JP4856351B2 - Ｂｖｄｖウイルス様粒子 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ウイルス様粒子、ＢＶＤＶウイルス様粒子を形成するに十分なＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするポリシストロン性ＲＮＡおよびそれに対応するＤＮＡ、ＢＶＤＶウイルス様粒子の構築のための因子や構造タンパク質をコードするウイルスベクター、ＢＶＤＶウイルス様粒子を含むワクチン、診断用キットおよびＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法に関する。
【０００２】
ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、ウシにおけるウシウイルス性下痢の病因であり、全世界に分布しており、感染率は９０％と高い。
【０００３】
ＢＶＤＶは、フラビ・ウイルス科のペスチウイルス属に属する[Horzinek（1991）, Pestiviruses - taxonomic perspectives, Arch. Virology Suppl. 3, 55-65]。ＢＶＤＶは、１個の大きなポリタンパク質に翻訳され得る１個のオープンリーディングフレームをコードする約１２.５キロベース（ｋｂ）のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する[Collet et al. （1988）, Proteins encoded by bovine viral diarrhea virus: the genomic organisation of a pestivirus, Virology 165, 200-208]。ＢＶＤＶビリオンは、糖タンパク質を含むエンベロープに囲まれたヌクレオカプシド内に封入されたゲノムＲＮＡからなる。
【０００４】
ポリタンパク質のＮ末端に近い順に、構造タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、および３つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅrnsまたはｇｐ４８、Ｅ１またはｇｐ２５、およびＥ２またはｇｐ５３）が存在する。これらすべての３つの糖タンパク質の上流にはシグナルペプチドが存在し、宿主のシグナルペプチダーゼによって、小胞体（ＥＲ）の内腔においてポリタンパク質から遊離する。
【０００５】
関連するフラビウイルス、即ちＣ型肝炎ウイルスに関しては、構造タンパク質をコードするのみであるゲノム部分の発現はウイルス様粒子形成するのに十分である[Baumert et al. （1998）, Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells, J. Virol. 72, 3827-3836]。
【０００６】
ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）は、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）および膿疱性陰門膣炎（ＩＰＶ）および感染性亀頭包皮炎（ＩＢＰ）の病因である。ＢＨＶ−１は世界中のウシにおいて高い感染率で見つかっている。
【０００７】
ＢＨＶ−１は、αヘルペスウイルスに属し、約１３６キロ塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、約７０の遺伝子をコードするが、そのうちの約３０の遺伝子がウイルスの複製に必須ではない。非必須な糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）遺伝子の欠失を有する自然突然変異体は、安全で有効なマーカーワクチンに用いられている[Kaashoek et al. （1994）, A conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and safe vaccine, Vaccine 12, 439-444]。
【０００８】
ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して保護するためのワクチンは、いずれかの不活化ＢＶＤＶ株、単離されたＢＶＤＶ糖タンパク質に基づくサブユニットワクチン、弱毒化ＢＶＤＶ株[reviewed by Van Oirschot et al. （1999）, Vaccination of cattle against bovine viral diarrhoea, Vet. Microbiol. 64, 169-183]、ＤＮＡワクチン[Reddy et al. （1999）, Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 22, 231-246; Harpin et al. （1999）, Vaccination of cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus major glycoprotein E2, J. Gen. Virol. 80, 3137-3144]、またはベクターワクチンに基づく。弱毒化ＢＶＤＶ株に基づくワクチンは免疫抑制を引き起こすことがあり得、子宮感染においては、母親の抗体の存在により効果が少ないかもしれない[Roth & Kaeberle（1983）, Suppression of neutrophil and lymphocyte function induced by a vaccinal strain of bovine viral diarrhea virus with or without administration of ACTH, Am. J. Vet. Res. 44, 2366-2372; Liess et al. （1984）, Studies on transplacental transmissibility of a bovine virus diarrhea（BVD）vaccine virus in cattle, Zentrbl. Veterinarmed. Reihe B 31, 669-681]。
【０００９】
不活化ＢＶＤＶに基づくワクチンまたはサブユニットワクチンは、抗原が細胞内で産生されず、免疫系のＴ細胞コンパートメントに効率よく提示されないので効果が低い。例えば、３種類のバキュロウイルスＢＶＤＶ Ｅ２サブユニットワクチンのうちの２つが、ヒツジモデルにおける胎児のＢＶＤＶ感染に対する保護を示さなかった[Bruschke et al.（1997）, A subunit vaccine based on glycoprotein E2 of bovine virus diarrhea virus induces fetal protection in sheep against homologous challenge, Vaccine 15, 1940-1945]。
【００１０】
ＤＮＡワクチンおよびベクターワクチンにはこの欠点がないが、現在用いられているＤＮＡワクチンやベクターワクチンは、構造タンパク質の部分のみを発現し、より免疫原性の高いウイルス様粒子を形成することができない。例えば、ＷＯ ９５／１２６８２は、ＢＨＶ−１株のＴＫ遺伝子座におけるＢＶＤＶ Ｅ２のみの発現を記載している[Kweon et al.（1999）, Bovine herpesvirus expressing envelope protein（E2）of bovine viral diarrhea virus as a vaccine candidate, J. Vet. Med. Sci. 61, 395-401も参照]。
