JP4847634B2 - 中枢神経系の虚血または外傷の機能的回復を増大させる方法 - Google Patents

Description

本出願は１９９６年３月２２日に出願されたUS出願番号０８／６２０，４４４にもとづく優先権を主張し、該US出願の記載はすべて本出願に包含されるものである。
発明の分野
本発明は一般的にヒトを含む哺乳動物の中枢神経系の虚血あるいは外傷性傷害の治療のための方法および組成物に関する。
本発明の背景
様々なタンパク質が今や、哺乳動物を含む脊椎動物における細胞増殖および／または組織分化を調節するモルフォゲンあるいは成長因子として同定され特徴づけられてきた。典型的には成長因子は細胞および／または組織の特定のサブセット（ｓｕｂｓｅｔｓ）に効力を発揮する。例えば、上皮細胞成長因子、神経細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、様々なホルモンおよび細胞増殖または分化を誘導または阻害する多くの種類の他のタンパク質が同定されそして細胞または組織の幾種類かのサブセットに影響することが示された。
神経栄養因子は神経系の分化に必要とされるポリペプチドである。最初に発見された神経栄養因子、神経成長因子（NDF）は、今やＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＮＴ４／ＮＴ５を含む大きな成長因子ファミリーの一部であることが知られている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０３２００にモルフォゲンとして規定された２量体タンパク質は神経分化において重要な役割を演ずると信じられている他のタンパク質ファミリーを構成する。Jones, et al（1991）Development 111:531-542;Ozkaynak, et al.（1992）J. Biol. Chem. 267:25220-25227; Lein, et al.（1995）Neuron 15: 597-605）。
ここでモルフォゲニックタンパク質類あるいはモルフォゲン類として参照されるタンパク質類は、自身が、祖先細胞の増殖と分化を誘導して、機能的な哺乳動物体組織とすることができる、真の組織モルフォゲンとして作用しうるものである。これらタンパク質としては、異所性、軟骨性骨形成を誘導する能力によって最初に同定された、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）のファミリー群をも含む。モルフォゲン類はこの技術分野では、一般的に、成長因子のＴＧＦーベータスーパーファミリーのサブグループとして分類されている（Hogan（1996）Genes & evelopment 10:1580-1594）モルフォゲンファミリー群のタンパク質類としては、哺乳動物骨形成タンパク質ー１（ＯＰー１。またＢＭＰ−７、ショウジョウバエ相同体60Aとしても知られている）、骨形成タンパク質ー２（ＯＰ−２、同様にＢＭＰ−８としても知られている）、骨形成タンパク質ー３（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡあるいはＣＢＭＰ−２Ａおよびショウジョウバエ相同体ＤＰＰとして知られている）、ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４（同様にＢＭＰ−２ＢあるいはＣＢＭＰ−２Ｂとして知られている）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびそのマウス相同体Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−９，ＢＭＰ−１０，ＢＭＰ−１１，ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−３（同様にＶｇｒ２として知られている）、ＧＤＦ−８，ＧＤＦ−９，ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１，ＧＤＦ−１２，ＢＭＰ−１３，ＢＭＰ−１４，ＢＭＰ−１５，ＧＤＦ−５（同様にＣＤＭＰ−１またはＭＰ５２として知られている）、ＧＤＦ−６（同様にＣＤＭＰ−２として知られている）、ＧＤＦ−７（同様にＣＤＭＰ−３として知られている）、アフリカツメガエル相同体ＶｇｌそしてＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰおよびＮＥＵＲＡＬを含む。
これらファミリーのメンバーは、２量体化でき、約９７−１０６アミノ酸のカルボキシ活性末端ドメインを含む成熟ポリペプチド鎖になることが出来る前駆体”プローフォーム”からのプロセッシングを含む、共通の構造を保有する分泌型ポリペプチドをコードする。全メンバーはこのドメイン中にシステインの保存されたパターンを有し、そして本タンパク質の活性型は単一ファミリーメンバーのジスルフィド結合性ホモ２量体かまたは２つの異なったメンバーのヘテロ２量体のいずれかである（Massague（1990）Annu.Rev.Cell Biol. 6:597; Sampath, et al,（1990）J. Biol. Chem. 265:13198等を参照）。同様に下記を参照、Ｕ．Ｓ．５,０１１,６９１；Ｕ．Ｓ．5,266,,683, Ozkanak et al.（1990）EMBO J.9: 2085-2093, Wharton et al.（1991）PNAS 88: 9214-9218）,（Ozkanak（1992）J. Biol. Chem. 267: 25220-25227,Ｕ．Ｓ．5,266,683）;（Celeste et al.（1991）PNAS 87:9843-9847）;（Lyonset al（1989）PNAS 86:4554-4558）。これら記述にはモルフォゲニックタンパク質の化学的および物理的特徴と同様にアミノ酸配列とＤＮＡ配列も記載されている。さらに下記を参照、Wozney et al.（1998）Science 242: 1528-1534）; BMP-9（ＷＯ ９３／００４３２,１９９３年１月７日公開）；ＤＰＰ（Padgettt et al.（1987）Nature 325: 81-84:そしてＶｇ−１（Weeks（1987）Cell 51: 861-867）。
モルフォゲンは、分化中の神経系を含む様々な組織の分化において自然に発現される（Ozkaynak, et al（1990）EMBO J. 9:2085-2093; Ozkaynak, et al.（1991）Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 116-123; Ozkaynak, et al（1992）supra）。
神経系の血管系疾患は、全ての神経系疾患中で頻度の点で第一位にランクされる；それらは成人病棟での全ての神経系の入院患者の約５０％を構成する。脳血管疾患の基本的な特徴は発作であって、病巣の神経系の欠損の急激でドラマチックな発生を意味する。例えば、血栓あるいは塞栓あるいは全身循環がそこなわれて血圧が下降するなどによって、動脈が中枢神経系の局所に栄養を供給できないと、その程度が重大で長時間にわたれば、血液と酸素を脳組織から奪い、生理機能の破壊と神経細胞の死そして受障部位のネクローシス（梗塞）を引き起こす。出血性梗塞において、脳組織中、くも膜下空間、あるいはその両者への血液の漏出が起きる。損傷は直接的な関係領域の物理的な破壊と周辺組織における血液塊による圧力から起きる。
発作における神経系疾患は、脳中での、梗塞と出血の部位と大きさの両者によって影響される。片麻痺は血管系疾患の典型的な兆候である、大脳半球あるいは脳幹を含む発作で生じる。しかしながら、同様にその部位に依存して、発作は片麻痺を伴って、または片麻痺なしで、麻痺、感覚疾患、えん下障害、視覚喪失、復視、めまい、言語障害を含む、多くの他の症状をひきおこすだろう。
”発作”をおこした、あるいはどんな形であれ、脳の虚血あるいは外傷性傷害を受けた患者は、普通部分的には回復する、しかししばしば中程度から重い障害が残る。例えば、ヒトにおいて、中脳動脈の全体的梗塞は、反対則の片麻痺、片麻酔、対応する片視野欠損、全体的あるいは完全な感覚器の失調（左半球）そして失行失認（右半球）を引き起こす。運動系、感覚系、言語失調を一旦起こしたならば、通常数ヶ月あるいは数年たっても、そのままの状態であるかあるいはほんの少ししか改善されない。患者はほとんど、再び効率的にコミニュケートできない。最近まで物理療法の他には、中枢神経系の発作を起こしたか、同様の傷害を受けた患者の予後を改善すると信じるに足る治療法というものはない。
本発明の要約
本発明は中枢神経系の虚血性あるいは外傷性傷害を受けた哺乳動物のための治療の方法と組成物に関する。特に、本発明は発作あるいは同様の血流破壊、あるいは中枢神経系の物理的（例、機械的）外傷の受傷に起因して、中枢神経系組織が破壊されるか失われるかした哺乳動物のための治療を提供する。哺乳動物へのモルフォゲンの投与は、例え、中枢神経系が損傷を受けた後の投与であっても、中枢神経系機能に有意の改善をもたらすという発見に基づいてここに方法と組成物を提供する。その方法はモルフォゲン２量体、これらモルフォゲンの誘導体、あるいは対応するモルフォゲン受容体のアゴニストの投与、あるいはモルフォゲンに露出されて刺激された細胞の移植を提供する。
従って、本発明は外傷性傷害あるいは発作のような損傷を中枢神経系に受けた哺乳動物を治療するための方法を提供する。本方法は、例えば損傷の開始後少なくとも６時間、たとえば１２時間、２４時間あるいは４８時間あるいはそれ以上時間が経過していても、モルフォゲンを投与して効果をあげることにかんする。
本発明に従った治療のレジュメは、中枢神経系の傷害から機能的な回復が増強されるように、投与方法、投与のタイミング、そして投与量に関して遂行される。本発明の組成物は治療的に有効な量のモルフォゲン、モルフォゲン誘導体あるいはモルフォゲン受容体のアゴニストを含む。すなわち本組成物には、有効成分の適当量が損傷を受けた神経系に中枢神経系機能の検出しうる回復をもたらすのに十分な時間提供されて、完全な回復をもたらすような量が含まれている。ここでモルフォゲンの効果的な量は単一投与あるいは２回投与あるいは複数回の投与で与えうる。モルフォゲンの有効量が複数回の投与で与えられる場合は、モルフォゲンは哺乳動物に好ましくは毎日投与される。他の好ましい実施例においては、哺乳動物に週２回（例えば３日から４日毎に）投与される。さらに他の好ましい実施例において、モルフォゲンは哺乳動物に週１回投与される。
本発明の実施は受傷した哺乳動物へ臨床的有効性を提供する、ことに本発明は哺乳動物の協調機能（例、姿勢、バランス、握力）感覚認知（例、視覚、触覚、味覚、嗅覚、固有受容器）あるいは会話のうちの１つに、臨床的に関連する回復をもたらす。臨床的に関連する改善は、損傷を受けたあるいは失われた中枢神経機能の検出しうる改善から完全な回復にまで及ぶ。本発明は、様々な条件から生じた中枢神経系の傷害の症状を治療するために用いられる。血栓、塞栓そして全身性血圧低下が発作のもっとも通常の原因である。他の傷害は高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤の破綻、血管腫、血液悪液質、心失調、心停止、心ショック、腎臓失調、敗血症性ショック、脳腫瘍、脊椎外傷、痙攣、腫瘍からの出血、あるいは血液量および／または血圧の失調等によっておきる。本発明に従ってモルフォゲンの投与は有意の臨床的有用性を提供する、例え傷害後おおくの時間経過後に投与がなされたとしても。
一般的に、本発明の方法と組成物に有用なモルフォゲンは１種あるいはそれ以上の有核（哺乳動物）細胞、組織あるいは器官の形態形成を誘導する２量体タンパク質である。ここで特に興味深いのは、少なくとも骨あるいは神経組織の形態形成を誘導するモルフォゲンである。モルフォゲンは、折りたたまれて２量体タンパク質となったとき、該モルフォゲンに特異的な受容体を保有している細胞あるいは組織においてモルフォゲン応答を引き出すことのできる構造となるような、ポリペチドの対からなっている。モルフォゲンは、一般的に、形態形成学的に許容される環境で下記のすべてを含むカスケード反応を誘導する：祖先細胞の増殖の促進；祖先細胞の分化の促進；分化した細胞の増殖の促進；そして分化した細胞の成長と維持の保持。
”祖先細胞”は、モルフォゲンが誘導される許容しうる環境での組織特異性と遺伝情報に依存して１種あるいはそれ以上の特異的な分化細胞になり得る未分化細胞である。モルフォゲンはさらに表現型および／または組織機能の老化あるいは静止消失の開始を遅らせたりゆるめたりできる。モルフォゲンはなお、さらに、代謝的および／または機能的、例、分泌、性質の発現を含む分化細胞の表現型発現を促進できる。加えてモルフォゲンは、適切な環境条件下で分化細胞の再分化を誘導できる。上記したように、少なくとも神経組織の増殖および／または分化を誘導する、そして／または神経組織の成長と維持そして／または機能性を支持するモルフォゲンは、ここでは特に興味深いものである。これらタンパク質の組織形態形成性についてさらに詳細な説明には、ＷＯ９２／１５３２３、ＷＯ９３／０４６９２そしてＷＯ９４／０３２００を参照。
ここで用いたように、用語”モルフォゲン”、”骨モルフォゲン”、”骨形態形成タンパク質”、”ＢＭＰ”、”形態形成タンパク質”そして”形態形成様タンパク質”は全て、ヒト骨形成タンパク質１（ｈＯＰ−１）によって代表されるタンパク質群を包含する。ｈＯＰー１のヌクレオチド配列とアミノ酸配列は配列表ＳＥＱ ＩＤ番号４と５に、それぞれ、開示される。記述の容易のためhOP-1が代表的骨形成タンパク質としてこれ以後再引用される。しかしながら、ＯＰ−１は、単に形態形成タンパク質として作用しうる実際の組織モルフォゲンのＴＧＦーベータサブクラスの代表として記載されるのであり、それに限定されるものではないことは、本分野の熟練技術者によって理解されるところである。他の既知のそして有用なタンパク質としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４，ＢＭＰ−５，ＢＭＰ−６，ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９，ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３，ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５，ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７，ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１，ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬおよびこれらの形態学的に活性のあるアミノ酸変異体を含む。また、一実施例として、好ましい形態形成タンパク質にはＯＰ−１、ＯＰ−２，ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５そしてＢＭＰ−６が含まれるがこれに制限されるものではない。加えて、本分野の通常の熟練者によって理解されるように、ここで引用した形態形成タンパク質のいずれも、参照配列として用いられる。
他の好ましい具体例として、本発明に有用なタンパク質は、ここで引用された形態形成タンパク質のいずれかの生物学的に活性な種の（生理活性のある）変異体を包含する。例えば、保存アミノ酸配列の変異株、変性ヌクレオチド配列変異株によってコードされるタンパク質、７つの保存システイン残基骨格を所有しそしてＯＰ−１そしてＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４を含む（これに制約されない）形態形成タンパク質をコードするＤＮＡ配列に標準的条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ配列によってコードされる形態形成活性のあるタンパク質を包含する。さらに他の具体例において、有用なモルフォゲンとしては、保存７システインドメインを所有し、下記に規定されるように参照モルフォゲン配列のＣ−末端活性ドメイン内に少なくとも７０％以上のアミノ酸配列ホモロジー（相似性）を保有するものをも包含する。好ましい具体例において、参照配列はOP-1である。
さらに、他の実施例において、本発明の方法と組成物に有用なモルフォゲンは、ＯＰＸと遺伝子配列７と８（配列番号表ＳＥＱ ＩＤ番号１と２それぞれ）、あるいは遺伝子配列９と１０（配列番号表ＳＥＱ ＩＤ番号６と７それぞれ）を含むここで規定された遺伝子配列のいづれかひとつを保有する形態形成的に活性のあるタンパク質として規定される。ＯＰＸは骨形成ＯＰ−１とＯＰ−２タンパク質の様々な種類間のホモロジーを表し、配列番号表ＳＥＱ ＩＤ番号３によって表示されたアミノ酸配列であらわされている。遺伝子配列９はｈＯＰ−１（ＳＥＱＩＤ番号５の残基３３５−４３１）によって規定される６システイン骨格を含む９６アミノ酸配列である。そしてここで残っている残基は、ＯＰ−１、ＯＰ−２，ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４，ＢＭＰ−５，ＢＭＰ−６，ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９，ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５，ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７，ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１，ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ，ＤＯＲＳＡＬＩＮ，ＮＥＵＲＡＬ、ＳＣＲＥＷそしてＡＤＭＰのホモロジー体である。ここで、非システイン残基のアミノ酸のそれぞれはタンパク質の引用群中の対応する残基から独立して選択される。遺伝子配列１０は、ｈＯＰ−１（３３０−４３１ ＳＥＱ ＩＤ番号５）によって規定される７システイン骨格を有し、遺伝子配列９のＮ末端に５アミノ酸が付け加えられた１０２のアミノ酸配列からなる。遺伝子配列７と８はそれぞれ９６と１０２個のアミノ酸からなり、６システイン骨格（遺伝子配列７）あるいは７システイン骨格（遺伝子配列８）のいずれかを含み、ｈＯＰ−１によって規定される。そしてここで残っている非システイン残基は、ＯＰ−１，ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｌー１そしてＧＤＦ−１にホモロジーを有している。
ここで予期されるように、ここで述べた形態形成タンパク質のファミリーは核タンパク質のより長い形と同様、系統発生的な、すなわち種間変異体と対立遺伝子間変異体、そして保存Ｃ−末端システイン骨格を変えるかもしれないような、Ｃー末端の付加と欠失変異体および変異体を含む生合成的な変異体を含む。それらの変更の後でも核タンパク質が２量体を形成し、それが哺乳動物の形態形成を許容される部位に投与されたとき神経組織の形成を誘導できる形態をもっていることを条件に加えて、本発明に有用な形態形成タンパク質は、自然に生じるか生合成的に誘導される異なった糖化パターンと異なったＮー末端を有した形をも包含する。そして後者の生合成的な誘導による合成は、前核細胞あるいは有核宿主細胞における組み替えＤＮＡの発現によって生産される。本タンパク質は、単一種として活性であるか（例；キメラを含むホモダイマーとして）あるいはヘテロダイマーを含む混合種として結合され活性がある。
ここでは哺乳動物の神経組織に投与されたとき、その組織の分化と成長の正常な状態を誘導あるいは維持するモルフォゲンは特に興味深い。現在好ましい例示できる具体例において、本モルフォゲンは脊椎動物中枢神経系組織の形成を達成する細胞および分子レベルでの分化のカスケードを誘導あるいは再誘導する。他の好ましい例示できる具体例では、本モルフォゲンは同様に、他の脊椎動物（例、鳥類あるいはほ乳類）の体組織をの形成を誘導し、たとえば骨、軟骨、骨髄、靱帯、歯の象牙質、セメント質、肝臓、腎臓、肺、心臓あるいは消化器系等があげられるがこれに限定されるものではない。現在の開示は、分化中の組織たとえば胚組織で、あるいは後胚組織における無菌の無傷部分で遂行されることができる。特に好ましいモルフォゲンは、中枢神経系あるいは表在神経系をひとつあるいはそれ以上の機能的に統合された要素を作り上げるため、ほ乳動物または鳥類の胚におけるパターン形成のカスケードを誘導しあるいは開始する。そのようなモルフォゲンは中枢神経系の虚血性あるいは外傷性傷害を受けた哺乳動物を治療するために用いることが出来る。
本発明は、またモルフォゲンのかわりにモルフォゲン誘導物質からなる方法および組成物で実施できる。”モルフォゲン誘導物質”は、哺乳動物の体内で内在性モルフォゲンを治療的に有効な濃度でインビボ生産（例、翻訳、転写そして／あるいは分泌）するのを刺激する化合物である。”効果的な”濃度は神経組織の再生または維持を促進するために、および／またはそれらの追加的な損失を阻害するために十分という意味である。そのような化合物は、哺乳動物に投与されたとき、哺乳動物のゲノム内でコードされたモルフォゲンを正常時には生産しうるおよび／または分泌しうる細胞に作用し、そして内在性モルフォゲンの濃度を増加させる物質を含むと考えられる。内在性あるいは投与されたモルフォゲンはエンドクリン、パラクリンあるいはアウトクリン因子として作用できる。このように、内在性モルフォゲンはモルフォゲン応答が誘導される細胞によって、近隣細胞によって、あるいは離れた組織細胞によって合成されうる。そのような場合には、分泌された内在性モルフォゲンは、たとえば個体の血流によって形態形成の部位に輸送される。好ましい具体例において、誘導物質は神経組織に利用されうる量に増加させるため内在性モルフォゲンの発現と／または分泌を刺激する。
さらに他の具体例に於いて、モルフォゲン受容体のアゴニストとして作用する薬剤がモルフォゲン自身のかわりに投与されるであろう。受容体の”アゴニスト”は受容体に結合する化合物である。そして、受容体が自然の内在性のリガンドと結合する場合と似た結果をもたらす。すなわち、化合物は受容体と相互作用すと、内在性リガンドのように同一のまたは実質的に類似した膜通過効果および／または細胞内効果をもたらさなければならない。このように、モルフォゲン受容体のアゴニストは受容体に結合し、そのような結合はモルフォゲン結合と同じまたは機能的に似た結果（例、形態形成の誘導）を有する。アゴニストの活性と能力は、いわゆる”部分アゴニスト”である場合には自然のリガンドのそれよりも劣る、あるいはいわゆる”フルアゴニスト”の場合には自然リガンドと等しいかより強い。このように、例えば、モルフォゲン受容体に結合し活性化してモルフォゲンの活性を模倣できる小ペプチドあるいは他の分子はモルフォゲンに等しいものとして使われるだろう。好ましくは、アゴニストはフルアゴニストである、しかし部分モルフォゲン受容体アゴニストも同様に有用に使われるだろう。そのようなアゴニストを同定するための方法は熟練者の知るところである。そしてモルフォゲン仲介応答を誘導する（例、後腎間葉の分化の誘導、軟骨形成の誘導、その他）化合物にたいする分析も知られている。
そのようなアゴニストはモルフォゲン”ミミック（mimic）””ミメテイック（mimetic）”あるいは”アナログ（analog）”としてよばれるだろう。
本発明のモルフォゲン、誘導体そしてアゴニストは、静注、皮下注、筋肉注、点眼、腹注、頬経由、直腸経由、膣経由、眼窩内、経口、脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内硬膜下腔内、包膜内、槽内、鼻腔内あるいはエアロソル投与を含むその化合物に適した投与方法のいずれかで投与される。そして投与経路に適切な許容されうる全ての薬理学的キャリヤーとともに製造される。加えて、様々な成長因子、ホルモン、酵素、治療的な組成物、抗生剤、あるいは他の生物活性薬剤がモルフォゲンとともに投与される。このように、酵素類、酵素阻害剤および／または化学誘発剤／化学タクテイック因子と同様に、たとえばＮＧＦ，ＦＧＦ，ＰＤＧＦ，ＩＧＦ、ＴＧＦーアルファそしてＴＧＦーベータのような、様々の既知の成長因子もモルフォゲンと結合することができ、欠損部位に運ばれる。
本発明の方法は、たとえ実施が中枢神経系への受傷後数時間後さらには数日後であっても中枢神経系の回復を効果的に促進する。このように、本発明は、中枢神経系が受傷し、診断されずあるいは組織の壊死前に診断または治療がされなかったたときに利用できる治療オプションを格段に改善するものである。
