_{2} y R'_{3}, independientemente entre sí, represen- {}\hskip0,2cm tan -CH_{3} o -C_{2}H_{5};

: \hskip0,15cm X es F, Cl, Br o I,

: \hskip0,15cm n' es 1, 2, 3 o 4,

y en la que * representa un carbono asimétrico y - representa una unión saturada sencilla o una unión insaturada doble.

Además, la presente invención se refiere a procesos para la preparación de los nuevos compuestos anteriores.

Por tanto, en un aspecto, aquí se describe un método para realizar la alteración o destrucción de un sustrato biológico elegido como objetivo, el cual comprende tratar el sustrato elegido como objetivo con una cantidad del compuesto de fórmula I, I' o I'', efectiva para fotosensibilizar dicho sustrato, seguido de irradiación de dicho sustrato elegido como objetivo con radiación en una banda de longitud de onda absorbida por el compuesto de fórmula I, I' o I'', durante un tiempo efectivo para alterar o destruir el sustrato.

En otro aspecto, la invención se dirige por tanto a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de fórmula I, I' o I'' como sustancia activa, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones son útiles para terapia fotodinámica in vivo y diagnóstico de tumores, y para destruir células, virus y bacterias, parásitos y hongos, en muestras y en tejidos vivos, mediante técnicas fotodinámicas bien conocidas.

Además, la invención se refiere al uso de compuestos de fórmula I, I' o I'', para la preparación de una composición farmacéutica útil en terapia fotodinámica.

La invención se refiere además al uso de los compuestos de la invención para la preparación de composiciones útiles en el diagnóstico y la destrucción ex vivo de bacterias, parásitos, virus y hongos.

La invención se refiere además al cloruro y anhídrido de ácido de fórmulas II y III debajo, respectivamente, como intermediarios.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el espectro de absorción óptica de Pd-BPheid en una mezcla de acetona y fosfato de tampón metanol/K.

Las figuras 2 y 3 representan, respectivamente, espectros de masas de resolución baja y alta de Pd-BPheid realizados mediante bombardeo rápido de átomos (FAB-MS).

La Figura 4 muestra los cambios morfológicos dependientes del tiempo de células A431 con Pd-BPheid o BChl-SerOMe después de PDT. (En las figuras, Bchl-Ser significa BChl-SerOMe, el seril-metil-éster de BChl).

La Figura 5 muestra la fototoxicidad de Pd-BPheid y BChl-SerOMe, ensayada sobre células ECV-304.

La Figura 6 muestra la fototoxicidad de Pd-BPheid y Pd-Bpheid-etil éster, sobre células cultivadas de melanoma de ratón M2R. (A) pigmentos disueltos en etanol al 95% y diluidos además hasta las concentraciones indicadas en el medio de cultivo + suero al 10%, hasta etanol al 1%. (B) pigmentos disueltos directamente en medio de cultivo + suero al 10%.

La Figura 7 muestra la fototoxicidad de Pd-BPeid sobre células de melanoma de ratón M2R y células de carcinoma H29 de colon humano.

La Figura 8 muestra melanoma de ratón PDT O M2R con Pd-BPehid (2,5 mg/kg) disuelto en Cremophor y diluido en solución salina.

La Figura 9 muestra PDT o M2R de melanoma de ratón con Pd-Bheid (2,5 mg/kg), disuelto en solución salita y diluido con Cremophor.

La Figura 10 ilustra la cura de tumores de glioma C6 primario, tras PDT con Pd-Bpheid o Pd-BPheid-SerOMe [en la Figura, Pd-Bchl-Ser)]

La Figura 11 muestra la aparición de metástasis de glioma C6 en ratones inmunosuprimidos CD1 tras cirugía (amputación) o tras PDT con Pd-BPheid o Pd-BPheid-Ser-OMe [En la figura, Pd-Bchl-Ser].

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Descripción detallada de la invención

En una realización preferida, los compuestos de la invención tienen la siguiente fórmula, con la configuración óptima siguiente:

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en la que A es como anteriormente.

Cuando las líneas discontinuas que representan la unión entre C7 y C8 y C17 y C18 en la estructura anterior son una unión sencilla saturada, los átomos de carbono numerados 7, 8, 17 y 18 son átomos de carbono asimétricos. Cuando R_{2} o R_{3} es H, C13^{2} es un átomo de carbono asimétrico.

En presencia de oxígeno o en el aire ambiental y bajo la acción de la luz, puede producirse la oxidación de las uniones C7-C8 y C17-C18 anteriores, produciendo compuestos con uniones dobles en dichas posiciones C7-C8 y C17-C18.

Los compuestos de fórmula I' y I'' de la presente invención son formas oxidadas de los compuestos de fórmula I, y se pueden obtener mediante los procesos descritos en Chlorophyll, de Sheer H. (ed.), CRC Press, 1991, págs. 147-209.

En una realización preferida de la invención, los compuestos son aquellos en los que A es OR_{1}.

En la realización de máxima preferencia, el compuesto de la invención es Pd-PBheid (también denominado aquí algunas veces Pd-BChl-COOH), el compuesto de fórmula I en el que A es OH, que tiene la siguiente estructura:

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Uno de los procesos para la preparación de los compuestos de fórmula I, en el que A es OH, comprende al menos las etapas de:

a) desmetalación combinada e hidrólisis de un compuesto M-BPheid-17^{3}-Z, en la que Z es fitilo, geranil-geranilo (gg) o SerOMe (seril-O-metil-éster) y M es un metal seleccionado de Mg, Cd o Zn:

b) incorporación de Pd con un reactivo de Pd en el compuesto obtenido en (a), obteniéndose así un Pd-BPheid y, si se desea,

c) reacción posterior de la Pd-BPheid obtenida con un compuesto correspondiente de fórmula A-H para formar la sal R_{1} correspondiente o un compuesto en el que A no es OH.

En una realización preferida, el proceso se dirige a la preparación de Pd-BPheid y la bacterioclorofila a (Bchla) se desmetala e hidroliza en la etapa (a), y la bacteriofeforbida (BPheid) obtenida se hace reaccionar con un reactivo de paladio en la etapa (b), para producir la Pd-BPheid deseada.

Otro procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula I comprende al menos las etapas de:

a) transmetalación de una BChlide-17^{3}-Z para obtener la correspondiente Pd-BPheid-17^{3}-Z, en la que Z es un fitilo o geranilgeranilo o SerOMe,

b) hidrólisis del compuesto obtenido, y

c) opcionalmente, reacción posterior de la Pd-BPheid obtenida, con un compuesto correspondiente de fórmula A-H, para formar la sal R_{1} correspondiente o un compuesto en el que A no es OH.

En una realización preferida, el proceso se dirige a la preparación de Pd-BPheid y la bacterioclorofila a (Bchla) se transmetala en la etapa (a) para reemplazar el átomo de Mg central original por Pd, y la Pd-BPheid-17^{3}-Z obtenida, en la que Z es fitilo, se hidroliza en la etapa (b), para producir la Pd-BPheid deseada.

a) hidrólisis enzimática de una BChlide-17^{3}-Z, en la que Z es un fitilo o geranilgeranilo, para obtener una Bchlide;

b) desmetalación ácida de dicha BChlide de (a);

c) incorporación de Pd, con un reactivo de Pd en la BPheid desmetalada de (b); y

d) opcionalmente, reacción posterior de la Pd-BPheid obtenida, con un compuesto correspondiente de fórmula A-H, para formar la sal R_{1} correspondiente o un compuesto en el que A no es OH.

En los procesos anteriores para la preparación de compuestos de fórmula I, el reactivo de Pd puede ser cualquier compuesto reactivo conveniente que proporcione Pd en tales estructuras como, por ejemplo, acetato de Pd y cloruro de Pd.

La incorporación de Pd en los procedimientos anteriores se puede lograr mediante un procedimiento en dos etapas que usa ascorbato de Na o ácido ascórbico, o mediante un procedimiento de una etapa que usa ácido 6-O-palmitoíl-L-ascórbico.

Los compuestos de la invención en los que A es diferente de OH y OR_{1}, se pueden obtener mediante reacción de la Pd-BPheid (Pd-BChl-COOH) con el correspondiente compuesto A-H.

Los compuestos de fórmula II y III anteriores son intermediarios para los compuestos de fórmula I de la invención. Los cloruros ácidos de fórmula II, Pd-BPheid-COCI, se pueden obtener usando cualquier sustancia adecuada para formar cloruros de acilo, como por ejemplo SOCl_{2}.