【００１１】
ＢＶＤＶは抗原変異を示し、いくつかの抗原性のグループに分けることができる（ＢＶＤＶ ＩＡおよびＩＢ、およびＢＶＤＶ ＩＩ）。この抗原変異はおもにＥ２における配列の多様性に基づくものである[van Rijn et al. （1997）, Subdivision of the pestivirus genus based on envelope glycoprotein E2, Virology 237, 337-348]。
【００１２】
１つのみのＢＶＤＶ型のＥ２に基づくワクチン[Bolin and Ridpath（1996）, Glycoprotein E2 of bovine viral diarrhea virus expressed in insect cells provides calves limited protection from systemic infection and disease, Arch. Virol. 141, 1463-1477]は、それらの交差保護において、可変度の少ないＮ、ＥrnsおよびＥ１タンパク質も発現するワクチン[Elahi et al. （1999）, Induction of humoral and cellular immune responses against the nucleocapsid of bovine viral diarrhea virus by an adenovirus vector with an inducible promoter, Virology 261, 1-7]と比較してより制限を受ける。
【００１３】
本発明は、ＢＶＤＶウイルス様粒子を提供する。
【００１４】
本明細書において用いられる「ウイルス様粒子」なる語は、対応する感染性の野生型ウイルスと共通している構造的特徴の大部分を有するウイルスの構造タンパク質の大部分またはすべてからなる粒子を意味する。しかし、これらのウイルスには適切な核酸配列が存在しないので、宿主細胞ウイルス様粒子との相互作用によって子孫ウイルスは産生しない。ＢＶＤＶウイルス様粒子の場合、ヌクレオカプシドは空であるかまたは無関係なＲＮＡを含んでいるが、それらの全体の構造は、野生型のヌクレオカプシドに類似し、野生型ＢＶＤＶにおいて見られるように、周りのエンベロープは同じ膜貫通糖タンパク質Ｅ１とＥ２および同じ膜関連タンパク質Ｅrnsを含む。
【００１５】
具体的には、本発明のウイルス様粒子は、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２を含む。本発明は、ＢＶＤＶ ＩＡ型の株（ＮＡＤＬ株に代表される）、ＢＶＤＶ ＩＢ型の株（Ｏｓｌｏｓｓ株に代表される）および細胞変性株８７-２５５２を含むＢＶＤＶ ＩＩ型の株（８９０株に代表される）[Reddy et al. （1995）, Antigenic differences between a field isolate and vaccine strains of bovine viral diarrhea virus, J. Clin. Microbiol. 33, 2159-2161]および本発明において一例として用いられるＢＶＤＶ Ｉ型ＰＴ８１０株等の、様々な天然に存在するＢＶＤＶ株に由来するＢＶＤＶウイルス様粒子を意図する。本発明はさらに、天然に存在するタンパク質とは同一ではなくアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含むが、但し、突然変異体の構造タンパク質はウイルス様粒子を構築する能力を保持している、ＢＶＤＶ構造タンパク質を意図する。
【００１６】
ＢＶＤＶ構造タンパク質は、翻訳後にプロセシングを受けたポリタンパク質から得られる。本発明のＢＶＤＶウイルス様粒子を製造するためには、ＤＮＡテンプレートからの構造タンパク質の合成に関する情報を含む宿主細胞を用いることが望ましい。ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードする、天然に存在するＲＮＡから調製したｃＤＮＡは、そのようなＤＮＡテンプレートから転写されるｍＲＮＡが、細胞核のスプライセオソームによって認識されるスプライス部位をあまりにも多く含んでいるので、機能しないであろう。そのようなｃＤＮＡから転写されたＲＮＡは、それが翻訳される前に破壊されるであろう。
【００１７】
従って、本発明は、細胞核においてＲＮＡがポリタンパク質をコードする部分においてほとんどまたは全くスプライシングを受けない、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするリボヌクレオチド配列を含むポリシストロン性ＲＮＡ分子を提供する。
【００１８】
本発明のＲＮＡ分子の好ましい態様は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡであって、そのポリタンパク質のコード部分において強力な潜在的スプライス部位を含まない、即ち、−２２よりも大きいスコアを有する潜在的なスプライスアクセプター部位および−１３.１よりも大きいスコアを有する潜在的なスプライスドナー部位を含まないＲＮＡによって代表される。
【００１９】
本発明のＲＮＡ分子の最も好ましい態様は、配列番号１のヌクレオチド番号１７〜ヌクレオチド番号２７１０のポリヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子によって表される。
【００２０】
本発明のＲＮＡ分子は、本発明によって同時に提供される対応するＤＮＡフラグメントから得ることができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡフラグメントは、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするが、強力な潜在的スプライス部位を含まない。スプライス部位は、エクソン−イントロン連結部（スプライスドナー配列）またはイントロン−エクソン連結部（スプライスアクセプター配列）のいずれかである真核生物ｍＲＮＡにおける認識配列であり、核内のスプライセオソームによって用いられてプレｍＲＮＡからイントロンが除かれ、エクソンに位置するコード領域を融合して一緒になって完全なオープンリーディングフレームを形成する。ＢＶＤＶのＲＮＡは通常は細胞質に留まるので、ＢＶＤＶ ｃＤＮＡは、これまで用いられていなかった「偶発的な」スプライスシグナルを含む。ＢＨＶ１等のウイルスベクターによってＢＶＤＶ ｃＤＮＡが発現することにより、核においてＲＮＡがつくられ、スプライセオソームによってプロセシングを受ける[Shiu et al. （1997）, The presence of RNA splicing signals in the cDNA construct of the E2 gene of classical swine fever virus affected its expression, J. Virol. Methods 69, 223-230]。
【００２２】