これから記述される好ましい方法、物質、そして例は単に例証のためであって、制約を加えるためのものではない。本発明の他の特徴および利点が、下記の詳細な記述と請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
図１は、様々な形態形成タンパク質のファミリーメンバーがここで規定されるように、Ｃ−末端の７個のシステインドメインにおいてＯＰ−１と共有するアミノ酸配列の同一性のパーセントとアミノ酸配列のホモロジー（”相似性”）のパーセント。
図２Ａ−２Ｂは、ＯＰ−１治療を受けた動物の肢（左）の前足の位置（２Ａ）そして後足の位置（２Ｂ）でのスコアーを表した線グラフである。（１０マイクログラム／くも膜下注射；８回投与における全ＯＰ−１量＝８０マイクログラム／動物；Ｎ＝７；■）及び賦形剤で治療された動物（Ｎ＝７；□）。
図３Ａ−３ＢはＯＰ−１治療を受けた動物のバランス（３Ａ）と体位反射（３Ｂ）のスコアーを表した線グラフである（１０マイクログラム／くも膜下注射；８投与の全ＯＰ−１量＝８０マイクログラム；Ｎ＝７；■）そして賦形剤で治療された動物（Ｎ＝７；□）。
図４は、ＯＰ−１治療の動物の体重を描いた線グラフである（１０マイクログラム／くも膜下注射）；８回でもたらされた全OP-1は８０マイクログラム／動物；Ｎ＝７；■）そして賦形剤治療の動物（Ｎ＝７；□）。
図５Ａ−５Ｂは、高濃度ＯＰ−１治療動物の処置肢（左）のウィスカーを置いたもの（５Ｂ）とウイスカー無しのもの（５Ａ）の前肢のスコアーを描いた線グラフ。高投与量ＯＰ−１治療動物（１０マイクログラム／くも膜下注射；２回投与での全ＯＰ−１＝２０マイクログラム／動物；Ｎ＝９動物；■）、低投与量ＯＰ−１治療動物（１マイクログラム／内腔注射；２回投与による全ＯＰ−１量＝２マイクログラム／動物；Ｎ＝８動物；■、そして賦形剤処置動物（Ｎ＝９，○）；
図６は、高濃度ＯＰ−１治療動物の処置を受けた（左の）肢の後足の位置のスコアーを描いた線グラフである。（１０マイクログラム／くも膜下注射；全ＯＰ−１は２回投与で２０マイクログラム／動物；Ｎ＝９動物；■）低投与ＯＰ−１動物（１マイクログラム／くも膜下投与、全ＯＰー１の２回投与＝２マイクログラム／動物；Ｎ＝８ 動物；□）そして賦形剤投与動物（Ｎ＝９、○）；
図７は、高濃度ＯＰ−１治療動物の体重を表した線グラフである。
（１０μｇ／クモ膜下注射；全ＯＰ−１は２回投与で２０μｇ／動物；Ｎ＝９動物；■）低投与ＯＰ−１動物（１μｇ／クモ膜下注射、全ＯＰー１の２回投与＝２マイクログラム／動物；Ｎ＝８ 動物；□）そして賦形剤投与動物（Ｎ＝９、○）；
図８Ａ−８Ｂは、ＯＰ−１で治療した動物の処置肢（左）のウイスカーを置いた（８Ｂ）またはおかない（８Ａ）前肢の位置のスコアーを描いた線グラフである（１０マイクログラム／くも膜下注射；Ｎ＝６動物；■）そして賦形剤処置動物（Ｎ＝８、□）
図９
ＯＰ−１治療動物の処置肢（左）の後肢の位置のスコアーを表した線グラフである（１０マイクログラム／くも膜下注射；Ｎ＝６動物；■）そして賦形剤処置動物（Ｎ＝８、□）
図１０
ＯＰ−１治療動物の体重を表した線グラフである
（１０マイクログラム／くも膜下注射；Ｎ＝６動物；■）そして賦形剤投与動物（Ｎ＝８、□）
好ましい実施例の詳細な説明
Ａ、一般
本発明は、部分的に、中枢神経系の発作あるいは外傷性傷害につづく機能的回復がモルフォゲンの投与によって、たとえ受傷組織が外傷に負けた後または中枢神経系機能が損傷をうけたり失われた後であっても、有意に増大したという驚くべき発見に基づいている。最も驚くべきことにはこの発明の実施は，影響をうけた（梗塞した）組織の量、囲によらない（減少することがない）ということである。このように、本発明は、機能的中枢神経系回復は、発作あるいは外傷性傷害を起こしたもともとの組織の喪失にもあっても達成できるという発見によりどころを持っている。中枢神経系機能の有意の回復（検出できる、臨床的にあきらかな）は、モルフォゲンの治療的に効力のある単回投与でも得られる。
本発明は、発作あるいは外傷性傷害のような中枢神経系に傷害を受けた哺乳動物を治療するための方法に特徴がある。本方法は、外傷の受傷後少なくとも６時間、たとえば１２時間、２４時間、４８時間あるいはさらに長い時間後、受傷哺乳動物にモルフォゲンを投与することを含む。本発明が実施される治療的ウィンドウの最終ポイントはいまだ確立されていない。本発明は様々の条件下でおきた中枢神経系傷害のひとつ以上の悪い結果を治療するために用いることが出来る。血栓、塞栓そして全身性の低血圧が発作の最も通常の原因である。他の傷害は高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤の破壊、血管種、血液悪液質、心失調、心停止、心源性ショック、腎失調、敗血症性ショック、頭部外傷、脊髄外傷、痙攣、腫瘍からの出血あるいは他の血液損失あるいは血圧の消失によって起きるであろう。このような外傷は生理機能の破壊を起こし、続いて神経細胞の死と受傷領域のネクローシス（梗塞）を起こす。”発作”という用語は上記の傷害にともなって引続きおきる急激でドラマテックな神経系の失調を含むものである。
ここで用いられる”虚血”あるいは”虚血性エピソード”という用語は組織への血液の供給が不足する結果になる全ての状況を意味する。このように、中枢神経系の虚血性エピソードは、大脳、小脳、あるいは脳幹のような、脳の局所への（これらに限定されないが）血液供給が不十分だったり妨げられることによって起きる。同様に中枢神経系の一部分である脊髄は血流減少で等しく虚血状態になる。虚血性エピソードは、血栓あるいは塞栓の場合における様な血管の収縮と閉塞によって起きるだろう。さらに虚血性エピソードは、上記したように心停止を含むあらゆる形の弱った心機能が原因でひきおこされうる。血液の不足が充分に重篤で長く続くと、生理機能の破壊をおこし、つづいて神経細胞の死がおきそして受傷領域のネクローシス（梗塞）を引き起こす。受傷から生じる神経の異常の程度とタイプは梗塞の部位と大きさまたは虚血の場所に依存する。虚血が発作と関連していると、発作の程度は全体的であることも局所的であることもある。
ここで中枢神経系について用いられる”局所の虚血”という用語は脳あるいは脊髄へ血液を供給する単一動脈のブロックから起きた状態を意味し、結果としてその動脈によって供給される部位で全ての細胞成分（パンーネクローシス）の死をひきおこす。中枢神経系についてここで用いられる”全体的虚血”という用語はは、脳全体、前頭葉あるいは脊髄への血流の一般的減少から生じる状態を意味し、これらの組織全体で特に代謝的に活性な領域で神経細胞の遅発性の死をひき起こす。これらおのおのにおける病理は、臨床的関連と同じく、全く異なっている。局所虚血のモデルは局所脳梗塞を受けた患者である、そして全体的虚血のモデルは心停止と他の全身性低血圧の結果に似ている。
本発明が同様に、頭部打撲のような機械的力によって引き起こされた中枢神経系への外傷性傷害の治療にも有効であることが期待される。外傷は、哺乳動物の頭、首、脊椎のいかなる部位あるいは付属物と外部物体の外傷性接触から生じるような擦過傷、切開、挫傷、穿刺、圧搾、その他の組織損傷を包含する。外傷性傷害の他の形は液体の不適切な蓄積による哺乳動物中枢神経系の収縮や圧縮から生じる（たとえば、正常脊椎液あるいはガラス状体液生産のブロックあるいは失調、代謝あるいは体積調節のブロックあるいは失調、あるいは硬膜下あるいは頭蓋内の血腫あるいは浮腫）。同様に外傷性収縮と圧迫は転移性あるいは原発性腫瘍のような異常組織の塊の存在によっても生じる。
Ｂ．有用な形態形成タンパク質の生化学的、構造的及び機能的性質
上記したように、新規、器官特異性組織を達成する細胞の分化のカスケードと分子レベルでの出来事を誘導するものとしてここで規定されるようにタンパク質は形態形成性である。好ましい実施例において、モルフォゲンはポリペプチド鎖の対からなる２量体タンパク質であり、各々の鎖は、対応する配列を有し、あるいはＳＥＱ ＩＤ 番号５に含まれるヒトＯＰー１の保存Ｃ−末端６あるいは７システイン骨格に少なくとも機能的に等しい配列をもっていてそして／またはＯＰ−１とこの領域において７０％のアミノ酸配列ホモロジーをもっている。モルフォゲンは、形態形成的に許される環境において一般的に次の全てのカスケード出来事を誘導しうる；祖先細胞の増殖を刺激；祖先細胞の分化を刺激；分化した細胞の増殖を刺激；そして分化した細胞の成長と維持を支持。適切な条件下でモルフォゲンは、”正常”分化経路から迷ってしまった細胞の再分化を誘導しうる。この発明で有用にモルフォゲンをどのように初めて同定したかの詳細がどのように作るか、モルフォゲン活性を用い試験するかの記述と同様に様々の雑誌に記述されている、それらはＵ．Ｓ．５，０１１，６９１、５，２６６，６８３そして国際公開出願ＷＯ９２／１５３２３；ＷＯ９３／０４６９２；ＷＯ９４／０３２００である。ここで開示されるように、モルフォゲンは自然に得られた原料物質からあるいは前核生物あるいは有核生物からここで開示された遺伝子配列を用いての組み換え生産された。他に、新規の形態形成配列はここで開示された以下の方法で同定される。
本発明の方法と組成に有用な実際の組織形態形成タンパク質と同定されそして／あるいは適用された自然に生じているタンパク質は、ＴＧＦーベータスーパーファミリーあるいはスーパー遺伝子ファミリーとして、ゆるい進化的グループ内で異なった配列関連性タンパク質の下位グループに分けられる。自然に生じているモルフォゲンはＣー末端基（ドメイン）内に本質的なアミノ酸配列ホモロジーを有している。典型的には上述した自然にあるモルフォゲンはＮ−末端シグナル配列をもった前駆体として翻訳され、シグナル配列は典型的には３５残基の長さでプロドメインに繋がっていて成熟タンパク質をもたらすとき切断される、そして生物学的に活性のあるＣ−末端ドメインを含む。シグナルペプチドは翻訳の時に素早く切断される、切断部位はフォン ヘイジネ（Von Heijne（1986）Nucleic Acids Research 14; 4683-4691）の方法を用いて与えられた配列中に予想することができる。プロドメインは、充分に切断された成熟Ｃ−末端ドメインよりも典型的には約３倍以上も長い。自然の条件下で、本タンパク質は成熟の２量体で分泌されそして切断されたプロドメインは、成熟２量体タンパク質の溶解性をおそらく改善するためにタンパク質複合体を形成するように結合する。典型的には、モルフォゲンの複合体は生理的条件下での成熟形よりも一層溶解性がある。
自然界から得た形態形成タンパク質は成熟形、ネイテイブ形において典型的にはグリコシル化されていて２量体で、典型的にはＳＤＳーＰＡＧＥで決定された実際の分子量測定では約３０−３６ｋＤａを有する。還元されたとき３０ｋＤａのタンパク質は約１６ｋＤａと１８ｋＤａの範囲の実際の分子量をもつ２つのグリコシル化したポリペプチドサブユニットを生じる。非グリコシル化２量体タンパク質も同様に形態形成活性を有する、典型的な分子量は約２７kDaである。還元したとき、２７ｋＤａのタンパク質は２個の非グリコシル化ポリペプチドをもたらし、それらは約１４ｋＤａから１６ｋＤａの範囲の分子量を持っている。
好ましい実施例において、ここで規定されるように２量体形態形成タンパク質のポリペプチド鎖のそれぞれは参照モルフォゲンのアミノ酸配列と明確な関係をもったアミノ酸配列からなる。ひとつの実施例において、好ましい形態形成ポリペプチド鎖は形態形成的に活性なヒトＯＰ−１，ＳＥＱ ＩＤ番号：５に存在している配列と明確な関連を有している。しかしながら、ここで開示されたひとつあるいはそれ以上の自然に生じるあるいは生合成の形態形成タンパク質は参照タンパク質として用いることが出来る。好ましい形態形成ポリペプチド鎖はヒトＯＰ−１、ＳＥＱ ＩＤ番号５：の残基３３５−４３１のＣ−末端６システインドメインと明確な関連を有する。好ましくは、形態形成ポリペプチド鎖はヒトＯＰ−１、ＳＥＱ ＩＤ番号５の残基３３０−４３１のＣ−末端７システインドメインと明確な関連を有する。組織形態形成活性をもつ２量体タンパク質における好ましいポリペプチド鎖はそれぞれ参照配列に一致する配列からなるかまたは機能的に等しい。
機能的に等しい配列は、例えばこれらシステインの直線配置を変えるようなアミノ酸の挿入あるいは欠失を含むが、しかし２量体形態形成タンパク質のフォールド構造における関連性は変えないような、、形態形成活性に必要であろうイントラあるいはインター鎖ジスルフイド結合形成する能力を含む、参照配列内に配列されるシステイン残基の機能的に等しい配置からなっている。例えば自然に生じているモルフォゲンは少なくとも一個の内部欠失（１残基の；ＢＭＰ２）あるいは挿入（４残基の；ＧＤＦ−１）が存在しているが、しかし生物活性を廃棄していないで存在する。機能的に等しい配列は、さらに一個あるいはそれ以上のアミノ酸配列が参照タンパク質の対応残基から異なっている、例えば、ヒトＯＰ−１のＣ−末端７システインドメイン（ここで保存７システイン骨格として同様に参照される、）、この相違は組織形態形成活性を破壊しないで提供される。従って、対照配列における対応アミノ酸の保存的置換は好ましいものである。参照配列において対応する残基の”保存的置換”があるアミノ酸残基は対応する参照残基に生理的にあるいは機能的に似たものである、例、似た大きさ、形、電荷、共有結合あるいは水素結合を形成する能力において似た化学的性質をもつ。特に好ましい保存性置換はダイフォフ等に受け入れられているポイント突然変異に規定された基準を満たしたものであり、その内容は参照によってここに取り込まれている（Dayhoff et al.（1978）, 5 Atlas of Sequence and Structure and Structure, Suppl. 3, ch.22（pp.354-352）Natl. Biomed. REs. Found., Washington, D.C. 20007）。
保存的置換の例に下記を含む：保存的置換は典型的には一個のアミノ酸の他の似た性質のものへの置換を含む、例、下記群内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニンそしてフェニルアラニン、チロシン。言葉”保存置換”は同様に非置換の両親アミノ酸の位地に置換アミノ酸となることを含み、置換したポリペプチドで生じた抗体は非置換ポリペプチドと同様に免疫反応を起こすものである。
ここで他に述べられたように、本発明の方法と組成に有用な形態形成タンパク質の分類はヒト骨形成タンパク質（ｈＯＰー１）によって象徴される。本発明の実施に有用な他の形態形成タンパク質としてはＯＰ−１，ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰー４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦー５、ＧＤＦー６、ＧＤＦー７、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰー１１、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰあるいはＮＥＵＲＡＬそしてそれらのアミノ酸変異体が挙げられる。好ましい実施例の一つとして、骨形成タンパク質はＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９そしてそれらのアミノ酸置換とそれらの種間ホモログを含むホモログが包含される。
その化学的及び生理学的性質並びにこれらの配列を開示している刊行物は下記をも含む：ＯＰ−１とＯＰ−２：Ｕ．Ｓ，５，０１１，６９１、Ｕ．Ｓ，５，２６６，６８３，オズカニャク Ozkaynak et al（1990）EMBO J.9; 2085-2093；ＯＰ−３：ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ ＵＳ９３／１０５２０）；ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰー４；ＷＯ ８８／００２０５、ウズニー等 Wozney et al（1988）Science 242; 1528-1534）；ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６：セレステ等Celeste et al（1991）PNAS 87：９８４３−９８４７；Ｖｇｒ−１：ライオンス等Lyons et al（1989）PNAS 86: 4554-4558；ＤＰＰ：パジェットPadgett et al（1987）Nature 325: 81-84；Ｖｇ−ｌ：ウイークスWeeks（1987）Cell 51: 861-867：ＢＭＰー９；WO 95/33830（PCT/US 95/07084）；ＢＭＰ−１０：ＷＯ ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）；ＢＭＰ−１１：ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）：ＢＭＰ−１２：ＷＯ ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＢＭＰ−１３：ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−１：ＷＯ ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）及びリー等 Lee et al（1991）PNAS 88:4250-4254:ＷＯ９４／21681
（PCT／US 94/03019）；ＧＤＦ−９：ＷＯ ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）；ＧＤＦ−１０：ＷＯ ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）；ＧＤＦ−１１：ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）；ＢＭＰ−１５：ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）；ＭＰ１２１：ＷＯ９６／０１３１６（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２）：ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７）及びＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）及びＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０）；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ−１３）：ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）及びＷＯ９６／１４３３５とＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦー７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２）：ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）及びＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）。他の実施例において、有用タンパク質は、新規生合成形態形成タンパク質および２個あるいはそれ以上の既知のモルフォゲンを用いてデザインされたキメリックタンパク質を含む。Ｕ．Ｓ，Ｐａｔ．５，０１１，６９１に開示された生合成構築物を同様に参照、ここで参照によって取り込まれた開示をも参照（例ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７及びＣＯＰ−１６）。
好ましい実施例において、有用な形態形成タンパク質はアミノ酸配列が少なくとも７０％以上のホモロジーまたは”相似性”を発揮する配列からなり、好ましくは前に自然に生じるタンパク質から選択された参照形態形成タンパク質と８０％のホモロジーまたは相似性からなる。好ましくは本参照タンパク質はヒトＯＰ−１であり、そしてその参照配列はヒトＯＰ−１、の骨形成性活性型にＣ−末端７システインドメイン、ＳＥＱ ＩＤ番号５の残基３３０−４３１である。従って有用な形態形成性タンパク質は対立遺伝子の、系統発生学的な片われと好ましい参照配列の他の変異体を含み、上記に同定されたりセットされたものを含むタンパク質の一般的形態形成ファミリーの新規メンバーと同様に自然に起きたあるいは生合成的に生産した（”変異”あるいは”変異タンパク質”を含む）ものを包含する。ある特に好ましい形態形成ポリペプチドは少なくてもヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と６０％のアミノ酸同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する。
ある実施例において、参照モルフォゲンポリペプチドに機能的に等しいことが期待されるポリペプチドがニードルマン等の方法を用いてNeedleman, et al.（1970）J. Mol. Biol.48:443-453, アラインプログラム（ＤＮＡスター（株））のようなコンピュータープログラムを用いて効率的に実施された。上記したように、内部ギャップと候補配列中へのアミノ酸挿入は定義された関係を算出するために無視され、候補配列と参照配列間のアミノ酸配列ホモロジーあるいは同一性のレベルとして効率的に発現された。
”アミノ酸配列ホモロジー”はここでアミノ酸配列の同一性と相似性の両者を含むと理解される。ホモロガス配列は同一のおよび／または類似のアミノ酸残基持ち、そして類似の残基は、あるいは整列した参照配列中の対応アミノ酸残基のための”許容されるポイント突然変異”への保存性置換である。このように、参照配列と７０％アミノ酸ホモロジーを示す候補ポリペプチド配列は、全ての許容残基の７０％が同一かあるいは参照配列の対応残基の保存性置換である。現在の好ましい実施例において、参照はＯＰ−１である。
図１はＯＰ−１を参照配列として用いるＴＧＦーβたファミリーのさまざまな発現系メンバーのＣ−末端７システインドメイン内における、アミノ酸配列のホモロジー（相似性）パーセントと同一性のパーセントを示す。図に示されたパーセントホモロジーはニードルマンの方法に従って本質的に配列から計算したNeedleman, et al.（1970）J. Mol. Biol. 48:443-453,アラインプログラム（ＤＮＡスター（株））を用いて計算される。
参照モルフォゲン配列からの挿入または欠失、ここではｈＯＰ−１のＣ−末端、生物学的活性な７システインドメインあるいは骨格は、計算の対照からは無視された。
本分野の熟練者には明らかな様に図１に載せられたタンパク質の配列を検討すると有意のアミノ置換がモルフォゲン活性を保持している参照配列間にある。例えば、ＧＤＦ−１タンパク質配列は単に５０％のアミノ酸同一性をここで述べたｈＯＰ−１配列との間に残している、一方ＧＤＦ−１配列は”ホモロジー”が上記に限定されるようにｈＯＰ−１配列と７０％以上ののアミノ酸ホモロジーを示す。さらに、ＧＤＦ−１は、ＯＰ−１（ＳＥＱＩＤ 番号５）の３７２と３７３に対応して２残基間に４アミノ酸挿入（ＧｌＹーＧｌｙ−ＰｒｏーＰｒｏ）を含む。同様に、ＢＭＰ−３は、ｈＯＰ−１（ＳＥＱＩＤ番号５）の残基３８５と３８６に対応して２残基間に挿入された”エクストラ”残基、バリンをもつ。同様にＢＭＰ−２とＢＭＰ−４は両者ともＯＰ−１（ＳＥＱ ＩＤ番号５）の残基３８９に対応するアミノ酸残基の”欠失”をもつ。生物活性と干渉する参照配列からの逸脱は見られない。
他の好ましい実施例において、本発明に有用な形態形成ポリペプチドのファミリーとそれらのメンバーは一般的なアミノ酸配列によって規定される。例えば一般的配列７（ＳＥＱ ＩＤ番号１）と一般的配列８（ＳＥＱ ＩＤ番号２）は下記に開示され、少なくともＯＰ−１，ＯＰ−２，ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇr１、そしてＧＤＦ−１を含む今日までに同定された好ましいタンパク質ファミリー間で共有されるホモロジーをもつ。これらのタンパク質のアミノ酸配列はここでおよび／または専門分野によって上記に要約したように記述される。一般的配列は、配列内の様々な位置の残基と同様、６および７システイン骨格（一般配列７と８、それぞれ）によって規定されるＣ−末端ドメイン内の配列によってもたらされる２つの同一のアミノ酸を含む。
一般配列は適切なシステイン骨格を提供し分子内あるいは分子間ジスルフィド結合が形成される。そしてフォールデイングしたタンパク質の４次元構造に影響するものと思われる重要なアミノ酸を含む。加えて、一般配列は位置３６（一般配列７）あるいは位置４１（一般配列８）で付加的システインを許容する、そしてそれによってＯＰ−２とＯＰ−３の形態形成学的に活性のある配列を取り囲んでいる。