Los anhídridos ácidos de fórmula III se pueden obtener mediante deshidratación de los compuestos de fórmula I, I', I'' con anhídrido acético.

Mediante reacción de estos intermediarios II y III con el correspondiente compuesto AH, se pueden obtener los compuestos de fórmula I, I' o I''.

La invención comprende además sales farmacéuticamente aceptables de los ácidos libres de fórmulas I, I' y I''. Las sales se pueden formar mediante métodos bien conocidos en la técnica, como mediante reacción del ácido libre o una sal del mismo con reactivos inorgánicos u orgánicos como por ejemplo, pero no limitados a, NaOH, KOH, sales de magnesio o calcio adecuadas, LiOH, NH_{4}OH, hidróxido de tetra-alquil-amonio, p.ej., hidróxido de tetraetil-amonio o N-metil-glucamina, glucamina y trietanol-amina.

Los compuestos de la invención están destinados al uso en terapia fotodinámica y diagnóstico con respecto a sustratos biológicos elegidos como objetivo. "Sustrato biológico elegido como objetivo" significa cualquier célula, virus o tejido que sea indeseable en el medio sobre el cual se emplea terapia u otra acción correctiva, como esterilización, o cuya localización se desea conocer, en un medio al cual se aplica el diagnóstico.

Según la presente invención, el fármaco se inyecta al sujeto, y se deja alcanzar una concentración óptima en el sustrato elegido como objetivo. A continuación, el sustrato elegido como objetivo se expone a radiación de una longitud de onda apropiada para el espectro de absorción del compuesto administrado. El efecto del compuesto se puede incrementar mediante incremento concomitante de la temperatura del sustrato elegido como objetivo.

Para uso en el método de la invención, los compuestos de la invención se formulan usando excipientes convencionales apropiados para el uso pretendido. Para la administración sistémica, en general, se emplean composiciones acuosas tamponadas, con suficiente detergente atóxico para disolver el compuesto activo. Como los compuestos de la invención generalmente no son muy solubles en agua, se puede emplear una cantidad solubilizante de tal detergente. Detergentes atóxicos adecuados incluyen, pero no están limitados a, Tween-80, varias sales biliares, como glicolato sódico, diversos análogos de sales biliares como los fusidatos. Composiciones alternativas utilizan vehículos de liposomas. La solución se tampona a un pH deseable, usando tampones convencionales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón fosfato Se pueden incluir también otros componentes que no interfieren con la actividad del fármaco, como cantidades estabilizadoras de proteínas, por ejemplo albúmina del suero, o lipoproteína de baja o alta densidad (LDL o HDL, respectivamente).

Las formulaciones sistémicas se pueden administrar mediante inyección, como inyección intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular o subcutánea (s.c.), o se pueden administrar mediante técnicas transmembranares o transdérmicas. Las formulaciones apropiadas para administración transdérmica o transmembranar incluyen pulverizadores y supositorios que contienen fluidos penetrantes, que pueden ser a menudo los detergentes descritos anteriormente.

Para administración tópica, la formulación puede contener también un fluido penetrante, y está en forma de un ungüento, pomada, linimento, crema o aceite. En Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, se encuentran formulaciones adecuadas para administración tópica, tanto sistémica como localizada.

Para uso ex vivo, para tratar, por ejemplo, sangre o plasma para transfusión o preparaciones de productos sanguíneos, no es necesaria una formulación especial, pero los compuestos de la invención se disuelven en un disolvente compatible adecuado y se mezclan en el fluido biológico a una concentración adecuada, típicamente del orden de 1-100 \mug/ml, previamente a la irradiación.

Para aplicaciones fotodinámicas terapéuticas y de diagnóstico, los intervalos de dosificación adecuados variarán con el modo de aplicación y la elección del compuesto, así como la naturaleza de la enfermedad tratada o diagnosticada. Sin embargo, en general, las dosificaciones adecuadas son del orden de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de 0,1 a 10 mg/kg. Para administración tópica, se emplean típicamente cantidades del orden de 5-100 mg totales.

Los procedimientos generales para el tratamiento fotodinámico ex vivo, son análogos a los descritos por Matthews, J.L., et al., Transfusion (supra).

En resumen, para administración sistémica, se deja pasar un período de tiempo adecuado después de la administración, típicamente de varios minutos a dos días, a fin de permitir una concentración óptima de los compuestos de la invención en el sustrato biológico elegido como objetivo. En general, este sustrato será una vasculatura tumoral, células tumorales o cualquier otro componente tumoral, y la localización del compuesto se puede controlar midiendo la absorción óptica del tejido elegido como objetivo, comparada con la absorción de fondo. Una vez lograda la optimización, el sustrato biológico elegido como objetivo se irradia con una banda adecuada de irradiación, en el intervalo de 740-800 nm, o 500-600 nm o 700-900 nm, a una velocidad de 5-750 mW/cm^{2}, y una energía total de 100-1000 J/cm^{2}.

Para tratamiento tópico, la localización es inmediata, y a continuación se puede proporcionar la radiación correspondiente. Para el tratamiento de fluidos biológicos ex vivo, se aplica la radiación tras alcanzar una unión/absorción óptima por el tejido elegido como objetivo. La fluencia de radiación es del orden de 1-10 J/cm^{2}. Debido a que no se requiere la penetración del tejido, se puede emplear una energía total inferior.

Las composiciones de la invención comprenden al menos un compuesto de fórmula I,I' o I'', según se definió anteriormente, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable. Estas composiciones pueden estar en forma de una solución, una emulsión lipídica o un gel, o en forma de liposomas o nanopartículas. El vehículo adecuado se elige para que permita la optimización de la concentración del compuesto de la invención en el sustrato elegido como objetivo. Ejemplos de tales vehículos son, pero no están limitados a, "Tween 80", polietilenglicol, p.ej. PEG400, "Cremophor EL", propilenglicol, etanol, aceite de albahaca, sales biliares y análogos de sales biliares, y sus mezclas. Las formulaciones de liposomas pueden estar basadas, por ejemplo, en dimiristoil-foafatidil-colina o fosfatidil-glicerol. El vehículo puede comprender también dipalmitoíl-fosfatidil-colina.

Cuando se usan nanopartículas, pueden estar en forma de nanopartículas de poli(ácido láctico) recubiertas con PEG. En la forma de emulsiones lipídicas, se usan normalmente lipoproteínas y triglicéridos de baja densidad.

En la composición de la invención, el compuesto o compuestos de la invención están en una cantidad de 0,01 a 20%, preferiblemente 0,05% a 5% en peso del peso total de la composición.

La invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de Pd-BPheid

Se preparó Pd-BPheid a partir de BChla, mediante el siguiente procedimiento en tres etapas.

(a) Aislamiento de bacterioclorofila a (BChla)

Se extrajo BChla de bacterias liofilizadas Rhodovolum sulfidophilum, como sigue:

Se trituraron células liofilizadas (100 g) hasta hacerlas polvo, se lavaron 5 veces con un total de 1250 ml de acetona para eliminar parcialmente por lavado los carotenoides, la mezcla se filtró y se extrajo BChla del sólido con metanol absoluto (\approx1200 ml, 4-5 filtraciones). Tras el filtrado, la solución azul oscuro-verde se evaporó parcialmente al vacío, la solución concentrada (\approx500 ml) se extrajo 2-3 veces con éter de gasolina (punto de ebullición 80-100ºC, \approx 1300 ml) para eliminar carotenoides adicionales, y la fase de éter de gasolina se extrajo dos veces con metanol (\approx 550 ml). Esta fase se desechó a continuación, la fase de metanol combinada se evaporó al vacío, y el residuo azul-verde se volvió a disolver en metanol-acetona (1:3, v/v) y se cargó sobre una columna de DEAE-Sefarosa (3 x 10 cm), equilibrada con metanol-acetona (1:3, v/v). La BChla se eluyó con metanol-acetona (1:3, v/v), la mezcla de metanol-acetona se evaporó, y la Bchla seca se volvió a disolver en un volumen exacto (para el espectro de absorción) de éter y se filtró a través de lana de algodón para eliminar el material de la columna disuelto. Después de una evaporación final, el pigmento sólido se almacenó en argón en la oscuridad a -20ºC. La extracción produjo: aproximadamente 700 mg de BChla por 100 g de células liofilizadas.

La columna de DEAE-Sefarosa se preparó según se describió previamente (Omata y Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., vol. 24, págs. 1093-1100). En resumen, la DEAE-Sefarosa se lavó con agua destilada y luego se convirtió en una forma de acetato, poniéndola en suspensión en un tampón de acetato sódico 1 M (pH = 7). La suspensión acuosa se lavó 3 veces con acetona y finalmente se puso en suspensión en metanol-acetona (1:3, v:v) para almacenamiento a 5ºC.