大部分の（潜在的な）スプライスシグナルを、Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするＢＶＤＶ ｃＤＮＡから取り除くために、ＰＣ／Ｇｅｎｅ バージョン２.３２ Ｊａｎ. １９８９ という核酸およびタンパク質配列解析ソフトウエアシステムを用いることができる。このソフトウエアプログラムでは、Ｓｔａｄｅｎ[（1984）, Computer methods to locate signals in nucleic acid sequences, Nucl. Acids. Res. 12, 505-519]の方法に基づく「スプライス・ジャンクション」というオプションが本発明において用いるのに適している。
【００２３】
本発明のＤＮＡフラグメントの好ましい態様は、配列番号１のヌクレオチド番号１７〜ヌクレオチド番号２７１０のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡによって代表される。
【００２４】
本発明はさらに、ＢＶＤＶウイルス様粒子を産生するのに適したＤＮＡ構築物を提供する。ＢＶＤＶ構造タンパク質の宿主細胞における発現を可能にするため、ＤＮＡはシス調節配列に作動可能なように連結する。そのような調節配列は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合することが可能で、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することが可能である。本発明を定義する目的で、シス調節配列には３’末端でＫｏｚａｋコンセンサス配列およびコード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）が続いており、上流へ（５’方向へ）と伸びて、バックグラウンドより上の検出レベルで転写を開始するのに必要最小限の塩基またはエレメントを含んでいる。シス調節配列内では、転写開始部位並びにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の結合を担うタンパク質結合モチーフが見られる。そのような調節配列の選択は、当業者には自明である。適当なシス調節配列は、真核生物、好ましくは哺乳類、の遺伝子から、または哺乳類が感染するウイルスに由来する遺伝子から得ることができる。例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよび、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）末端繰り返し配列（ＭＬＶ-ＬＴＲ）などのレトロウイルスの長い末端反復配列に存在するシス調節配列が挙げられる。
【００２５】
本発明のＤＮＡ構築物の好ましい態様では、ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするＤＮＡは、ヒトサイトメガロウイルス前初期１プロモーターに作動可能なように連結している。
【００２６】
本発明に従うＤＮＡ構築物は、好ましくは、さらにターミネーター配列をコード領域の３’末端に含む。真核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩによるｍＲＮＡ合成は、一般に「ＴＡＴＡ−ボックス」から短い距離の下流に位置する明確な開始部位を有するが、明確な終止シグナルはない。転写領域の３’末端の上流に見られるポリ（Ａ）シグナルは、ｍＲＮＡの３’末端の開裂およびポリアデニル化において重要な役割を担っており[Keller（1995）, No end yet to messenger RNA 3' processing, Cell 81, 829-832]、転写の終止にも関わっているが、このポリ（Ａ）シグナルの下流の配列もｍＲＮＡ転写の終止において役割を担っていると考えられる。これらの配列は、転写複合体の遅延または休止に関わっている[Vandenbergh（1991）, An apparent pause site in the transcription unit of the rabbit alpha-globin gene, J. Mol. Biol. 220, 255-270]。効率的な終止およびポリアデニル化はｍＲＮＡに安定性を与えるので、終止シグナルは（ウシ成長ホルモン遺伝子の下流に見られるのと同様に）真核発現ベクターにしばしば含まれる。
【００２７】
本発明のＤＮＡ構造物の好ましい態様では、ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするＤＮＡの後にウシ成長ホルモン終止配列が続く。
【００２８】
実際的見地から、ウイルスのベクターの使用は以下の理由により好都合である：
・ウイルスベクターは、挿入遺伝子上でコードされるタンパク質を高いレベルで発現することができる；
・組換えウイルスを、サブユニットワクチンよりも低いコストで、適当な宿主細胞において高い力価で製造することができる；
・宿主に投与すると、組換えウイルスが挿入遺伝子上でコードされるタンパク質を発現し、宿主においてこれらのタンパク質が大量に産生される；
・挿入遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞内で発現し、そのためＭＨＣクラスＩ分子によって効率的に提示され、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する；
・ＢＶＤＶゲノムのすべての構造タンパク質を発現することができ、修飾された生きたウイルスワクチンに匹敵するが、例えば野生型への復帰のような、そのようなワクチンが通常遭遇するような危険を有しない、ウイルス様粒子を形成することができる；
・一般に、生きたワクチンは死滅ワクチンよりも免疫原性が高い。
【００２９】
本発明は、ＢＶＤＶウイルス様粒子の構築に必要な因子およびＢＶＤＶ構造タンパク質をコードするウイルスベクターを提供する。
【００３０】
好ましい態様では、ウイルスベクターはウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）に代表される。
【００３１】
さらに好ましい態様では、糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）をコードする配列内に欠失を含むまたはｇＥをコードするゲノム領域を完全に欠いているＢＨＶ−１ベクターを、ＢＶＤＶウイルス様粒子を製造するために用いる。そのようなＢＨＶ−１ ベクターの例は、パスツール研究所（フランス）に受託番号Ｉ−１２１３で寄託されているＤｉｆｉｖａｃ−１が挙げられる。そのようなベクターの使用により、ダブルマーカー特性を有するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンの製造が可能である。本明細書に記載されたＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンで免疫された宿主、具体的にはウシは、ＢＨＶ−１およびＢＶＤＶには反応するが、ＢＨＶ−１ｇＥまたはＢＨＶ−１ｇＩ／ｇＥ複合体およびＢＶＤＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３またはｐ８０には反応しない抗体を産生する。このことにより、抗ＢＨＶ−１ｇＥまたは抗ＢＨＶ−１ｇＩ／ｇＥ抗体および／または抗ＢＶＤＶ抗体の存在を宿主の体液、具体的には鼻液サンプルおよび血清サンプル、において測定することにより、野生型ＢＨＶ−１および／または野生型ＢＶＤＶに感染した宿主、具体的にはウシを、このＢＶＨ−１／ＢＶＤＶワクチンでワクチン化しただけの宿主から区別することが可能である。