ここでＸａａは独立に下記に規定される１個以上の特異的なアミノ酸のグループから選択される：”Ｒｅｓ”は”残基”を意味する。そして残基２のＸａａ＝（TyrまたはＬｙｓ）、残基３のＸａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基６のＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；残基７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）、残基８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基１１のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ，Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ，Ａｒｇ，ＡｓｎまたはＧｌｕ）；残基１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；残基１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；残基２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２１のＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；残基２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；残基３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＩｌｅまたはＡｓｎ）；残基３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；残基３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；残基３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；残基３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基３８のＸａａ＝（Ａｓｎ，ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、GlｙまたはＰｒｏ）；残基４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；残基４５のＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；残基４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ，AlaまたはＳｅｒ）；残基４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；残基５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ，Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、GlyまたはＰｈｅ）；残基５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；残基５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；残基５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；残基５７＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；残基６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｌａ）；残基６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ，ＡｓｐまたはＧｌｙ）；残基６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；残基７２のＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｌｅｕ、ＭｅｔあるいはＩｌｅ）；残基７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；残基７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）、残基７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＳｅｒ）；残基７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；残基７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＬｙｓ）；残基８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；残基８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；残基８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓ）；残基８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；残基８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ，ＴｒｐまたはＡｓｐ）；残基９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、あるいはＧｌｕ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；残基９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）；残基９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）。
一般配列8（SEQ ID NO: 2）は一般配列7（SEQ ID NO: 1）の全てを包含し、更にN−末端に次の配列（SEQ ID NO: 8）を包含する：