(b) Preparación de bacteriofeoforbida (BPheid)

Se disolvió un extracto de Bchla bruto según se obtuvo en (a) (aproximadamente 100 mg de Bchla que contenían algunos carotenoides residuales) en ácido trifluoroacético acuoso al 80% (aproximadamente 15 ml), que se había burbujeado con nitrógeno durante 10 min. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Luego, la mezcla de reacción se vertió en agua (250 ml) y se extrajo con cloroformo. El extracto se lavo dos veces con agua y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Tras la evaporación del disolvente, el residuo se cromatografió sobre sílice (columna de 3 cm x 15 cm, Kieselgel 60, Merck) y se eluyó con metanol en cloroformo mediante un gradiente escalonado: 2%, 5%, 10%, 15%. Al principio, se eliminaban mediante lavado los carotenoides y una pequeña cantidad de bacteriofeofitina, seguido de elución de alo-bacteriofeofitina y carotenoides. Con metanol al 10% en cloroformo, el producto se empezó a recoger y supervisar mediante TLC (Kieselgel, cloroformo-metanol, 9:1). El producto (60 mg) se evaporó, y el residuo se disolvió en CHCl_{3}, se filtró a través de una membrana UltraPore, para eliminar la sílice residual que, de lo contrario, podría producir oxidaciones.

(c) Incorporación de paladio en bacteriofeoforbida (Bpheid)

Se disolvieron BPheid (100 mg), según se obtuvo en (b) y acetato de paladio (80 mg), en dicloro-metano (\approx 10 ml) y se añadió a una suspensión de 200 mg de ascorbato sódico en 50 ml de metanol. La mezcla de reacción se agitó en un matraz cerrado a temperatura ambiente, y se recogieron muestras de la mezcla de reacción cada 15-20 minutos, y se registró su absorción óptica. Después de aproximadamente 4 horas, la mayoría de la absorción de BPheid a 357 nm se había reemplazado por la absorción de Pd-Bheid a 330 y 390 nm.

La mezcla de reacción se transfirió a una solución de cloroformo/agua (200 ml; 50:50 v/v), y se agitó en un embudo de separación. La fase orgánica se recogió, se lavó con agua, se secó sobre cloruro sódico anhidro, y se evaporó. El material seco se añadió a 80 mg de acetato de paladio y se repitieron las etapas anteriores hasta que la absorción residual a 357 nm desapareció completamente y la proporción entre la absorción a 765 nm (el pico de la transición más roja) y el máximo de absorción a 330 nm alcanzó el valor de \approx 2,4 (en cloroformo).

La mezcla de reacción seca se disolvió en un volumen mínimo de 2:1 cloroformo:acetona, y se cargó sobre una columna de CM-Sefarosa (150 mm x 25 mm), que se había equilibrado previamente con acetona. La columna se lavó primero con acetona y la primera fracción eluida se desechó. La columna se lavó a continuación con acetona:metanol 9:1. Se revelaron dos bandas y se eliminaron mediante lavado - la primera era el producto principal y la segunda era un subproducto alomerizado (desechado). El producto se concentró casi hasta la sequedad, y se transfirió a un sistema de cloroformo:agua 50:50, en un embudo de separación. La mezcla se agitó cuidadosamente y la fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico anhidro (o cloruro sódico) y se evaporó hasta la sequedad.

Ejemplo 2 Preparación de Pd-BPheid (a) Aislamiento de Bchla

Esta etapa del procedimiento se realizó como en el Ejemplo 1(a) anterior.

(b) Preparación de Pd-Bpheid

Se disolvió ácido 6-O-palmitoíl-L-ascórbico (246 mg, 593 \mumoles) en MeOH (84 ml) y se hizo pasar N_{2} a través de la solución. Se disolvieron Bpheid (92 mg, 151 \mumoles) y Pd(CH_{3}COOH)_{2} (83 mg, 370 \mumoles) en CHCl_{3} (34 ml, desgasificado con N_{2}) y se añadieron a la solución metanólica. La mezcla se mantuvo en atmósfera inerte mediante agitación y se supervisó el avance de la reacción registrando los espectros de absorción de pequeñas partes de la reacción cada pocos minutos. Después de \sim30 min, la reacción se completó y los disolventes se evaporaron.

(c) Purificación de Pd-Bpheid

La Pd-Bpheid bruta se disolvió en CHCl_{3} y se cargó sobre una columna rellena con 15 g de sílice-Asc. al 0,4%. Se hizo pasar un pequeño volumen de CHCl_{3} (\sim30 ml) a través de la columna y luego se eluyó el pigmento usando MeOH-CHCl_{3} (1:99, \sim250 ml). La pureza de las fracciones se determinó mediante TLC y espectroscopía de absorción óptica. Se realizó espectroscopía de masas y detección de NMR sobre muestras representativas. Producto: 82,5 mg de Pd-Bpheid pura (76%).

Para la preparación de sílice-Asc al 0,4%, se disolvió ácido ascórbico (240 mg) en 240 cc. de una mezcla de EtOH:CHCl_{3}:MeOH (60:60:120). Se añadió gel de sílice 60 (60 g, Merck, Nº de catálogo 107734, malla 70-230) y suspensión acuosa de la mezcla se agitó durante 10 min. y luego se filtro en la bomba. La sílice-Asc amarillenta se secó finalmente durante \sim1 h. a \sim50ºC. Esta sílice-Asc. al 0,4% está preparada para usarla como gel de sílice corriente; su naturaleza es menos polar y tiene ciertas propiedades antioxidantes.

Ejemplo 3 Preparación de Pd-BPheid (a) Aislamiento de Bchla

Esta etapa se realizó como en el Ejemplo 1(a) anterior.

(b) Preparación de clorofilasa (Chlase)

Se preparó clorofilasa (Chlase) de cloroplastos de Melia azedarach L, hojas de cinamomo. Se trituraron hojas frescas (50 g) durante 2 min. en una mezcladora que contenía 350 ml de acetona enfriada hasta -20ºC. El homogeneizado se filtro a través de cuatro capas de gasa, y el filtrado se recogió y se dejó durante la noche a 4ºC para una precipitación posterior. La acetona se eliminó mediante filtración, y el polvo restante se lavó varias veces con acetona fría para eliminar los restos de Chlase y carotenoides, hasta que el filtrado era incoloro. El polvo de acetona de Chlase se secó finalmente en un liofilizador y se almacenó posteriormente a -20ºC. En estas condiciones, la preparación enzimática era estable durante 1 año, sin pérdida perceptible de actividad. Producto: se obtuvieron 20 g de Chlase por 1 kg de hojas.

(c) Síntesis y purificación de bacterioclorofilida (BChlide)

Se disolvió ácido ascórbico (70 mg; Merck) en agua (9 ml), el pH de la solución se ajustó hasta 7,7 usando una solución acuosa de KOH 10 M, y se añadió 1 ml de tampón de fosfato sódico 0,5 M (pH 7,7) para mantener el pH durante la reacción. Se añadió Triton X-100 (aproximadamente 80 \mul), para lograr una concentración de detergente final de 0,8% (v/v). Se homogenizó polvo de acetona de Chlase (200 mg) en 6 ml de esta solución, usando una homogeneizadora Polytron. La solución restante se usó para lavar el instrumento, y luego se combinó con el homogeneizado. La solución enzimática se sometió a ultrasonidos con 20 mg de Bchla sólida saturada con argón e incubada en la oscuridad durante 6 h a 37ºC, con agitación simultánea.

\newpage

Para purificación, el material de reacción se congeló directamente (-20ºC) tras 6 h de reacción y, posteriormente, se liofilizó. El residuo seco se disolvió en acetona y se sometió a ultrasonidos, y la solución se sometió luego a una columna de CM-Sefarosa equilibrada en acetona. La columna se lavó con acetona para eluir el material que no había reaccionado y luego con metanol al 5% y al 7% (v/v) en acetona, para eluir bacterioclorofilida (Bchlide) y bacteriofeoforbida (BPheid). El producto se eluyó con metanol al 25% en acetona. El disolvente se evaporó y el pigmento sólido se almacenó en argón, a -20ºC, en la oscuridad. Rendimiento de la reacción: 30-55%.