【００３２】
本発明のウイルスベクターの最も好ましい態様は、２０００年６月８日にパスツール研究所ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）（25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris, France）に受託番号Ｉ−２４８８として寄託されたＡ９−ＳＶ−１Ｆ９（ｓｙｎｔｈ. ＢＶＤＶカプシド；Ｄｉｆｉｖａｃ−１のｇＥ遺伝子座におけるＥrns、Ｅ１およびＥ２）に代表される。
【００３３】
本発明はさらに、上記のウイルスベクターを含む宿主細胞を提供する。このウイルスベクターは、感染またはトランスフェクションにより宿主細胞中へ導入することができる。適当な宿主細胞の例としては、胚性ウシ気管（ＥＢＴｒ）細胞またはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞である。
【００３４】
本発明はさらに、ＢＶＤＶウイルス様粒子および製薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む、ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して宿主を免疫するためのワクチンを提供する。本発明において有用な製薬的に許容し得る担体または希釈剤の例としては、炭化水素（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼイン等のタンパク質、ウシ血清または脱脂粉乳等のタンパク質含有試薬および緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）などの安定化剤が挙げられる。場合により、アジュバント活性を有する１またはそれ以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当なアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または酸化アルミニウムおよびサポニン等の油乳濁液が挙げられる。
【００３５】
投与すべき有用な有効量は、年齢、体重、投与形式およびワンチン化を試みる対象となる病原体のタイプに依存して変化するであろう。適当な投与量は、例えば約１０3〜１０7ｐｆｕ／動物であろう。
【００３６】
本発明のワクチンは、特に、鼻内、経皮、皮下または筋肉内で投与することができる。
【００３７】
本発明に従う好ましいワクチンは、ワクチン化された宿主において、ＢＶＤＶウイルス様粒子の細胞内での産生を導き、ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して保護する有益な免疫反応を誘導するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換えウイルスベクターを含む。さらに、そのようなワクチンは、ＢＨＶ−１誘発性疾患も保護し、ｇＥを欠くＢＨＶ−１をベクターとして用いるならば、そのようなワクチンでワクチン化された宿主をＢＨＶ−１またはＢＶＤＶのいずれかに感染した宿主から区別することができる。
【００３８】
本発明はさらに、抗ＢＶＤＶ抗体の存在および／または不在を検出するための診断用キット、具体的には、生物学的な体液サンプル、具体的には鼻液サンプルまたは血清サンプル等の生物学的サンプルにおける抗ＢＶＤＶおよび抗ＢＨＶ−１抗体の存在および／または不在を検出するための診断用キットを提供する。これらの診断試験は、野生型ウイルスに感染した宿主と本明細書に記載のＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンでワクチン化されただけの宿主とを区別するために用いられる。
【００３９】
これらの診断試験において検出される抗ＢＨＶ−１および／または抗ＢＶＤＶ抗体は、ワクチンに存在しないウイルス抗原、特にＢＨＶ−１ｇＥおよびＢＨＶ−１ ｇＩ／ｇＥ複合体およびＢＶＤＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３またはｐ８０と反応する。
【００４０】
本発明はさらに、
（ａ）上記のＤＮＡ構築物をＢＶＤＶウイルス様粒子の構築のための因子をコードするウイルスベクター内へ挿入すること；
（ｂ）該ＤＮＡによってコードされるポリタンパク質を発現することが可能な適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｃ）該宿主細胞を適当な条件下で培養すること
を含むＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、
（ａ）上記のウイルスベクターで適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｂ）該宿主を適当な条件下で培養すること
を含むＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、
（ａ）上記のＤＮＡ構造物をＢＨＶ−１のゲノムへ挿入すること、
（ｂ）該ベクターによってコードされるポリタンパク質を発現することが可能な適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｃ）該宿主細胞を適当な条件下で培養すること
を含む、ＢＶＤＶウイルス様粒子の形成のための構造タンパク質のすべてをコードするＢＨＶ１／ＢＶＤＶ組換えウイルスの製造方法を提供する。
【００４３】
適当な宿主細胞は、感染性の培養細胞の上清を、これら細胞、例えばＥＢＴｒ細胞またはＭＤＢＫ細胞、の単層へ添加することによって、組換えウイルスで感染させることができる。例えば、１５０ｃｍ2の組織培養フラスコ内の単層で、培地を取り出した後に１〜３ｍＬのウイルス含有培養細胞（１０3〜１０7ｐｆｕ／ｍＬの範囲の力価）を添加することができる。２時間インキュベーションした後、新鮮な組織培養培地を添加して３０ｍＬにすることができる。感染後２〜３日で完全な細胞変性効果（ｃｐｅ）が見られ、培地において１０8ｐｆｕ／ｍＬまで認めることができる。
【００４４】
実施例
ＢＶＤＶ構造タンパク質のコード領域の構築
最近のＢＶＤＶ単離物の構造タンパク質のアミノ酸配列を決定するために、ヨーロッパにおいて最近単離されたＢＶＤＶ Ｉ型ＰＴ８１０株のヌクレオチド配列の５’側半分を標準的な方法を用いて確定した。
【００４５】
ヌクレオカプシドタンパク質Ｎおよび糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２のコード領域を、決定されたアミノ酸配列と公開されているＢＶＤＶ配列とを比較することにより同定した。これらのコード領域は、核のＢＨＶ−１によって発現したときに、スプライオセオームによって認識されプロセシングされ得る配列（スプライシングシグナル）を含んでいるであろう。従って、その配列は、コード化の潜在能力が影響を受けないと同時に、（潜在的な）スプライシングシグナルの大部分が除去されるように適合化された。適合化した配列は、合成により製造されたものであり、Ｎタンパク質の最初のアミノ酸を除いて元のＢＶＤＶ配列と同じアミノ酸をコードする。
【００４６】