従って、残基7で始まり、一般配列8の各“Xaa”は一般配列7に関して定義された特定のアミノ酸である。その定義は遺伝子配列7に関して記述された各残基番号を一般配列8の中で5つずつシフトしたものである。このように、一般配列7における“残基2のXaa=（TyrまたはLys）”は一般配列8における残基7のXaaをさす。一般配列8においては、残基2のXaa=（Lys, Arg, AlaまたはGln）；残基3のXaa=（Lys, ArgまたはMet）；残基4のXaa=（His, ArgまたはGln）；および残基5のXaa=（Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr, またはTyr）。
他の具体例では、有用な骨源製タンパク質は上述された一般配列9および10（それぞれSEQ ID NO: 6および7）により定義されたこれらを包含する。特に、一般配列9および10は以下のタンパク質の混合アミノ酸配列である；
ヒトOP-1、ヒトOP-2、ヒトOP-3、ヒトBMP-2、ヒトBMP-3、ヒトBMP-4、ヒトBMP-5、ヒトBMP-6、ヒトBMP-8、ヒトBMP-9、ヒトBMP-10、ヒトBMP-11、Drosophila 60A、Xenopus Vg-1、ウニUNIVIN、ヒトCDMP-1（マウスGDF-5）、ヒトCDMP-2（マウスGDF-6、ヒトBMP-13）、ヒトCDMP-3（マウスGDF-7、ヒトBMP-12）、マウスヒトGDF-1、マウスGDF-1、ニワトリDORSALIN、Drosophila dpp、Drosophila SCREW、マウスNOCAL、マウスGDF-8、ヒトGDF-8、マウスGDF-9、マウスGDF-10、ヒトGDF-11、マウスGDF-11、ヒトBMP-15、およびラットBMP-3b。一般配列7と同様に、一般配列9はC-末端6個のシスティン骨格に適応し、また一般配列8と同様に、一般配列10は7個のシスティン骨格に適応する。