La CM-Sefarosa para cromatografía se preparó primero lavando CM-Sefarosa con agua, y luego 3 veces con acetona, antes de rellenar una columna y equilibrar en acetona. El material cromatográfico se podría reutilizar después de aclarado cuidadoso con solución acuosa de NaCl 2 M hasta tornarse incoloro, lavado con agua, y nueva suspensión en acetona.

(d) Incorporación de paladio en la bacteriofeoforbida (BPheid)

El procedimiento es el mismo que en el Ejemplo 1 (c) anterior. La HPLC del material seco mostraba el producto principal en forma de dos epímeros que eran químicamente idénticos (88% de la mezcla total) y alómeros residuales. Había también una ligera contaminación (0,5%) de la materia prima, BPheid.

Ejemplo 4 Caracterización del compuesto Pd-BPheid (a) Espectros de absorción

Los espectros de absorción de Pd-BPheid se determinaron con un espectrofotómetro UVICON (1 cm de paso de luz), usando un detector de PM que está normalizado hasta la línea de base. La sensibilidad es 0,05.

En la Tabla 1 y la Figura 1 se describen los espectros de absorbancia de Pd-BPheid en acetona y una mezcla de metanol/tampón de fosfato potásico.

El espectro de absorbancia de Pd-BPheid en plasma viró hacia el rojo a 763 nm.

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TABLA 1

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La detección gráfica reveló los siguientes picos según la Figura 1: a 758 nm: 1,2502; a 537 nm: 0,3239; a 384 nm: 0,5351; y a 329 nm: 0,7766.

(b) Detección HPLC de Pd-BPheid

Se desarrolló un método HPLC de fase inversa para caracterizar el perfil de impurezas y cuantificar la paladio-BPheid.

Fase sólida:: Inertsil C_{8} 5 \mum, 250 x 4,6 mm

Fase líquida:: metanol: tampón de fosfato potásico 20 mM; pH = 6,59 (70%:30%)

Velocidad de flujo:: 1 ml/min.

Volumen de inyección:: 100 \mul

Detección:: 1-Spectroflow 783, Lámpara de deuterio: 385 nm2-Spectroflow 757, Lámpara de volframio: 753 nm

Según se muestra en la Tabla 2, el análisis HPLC del producto Pd-Bpehid, según se obtuvo en el Ejemplo 3, presentaba 7 picos. El pico principal representaba de 64 a 70% de los productos totales.

Las soluciones de Pd-BPheid almacenadas en acetona a -20ºC eran estables durante al menos un período de 2 meses. Cuando la solución de reserva se mantenía a temperatura ambiente durante 18 horas, no se observaba ningún cambio en el perfil HPLC, mostrando que la Pd-BPheid es un compuesto estable.

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TABLA 2 Detección HPLC de Pd-BPheid

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(c) Caracterización de Pd-BPheid mediante NMR

Tras una etapa de purificación de la Pd-BPheid preparada según el Ejemplo 3, el porcentaje del pico principal era superior al 90%. Esta purificación se realizó mediante una HPLC C8 preparativa. Este compuesto purificado se usó para la caracterización del producto mediante NMR y espectrometría de masas.

El análisis de Pd-BPheid mediante NMR se realizó y los cambios químicos se enumeran en la Tabla 3:

- ^{1}H NMR y ^{13}C NMR

- 2D^{1}H NMR (COSY y NOESY)

- 2D^{1}H-^{13}C NMR (HMQC y HMBC: detección inversa).

TABLA 3 Cambios químicos ^{1}H, ^{13}C (ppm)

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(d) Caracterización de Pd-BPheid mediante espectrometría de masas

El análisis de espectrometría de masas de Pd-BPheid produjo los espectros representados en las Figuras 2 y 3. Se realizó mediante bombardeo rápido de átomos (FAB), a resoluciones baja y elevada. El espectrómetro era un espectrómetro "ZabSpec TOF Micromass"; modo de ionización: LSIMS con Cs^{+}, positiva, aceleración: 8 kV; temperatura de la fuente: 40ºC; disolvente usado: nNBA (alcohol meta-nitrobencílico); entrada: lateral.

Resultados: tipo de ión: M+; fórmula: C_{35}H_{36}N_{4}O_{61}^{106}Pd; teoría: 714,1670 Z:1, m/z teórico 714,1670, m/z encontrado 714,1689.

Estos resultados confirmaron el estudio NMR: m/e = 714 y confirmaron la inserción de paladio metálico.

La estructura química analizada mediante NMR y espectrometría de masas es el derivado de paladio de la forma de ácido libre de BChl-Pd-BPheid.

Ejemplo 5 Actividad biológica de Pd-BPheid sobre células L1210 murinas y HT29 humanas

(i) Líneas celulares. La línea celular de leucemia murina (L1210) se mantuvo en cultivo en suspensión usando medio de Fischer enriquecido con suero equino al 10%, glutamina 1 mM, marcaptoetanol 1 mM y gentamicina. El tumor RIF (fibrosarcoma inducido por radiación) se mantuvo y describió por Twentyman et al. (1980, "A new mouse tumor model system (RIF-1) for comparison of end-point studies", J. Natl. Cancer Inst., 64, 595-604). Los cultivos se dejaron crecer en medio de Weymouth que contenía suero bovino fetal al 10% y gentamicina.

Se cultivaron células de adenocarcinoma de colon humano HT29 en RPMI 1640 sin rojo fenol y con FCS al 10%. Las células se subcultivaron mediante dispersión con tripsina al 0,25% en EDTA AL 0,02% y se volvieron a sembrar en placa a intervalos de 1:5.

(ii) Fototoxicidad in vitro . Para estudios de fototoxicidad que implican células L1210 y RIF, se proporcionó luz mediante una fuente de cuarzo-halógena de 600 vatios filtrada con 10 cm de agua y un dispositivo de ajuste de 850 nm de límite, para eliminar los IR. La anchura de banda se limitó aún más hasta 660 \pm 5 nm mediante un dispositivo de ajuste de interferencias (Oriel). Se incubaron células en suspensión (L1210) o adheridas a portas de 24 mm de diámetro, en medio de cultivo (con HEPES 20 mM a pH 7 en lugar de NaHCO_{3} para una capacidad tamponadora adicional), durante 15 min., en presencia de concentraciones especificadas de sustancias fotosensibilizadoras. Las células se lavaron a continuación para eliminar la sustancia fotosensibilizadora y se transfirieron a medio sin tratar. Las irradiaciones se realizaron a 10ºC. Para algunos estudios, las células se marcaron a continuación con sondas fluorescentes y se evaluó el deterioro producido por la luz. En otros estudios, las células se incubaron a continuación durante 60 min. a 37ºC en medio sin tratar, para permitir que se produjese la apoptosis. Se realizaron estudios de viabilidad usando placas de 96 pocillos y un ensayo MTT de 72 horas, por cuadruplicado.

Para el modelo HT29, las células se incubaron durante 1 hora con diferentes concentraciones de Pd-Bpheid y se irradiaron mediante una lámpara halógena o un láser de zafiro de titanio con 300 mW/cm^{2} a 10 y 25 J/cm^{2}.

(iii) Viabilidad de las células. La supervivencia celular se valoró mediante la reacción MTT realizada 3 días después de sembrar 1.000-50.000 células en placas de 96 pocillos. La intensidad de color se comparó con una curva estándar que contenía números variables de células testigo. Se determinó la absorbancia a x nm con un lector de placas de BioRad. Para L1210, se permitió el crecimiento en medio sin tratar durante los siguientes 3 días, y los números de células se estimaron de forma similar, usando el procedimiento de ensayo MTT.

(iv) Unión de lipoproteína. Se determinó la unión de Pd-BPheid a compuestos de proteína y lipoproteína de plasma humano testigo. Se llevo a cabo la incubación de una muestra de 250 \mul de plasma con 3 \muM del compuesto, durante 30 min. a 37ºC. Los componentes de lipoproteína y proteína se separaron a continuación mediante centrifugadora de gradiente de densidad. Los gradientes se fraccionaron, las fracciones se diluyeron en 3 ml de detergente Triton X-100 10 mM o se determinó la fluorescencia a 750-800 nm, determinada tras excitación a 400 nm.

Resultados (v) Efecto de fototoxicidad de Pd-BPheid sobre células L1210

Se incubaron células de leucemia murina L1210 con 1 \muM de Pd-BPheid durante 30 min. a 37ºC, produciendo un 50% de destrucción celular, usando una dosis de 75 mJ/cm^{2} de luz a 750 \pm 5 nm. Un grado similar de destrucción celular en la línea RIF, requería una dosis de luz de 215 mJ/cm^{2}.