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株において、Ｎタンパク質の最初のアミノ酸はセリンであるが、合成されたコード領域の効率的な翻訳を可能するために、このアミノ酸をメチオニンで置換し、その上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列を存在させた。タンパク質コード領域を終止させるために、膜貫通領域のすぐ後ろで、Ｅ２タンパク質の推定カルボキシ末端の後ろに終止コドンを挿入した。クローニングを容易にするため、Ｓｔｕ Ｉ制限酵素によって認識される配列を合成配列の両側に加え、全長２７１５ヌクレオチドを得た。配列番号１参照。二本鎖ＤＮＡフラグメントを合成し、原核プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へクローニングして大腸菌において増殖させた。図１参照。
【００４７】
Ｄｉｆｉｖａｃ−１のｇＥ遺伝子座のためのＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え／発現カセットの構築
ｇＥ欠損Ｚａ株（ＷＯ ９２／２１７５１においてＤｉｆｉｖａｃ−１と新たに命名された）のＵS領域に見られる組換えの解析によって、糖タンパク質Ｅ遺伝子および隣のＵＳ９遺伝子の欠失およびＵＳ１.５遺伝子の一部の同時重複逆位が示された。この解析によってさらに組換え点の位置が示された[Rijsewijk et al. （1999）, Spontaneous BHV-1 recombinants in which the gI/gE/US9 region is replaced by a duplication/inversion of the US1.5/US2 region, Arch. Virol. 144, 1527-1537]。図２参照。
【００４８】
ｇＥ欠失の位置でまたはその近くで、Ｚａ株のゲノムにヘテロローガスな遺伝子を挿入するために、組換えカセットを構築した。この目的のため、ｇＩ遺伝子の部分をコードし、Ｚａ組換え点の４０ｂｐ上流で終わる０.８キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメント、およびＺａ組換え点から４０ｂｐ下流で始まりＵＳ１.５遺伝子の部分をコードする０.７キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメントを、それらの元の方向でｐＵＣ１８にクローニングした。この構築物をｐＭ４００と命名し、組換えフラグメントの間に発現カセットの挿入のための独特なＳｍａＩ部位を有する。図３参照。
【００４９】
ｐＭ４００のＳｍａＩ部位に、プラスミドｐＶＲ１０１２由来の１.９キロ塩基対のＢａｌ Ｉ−Ａｃｃ６５ Ｉフラグメントを、連結している組換えフラグメントと同じ方向でそのシス調節配列とともにクローニングした。これらのシス調節配列は、ヒトサイトメガロウイルス前初期１プロモーター（ｈＣＭＶＩＥｐ.）およびその５’非翻訳リーダー（５'ＵＴ）、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列（ＢＴ）である。得られた構築物をｐＳ２０５と命名し、プロモーター領域とターミネーター領域の間に独特なＥｃｏＲ Ｖ部位を有する。
【００５０】
ｐＳ２０５のＥｃｏＲ Ｖ部位において、ＢＶＤＶヌクレオカプシドタンパク質ＮおよびＢＶＤＶ糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードする２７０７塩基対のＳｔｕ Ｉフラグメントを、プロモーター／ターミネーターおよび連結している組換え配列と同じ方向にクローニングした。このＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え／発現カセットをｐＳ３１８と命名した。図３参照。
【００５１】
ＢＶＤＶ構造タンパク質のコード領域を発現するＢＨＶ−１組変えウイルスの構築および単離
ＢＶＤＶヌクレオカプシドタンパク質ＮおよびＢＶＤＶ糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２を発現するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体（図４に記載）を構築するために、線状化したｐＳ３１８プラスミドおよびＺａ株のゲノムＤＮＡを標準的な方法に従ってウシ細胞中へ同時トランスフェクションし、同時トランスフェクションから４８時間後に細胞を凍結／融解し、想定される組換えウイルスを遊離させた。これら組換えウイルスを単離するために、細胞破片をペレット化し、上清を９６ウェルプレートにてウシ細胞を感染させるために用い、抗ＢＶＤＶＥ２ ＭＡｂ １６６を用いた免疫染色法により、ＢＶＤＶ陽性のウェルを同定した。ＢＶＤＶ Ｅ２陽性のウェルの培地中のウイルスを希釈し、別の９６ウェルのマイクロプレートにてウシ細胞を感染させ、ＢＶＤＶ Ｅ２陽性の１個のプラークに由来するウイルスを３回プラーク精製し、精製された組換え体を得た。このようにして得られた組換え体の１つをＡ９−ＳＶ−１Ｆ９と命名し、ＭＤＢＫ細胞にて８回パッセージして６種の異なるウシ細胞系での発現の安定性について試験した。図５参照。試験したウシ細胞系のすべてにおいて、８回パッセージしたにもかかわらず、ほぼすべてのプラークがＢＶＤＶ Ｅ２陽性であることが分かった。ＭＤＢＫ細胞において、ＢＶＤＶ Ｅ２陽性プラークのパーセントを求め、８回パッセージした後に依然として９０％を超えていることが分かった。
【００５２】
配列表および図面の説明
配列番号１および２
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のタンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードする２７１５ヌクレオチドの長さの合成ＤＮＡフラグメントＰＴ８１０ＡＭ１０の配列を示す。ＤＮＡフラグメントの両側に制限酵素Ｓｔｕ Ｉの認識配列が付加され、スタートコドン（ＡＴＧ）の上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列が挿入されている。ＰＴ８１０ＡＭ１０配列を普遍的遺伝コードを用いて翻訳し、コードされたアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に３文字コードで表記した。オープンリーディングフレームによってコードされるすべてのアミノ酸は、オープンリーディングフレームの最初のアミノ酸を除いてＢＶＤＶ ＰＴ８１０株においてみられるものと同一である。この最初のアミノ酸は、ＰＴ８１０ではセリン残基であり、ＰＴ８１０ＡＭ１０ではメチオニン残基に変わっている。タンパク質コード領域の末端の終止コドンは、ＤＮＡフラグメントのＳｔｕ Ｉ部位とオーバーラップしている。
【００５３】
配列番号３および４
タンパク質Ｎをコードする配列番号１の部分
【００５４】
配列番号５および６
タンパク質Ｅrnsをコードする配列番号１の部分
【００５５】
配列番号７および８
タンパク質Ｅ１をコードする配列番号１の部分
【００５６】
配列番号９および１０
タンパク質Ｅ２をコードする配列番号１の部分
【００５７】
図１
プラスミドＢＳＭ５８４の構造。２７１５ヌクレオチドの長さのＤＮＡフラグメントＰＴ８１０ＡＭ１０を原核プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。プラスミドＢＳＭ５８４を制限酵素Ｓｔｕ Ｉで消化することにより、２７０７ヌクレオチドの長さのフラグメントを遊離させ、ＢＨＶ−１組換え／発現カセットｐＳ２０５内へ挿入した。図３参照。