ここで各Xaaは以下のように定義された1個ないしそれ以上の特定のアミノ酸のグループから独立的に選択される；”Res.”は残基を意味し、残基1のXaa=（Phe, LeuまたはGlu）；残基2のXaa=（Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, ValまたはGlu）；残基3のXaa=（Val, Ile, LeuまたはAsp）；残基4のXaa=（Ser, Asp, Glu, AsnまたはPhe）；残基5のXaa=（PheまたはGlu）；残基6のXaa=（Arg, Gln, Lys, Ser, Glu, AlaまたはAsn）；残基7のXaa=（Asp, Glu, Leu, AlaまたはGlu）；残基8のXaa=（Leu, Val, Met, IleまたはPhe）；残基9のXaa=（Gly, HisまたはLys）；残基10のXaa=（TrpまたはMet）；残基11のXaa=（Gln, Leu, His, Glu, Asn, Asp, SerまたはGly）；残基12のXaa=（Asp, Asn, Ser, Lys, Arg, GluまたはHis）；残基13のXaa=（TrpまたはSer）；残基14のXaa=（IleまたはVal）；残基15のXaa=（IleまたはVal）；残基16のXaa=（Ala, Ser, TyrまたはTrp）；残基18のXaa=（Glu, Lys, Gln, Met, Pro, Leu, Arg, HisまたはLys）；残基19のXaa=（Gly, Glu, Asp, Lys, Ser, Gln, ArgまたはPhe）；残基20のXaa=（TyrまたはPhe）；残基21のXaa=（Ala, Ser, Gly, Met, Gln, His, Glu, Asp, Leu, Asn. LysまたはThr）；残基22のXaa=（AlaまたはPro）；残基23のXaa=（Tyr, Phe, Asn, AlaまたはArg）；残基24のXaa=（Tyr, His, Glu, PheまたはArg）；残基26のXaa=（Glu, Asp, Ala, Ser, Tyr, His, Lys,Arg, GlnまたはGly）；残基28のXaa=（Glu, Asp, Leu, Val, Lys, Gly, Thr, AlaまたはGln）；残基30のXaa=（Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Glu, Asp, Phe, GlnまたはLeu）；残基31のXaa=（Phe, Tyr, Leu, Asn, GlyまたはArg）；残基32のXaa=（Pro, Ser, AlaまたはVal）；残基33のXaa=（Leu, Met, Glu, PheまたはVal）；残基34のXaa=（Asn, Asp, Thr, Gly, Ala, Arg, LeuまたはPro）；残基35のXaa=（Ser, Ala, Glu, Asp, Thr, Leu, Lys, GlnまたはHis）；残基36のXaa=（Tyr, His, Cys, Ile, Arg, Asp, Asn, Lys, Ser, GluまたはGly）；残基37のXaa=（Met, Leu, Phe, Val, GlyまたはTyr）；残基38のXaa=（Asn, Glu, Thr, Pro, Lys, His, Gly, Met, ValまたはArg）；残基39のXaa=（Ala, Ser, Gly, ProまたはPhe）；残基40のXaa=（Thr, Ser, Leu, Pro, HisまたはMet）；残基41のXaa=（Asn, Lys, Val, ThrまたはGln）；残基42のXaa=（His, TyrまたはLys）；残基43のXaa=（Ala, Thr, LeuまたはTyr）；残基44のXaa=（Ile, Thr, Val, Phe, Tyr, MetまたはPro）；残基45のXaa=（Val, Leu, Met, IleまたはHis）；残基46のXaa=（Gln, ArgまたはThr）；残基47のXaa=（Thr, Ser, Ala, AsnまたはHis）；残基48のXaa=（Leu, AsnまたはIle）；残基49のXaa=（Val, Met, Leu, ProまたはIle）；残基50のXaa=（His, Asn, Arg, Lys, TyrまたはGln）；残基51のXaa=（Phe, Leu, Ser, Asn, Met, Ala, Arg, Glu, GlyまたはGln）；残基52のXaa=（Ile, Met, Leu, Val, Lys, Gln, AlaまたはTyr）；残基53のXaa=（Asn, Phe, Lys, Glu, Asp, Ala, Gln, Gly, LeuまたはVal）；残基54のXaa=（Pro, Asn, Ser, ValまたはAsp）；残基55のXaa=（Glu, Asp, Asn, Lys, Arg, Ser, Gly, Thr, Gln, ProまたはHis）；残基56のXaa=（Thr, His, Tyr, Ala, Ile, Lys, Asp, Ser, GlyまたはArg）；残基57のXaa=（Val, Ile, Thr, Ala, LeuまたはSer）；残基58のXaa=（Pro, Gly, Ser, AspまたはAla）；残基59のXaa=（Lys, Leu, Pro, Ala, Ser, Glu, ArgまたはGly）；残基60のXaa=（Pro, Ala, Val, ThrまたはSer）；残基61のXaa=（Cys, ValまたはSer）；残基63のXaa=（Ala, ValまたはThr）；残基65のXaa=（Thr, Ala, Glu, Val, Gly, AspまたはTyr）；残基66のXaa=（Gln, Lys, Glu, ArgまたはVal）；残基67のXaa=（Leu, Met, ThrまたはTyr）；残基68のXaa=（Asn, Ser, Gly, Thr, Asp, Glu, LysまたはVal）；残基69のXaa=（Ala, Pro, GlyまたはSer）；残基70のXaa=（Ile, Thr, LeuまたはVal）；残基71のXaa=（Ser, Pro, Ala, Thr, AsnまたはGly）；残基72のXaa=（Val, Ile, LeuまたはMet）；残基74のXaa=（Tyr, Phe, Arg, Thr, TyrまたはMet）；残基75のXaa=（Phe, Tyr, His, Leu, Ile, Lys, GlnまたはVal）；残基76のXaa=（Asp, Leu, AsnまたはGlu）；残基77のXaa=（Asp, Ser, Arg, Asn, Glu, Ala, Lys, GlyまたはPro）；残基78のXaa=（Ser, Asn, Asp, Tyr, Ala, Gly, Gln, Met, Glu, AsnまたはLys）；残基79のXaa=（Ser, Asn, Glu, Asp, Val, Lys, Gly, GlnまたはArg）；残基80のXaa=（Asn, Lys, Thr, Pro, Val, Ile, Arg, SerまたはGln）；残基81のXaa=（Val, Ile, ThrまたはAla）；残基82のXaa=（Ile, Asn, Val, Leu, Tyr, AspまたはAla）；残基83のXaa=（Leu, Tyr, LysまたはIle）；残基84のXaa=（Lys, Arg, Asn, Tyr, Phe, Thr, GluまたはGly）；残基85のXaa=（Lys, Arg, His, Gln, Asn, GluまたはVal）；残基86のXaa=（Tyr, His, GluまたはIle）；残基87のXaa=（Arg, Glu, Gln, ProまたはLys）；残基88のXaa=（Asn, Asp, Ala, Glu, GlyまたはLys）；残基89のXaa=（MetまたはAla）；残基90のXaa=（Val, Ile, Ala, Thr, SerまたはLys）；残基91のXaa=（ValまたはAla）；残基92のXaa=（Arg, Lys, Gln, Asp, Glu, Val, Ala, SerまたはThr）；残基93のXaa=（Ala, Ser, Glu, Gly, ArgまたはThr）；残基95のXaa=（Gly, AlaまたはThr）；残基97のXaa=（His, Arg, Gly, LeuまたはPro）。更に、rBMP-3bおよびmGDF-10の残基53の後にIleがあり、GDF-1の残基54の後にTがある；BMP-3の残基54の後にはVがある；BMP-8およびDorsalinの残基78の後にはGがある；hGDF-1の残基37の後にはPro, Gly, Gly, Proがある。
一般配列10（SEQ ID NO: 7）は一般配列9（SEQ ID NO: 6）の全てを包含し、更にN−末端に次の配列（SEQ ID NO: 9）を包含する:

従って、残基6で始まり、一般配列10の各“Xaa”は一般配列9に関して定義された特定のアミノ酸である。その定義は一般配列9に関して記述された各残基番号を一般配列10の中で5つずつシフトしたものである。このように、一般配列9における“残基1のXaa=（Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, ValまたはGlu）”は一般配列10における残基6のXaaをさす。一般配列10においては、残基2のXaa=（Lys, Arg, Gln, Ser, His, Glu, AlaまたはCys）；残基3のXaa=（Lys, Arg, Met, Lys, Thr, Leu, TyrまたはAla）；残基4のXaa=（His, Gln, Arg, Lys, Thr, Leu, Val, ProまたはTyr）；および残基5のXaa=（Gln, Thr, His, Arg, Pro, Ser, Ala, Gln, Asn, Tyr, Lys, AspまたはLeu）。
一般配列10の定義内で自然に起こるモルフォゲンの整列化に基づいて、少なくとも残基11-12、42-43、59-60、68-69および83-84の間ないしこれを含む部分で、1個ないしそれ以上のアミノ酸残基の欠落および／あるいは挿入が許容される（生物学的活性の消失なしで）ことは明らかにすべきである。
上述したように、この発明において有用な広く好ましい形態発生的ポリペプチド配列は、hOP-1の好ましい参照配列で定義されるアミノ酸配列と60%以上の相同性、好ましくは65%以上の相同性を有している。これらの特殊な参照配列は、OP-1およびOP-2タンパク質の対立遺伝的でかつ系統発生的な相対変異物を包含する。また、Drosophila 60Aタンパク質を含みBMP-5、BMP-6およびVgr-1タンパク質に非常に近いものである。従って、特に好ましい具体例では、有用な形態発生的タンパク質は、”OPX”と上述された一般的アミノ酸配列（SEQ ID NO: 3）内にあるポリペプチド鎖対を含む活性タンパク質を含有する。そしてそれは、7個のシスティン骨格を定義し、OP-1およびOP-2タンパク質のいくつかの同定された変異物間の相同性を与える。従って、OPXの決められた位置の各”Xaa”は、マウスあるいはヒトOP-1ないしOP-2のC-末端配列にある相当する位置にある残基から独立的に選択される。特に、各”Xaa”は以下のように定義された1個ないしそれ以上の特定のアミノ酸のグループから独立的に選択される；

ここで、残基2のXaa=（LysまたはArg）；残基3のXaa=（LysまたはArg）；残基11のXaa=（ArgまたはGln）；残基16のXaa=（GlnまたはLeu）；残基19のXaa=（IleまたはVal）；残基23のXaa=（GluまたはGln）；残基26のXaa=（AlaまたはSer）；残基35のXaa=（AlaまたはSer）；残基39のXaa=（AsnまたはAsp）；残基41のXaa=（TyrまたはCys）；残基50のXaa=（ValまたはLeu）；残基52のXaa=（SerまたはThr）；残基56のXaa=（PheまたはLeu）；残基57のXaa=（IleまたはMet）；残基58のXaa=（AsnまたはLys）；残基60のXaa=（Glu, AspまたはAsn）；残基61のXaa=（Thr, AlaまたはVal）；残基65のXaa=（ProまたはAla）；残基71のXaa=（GlnまたはLys）；残基73のXaa=（AsnまたはSer）；残基75のXaa=（IleまたはThr）；残基80のXaa=（PheまたはTyr）；残基82のXaa=（AspまたはSer）；残基84のXaa=（SerまたはAsn）；残基89のXaa=（LysまたはArg）；残基91のXaa=（TyrまたはHis）；および残基97のXaa=（ArgまたはLys）。
更に他の好ましい例では、有用な形態発生的活性タンパク質は、以下の核酸によりコードされる配列からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を保有している。その核酸は、例えば、OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、60A、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7および類似タンパク質の保存された7個のシスティン骨格で定義されるC-末端配列のような参照形態発生的配列をコードしているDNAあるいはRNAと、低、中、または高緊迫ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ここで用いた高緊迫ハイブリダイゼーション条件は、既知の方法、即ち、40%ホルミアミド、5 X SSPE、5 X Denhardt溶液、および0.1% SDSで37℃一晩、そして50℃で0.1 X SSPE、0.1% SDS中で洗う操作に従ったハイブリダイゼーションである。標準の緊迫条件は標準の分子生物学クローニング教科書によく述べられている。例えば、以下のものを参照；1 Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、Shamrook、Fritsch、Daniatis著（Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989）；

Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait著、1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D. HamesおよびS.J.Higgins著、1984）：A Practical Guide To Molecular Cloning（B. Perbal著、1984）。
従って、この発明の物質や方法において有用な形態発生的なタンパク質は、天然由来のもの、あるいはリコンビナントDNAもしくは他の合成法によるものにかかわらず、上述したポリペプチド鎖のいずれかを有するタンパク質を含有することができ、また、これらタンパク質の対立遺伝的でかつ系統発生的な相対変異物も包含するし、それらの生合成変異物（突然変異物）や不完全で融合したものでもよい。欠損あるいは添加変異物もまた活性であると予想される。これらには、これらの変異が折り畳み構造に置いてシステインと関連を機能的に損なわない条件で、保存されたC-末端の6または7個のシスティンドメインを変えたものも含まれる。従って、そのような活性型は、ここで明らかにされ特に述べられた構造と等価であると考えられる。これらのタンパク質は宿主細胞のレコンビナントDNAの発現により産生された、種々の糖化パターン、種々のN-末端、アミノ酸配列の相同性部分を有する関連タンパク質ファミリー、および天然のまたは生合成タンパク質の活性な切形型あるいは成熟型を含む。
ここで考慮された骨形態発生的タンパク質は、宿主の原核および真核細胞において完全なあるいは不完全なcDNAまたは合成DNAにより発現され、精製され、切断され、再び折り畳まれ、２量体化されて形態学的に活性な形に形成される。現在の好ましい宿主細胞には、大腸菌を含む原型細胞、酵母を含む真核細胞、およびCHO、COSあるいはBSC細胞等の哺乳動物細胞を含むが、これらに制限されるものではない。当業者には、他の宿主細胞も有利に使用できることが理解されよう。この発明における実用化に際して有用な形態発生的なタンパク質についての、作成方法、使用法およびその活性の試験法を含む詳細な記述は、多数の論文により明らかにされる。これらの開示はここに引用し、本明細書に援用する。従って、標準の分子生物学的教科書や手順および使用可能な知見を使用することで、技術のある遺伝子工学技術者／分子生物学者は種々の異なった生物学的種のcDNAや遺伝子ライブラリーから、適当なアミノ酸配列あるいはオリゴヌクレオチドから作り上げたDNAをコードしている遺伝子を単離することが可能である。また、哺乳動物で神経細胞の形態発生を促進する活性タンパク質を多量に生産するために、原核細胞および真核細胞の両方を含む多種の宿主細胞でそれらを発現することが出来る。
他の例では、モルフォゲンを適用する代わりに、哺乳動物における内因性の形態発生的タンパク質の発現を促進ないし誘発する物質の有効量を、ここに記述されたいかなるルートによって投与してもよい。このようなモルフォゲンの誘発物質は哺乳動物に与えることが出来る。例えば、哺乳動物への全身投与や神経細胞への直接投与である。与えられた組織における内因性モルフォゲンのレベルを調節できる誘発物質（促進物質）を同定し試験することは、発行済みの出願WO 93/05172およびWO 93/05751に詳細が記述されており、参照することにより本明細書に援用する。簡単には、候補化合物が同定され、試験組織や細胞あるいはそれ由来の培養細胞を用いて、例えば、その組織細胞により産生されるモルフォゲンの発現および／あるいは分泌等の産生に影響を与えるのに十分な時間in vitroのインキュベーションを行うことにより試験できる。適当な組織あるいはその培養細胞として、好ましくは腎臓の上皮細胞、卵巣組織、繊維芽細胞、および骨芽細胞である。
更に他の例では、モルフォゲン受容体のアゴニストとして働く物質をモルフォゲンそれ自体の代わりに投与することが可能である。そのような物質は“模倣の”、“擬態の”あるいは“類似の”モルフォゲンと称される。このように、例えば、小さなペプチドや他の分子が、モルフォゲン受容体に結合する活性およびモルフォゲン受容体を活性にすることを模倣することにより、モルホゲと等価なものとして使用できる。好ましくは、アゴニストは完全アゴニストであるが、モルフォゲン受容体の部分的アゴニストも有利に使用できる。そのようなアゴニストの同定法は公知であり、モルフォゲンが介在する反応（例えば、後腎間葉細胞の分化誘導、軟骨内骨形成の誘導）を誘導する化合物のアッセイも含む。例えば、モルフォゲン誘導物質あるいはモルフォゲン受容体アゴニストの同定法はU.S.Ser. No.08/478,097, June 7, 1995出願、およびU.S.Ser. No.08/507,598, July 26, 1995出願に明らかにされ、ここで参照することにより本明細書に援用する。
最後に、上述のように、他の例では、中枢神経系の虚血や外傷による障害を受けた対象に、モルフォゲンのソースおよび／あるいは追加機能的な神経組織のソースとして働かすために、細胞を移植することができる。そのような細胞は、モルフォゲンを正常に発現する、モルフォゲンを発現するように形質変換された、あるいは分化を誘導するためにモルフォゲンで処理してきた宿主あるいは提供細胞である。
Ｃ．処置に望ましい哺乳動物
一般的に、この発明の方法は中枢神経系の虚血や外傷による障害を受けた哺乳動物対象に適応できる。その方法は、少なくとも処置開始6時間前、例えば、12時間、24時間前あるいは48時間前、あるいはそれ以上前に脳卒中や外傷による障害が起きた哺乳動物を用いて実用化できる。発明の実用化は障害哺乳動物への有意な臨床効果を確かにする。この発明は、これまでに記述したように中枢神経系機能の臨床的な有意な回復をもたらす。この発明はいかなる霊長類、好ましくは人類のような高等な霊長類に適している。更に、この発明はヒトの仲間としての哺乳動物（例、犬、猫、馬）、商品としての価値ある哺乳動物（例、山羊、豚、羊、牛、スポーツ用あるいは牽引用動物）、科学的な価値ある哺乳動物（例、絶滅寸前種の捕獲あるいは自由な標本、繁殖あるいは飼育した動物種）、あるいは他の価値ある哺乳動物、等の家庭的な哺乳動物の処置にも適応できる。医学あるいは獣医学における通常の技術者は、哺乳動物が中枢神経系の虚血や外傷により障害を受けているかどうかを確かめることに訓練されている。例えば、日常的な試験および／あるいは臨床的または獣医学的な診断評価は、哺乳動物が中枢神経系（神経学的）機能の障害や欠損を受けているかどうかを明らかにするであろう。臨床的あるいは非臨床的指標は、蓄積された経験と同様に、治療のここで開示されたおよび他の処置方法に関して、熟練した医者に、対象が中枢神経系の虚血や外傷により障害を受けているかどうか、また、この発明を含む特別の処置が必要かどうかを知らせる。
Ｄ．処置の組織化および方法
この発明でのモルフォゲン、モルフォゲン誘導物質、あるいはモルフォゲン受容体アゴニストは、使用する特別なモルフォゲン、誘発物質あるいはアゴニストに適したいかなるルートでも投与できる。このように、投与は経口または非経口的に行われる。静脈内あるいは皮下投与も含まれる。更に、モルフォゲン、誘導物質、あるいはアゴニストの大丸薬の間欠投与も可能である。また、外部（例、袋）あるいは内部の（例、移植血管または移植コロニー、モルフォゲン生産細胞）リザーバーからのより継続的な静脈内あるいは皮下投与もできる。
この発明の治療剤（例、モルフォゲン、モルフォゲン誘導物質、あるいはモルフォゲン受容体アゴニスト）は適当ないかなる手段、直接（例、局所組織への注射、移植、組織部位への局所投与）あるいは全身的（例、非経口的あるいは経口投与）で個人に与えられる。治療剤は非経口的に、例えば静脈内、皮下、分子内、眼科的、腹腔内、筋肉内、口腔内、直腸内、経膣、眼内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、腱捷内、槽内、嚢内、鼻内、あるいは水溶液の部分からなる治療剤のエアロゾル投与による。溶液は生理学的に許容されるもので更に患者に望ましい形で投与される。溶液は患者の電解質および／あるいは容積バランスに副作用がない。それ故に、水溶性治療薬は通常の生理食塩水（9.85% NaCl, 0.15M, pH7-7.4）を含む。
必要があれば、モルフォゲンや他の物質は適当な化合物と結合させることでより水溶性にできる。例えば、成熟したモルフォゲン２量体とプロドメインとを結合させると、相当する成熟型よりも典型的に生理溶液中でより水溶性あるいは分散可能な、モルフォゲンの前駆型となる。事実、内因性モルフォゲンはこの形で哺乳動物体内に輸送（例、分泌および循環）される。このタンパク質の可溶性型は、モルフォゲン−分泌哺乳動物細胞、例えばモルフォゲンを発現することのできる核酸で形質転換した細胞、の培養培地から得られる。また、か溶性の種は成熟した形態学的に活性なポリペプチド２量体（またはその活性フラグメント）とモルフォゲンのプロドメインあるいは可溶性を高めたフラグメントを混合することで達成できる。水溶性を高めたプロドメインフラグメントは、成熟したポリペプチドの２量体とコンプレックスを形成し非共有結合あるいは共有結合の安定性および／あるいは解離性を高めるモルフォゲンファミリーメンバーの前駆領域のN-末端、C-末端、あるいは内部フラグメントのいずれかで可能である。典型的には、有用なフラグメントはタンパク加水分解部位Arg-Xaa-Xaa-Argで切断されたものである。モルフォゲンの可溶性コンプレックスに関する詳細は、作成法、試験法および使用法を含め、WO 94/03600（PCT/US 93/07189）に記述されている。OP-1の場合、有用なプロドメインフラグメントは全プロドメイン（残基30-292）およびフラグメント48-292、158-292、またはSe, ID No.5の全てである。他の溶解性を高めかつ特に経口投与で有効にした分子はカゼインである。例えば、0.2%カゼインを添加すると、成熟した活性OP-1の溶解性を80%高める。ミルク中に見られる他の組成物および／あるいは種々の血清タンパク質も有効である。
非経口投与に有用な溶液は、薬理学でよく知られた方法のいずれかで調製できる。その方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Gennaro, A.著）、Mack Pub., 1990に記載されている。発明の治療薬の製剤は、例えばポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜由来の油、水素化ナフタレン類および類似物を含む。直接投与薬の製剤は、特に望んだ部位に留まらせるためにグリセロールと高粘度の他の組成物とを含む。生物利用できる、望ましくは生物由来の高分子、例えばヒアルロン酸、コラーゲン、トリカルシウム、リン酸、ポリブチレート、乳酸塩、およびグリコライド高分子、また乳酸塩／グリコライドコポリマーは、in vivoで治療薬の遊離を調節できる有用な素材である。他の特に非経口投与で有用な系は、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、オスモティックポンプ、移植可能な注入システム、およびリポゾームを含む。吸入投与の製剤化は、例えば、乳糖、のような素材を含む。あるいは、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸を含む水溶液、あるいは、鼻への滴投与または鼻内への投与するゲル状の油状溶液も可能である。非経口投与の製剤化は、口腔内投与のためのグリココール酸、直腸内投与のためのメトキシサリチル酸、経膣投与のためのクリン酸、等を含む。直腸内投与の製剤化は、モルフォーゲン、誘導体またはアゴニスト、ココアバターのような非刺激性の成分、あるいは室温では固形で体温では液状となる成分を混合することで可能である。
皮膚表面への局所投与は、モルフォーゲン、誘導体またはアゴニストを、ローション、クリーム、軟膏あるいは石鹸のような皮膚に適応できるキャリアーと分散することで可能である。特に有用なものは、皮膚表面にフィルムや層を形成し、投与を局所化し蒸散を防ぐキャリアーである。内部組織表面への局所投与には、治療薬は組織に吸着する液体あるいは組織表面への吸着を促進することが知られている他の物質へ分散させることで可能である。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースやフィブリノーゲン／トロンビン溶液が有効である。または、ペクチンでコートした製剤のような組織―コーティング溶液も使われる。
ここで述べてきた治療薬が経口投与にも用いられる。大概のタンパク質は血流に吸収されるまでに哺乳動物の消化器系消化酵素や酸により分解されるので、治療薬としてのタンパク質の経口投与は実用的ではない。しかしながら、ここで記述したモルフォーゲンは酸に安定でタンパク分解酵素に耐性である（参照、例、U.S. Pat. No. 4,968,590）。更に、少なくとも一つのモルフォーゲン、OP-1は乳腺抽出物、初乳および57日乳に見出されている。その上、乳腺抽出物から精製されたOP-1は形態発生的に活性で血流にも見出される。分泌乳を通して母胎からの投与は、TGF-βスーパーファミリータンパクの自然の伝達である。Letterioら（1994）、Science 264; 1936-1938,はTGF-βはマウスの乳にも存在し、放射能ラベルしたTGF-βが授乳子の胃腸粘膜に吸収されることを報告している。ラベルし、取り込んだTGF-βは、子の肺、心臓および肝臓を含む体組織中に素早く完全な形で現れる。最後に、モルフォーゲンの水溶性型、例えばプロドメインと結合した成熟モルフォーゲンは形態学的に活性である。これらの知見は、下記例に示されるように、経口および非経口投与がモルフォーゲンを含むTGF-βスーパーファミリータンパクの個体への投与に有効であることを示唆している。更に、ここで述べたあるモルフォーゲンの成熟型はわずかに水溶性であるが、乳（乳腺および初乳）中では可溶性であり、多分、成熟した形態学的に活性な形と発現された完全長のポリペプチド鎖のプロドメインの一部あるいは全部との結合、および／あるいは一つないしそれ以上の乳成分の結合によりなる。従って、ここで提供できる化合物はin vivoまたはin vitroで水溶性を高める化合物である。
この化合物は、モルフォーゲン、誘導体またはアゴニストを望む組織へ送ることが可能である分子と結合することができる。例えば、抗体、抗体フラグメント、あるいは望む組織細胞の表面分子へ特異的に結合する他の結合タンパク質が有用である。有用な標的化分子は、例えばU.S. Pat. No. 5,091,513に述べられている単鎖結合部位テクノロジーを用いて作成できる。標的化分子は、モルフォーゲン、誘導体またはアゴニストと共有結合あるいは非共有結合で結合する。
当業者に認められるように、製剤化された組成物はモルフォーゲン、モルフォーゲン誘導体またはモルフォーゲン受容体アゴニストの治療に有効な濃度を含む。即ち、これは中枢神経系機能回復を完全回復までも含んで促進するのに充分な時間、神経組織に影響する治療薬の濃度を含む製剤である。これらの濃度は、選択された治療薬の生物活性、特定の薬剤の化学的性質（例、疎水性）、一つないしそれ以上の賦形剤との混合物を含む製剤、投与ルート、および活性成分が組織部位に直接投与されるか、全身投与かの考えられる処置方法、等の多数の因子により変動する。好ましい投与量も病気あるいは障害の組織の状態および個別の哺乳動物の健康状態により異なる。一般的に、0.00001-1000mgのモルフォーゲンの単回、毎日、隔週および毎週の投与で充分であり、0.0001-100mgが好ましく、より好ましくは0.001ないし10mgの投与である。または、0.01-1000ug/Kg体重の単回、毎日、隔週および毎週の投与、好ましくは0.01-10ug/Kg体重で有利に使用できる。現在の有効投与量は単回ないし複数（２回ないしそれ以上）の分割投与で投与できる。拡散注入製剤の一括投与が用いられる。繰り返しあるいは頻回の注入が望まれるときは、半永久的なステント（静脈、腹腔、嚢内、槽内）の移植がアドバイスされる。下記実施例２では、参照モルフォーゲン（hOP-1）の6-240ug/Kgの脳室内投与が中枢神経系機能の欠損ないし障害に対し明らかな検出可能な回復をもたらした。成熟モルフォーゲン（OP-1, 20mg）を正常な生育ラットに21日間連続投与した場合に全くモルフォーゲンによる障害が見られなかったことは特記すべきである。更に、10mgのモルフォーゲン（OP-1）の正常新生マウスへの毎日10日間の全身投与は全く成長異常を起こさなかった。
本発明のモルフォーゲン、誘導体またはアゴニストは、勿論、単独でも、ここに記述する処置に有効な他の分子とともにでも投与できる。例えば、種々の既知の成長因子、ホルモン、酵素、治療用製剤、抗生物質、あるいは他の生物活性な物質も投与できる。NGF, EGF, PDGF, IGF, FGE, TGF-α,およびTGF-β等の既知の成長因子は、酵素、酵素阻害剤、抗酸化剤、抗炎症剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗生物質および／あるいは化学誘因物質／化学起因因子と同様この投与可能なモルフォーゲン製剤に含ませることができる。中枢神経組織によるモルフォーゲン、誘導体またはアゴニストの取り込みを促進するために親油性の基を導入したり脳血液関門を活性を持って通過できる物質を導入する。
本発明の実用化のために、追加の好ましい特徴、具体例を含め以下の実施例により更に理解されるであろう。しかしこれら説明のためのみのものであって、本発明を制限するものではない。
実施例１；In Vivo投与のための溶解性モルフォーゲンタンパク溶液の調製
Ａ．水溶性溶液
成熟した２量体の形態発生的タンパク質は本質的には生理的緩衝液中ではほとんど溶解しないが、注射可能な溶解型に変換することができる。モルフォーゲンを含む水溶液の一例は、0,1%トリフロロ酢酸（TFA）、0.1%塩酸あるいは同等の溶液中にアセトニトリルを含む50%エタノールにモルフォーゲンを溶解ないし分散させることで可能となる。その得られた溶液の１容を10容のリン酸緩衝食塩水（PBS）に添加する。PBSには0.1-0.2%ヒト血清アルブミン（HSA）または類似のキャリアータンパク質を含む。混合液を激しく攪拌し、生理的に適応可能なモルフォーゲン製剤を作成する。
他の例では、OP-1を含むモルフォーゲンはpHを低下させることで溶解できる。
一例では、溶液をより等張にするために5%マンニトールを含む0.2M酢酸バッファー、pH4.3を用いる。他の生理的に適応可能な製剤化の方法は記載されている通りである。
Ｂ．溶解性コンプレックスの形成
ここで有用な水溶液への溶解性が改良された好ましいモルフォーゲンは、少なくともC-末端7個のシステインドメインをもつモルフォゲンファミリーの特徴を含み、モルフォーゲンファミリーの一つの前駆領域、またはその溶解性を高められたフラグメント、またはその対立遺伝子、種、他の配列変異体を含むペプチドと複合した２量体モルフォーゲンタンパク質である。水溶性を高めたフラグメントは、可溶性コンプレックスの安定性を高めるために成熟した２量体ポリペプチドと複合体を形成するモルフォゲンファミリーメンバーの前駆領域のN-末端、あるいはC-末端のフラグメントである。望ましくは、２量体モルフォゲンは２つのプロドメインとコンプレックスを形成することである。
上述および刊行された出願WO 94/03600に記載通り、これは参照するこにより本明細書に援用する、適当な条件下で溶解性コンプレックスは細胞培養培地（または体液）から単離できる。または、溶解性コンプレックスはin vitroで作成できる。