(vi) Efecto de fototoxicidad de Pd-BPheid sobre células HT29

El índice de supervivencia variaba entre 100% y 79% cuando las células HT29 se incubaban con Pd-BPheid sin luz. El índice de supervivencia celular se reducía cuando la concentración de Pd-BPheid era superior y cuando las dosis de energía suministrada se incrementaban. La dosis de sustancia fotosensibilizadora de Pd-BPheid que producía un índice de muerte de 50% (también llamada LD_{50}) era 48 \muM, bajo una irradiación de 25 J/cm^{2}. La longitud de onda de excitación que inducía la fototoxicidad más importante era 773 nm.

(vii) Sitios de deterioro producido por la luz. Usando células L1210 de leucemia de ratón, La Pd BPheid era una sustancia fotosensibilizadora mitocondrial altamente específica, sin deterioro producido por la luz detectable a la membrana plasmática o a los lisosomas. Tal resultado se ha asociado con la iniciación rápida de la apoptosis.

(viii) Unión a lipoproteínas plasmáticas. Los estudios realizados indicaban que la Pd-BPheid se unía a HDL>
LDL\may{3}fracciones de albúmina del suero humano, consideradas como un determinante de la selectividad por PDT.

Ejemplo 6 Formulaciones de Pd-BPheid: Solubilización y estabilidad de Pd-BPheid en disolventes usados para experimentos animales

Se obtuvieron soluciones de Pd-BPheid en diferentes formulaciones, para obtener una concentración de 0,05 a 2%.

(a) Se preparó una formulación de Cremofor como sigue: se disolvieron 40 mg de Pd-BPheid en 2 ml de Cremofor EL en un tubo seco, mediante rotación lenta del vial hasta que la solución estaba completamente exenta de partículas, o usando pulsos cortos de una sonda de oscilador sónico. El tubo se enfrió de forma que la temperatura no subiese por encima de 30ºC. Una vez solubilizado el fármaco, se añadieron 0,6 ml de propilenglicol y se mezcló otra vez mediante rotación lenta o con la sonda sónica. A continuación se añadió NaCl isotónico en porciones de 0,1 ml hasta un volumen total de 4 ml. La mezcla debería de ser transparente después de cada adición, sin evidencia de precipitado. Las composiciones se trataron brevemente con la sonda sónica después de cada adición de NaCl al 0,9%, teniendo cuidado de mantener la temperatura por debajo de 25-30ºC. La concentración del fármaco se valoró midiendo la absorbancia a 757 nm, tras dilución en etanol.

Cuando se usaban 20 mg/kg de Pd-BPheid en estudios experimentales, esto se traducía en 0,4 mg por 20 gramos de ratón. Debido a que no se pueden inyectar más de 0,1 ml de Cremofor en una vena de la cola, la concentración de fármaco era entonces 4 mg/ml.

(b) Se preparó una formulación de Cremofor modificada como sigue: se mezclaron 5 mg de Pd-BPheid con 0,4 ml de Cremofor EL. Tras la disolución, se añadieron 0,12 ml de propilenglicol. Luego se añadió solución salina isotónica (1,48 ml) en pequeñas porciones, y se mezcló después de cada adición. La solución final era completamente transparente y exenta de partículas. Se usó una sonda ultrasónica para ayudar a disolver el fármaco, manteniendo las soluciones por debajo de 25ºC, enfriando si era necesario en un baño de hielo.

La determinación de la concentración de Pd-BPheid en la solución de Cremofor se realizó mediante dilución en metanol. El espectro de absorbancia se midió a 740-780 nm. El valor máximo se comparó con los resultados de una concentración conocida de Pd-BPheid.

(c) Se prepararon formulaciones adicionales usando Tween 80 y etanol para solubilizar Pd-BPheid (1 md de Pd-BPheid/ml de solución).

Ejemplo 7 Estudios de toxicidad in vivo - efecto de Pd-BPheid en modelos tumorales murinos

Se usaron dos grupos de experimentos que implicaban modelos tumorales murinos, para valorar la fototoxicidad de Pd-BPheid.

(a) La sensibilidad fotodinámica de Pd-BPheid se evaluó inicialmente en dos modelos tumorales murinos: BA-adenocarcinoma mamario y fibrosarcoma inducido por radiación (RIF-1).

Parámetros de terapia fotodinámica: Se introdujeron ratones con tumores que medían 5-7 mm de diámetro, en experimentos PDT. Se evaluaron tres dosis de fármaco de Pd-BPheid (1, 5 y 10 mg/kg) y dos dosis de luz (100 y 300 Julios/cm^{2}). Se administró una formulación de Pd-BPheid disuelta en Cremofor, mediante inyección i.v. en la cola. La exposición a luz PDT se inició cada 15 minutos, 1 hora o 4 horas después de la inyección. Se trataron tres ratones con cada condición de tratamiento, a menos que los resultados iniciales demostrasen toxicidad letal o falta de respuesta. Se usó un láser de zafiro de titanio ajustado a 757 nm como fuente de luz para PDT. La luz generada por el láser se acopló en fibras de cuarzo para suministro de luz a tumores. Se usó una densidad de potencia de luz de 75 mW/cm^{2}. El tamaño del tumor se midió 3 días por semana tras los tratamientos PDT y se determinó el porcentaje de curas de tumores (definido como no repetición del tumor durante 40 días posteriores al tratamiento).

Respuesta PDT in vivo: Las tablas 4 y 5 a continuación proporcionan sumarios de los resultados de tratamiento PDT para ratones C3H transplantados, bien con el carcinoma mamario BA o con el fibrosarcoma RIF-1. Cada tabla indica los siguientes parámetros: 1) dosis de fármaco intravenosa expresada en mg/kg; 2) parámetros de tratamiento láser, incluyendo la dosis de luz total (J/cm^{2}), la longitud de onda (757 nm), la velocidad de dosificación de la luz (mW/cm^{2}), y el intervalo de tiempo (entre los tratados para cada grupo, 4), toxicidad (cuatro ratones murieron en breve después del tratamiento), nuevo crecimiento tumoral (consistente en el número de días entre el tratamiento PDT y la reaparición del tumor) y 6) el número (y porcentaje) de ratones con curas tumorales inducidas por Pd-BPheid PDT.

Según se muestra aquí, se demostró que la PDT en la que interviene Pd-BPheid inducía una respuesta tumoricida clásica y eficiente en dos modelos tumorales de ratón. La sensibilidad tumoral en la que interviene PDT se correlacionaba directamente con la dosis de fármaco, la dosis de luz y el intervalo de tiempo entre la administración del fármaco y el tratamiento lumínico. Específicamente, dosis de fármaco mayores y/o dosis de luz mayores producían respuestas mejoradas. Se demostró que el carcinoma mamario BA era más sensible a PDT mediada por Pd-BPheid que tratamientos de PDT comparables del fibrosarcoma RIF-1. La PDT en la que interviene Pd-BPheid era efectiva cuando los tratamientos lumínicos se iniciaban en la hora posterior a la administración del fármaco, y no era efectiva cuando se usaba un intervalo de 4 horas entre la administración del fármaco y el tratamiento lumínico.

(b) En el segundo grupo de experimentos, se valoró la fototoxicidad de Pd-BPheid en un modelo de tumor de ratón transplantado con adenocarcinoma de colon humano HT29.

Modelo animal y tumoral: Se trituró mecánicamente en 1 ml de solución salina al 0,9% un tejido tumoral sólido (2 cm de diámetro) extirpado de un ratón donador, inmediatamente después de la muerte, y la solución (0,1 ml) se inyectó s.c. en un cuarto trasero de la pata de cada ratón. Los ratones se incluían para experimentos cuando el diámetro del tumor era 8-10 mm. Los tumores se injertaron s.c. en ratones inmunosuprimidos Swiss de 8 semanas, 10 días después del experimento.

Estudios fototóxicos: se inyectaron 0,15 ml de Pd-BPheid i.v. a razón de 15 mg/kg. Los ratones se anestesiaron con tiopental a razón de 40 mg/kg justo antes de la irradiación. A los 30 min., 1 h o 24 h después de la inyección, los ratones se irradiaron con un láser de zafiro de titanio a razón de 300 mW/cm^{2}, y se midieron los diámetros medios para ajustar el tiempo de irradiación, hasta obtener 200 o 300 J/cm^{2}. Los ratones testigo no inyectados con Pd-BPheid se irradiaron también en las mismas condiciones. El retraso en el crecimiento tumoral por PDT se analizó mediante equivalencia con ensayos realizados en radioterapia experimental. Para estudios in vivo y para cada experimento separado, todos los resultados eran la media de 2 o 3 experimentos separados, y para cada experimento separado, se usaron 2 ratones para cada condición experimental.