【００５８】
図２
上段：ＢＨＶ−１ゲノム、およびベクターとして用いたＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１株に見られる組換えの構造を示す図。野生型ＢＨＶ−１は約１３６キロ塩基対の長さであり、長い部分（Ｌ）と短い部分（Ｓ）を有する。短いフラグメントは斜線部分で示される逆位反復配列が隣接した独特なドメインを有する。
【００５９】
中段：独特な短いドメイン（Ｕｓ）において８個のオープンリーディングフレームが認められる：ＵＳ１.５、ＵＳ２、ＰＫ、ｇＧ、ｇＤ、ｇＩ、ｇＥおよびＵＳ９。
【００６０】
下段：天然のｇＥ欠失突然変異体ＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１（Ｄｉｆ.）において、ｇＥおよびＵＳ９遺伝子が欠失し、その代わりにＵＳ１.５遺伝子の部分が反復している。組換え点を矢印で示した。このＤｉｆｉｖａｃ−１突然変異体は、ＷＯ ９２／２１７５１およびRijsewijkらのArch. Virol. （1999）144, 1527-1537に記載されている。
【００６１】
図３
プラスミドｐＳ３１８の組換え／発現カセットを示す図。いずれもＤｉｆｉｖａｃ−１株から単離された、ｇＥ遺伝子座の上流側から０.８キロ塩基対のＢｓａ Ｉ（Ｂ）フラグメントおよびｇＥ遺伝子座の下流側から０.７キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメントを、それぞれ原核プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ ＩＩ部位およびＥｃｏＲ Ｉ部位にクローニングした。０.８ｋｂｐのＢｓａ ＩフラグメントをＨｉｎｃ ＩＩ部位に挿入するために、Ｂｓａ Ｉフラグメントの平滑末端を作成し、０.７ｋｂｐのＢｓａ ＩフラグメントをＥｃｏＲ Ｉ部位へ挿入するために、標準的な方法を用いてＥｃｏＲ Ｉリンカーをこのフラグメントに付加した。得られたプラスミドをｐＭ４００と命名した。ｐＭ４００のＳｍａＩ部位において、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ１プロモーター／エンハンサー（ｈＣＭＶＩＥｐ.）および同プロモーターの５’非翻訳領域（５'ＵＴ）およびウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＴ）配列を含むプラスミドｐＶＲ１０１２から得られたフラグメントを挿入した。得られたプラスミドをｐＳ２０５と命名した。ｐＳ２０５の独特なＥｃｏＲ Ｖ部位へ、プラスミドＢＳＭ５８４由来の２７０７ｂｐのＳｔｕ Ｉフラグメントを挿入した。得られたクローンをプラスミドｐＳ３１８と命名し、同時トランスフェクション実験において、このプラスミドを用いて、ＢＶＤＶ遺伝子をＺａのｇＥ遺伝子座（Ｄｉｆｉｖａｃ−１）へ組換えさせた。図４参照。
【００６２】
図４
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のすべての構造タンパク質をコードするＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９を示す図である。上段にはＢＨＶ−１ゲノムの構造を示した。中段には、短い独特な領域を含むＥｃｏＲ Ｉフラグメントをすべての遺伝子の位置とともに示し、下段には、ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株の構造タンパク質をコードする２７０７ｂｐの長さのＢＶＤＶ発現カセットを示した。ＢＶＤＶのオープンリーディングフレームの上流にはＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域（ｈＣＭＶＩＥ１ｐ.）およびこのプロモーターの５'非翻訳（５'ＵＴ）リーダーが存在し、ＢＶＤＶオープンリーディングフレームの下流には、ウシ成長ホルモンターミネーター配列（ＢＴ）が存在している。このカセットをｇＥ遺伝子座のこのゲノムに見られる組換え点の４０ｂｐ上流のＤｉｆｉｖａｃ−１ゲノムに周りの遺伝子と同じ方向で挿入した。
【００６３】
図５
ＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９で感染させ、感染から４日後に抗ＢＶＤＶ Ｅ２ＭＡｂ １６６で染色したＭＤＢＫ細胞の単層のＩＰＭＡ。感染細胞は、抗体によって染色されている丸いプラークを形成しているが、周りの細胞は染色されていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドＢＳＭ５８４の構造。
【図２】 上段：ＢＨＶ−１ゲノム、およびベクターとして用いたＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１株に見られる組換えの構造を示す図。中段：独特な短いドメイン（Ｕｓ）において８個のオープンリーディングフレームが認められる：ＵＳ１.５、ＵＳ２、ＰＫ、ｇＧ、ｇＤ、ｇＩ、ｇＥおよびＵＳ９。下段：天然のｇＥ欠失突然変異体ＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１（Ｄｉｆ.）において、ｇＥおよびＵＳ９遺伝子が欠失し、その代わりにＵＳ１.５遺伝子の部分が反復している。組換え点を矢印で示した。
【図３】 プラスミドｐＳ３１８の組換え／発現カセットを示す図。
【図４】 ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のすべての構造タンパク質をコードするＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９を示す図である。上段にはＢＨＶ−１ゲノムの構造を示した。中段には、短い独特な領域を含むＥｃｏＲ Ｉフラグメントをすべての遺伝子の位置とともに示し、下段には、ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株の構造タンパク質をコードする２７０７ｂｐの長さのＢＶＤＶ発現カセットを示した。
【図５】 ＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９で感染させ、感染から４日後に抗ＢＶＤＶ Ｅ２ＭＡｂ １６６で染色したＭＤＢＫ細胞の単層のＩＰＭＡ。
【配列表】
本発明は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ウイルス様粒子、ＢＶＤＶウイルス様粒子を形成するに十分なＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするポリシストロン性ＲＮＡおよびそれに対応するＤＮＡ、ＢＶＤＶウイルス様粒子の構築のための因子や構造タンパク質をコードするウイルスベクター、ＢＶＤＶウイルス様粒子を含むワクチン、診断用キットおよびＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法に関する。
【０００２】
ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、ウシにおけるウシウイルス性下痢の病因であり、全世界に分布しており、感染率は９０％と高い。
【０００３】