溶解性コンプレックスは調整培地から簡単に、変性剤を用いない３段階のクロマトグラフのプロトコールで単離できる。プロトコールはWO 94/03600に記載通り培地（または体液）をアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲル濾過クロマトグラフィーをかける。アフィニティカラムはZn-IMACカラムである。この例ではOP-1を用いたが、これに制限するものではない。このプロトコールは他のモルフォーゲンにも応用可能で、全てのモルフォーゲンは以下に記述されている手順を少しかえることで単離可能である。用いたモルフォーゲンドメインに特異的な抗体を用いた免疫アフィニティーカラムおよび、例えば、あるモルフォゲンプロドメインに特異的な抗体（プロテインＡ−共役セファロースへのコンプレックス）を用いる利用が考えられる。免疫アフィニティーカラムの操作手順は文献に記載通りである（参照、例、Guide to Protein Purification, M. Deutscher著、Academic Press, San Diego, 1990、VIIおよびXI巻）。
この例では、OP-1は哺乳動物細胞（CHO、チャイニーズハムスター卵巣）で発現できた（参照、例、国際出願US90/05903（WO 94/03600））。0.5% FBSを含むCHO調整培地は最初に固定化金属イオンアッフィニティークロマトグラフィー（IMAC）で精製する。調整培地からの溶解性のOP-1コンプレックスは非常に選択的にZn-IMAC樹脂に結合し、結合コンプレックスの溶出には高濃度（50mM, pH8.0）イミダゾールが必要である。Zn-IMAC精製溶解OP-1は次に20mM NaPO4（pH7.0）と50mM NaClで平衡化したS-セファロースイオン交換にかける。次にタンパクをTBSで平衡化したSephacryl S-200HRカラムにかける。本質的に同じ手順を用いて、血清、脳脊髄液あるいは末梢体液を含む一つないしそれ以上の体液から溶解性モルフォーゲンを単離できる。
溶解性OP-1コンプレックスは見掛け上の分子量110kDaで溶出する。これは１つの成熟OP-1の２量体（35-36kDa）と２つのプロ−ドメイン（39kDa）の複合体と予想した分子量に一致する。最終コンプレックスの純度は減少15%ポリアクリルアミドゲル上で確認する。
培地あるいは体液からの溶解性コンプレックスの精製への代替法として、可溶解性コンプレックスは精製プロドメインと成熟２量体とを結合させて作成することがある。コンプレックスの生成が成功するためにはジスルフィド結合に影響しないように折り畳み構造を解放するのに十分な変性条件が必要である。望ましくは変性条件は細胞内小胞の環境を模倣したもので、折り畳み条件を解放するのに十分な条件下で切断されたプロドメインが成熟２量体と結合する機会が与えられる。溶液中の変性剤の濃度を望ましくは段階的に低下させ、２量体とプロドメインと結合を維持しながら、再折り畳みを起こさす。有用な変性剤は、pH4-10、望ましくはpH6-8の緩衝液中に4-6M尿素または塩酸グアニジン（GuHCl）を含む。溶解性コンプレックスは次に、0.1-2M尿素またはGuHCl、望ましくは1-2M尿素またはGuHCl以下の変性剤濃度での透析を行う。タンパク精製／変性法は文献に詳しい。有用な教科書はGuide to Protein Purification, M. Deutscher著、Academic Press, San Diego, 1990、V巻。コンプレックス形成は一つないしそれ以上のシャペロンタンパクの添加によっても可能である。
生理バッファー、例えばTris-緩衝液（TBS）およびリン酸バッファー-生理食塩水（PBS）中の高純度溶解モルフォーゲンコンプレックスの安定性は３種の添加物の1つ以上の手段を含む多くの手段で高めることができる。添加物としては塩基性アミノ酸（例、L-アルギニン、リジンおよびベタイン）；非イオン性界面活性剤（例、Tween 80またはNonIdet P-120）；およびキャリアータンパク（例、血清アルブミンおよびカゼイン）がある。これらの添加物の有用な濃度は、塩基性アミノ酸で1-100mM、望ましくは50mMを含む10-70mM、非イオン性界面活性剤で0.01-1%、望ましくは0.1%（v/v）を含む0.05-0.2%、キャリアータンパクで0.01-1.0%、望ましくは0.1%（w/v）を含む0.05-0.2%である。
実施例２；脳血管の外科的結紮による脳卒中モデル
中心脳動脈（MCA）結紮モデルは、部分的虚血や脳卒中のモデルとしてよく取り入れられている（Gottiら、（1990）Brain Res. 522; 290-307）。大脳小葉虚血はMCAからの血流を遮ることで起こり、この血管で供給される脳の部分の梗塞が起こる。MCAモデルはモルフォーゲンのような脳卒中により中枢神経機能の欠損や障害を受けた患者に対する薬物の薬効を評価するには最適な系である。例えば、MCAモデルは、MCA関与の領域の中枢神経系機能である協調行動、感覚認知、会話等の改善を評価できる。
OP-1で処置した動物は以下に述べる機能／行動試験でMCA結紮後、最初の24時間で対照の動物より有意に改善した。
Ｉ．外科的結紮法
この研究に用いた動物は、体重250-300gの雄Sprague-Dawleyラット（Charles River）である。外科処置のために、動物を70%/NO2/30%O2中2%ハロセンで麻酔した。尾静脈にカニューレを挿入し、血中ガスおよび血中グルコース濃度をモニターした。体温は直腸プローブを用いて測定し、保温パッドで37±0.5℃に維持した。正中脳動脈（MCA）をTamuraら（1981,J. Cereb. Blood Flow Metab. 1;53-60）の方法の変法で永久結紮した。簡単には、MCAを橋梁や顔面神経を傷つけずに露出した。血管は両極性マイクロコアギュレーターを用いて電気的に凝血させた（Bedersonら（1986）Stroke 17;472-476）。ラットは覚醒するまで観察しケージに返した。感染を防ぐために全ての動物に卒中の１日前と直後に抗生物質のセファゾリンナトリウムを投与（40mg/Kg, i.p.）した。卒中の術中は血中ガスおよび血中グルコース濃度に、OP-1処置ラットと対照とで差は見られなかった。
II．モルフォーゲンの投与
OP-1処置ラットは脳室内投与で1ないし10ug/injectionの量で投与した。対照ラットはOP-1を除いた以外は全て同じ溶液を投与した。
脳室内投与するために、動物を70%/NO₂/30%O₂中ハロセンで麻酔し、常同行動フレームに入れた。OP-1を含む溶液またはビヒクルのみの溶液の脳室内投与の手順と対照の溶液の投与は本質的に同じである。麻酔技術を用いてOP-1（1または0μg/injection）または同量のビヒクルを経皮注射により、投与は26ゲージの注射針のついたHamilton注射器を用いて脳室内に行った（Yamadaら（1981,J. Cereb. Blood Flow Metab. 11;472-478）。各注射前にHamilton注射器で1-2μlの脳脊髄液（CSF）を採取し、クモ膜下腔の針の位置を確認した。予備試験では、1% Evans Blue液が投与後１時間以内に大脳基底を通り大脳皮質上に自由に拡散することを示している。動物は、OP-1処理群とビヒクル処理群にランダムに郡分けをした。
この研究では、脳卒中後最初の24時間後から、一週間に2回ずつ４週間（1,4,8,11,15,18,22,および25日）に脳室内投与した（10ug/injection OP-1またはビヒクル）。２回目の研究では２回脳室内投与を行った（2 x 1μ/注射OP-1、2 x 10μ/注射OP-1または2xビヒクル）、最初の注射は発作後24時間、２回目の注射は発作後4日後に実施した。３回目の研究では発作後24時間後単回投与した。
III．行動試験
行動／機能学的なテストをするのに必要なので、動物を手術の前３日間、毎日10分間手で触られるのに慣らした。手術後は動物は個別のケージに入れた。梗塞後の感覚認知および機能を反映するために４つの標準機能／行動試験を行った。試験法は以下に詳細が記述されている（Bedersonら（1986）Stroke 17;472-476；Deryckら（1992）Brain Res. 573; 44-60; Markgrafら（1992）Brain Res. 575; 238-246；Alexisら（1995）Stroke 26; 2338-2346）。
Ａ．前肢位置試験
簡単には、前肢位置試験は、３つの小試験からなる。各前肢について得点をスコアー化する。視覚位置小試験では、動物は実験者に垂直に保持された机の表面近くまでもってこられる。机へ正常に前肢を位置した場合はスコアーは”0”で、遅れて（２秒以内）位置した場合は”1”、非常に遅れた場合または正常に位置しない場合は２秒以上）は”2”とする。最初は動物は、前向きにつれてこられ、２回目は横向きにつれてこられる（1本の肢当たり最大スコアは4。いずれの場合も高い得点はより大きな損傷を表す）。触感のサブテストでは動物には机を見せず、またホホヒゲが机と当たらないように置かれる。1回目に動物が前向きにつれてこられるとき、2回目に横向きつれてこられるとき、前肢後側は机に軽く触れさせるスコアー化は上記と同様である（最大スコアは1本の肢あたり）。自己刺激感応位置小試験では、動物は前向きにだけつれてこられ前踵にはより強い圧を加える。位置は上記のようにスコア化される（1本の肢あたりの最大のスコアは2）。何匹かの動物ではホホヒゲの位置サブテストが行われた。そこではホホヒゲの刺激に反応して前肢を机上に置く能力試験された（1本の肢あたり最大スコアは２）。それからサブスコアをたし1本あたりの全前肢位置スコアが決定された（0-10、ホホヒゲテストのあるとき0-12）。
Ｂ．後肢位置試験
後肢位置試験は前肢位置試験と同様に行うが、触覚位置サブテストおよび自己刺激感応位置サブテストのみを含む。
Ｃ．変形平衡棒巣部テスト
変形平衡棒試験は、動物が狭い棒（30 x 1.3cm）上で60秒間バランスをとる運動反射機能を見る。平衡棒上のバランス能力は次のようにスコアー化する；１，棒の頂上で４肢全てでバランスをとる。２，棒の横に肢を乗せるが棒上ゆらゆらする。３，１個ないし２個の肢がすべる。４，３個の肢がすべる。５，動物は肢でバランスをとろうとするが落ちる。６，動物は棒を滑り落ちる。７，動物はバランスをとろうとしないで落ちる。動物はすべて手術の前に３回訓練される。最後の訓練でのスコアーを基礎点とする。
Ｄ．姿勢反射試験
姿勢反射試験は、反射と感覚認知の両方の機能を試験する。最初動物の尻尾を持ち床上につり下げる。両前足を対称に床につこうとのばせばスコアーは０とする。姿勢の異常さに従って、スコアーを１および２とする。異常な姿勢を見せる動物（片足だけ収縮する、体が回転する）紙製の背当てかプラスチックのシートに入れる。低い側圧による横の動きに耐えられる動物はスコア1で、この動き二耐えられないのはスコア2となる。すべての機能/行動試験は、発作手術の直前に行われ、発作後1〜31日まで1日おきに行われた。どのセッションも動物は試験前30分部屋に慣らされた。
IV．組織学的解析
ＭＣＡ閉塞の３１日後、動物はペントバルビタールで深く麻酔された。そしてヘパリン含有生理食塩水で心臓から還流し、続いて１０％緩衝液フォルマリンでこれを行った。脳が取り出され３片にカットされ、そして脱水とパラフィン包埋前に１０％緩衝液フォルマリン中に保存した。頭頂セクション（５マイクロメーター）がスライドするミクロトームでカットされた、グラススライドに載せられそしてヘマトキシリンエオシンで染められた。７片（ブレグマと比較して、＋４．７、＋２．７、＋０．７、−１．３、−３．３、−５．３そして−７．３）のそれぞれについて脳梗塞の領域がコンピューター介在画像システム（リオクアント。アール＆エムバイオメトリクス（株）ナシュビル、テーエム）を用いて決定された。片当たりの全梗塞領域は、プロセシング中の脳の収縮を補正するため次のような”間接的な方法”によって決定された、「無傷の反体側の半球の領域」−「無傷の同側半球の領域」（Ｓｗａｎｓｏｎ，ｅｔａｌ。、（１９９０）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．ＢｌｏｏｄＦＬＯＷＭｅｔａｂ．１０：２９０−２９３）。梗塞領域は次に反対側半球の体積に対するパーセンテージとして表現された。皮質や脳幹中の梗塞の体積は同様にこれらの方法を用いて別に決定された。
くも膜下注射行動試験組織的分析を行う実施者は全てのデータが集められるまで処置については知らされていなかった。データは平均値±ＳＤそして±ＳＥＭで表現し、変異分析の測定を繰り返した。（ANOVA）に引き続いて複数回比較のボンフェロニ補正方法を用いて、適切な対を為さない両側検定を行った。
Ｖ．結果
OP-1処置ラットとビヒクル処置動物との間でトータルの梗塞の大きさと体重との差
OP-1処置およびビヒクル処置の両群動物で、MCAの範囲の右側大脳皮質と線状核に大きな梗塞が見られた。脳の部位は、頭頂皮質、領域1と2（Par1,Par2）および顆粒島皮質（GI）、に含まれる梗塞による重篤な障害を受けた。部分的な梗塞を浮けた部位は前頭皮質（frontal cortex）, 領域1,2および3（FR1,FR2,FR3）；顆粒島皮質（granular insular cortex）（AI）；側頭皮質（temporal cortex）,領域1および3（Tel1,Tel3）; 外側後頭皮質（lateral occipital cortex）,（Oc2L）; cortical forelimb area（FL）およびcaudoputamenn（cPu; PaximosおよびWatson, 1986）を含む。Cortical hindlimb area（HL）は梗塞を受けなかった。
OP-1を連続投与（8 x 10μg/注射）した動物とビヒクル処置とではトータルの梗塞部位の大きさには差が見られなかった。（対側性半球容積，それぞれ26.3±2.5%対28.0±2.0%、t=0.538, p-n.s.）更に、皮質と線状核の梗塞部位の大きさにも両群のラットで差が見られなかった。（皮質；それぞれ30.9±3.1%対31.9±2.9%、t=0.254, p-n.s.；線状核；それぞれ66.0±3.0%対66.5±2.9%、t=0.121, p-n.s.）。更に、ヘマトキシリンおよびエオジン染色によりOP-1処置動物でも脳で異常な細胞増殖は起こっていないことが明らかとなった。同様に、単回OP-1注射または2回OP-1注射を受けた動物の梗塞の容積は、ビヒクル処置動物から有意な差はなかった（データはしめさず）。
ビヒクル処置動物の亀裂骨折後一月の体重変化の時間経過は、（a）OP-1を連続投与（8 x 10μg/注射）した動物（図4 F=0.56,p-n.s）、（b）OP-1 ２回注射（高投与=2 x 10μg/動物; 低投与=2 x 1μg/動物）（図7 F=0.417,p-n.s）、いずれの群でも差は見られなかった。（図４，７，１０）
OP-1処置ラットおよび対照ラットとの機能
梗塞後、全てのラットが以下の４試験全部で重篤な感覚認知と機能の反映障害を示した。肢位置試験で反対側（左）の足に麻痺を受けた。対照群のラットで卒中後最初の一月で部分的に回復した。（参照図2A-2B, 3A-3B, 5A-5B, 6, 8A-8B, 9）
（i）隔週毎のOP-1投与を受けた動物
隔週毎にOP-1投与を受けたラットはビヒクル処置ラットより早く回復した。OP-1対ビヒクル処置動物の回復は前肢（図2A; F=109.0, p=0.0001）および後肢（図2B; F=34.8, p=0.001）位置試験で顕著であった。また、他の試験ではそれほど顕著ではなかったが、平衡棒試験ではそれでも有意（図3A; F=11.7, p=0.0051）であった。しかし、姿勢反射試験では両群の差は有意ではなかった。
OP-1による回復の促進効果は感覚認知機能試験で最も顕著であった。MCA梗塞は前肢および後肢の大脳皮質領域を完全には損傷しなかった。
（ii）２回のOP-1投与を受けた動物
２回のOP-1投与（梗塞後１および４日）を受けた動物
２回のOP-1投与（梗塞後１および４日）を受けた動物は、ビヒクル処置のラットに比較してより早くずっと良い行動試験の回復を示した。OP-1（2x 1.10μG/注射）は（a）ホホヒゲなしの前肢位置試験（図5A; F=31.835, p=0.001, 高投与量対ビヒクルp<0.0001、低投与量対ビヒクルp<0.0001）、（b）ホホヒゲでの前肢位置試験（図5B; F=27.462, p=0.001, 高投与量対ビヒクルp<0.0001、低投与量対ビヒクルp<0.0001）、）、および（c）後肢位置試験（図6; F=14.867,p=0.001）で有意に回復が促進された。高投与量では低投与量より行動試験で良い回復を示す傾向が見られたが、このグループ間では有意ではなかった。
（iii）単回OP-1投与を受けた動物
単回のOP-1投与が長期的な機能回復を示すことが認められた。MCA結紮の24時間後に脳室内に10ugのOP-1を投与した動物では、対照よりも早くずっとよい行動の回復が見られた。OP-1は（a）ホホヒゲなしの前肢位置試験（図8A; F=10.853, p=0.0064）、（b）ホホヒゲでの前肢位置試験（図8B; F=10.629, p=0.0068）、および（c）後肢位置試験（図9; F=15.343, p=0.001）で有意に回復が促進された。
本発明では、OP-1による中枢神経系の虚血性障害の治療は、梗塞後最初の一月で機能回復の速度および程度の両方を高めた。OP-1の有効濃度の単回投与は長期の機能回復をもたらすのに十分であった。
OP-1処置により梗塞部位の大きさには変化が見られなくて、ビヒクル処置動物と比較して行動回復は改善された。全ての群で、OP-1は虚血の１日後に与えられたが、見掛け上の“治療の窓”をこえて、その間OP-1が梗塞サイズを減少すると考えられる。これは、WO93/04692およびWO94/03200に記載されているのに従っている。この知見は、生物活性のある因子の外部からの投与が脳卒中モデルにおいて梗塞サイズを減少しないで行動を改善することを示唆している。
同様にルーティンの変更を加えて、他の卒中モデルや外傷モデルでモルフォーゲンが損傷を受けたまた失われたCNS機能を回復することを確かめることができる。
同等語
本発明は、本精神あるいは本質的特徴から離れて他の特異的な形で具体化できないだろう。前述の具体化はそれゆえここで述べた本発明についての制限よりも全ての面をイラスト的に考慮することである。本発明の範囲はこのように前述の記述によってよりもむしろ添えられた請求項によって示される。そして本請求項に同義の意味と範囲内の全ての変化はここに含まれることを強調する。
配列表
（1）一般情報
（i）出願人 チャレット，マーク エフ．フィンクルステイン，セス ピー．
（ii）発明の名称 中枢神経系の虚血または外傷の機能的回復を増大させる方法
（iii）配列表の数 ９
（iv）通信先住所
（A）住所： クリエイティブ バイオモレキュルズ，インコーポレイテッド
（B）街： ４５ サウス ストリート
（C）市： ホプキントン
（D）州： マサチューセッツ州
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：01748
（v）コンピューター読み取り形式
（A）媒体： フロッピーディスク
（B）コンピューター：IBM PC コンパチブル：
（C）操作システム： PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：PatentIn Release＃1.0, version ＃1.30
（vi）本出願データ
（A）出願番号
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）弁護士／事務所情報
（A）氏名 フェントン，ジリアン エム
（B）登録番号 ３６，５０８
（C）分類： ＣＲＰ−０６９ＣＰ
（ix）通信情報
（A）電話番号：（６１７）２４８−７０００
（B）テレファクス：（６１７）２４８−７１００
（２）配列番号１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：９７アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．９７
（D）他の情報：/label=Generic-Seq-7
/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号１