En referencia a los estudios de crecimiento tumoral, los resultados se expresan como variaciones del índice tumoral con referencia (=1) correspondiente al índice tumoral de células no tratadas. El índice tumoral se calculó como sigue:

Índice tumoral = (diámetro tumoral máximo + diámetro opuesto perpendicularmente)/2.

Estudios de variación de temperatura: para asegurar que el efecto térmico no era excesivo, se midió la variación de temperatura para la lámpara halógena y la irradiación láser de zafiro de titanio, usando microtermopares embutidos en aluminio, no absorbentes.

Los resultados de este experimento son los siguientes:

(i) Irradiación de 763 nm a 200 J/cm^{2}

Se observó una reducción del crecimiento tumoral (comparada con los testigos) para las condiciones de 30 min. y 4 h después de la inyección. Se observó una reducción del índice tumoral de hasta 7 días, para las condiciones de 1 h y 24 h tras la inyección.

(ii) Irradiación de 763 nm a 300 J/cm^{2}

Se observó una reducción del crecimiento tumoral (comparada con los testigos) para las condiciones de 30 min. y 24 h después de la inyección. Se observó una reducción del índice tumoral de hasta 7 días, para las condiciones de 1 h y 4 h tras la inyección.

(iii) Irradiación de 300 J/cm^{2} 1 h después de la inyección

Se observó una reducción del crecimiento tumoral (comparada con los testigos), para la condición de 773 nm y de hasta 5 días, y para las condiciones de 763 nm y 773 nm, hasta 12 días. La reducción del crecimiento tumoral máxima se observó para 773 nm.

(iv) Irradiación de 300 J/cm^{2}, 24 h después de la inyección

Se observó una reducción del crecimiento tumoral (comparada con los tetigos) para la condición de 753 nm hasta 4 días y para las condiciones de 763 nm y 773 nm hasta 12 días. La máxima reducción del crecimiento tumoral se observó para 773 nm.

No se observó una variación de temperatura excesiva durante la irradiación de ratones con lámpara halógena o zafiro de titanio.

Como resumen de este estudio, se encontró que la longitud de onda de irradiación óptima era 773 nm. El retraso entre la inyección y la iluminación tenía una influencia en la respuesta tumoral. A 764 nm, se observó que lo más eficiente era un retraso de 1 hora. Cuando se usa una longitud de onda de 773 nm, el retraso más eficiente era de 24 horas.

TABLA 4 Respuesta de carcinoma mamario C3H/BA a Pd-Bpheid

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TABLA 5 Respuesta RIF-1 a Pd-BPheid

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Ejemplo 8 Evaluación morfológica de células carcinoides epiteliales humanas A431 tras PDT basada en Pd-BPheid y Bchl-Ser

Este experimento se realizó para examinar los cambios morfológicos dependientes del tiempo que se producían tras PDT con Pd-BPheid o BChl-SerOMe en células carcinoides epiteliales humanas A431.

(i) Materiales: La Pd-BPheid se preparó como en el Ejemplo 1 anterior, y el éster de metil serina BChl-SerOMe se preparó como en el documento EP 584552.

(ii) Fuente de luz: Lámpara halógena (Osram, Alemania, 100 W), con filtro de agua de 4,5 cm y umbral del
filtro >650 nm. Las células se iluminaron durante 10 minutos, 15 mW/cm^{2}, a una fluencia de energía total de 9 J/cm^{2}. Para iluminación, las placas de cultivo se colocaron sobre una mesa de cristal, para proporcionar luz desde el fondo.

(iii) Estudio de fototoxicidad: Se sembraron células A431 (5x10^{4} células) en placas de 3 cm por duplicado, y se cultivaron hasta el 75% de confluencia en medio de Dulbecco modificado con Eagle (DMEM) + F12 (1:1), tamponado con HEPES (25 mM, pH 7,4), suero bovino fetal (FCS) con penicilina (0,06 mg/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml). Se añadieron Pd-BPheid o BChl-Ser a las células a la concentración LD_{90} correspondiente (0,1 y 1 \muM, respectivamente). Tras un período de 4 horas, las células se lavaron con medio de cultivo y las células se iluminaron con la fuente de luz anterior. El examen microscópico de contraste de fases se realizó en diferentes momentos tras la iluminación (0, 0,5, 4 y 24 horas tras PDT) usando un microscopio de luz Zeiss Axiovert-35 (amplificación x 320), equipado con una cámara SLR Contax de 35 mm. En la segunda placa de cada duplicado, se valoró la viabilidad celular 24 horas después de PDT, usando un ensayo de viabilidad de rojo neutro (Zhang SZ, 1990, Cell Biol. Toxicol. 6(2):219-234).

(iv) Resultados: Ambas sustancias fotosensibilizadoras producían cambios significativos en la morfología celular. La Pd-Bpheid producía una alteración rápida en la estructura de la membrana de las células (30 minutos), las células se encogían rápidamente y se formaban conexiones fibrosas, conectando las membranas celulares con los puntos de adhesión focal originales (fenotipo fibroso). Tras 4 horas, 90% de las células perdían la mayoría de su volumen interno y una gran proporción de las mismas se despegaban de la placa; no se observaba ningún cambio adicional tras 24 horas (Fig. 4, columna derecha). BChl-Ser mostraba un patrón diferente de cambios morfológicos dependientes del tiempo, que se podían observar sólo tras 4 horas. Se observó vesiculación de la membrana en forma de vesículas oscuras que brotaban de la membrana celular. No se observó una reducción de volumen significativa durante 24 horas y, después de este período, la mayoría de las células estaban unidas a la placa pero aparecían huecas (fenotipo vesiculado, Fig. 4, columna izquierda). Veinticuatro horas después de la iluminación, se realizó un ensayo de viabilidad de rojo neutro que confirmó 90 \pm 7% de destrucción celular en ambos grupos experimentales. En la Fig. 4, el fenotipo fibroso se representa en la columna derecha, y el fenotipo vesiculado se representa en la columna izquierda. Las flechas blancas rellenas muestran las formaciones de las fibras o vesículas.

Ejemplo 9 Fototoxicidad de Pd-BPheid y Bchl-SerOMe en la línea celular ECV304 de carcinoma de vejiga humano

Este experimento se realizó para valorar los efectos fotocitotóxicos de las sustancias fotosensibilizadoras Pd-BPheid y BChl-SerOMe sobre células de carcinoma de vejiga humano ECV304.

(i) Materiales: como en el Ejemplo 8(i).

(ii) Fuente de luz: como en el Ejemplo 8(ii).

(iii) Estudio de fototoxicidad: células ECV304 (2X10^{4} células por pocillo) se cultivaron en M-199, FCS al 10% con penicilina (0,06 mg/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml) en placa de 96 pocillos hasta la confluencia (\sim2x10^{5} células por pocillo). La incubación con concentraciones crecientes de Pd-BPheid o Bchl-SerOMe con las células durante 4 horas, estaba seguida de lavado con medio de cultivo reciente e iluminación según se describió anteriormente Sec. 1. Veinticuatro horas después de la iluminación, se valoró la viabilidad celular, usando el ensayo de viabilidad de rojo neutro. Se usaron los siguientes testigos: testigo de luz: células irradiadas, no tratadas con la sustancia fotosensibilizadora. Testigo negro: células no irradiadas, tratadas con sustancia fotosensibilizadora en la oscuridad. Testigo sin tratar: se usaron células no tratadas con sustancia fotosensibilizadora y no irradiadas para el cálculo del 100% de supervivencia (Rosenbach-Belkin V. et al., 1996, Photochem. Photobiol. 64(1):174-181).

(iv) Resultados: Tanto la Pd-BPheid como Bchl-SerOMe presentaban citotoxicidad dependiente de dosis y luz sobre células ECV304 (Fig. 5). Los valores LD_{50} correspondientes son 19 y 1000 nM. Los cambios morfológicos pos-PDT eran consecuentes con las observaciones realizadas con células A431 (datos no mostrados).

Ejemplo 10 PDT de Pd-BPheid y Pd-BPheid-etil-éster sobre células de melanoma de ratón M2R

El objetivo de este experimento era ensayar el efecto de Pd-BPheid y Pd-BPheid-etil-éster sobre células M_{2}R.