ＢＶＤＶは、フラビ・ウイルス科のペスチウイルス属に属する[Horzinek（1991）, Pestiviruses - taxonomic perspectives, Arch. Virology Suppl. 3, 55-65]。ＢＶＤＶは、１個の大きなポリタンパク質に翻訳され得る１個のオープンリーディングフレームをコードする約１２.５キロベース（ｋｂ）のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する[Collet et al. （1988）, Proteins encoded by bovine viral diarrhea virus: the genomic organisation of a pestivirus, Virology 165, 200-208]。ＢＶＤＶビリオンは、糖タンパク質を含むエンベロープに囲まれたヌクレオカプシド内に封入されたゲノムＲＮＡからなる。
【０００４】
ポリタンパク質のＮ末端に近い順に、構造タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、および３つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅrnsまたはｇｐ４８、Ｅ１またはｇｐ２５、およびＥ２またはｇｐ５３）が存在する。これらすべての３つの糖タンパク質の上流にはシグナルペプチドが存在し、宿主のシグナルペプチダーゼによって、小胞体（ＥＲ）の内腔においてポリタンパク質から遊離する。
【０００５】
関連するフラビウイルス、即ちＣ型肝炎ウイルスに関しては、構造タンパク質をコードするのみであるゲノム部分の発現はウイルス様粒子形成するのに十分である[Baumert et al. （1998）, Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells, J. Virol. 72, 3827-3836]。
【０００６】
ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）は、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）および膿疱性陰門膣炎（ＩＰＶ）および感染性亀頭包皮炎（ＩＢＰ）の病因である。ＢＨＶ−１は世界中のウシにおいて高い感染率で見つかっている。
【０００７】
ＢＨＶ−１は、αヘルペスウイルスに属し、約１３６キロ塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、約７０の遺伝子をコードするが、そのうちの約３０の遺伝子がウイルスの複製に必須ではない。非必須な糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）遺伝子の欠失を有する自然突然変異体は、安全で有効なマーカーワクチンに用いられている[Kaashoek et al. （1994）, A conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and safe vaccine, Vaccine 12, 439-444]。
【０００８】
ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して保護するためのワクチンは、いずれかの不活化ＢＶＤＶ株、単離されたＢＶＤＶ糖タンパク質に基づくサブユニットワクチン、弱毒化ＢＶＤＶ株[reviewed by Van Oirschot et al. （1999）, Vaccination of cattle against bovine viral diarrhoea, Vet. Microbiol. 64, 169-183]、ＤＮＡワクチン[Reddy et al. （1999）, Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 22, 231-246; Harpin et al. （1999）, Vaccination of cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus major glycoprotein E2, J. Gen. Virol. 80, 3137-3144]、またはベクターワクチンに基づく。弱毒化ＢＶＤＶ株に基づくワクチンは免疫抑制を引き起こすことがあり得、子宮感染においては、母親の抗体の存在により効果が少ないかもしれない[Roth & Kaeberle（1983）, Suppression of neutrophil and lymphocyte function induced by a vaccinal strain of bovine viral diarrhea virus with or without administration of ACTH, Am. J. Vet. Res. 44, 2366-2372; Liess et al. （1984）, Studies on transplacental transmissibility of a bovine virus diarrhea（BVD）vaccine virus in cattle, Zentrbl. Veterinarmed. Reihe B 31, 669-681]。
【０００９】
不活化ＢＶＤＶに基づくワクチンまたはサブユニットワクチンは、抗原が細胞内で産生されず、免疫系のＴ細胞コンパートメントに効率よく提示されないので効果が低い。例えば、３種類のバキュロウイルスＢＶＤＶ Ｅ２サブユニットワクチンのうちの２つが、ヒツジモデルにおける胎児のＢＶＤＶ感染に対する保護を示さなかった[Bruschke et al.（1997）, A subunit vaccine based on glycoprotein E2 of bovine virus diarrhea virus induces fetal protection in sheep against homologous challenge, Vaccine 15, 1940-1945]。
【００１０】
ＤＮＡワクチンおよびベクターワクチンにはこの欠点がないが、現在用いられているＤＮＡワクチンやベクターワクチンは、構造タンパク質の部分のみを発現し、より免疫原性の高いウイルス様粒子を形成することができない。例えば、ＷＯ ９５／１２６８２は、ＢＨＶ−１株のＴＫ遺伝子座におけるＢＶＤＶ Ｅ２のみの発現を記載している[Kweon et al.（1999）, Bovine herpesvirus expressing envelope protein（E2）of bovine viral diarrhea virus as a vaccine candidate, J. Vet. Med. Sci. 61, 395-401も参照]。
【００１１】
ＢＶＤＶは抗原変異を示し、いくつかの抗原性のグループに分けることができる（ＢＶＤＶ ＩＡおよびＩＢ、およびＢＶＤＶ ＩＩ）。この抗原変異はおもにＥ２における配列の多様性に基づくものである[van Rijn et al. （1997）, Subdivision of the pestivirus genus based on envelope glycoprotein E2, Virology 237, 337-348]。
【００１２】