（２）配列番号２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：１０２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．１０２
（D）他の情報：/label=Generic-Seq-8
/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号２

（２）配列番号３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：１０２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．１０２
（D）他の情報：/label=Generic-Seq-OPX
/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号３

（２）配列番号４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：１８２２塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（vi）起源
（A）生物：ホモサピエンス
（F）組織型：HIPPOCAMUPUS
（ix）特徴
（A）名前／キー：CDS質
（B）ロケーション：４９．．１３４１
（C）同定方法：実験
（D）他の情報：/function=“骨原性タンパク質”
/ product=”op-1”
/ 証拠=実験
/標準名:OP-1
（xi）配列の記述：配列番号４

（２）配列番号５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：４３１アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列の記述：配列番号５

（２）配列番号６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：９７アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数： 一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．９７
（D）他の情報：/label=Generic-Seq-9
/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号６

（２）配列番号７の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：１０２アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数： 一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．１０２
（D）他の情報：/label=Generic-Seq-10
/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号７

（２）配列番号８の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．５
（D）他の情報：/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号８

（２）配列番号９の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：５アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）特徴
（A）名前／キー：蛋白質
（B）ロケーション：１．．５
（D）他の情報：/ ノート=各Xaaは１以上の明細書に記載した特定のアミノ酸から独立に選択される。
（xi）配列の記述：配列番号９

Claims (13)

1. 次に掲げる要件の全てを満たす、虚血性又は外傷性の中枢神経系傷害に罹患した哺乳動物において中枢神経系機能の回復を促進するための医薬組成物。
   （a）当該中枢神経系機能は運動協調、感覚知覚及び会話の中から選択される。
   （b）当該医薬組成物はOP-1、BMP-5及びBMP-6からなる群から選択されるモルフォゲンを含む。
2. モルフォゲンがOP-1である請求項1に記載の医薬組成物。
3. モルフォゲンが当該モルフォゲンを分泌する宿主細胞の培養液上清から得られたものである、請求項1又は2のいずれかに記載の医薬組成物。
4. モルフォゲンが槽内に、脳室内に、くも膜下腔内に又は静脈内に投与されるものである、請求項1から3のいずれかに記載の医薬組成物。
5. 運動協調機能が姿勢、平衡、握力及び歩調の調節から選択される、請求項1から4のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 感覚知覚が視覚、聴覚、触覚、味覚、自己受容及び嗅覚から選択される、請求項1から5のいずれかに記載の医薬組成物。
7. 哺乳動物がヒトに限定される、請求項1から6のいずれかに記載の医薬組成物。
8. 医薬組成物が、傷害の発生後少なくとも6時間後に投与するためのものである、請求項1から7のいずれかに記載の医薬組成物。
9. 医薬組成物が、傷害の発生後少なくとも24時間後に投与するためのものである、請求項1から8のいずれかに記載の医薬組成物。
10. 医薬組成物が、傷害の発生後少なくとも48時間後に投与するためのものである、請求項1から9のいずれかに記載の医薬組成物。
11. 医薬組成物が、毎日投与されるためのものである、請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物。
12. 医薬組成物が、週2回投与されるためのものである、請求項1から11のいずれかに記載の医薬組成物。
13. 医薬組成物が、毎週投与されるためのものである、請求項1から12のいずれかに記載の医薬組成物。

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