(i) Materiales: Se preparó Pd-BPheid como en el Ejemplo 1 anterior, y se preparó un éster etílico de Pd-Bacteriofeoforbida (Pd-BPheid-etil-éster), según se describe en WO 97/19081.

(ii) Fuente de luz Como anteriormente en el Ejemplo 8(ii), pero las células se iluminaron durante 10 minutos, 12 mW/cm^{2}, una fluencia de energía total de 7 J/cm^{2}.

(iii) Estudio de fototoxicidad: Se cultivaron las células M2R como monocapas en medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) + F12 (1:1), tamponado con HEPES (25 mM, pH 7,4). Se incluyeron suero bovino fetal (FBS) (al 10%), glutamina (2 mM), penicilina (0,06 mg/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml), y las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 8%. Para análisis de fototoxicidad se cultivaron células (1x10^{4} células/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 24 horas, hasta una densidad aproximada de 2x10^{4} células/pocillo. Los pigmentos se disolvieron directamente en el medio de cultivo o en etanol al 95%, y se diluyeron posteriormente en medio de cultivo hasta una concentración final de etanol al 1%. Se añadieron los pigmentos diluidos y las células se incubaron en la oscuridad durante cuatro horas a 37ºC. Antes de la iluminación, las células se lavaron una vez y se repusieron con medio de cultivo reciente. Las placas se iluminaron a continuación desde el fondo durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se colocaron en la incubadora de cultivos a 37ºC en la oscuridad. La supervivencia celular se determinó 24 horas después. Se usaron los siguientes sistemas testigo: Testigo oscuro - células sin tratar mantenidas en la oscuridad; testigo de luz - células no tratadas con la sustancia fotosensibilizadora, que se iluminaron; Toxicidad en la oscuridad - células tratadas con pigmento pero mantenidas en la oscuridad. La supervivencia celular se determinó mediante incorporación de [^{3}H]-timidina, según se describió anteriormente (WO 97/19081).

(iv) Resultados: Según se puede observar en la Fig. 6A, cuando los pigmentos se disolvían en etanol al 95%, Pd-BPheid tenía una LD_{50} de 0,03 \muM, mientras que el Pd-BPheid-etil-éster tenía una LD_{50} de 0,07 \muM. Cuando los pigmentos se disolvían directamente en el medio de cultivo que contenía suero al 10%, sólo la Pd-BPheid era totalmente activa,
mientras que el Pd-BPheid-etil-éster no era nada activo hasta 1 \muM, la concentración máxima ensayada (Fig. 6B).

Ejemplo 11 PDT de Pd-BPheid sobre células M2R de melanoma de ratón y células de carcinoma de colon HT29 humanas

El objetivo de este experimento era determinar el efecto fototóxico de Pd-BPheid sobre dos líneas celulares: células de melanoma de ratón M_{2}R y células células de carcinoma de colon HT29 humanas.

(i) Materiales: Se preparó la Pd-Bpheid en el Ejemplo 1 anterior.

(ii) Fuente de luz: la fuente de luz era una lámpara de Xenón flúor XLS3-PDT (Bio-Spec, Rusia), con un filtro de agua de 10 cm y una banda de luz de 720-850 nm. Las células se iluminaron durante 10 min., 12 mW/cm^{2}, a una energía total de 7 J/cm^{2}.

(iii) Estudio de fototoxicidad: Se realizaron análisis con el mismo protocolo descrito anteriormente (Ejemplo 10) con los siguientes cambios: Pd-BPheid se disolvió directamente en medio que contenía suero al 10%, y luego se añadió a las células. Se determinó la supervivencia de las células M2R mediante incorporación de [^{3}H]-timidina y la de las células NT29 con el ensayo MTT (Merlin JL et al., 1992 Eur. J. Cancer 28A: 1452-1458).

(iv) Resultados: Según se puede observar en la Figura 7, las células HT-29 de colon humano muestran sensibilidad inferior hacia este pigmento (LD_{50} de 0,5 \muM), mientras que las células M_{2}R eran aproximadamente 10 veces más sensibles (LD_{50} DE 0,03 \muM).

Ejemplo 12 PDT in vivo de tumores de melanoma de ratón M2R con Pd-BPheid

El objetivo de este experimento fue estudiar PDT de tumores de melanoma de ratón M2R en ratones inmunosuprimidos CD1 con 2,5 mg/kg de Pd-BPheid.

(i) Materiales: se preparó Pd-BPheid como en el Ejemplo 1 anterior.

(ii) Ratones: ratones inmunosuprimidos CD1 (25-30 g).

(iii) Anestesia: inyección i.p. de 50 \mul de quetamina/rumpon (v/v = 85/15).

(iv) Implante de tumores: Se implantaron a ratones 10^{6} células M2R en la espalda y los tumores alcanzaron el tamaño de tratamiento (7-8 mm) en 2-3 semanas.

(v) Fuente de luz: Lámpara foto-óptica halógena 64643 Osram de 150 W (D.K. Keller et al. 1999, Int. J. Hyperthermia 15, 467-474) provista de una ventana espectral de \lambda = 650-900 nm, 300 mW/cm^{-2}. La iluminación se realizó durante 30 min.

(vi) Protocolo PDT: Al ratón anestesiado se le inyectó i.v. el pigmento y el tumor se iluminó inmediatamente. Al final del tratamiento el ratón se colocó de nuevo en la jaula. Se tomaron fotografías del tumor antes y en los momentos indicados.

Experimento 1

Preparación de sustancia fotosensibilizadora: Se disolvieron dos mg de Pd-BPheid en 0,25 ml de cremofor EL, seguido de 20 min. de aplicación de ultrasonidos. Se añadieron 0,075 ml de 1,2-propilenglicol y se continuó la aplicación de ultrasonidos durante otros 15 min. Luego, se añadieron 0,9 ml de NaCl 0,15 mM, seguido de 5 min. de aplicación de ultrasonidos. La muestra se centrifugó durante 12 min. a 13.000 rpm (Eppendorf). La concentración final calculada de Pd-BPheid, basada en el espectro en cloroformo era de 0,5 mg/ml.

PDT del tumor: Se inyectó i.v. Pd-BPheid a razón de 2,5 mg/kg, a ratones inmunosuprimidos CD1 que tenían un tumor de melanoma M2R. El tejido tumoral se iluminó durante 30 min. a 300 mW · cm^{-2}. La temperatura del área tumoral epitelial del ratón era de 37,7-38ºC. Se supervisó la respuesta del tumor 1 y 4 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Fig. 8.

Experimento 2

Preparación de sustancia fotosensibilizadora: Se disolvieron dos mg de Pd-BPheid en 0,1 ml de metanol, 0,1 ml de KH_{2}PO_{4}, pH = 8,0 y 0,9 ml de PBS y se aplicaron ultrasonidos durante 10 min. El metanol se evaporó con argón y cremofor EL al 20%: se añadió 1,2-propilenglicol (3:1), seguido de 15 min. de aplicación de ultrasonidos. La muestra se centrifugó durante 8 min. a 13.000 rpm, siendo 0,5 mg/ml la concentración final calculada de Pd-BPheid, basada en el espectro en cloroformo.

PDT del tumor: se administraron i.v. 2,5 mg/kg (120 \mul) de Pd-BPheid a ratones inmunosuprimidos CD1, que tenían un tumor de melanoma M2R. El tejido tumoral se iluminó durante 30 min. a 300 mW · cm^{-2}. La temperatura del área tumoral epitelial del ratón era de 37,7-38ºC. La respuesta del tumor se supervisó 1 y 4 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Fig. 9.

Resultados: Según se muestra en Figs. 8 y 9, los tumores de melanoma PDT de M2R con 2,5 mg/Kg de Pd-BPheid según se describieron anteriormente, inducen una respuesta inflamatoria grave, con necrosis del tumor en 24 h.

Ejemplo 13 La PDT basada en Pd-BPheid reduce la velocidad de formación de metástasis de glioma C6 en ratones: ventaja frente a la cirugía

Estos experimentos se realizaron a fin de comparar el potencial terapéutico de PDT basada en Pd-BPheid y BChl-SerOMe, y la probabilidad de extensión de la metástasis mediante PDT basada en Pd-BPheid y BChl-SerOMe.

(i) Materiales: Pd-BPheid (preparada como en el Ejemplo 1) o Pd-BPheid-SerOMe 5 mg/kg en Cremofor EL al 20%.

(ii) Fuente de luz: La fuente de luz era una lámpara de PDT de xenon flúor LS3 (Bio-Spec, Rusia), con un filtro de agua de 10 cm y una banda de luz de 720-850 nm.

(iii) Ratones: ratones inmunosuprimidos CD1.

(iv) Tumores: Se implantaron a los ratones 10^{6} células de glioma C6 en el pie de la pata trasera. Los tumores se trataron cuando alcanzaron una longitud de 7-8 mm.

(v) Anestesia: 50 \mul de vetalar/rumpon (v/v = 85/15).

(vi) Analgesia: oxicodona (12 mg/litro) añadida en agua potable de sacarosa al 5%, como tratamiento (amputación o PDT) durante una semana.

(vii) Protocolo: Se inyectaron i.v. a tres grupos (10 ratones en cada uno) 5 mg/Kg de sustancia fotosensibilizadora (Pd-BPheid o Pd-BPheid-SerOMe), e inmediatamente se iluminaron a 200 mW/cm^{2}, durante 30 minutos, y se dejó que los animales se recuperasen en la jaula. Grupos 1 y 2: Animales que recibieron PDT de Pd-BPheid y Pd-BPheid-SerOMe, respectivamente. La respuesta tumoral y la formación de metástasis en la ingle se supervisaron durante 4 semanas. Grupo 3: Animales que sufrieron amputación en la articulación del tobillo (apareados con el Grupo 1) y la formación se metástasis en la ingle se supervisó durante 4 semanas. Los parámetros de respuesta a PDT eran el porcentaje de animales con necrosis tumoral y desaparición, respecto al número total de animales tratado. La metástasis se manifestó por la aparición de tumores en la ingle o en otras zonas. Los criterios de valoración considerados fueron: seguimiento durante 4 semanas, muerte espontánea, tumores que alcanzaron un diámetro de 2 cm y metástasis, cualquiera que fuese el que sucediera primero.

(viii) Resultados: Los resultados del aplanamiento (desaparición) del tumor se muestran en la Figura 10. Mientras que en el día 11 la respuesta a Pd-BPheid era más intensa que a Pd-BPheid-SerOMe (100% y 80% de aplanamiento de tumor, respectivamente), más tarde, en el día 28, el porcentaje de respuesta era similar, aproximadamente 60%. La reducción en el aplanamiento del tumor a largo plazo se debe a cierto nuevo crecimiento tumoral en algunos de los animales tratados, probablemente debido al desajuste entre el campo de luz y el área tumoral. Los resultados de la aparición de metástasis se muestran en la Figura 11. El tratamiento quirúrgico mediante amputación de la pata produjo un porcentaje sustancialmente mayor de metástasis, en comparación con PDT (hasta el 78%). Además, la metástasis tras la amputación apareció mucho antes. La frecuencia de metástasis tras PDT con Pd-BPheid era la inferior (hasta el 23%). Este resultado es similar al obtenido con Pd-BPheid-SerOMe, y la principal ventaja de la PD-BPheid es un retraso en la aparición de metástasis. La PDT con Pd-BPheid o Pd-BPheid-SerOMe son curativas para tumores de glioma C6. La formación de metástasis tras PDT es sustancialmente inferior, cuando se compara con el tratamiento quirúrgico.

Claims

1. Un compuesto de fórmula I, I' o I''

18

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19

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20

en la que

A representa OH,

OR_{1},

-O-(CH_{2})_{n}-Y,

-S-(CH_{2})_{n}-Y,

-NH-(CH_{2})_{n}-Y,

-O-(CH_{2})_{2}-OH,

-NH-(CH_{2})_{2}-NH-BOC o

-N-(CH_{2}-CH=CH_{2})_{2}

en la que

^{+}NH_{3}-C(CH_{2}OH)_{3}, ^{+}NH_{3}-CH_{2}-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH,

^{+}NH_{2}(CH_{3})-CH_{2}-(CHOH)_{4}-CH_{2}OH o

^{+}N(C_{n}·H_{2n'+1})_{4};

R_{2} representa H, OH o COOR_{4}, en la que R_{4} es alquilo C_{1}-C_{2} o cicloalquilo C_{2}-C_{12};

R_{3} representa H, OH o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12};

n es 1, 2, 3, 4, 5, o 6,

Y es -NR'_{1}R'_{2} o -^{+}NR'_{1}R'_{2}R'_{3}, X, en la que R'_{1}, R'_{2} y R'_{3} representan, independientemente entre sí -CH_{3} o -C_{2}H_{5};

X es F, Cl, Br o I,

n' es 1, 2, 3 o 4,

2. El compuesto I de la reivindicación 1, de fórmula y configuración óptica según se indican debajo:

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en la que A es OH, o OR_{1}, y R_{1} es según se definió en la reivindicación 1.

3. El compuesto de la reivindicación 2, en el que A es OH, identificado aquí como Pd-Bacteriofeoforbida a (Pd-BPheid).

4. Un compuesto de fórmula I, I' o I'', según se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como fármaco.

5. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula I, I' o I'', según se definió en las reivindicaciones 1 a 3, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicha composición está en forma de solución, emulsión lipídica o gel, o en forma de liposomas o nanopartículas.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 o 6, en la que el compuesto o compuestos están presentes en una cantidad de 0,01 a 20% en peso, basado en el peso total de la composición.

8. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I en la reivindicación 1, en la que A es OH, que comprende las etapas consistentes en:

a) desmetalación e hidrólisis combinadas de un compuesto de M-BPheid-17^{3}-Z, en la que Z es fitilo, genranil-geranilo o seril-metil-éster (SerOMe) y M es un metal seleccionado de Mg, Cd y Zn; y

b) incorporación de Pd con un reactivo de Pd, al compuesto obtenido en (a).

9. El procedimiento según la reivindicación 8 para la preparación de Pd-BPheid, en el que la bacterioclorofila a (Bchla) se desmetila e hidroliza en la etapa (a), y la bacteriofeoforbida a (BPheid) obtenida se hace reaccionar con un reactivo de Pd en la etapa (b), para producir la Pd-BPheid deseada.

10. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I en la reivindicación 1, en la que A es OH, que comprende las etapas de:

a) transmetalización de una BChlide-17^{3}-Z, para obtener la correspondiente Pd-BPheid-17^{3}-Z, en la que Z es fitilo, geranil-geranilo o SerOMe; y

b) hidrólisis del compuesto obtenido en (a).

11. El procedimiento según la reivindicación 10 para la preparación de Pd-BPheid, en el que la bacterioclorofila a (Bchla) se transmetalizó en la etapa (a) para reemplazar el átomo de Mg central nativo por Pd, y la Pd-BPheid-17^{3}-Z obtenida, en la que Z es fitilo, se hidroliza en la etapa (b), para producir la Pd-BPheid deseada.

12. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I en la reivindicación 1, en la que A es OH, que comprende las etapas consistentes en:

a) hidrólisis enzimática de una BChlida-17^{3}-Z, en la que Z es fitilo o geranil-geranilo, para obtener una BChlida,

b) desmetalación ácida de la Bchlida de (a); y

c) incorporación de Pd con un reactivo de Pd en el compuesto desmetalado de (b).

13. El procedimiento según la reivindicación 12, para la preparación de Pd-BPheid, en el que la bacterioclorofila a (Bchla) se hidroliza enzimáticamente en la etapa (a), se desmetala en la etapa (b) y se hace reaccionar con un reactivo de paladio en la etapa (c), para producir la Pd-BPheid deseada.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende adicionalmente la etapa de reacción del compuesto de Pd-BPheid obtenido, con un compuesto A-H correspondiente, para obtener un compuesto de fórmula I, en la que A es diferente de OH.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que el reactivo de Pd es acetato de Pd o cloruro de Pd.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la incorporación de Pd se realiza mediante un procedimiento en dos etapas, usando ascorbato de Na o ácido ascórbico, o mediante un procedimiento en una etapa usando ácido 6-O-palmitoíl-L-ascórbico.

17. Uso de un compuesto de fórmula I, I' o I'', según se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de composiciones farmacéuticas útiles en terapia fotodinámica (PDT) de tumores.

18. Uso de un compuesto de fórmula I, I' o I'', según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de composiciones útiles en la destrucción ex vivo de bacterias, virus, parásitos y hongos.

19. Uso de Pd-BPheid, según la reivindicación 17 o 18.

20. Uso de un compuesto de fórmula I, I' o I'', según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de composiciones farmacéuticas para uso en diagnóstico de tumores.

21. Uso, según la reivindicación 20, de un compuesto de fórmula I.

22. Uso, según la reivindicación 21, en el que dicho compuesto de fórmula I es Pd-Bacteriofeoforbida a.

23. Un compuesto de fórmula II o III como intermediario.

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