１つのみのＢＶＤＶ型のＥ２に基づくワクチン[Bolin and Ridpath（1996）, Glycoprotein E2 of bovine viral diarrhea virus expressed in insect cells provides calves limited protection from systemic infection and disease, Arch. Virol. 141, 1463-1477]は、それらの交差保護において、可変度の少ないＮ、ＥrnsおよびＥ１タンパク質も発現するワクチン[Elahi et al. （1999）, Induction of humoral and cellular immune responses against the nucleocapsid of bovine viral diarrhea virus by an adenovirus vector with an inducible promoter, Virology 261, 1-7]と比較してより制限を受ける。
【００１３】
本発明は、ＢＶＤＶウイルス様粒子を提供する。
【００１４】
本明細書において用いられる「ウイルス様粒子」なる語は、対応する感染性の野生型ウイルスと共通している構造的特徴の大部分を有するウイルスの構造タンパク質の大部分またはすべてからなる粒子を意味する。しかし、これらのウイルスには適切な核酸配列が存在しないので、宿主細胞ウイルス様粒子との相互作用によって子孫ウイルスは産生しない。ＢＶＤＶウイルス様粒子の場合、ヌクレオカプシドは空であるかまたは無関係なＲＮＡを含んでいるが、それらの全体の構造は、野生型のヌクレオカプシドに類似し、野生型ＢＶＤＶにおいて見られるように、周りのエンベロープは同じ膜貫通糖タンパク質Ｅ１とＥ２および同じ膜関連タンパク質Ｅrnsを含む。
【００１５】
具体的には、本発明のウイルス様粒子は、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２を含む。本発明は、ＢＶＤＶ ＩＡ型の株（ＮＡＤＬ株に代表される）、ＢＶＤＶ ＩＢ型の株（Ｏｓｌｏｓｓ株に代表される）および細胞変性株８７-２５５２を含むＢＶＤＶ ＩＩ型の株（８９０株に代表される）[Reddy et al. （1995）, Antigenic differences between a field isolate and vaccine strains of bovine viral diarrhea virus, J. Clin. Microbiol. 33, 2159-2161]および本発明において一例として用いられるＢＶＤＶ Ｉ型ＰＴ８１０株等の、様々な天然に存在するＢＶＤＶ株に由来するＢＶＤＶウイルス様粒子を意図する。本発明はさらに、天然に存在するタンパク質とは同一ではなくアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含むが、但し、突然変異体の構造タンパク質はウイルス様粒子を構築する能力を保持している、ＢＶＤＶ構造タンパク質を意図する。
【００１６】
ＢＶＤＶ構造タンパク質は、翻訳後にプロセシングを受けたポリタンパク質から得られる。本発明のＢＶＤＶウイルス様粒子を製造するためには、ＤＮＡテンプレートからの構造タンパク質の合成に関する情報を含む宿主細胞を用いることが望ましい。ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードする、天然に存在するＲＮＡから調製したｃＤＮＡは、そのようなＤＮＡテンプレートから転写されるｍＲＮＡが、細胞核のスプライセオソームによって認識されるスプライス部位をあまりにも多く含んでいるので、機能しないであろう。そのようなｃＤＮＡから転写されたＲＮＡは、それが翻訳される前に破壊されるであろう。
【００１７】
従って、本発明は、細胞核においてＲＮＡがポリタンパク質をコードする部分においてほとんどまたは全くスプライシングを受けない、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするリボヌクレオチド配列を含むポリシストロン性ＲＮＡ分子を提供する。
【００１８】
本発明のＲＮＡ分子の好ましい態様は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡであって、そのポリタンパク質のコード部分において強力な潜在的スプライス部位を含まない、即ち、−２２よりも大きいスコアを有する潜在的なスプライスアクセプター部位および−１３.１よりも大きいスコアを有する潜在的なスプライスドナー部位を含まないＲＮＡによって代表される。
【００１９】
本発明のＲＮＡ分子の最も好ましい態様は、配列番号１のヌクレオチド番号１７〜ヌクレオチド番号２７１０のポリヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子によって表される。
【００２０】
本発明のＲＮＡ分子は、本発明によって同時に提供される対応するＤＮＡフラグメントから得ることができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡフラグメントは、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするが、強力な潜在的スプライス部位を含まない。スプライス部位は、エクソン−イントロン連結部（スプライスドナー配列）またはイントロン−エクソン連結部（スプライスアクセプター配列）のいずれかである真核生物ｍＲＮＡにおける認識配列であり、核内のスプライセオソームによって用いられてプレｍＲＮＡからイントロンが除かれ、エクソンに位置するコード領域を融合して一緒になって完全なオープンリーディングフレームを形成する。ＢＶＤＶのＲＮＡは通常は細胞質に留まるので、ＢＶＤＶ ｃＤＮＡは、これまで用いられていなかった「偶発的な」スプライスシグナルを含む。ＢＨＶ１等のウイルスベクターによってＢＶＤＶ ｃＤＮＡが発現することにより、核においてＲＮＡがつくられ、スプライセオソームによってプロセシングを受ける[Shiu et al. （1997）, The presence of RNA splicing signals in the cDNA construct of the E2 gene of classical swine fever virus affected its expression, J. Virol. Methods 69, 223-230]。
【００２２】
大部分の（潜在的な）スプライスシグナルを、Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードするＢＶＤＶ ｃＤＮＡから取り除くために、ＰＣ／Ｇｅｎｅ バージョン２.３２ Ｊａｎ. １９８９ という核酸およびタンパク質配列解析ソフトウエアシステムを用いることができる。このソフトウエアプログラムでは、Ｓｔａｄｅｎ[（1984）, Computer methods to locate signals in nucleic acid sequences, Nucl. Acids. Res. 12, 505-519]の方法に基づく「スプライス・ジャンクション」というオプションが本発明において用いるのに適している。
【００２３】
本発明のＤＮＡフラグメントの好ましい態様は、配列番号１のヌクレオチド番号１７〜ヌクレオチド番号２７１０のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡによって代表される。
【００２４】
本発明はさらに、ＢＶＤＶウイルス様粒子を産生するのに適したＤＮＡ構築物を提供する。ＢＶＤＶ構造タンパク質の宿主細胞における発現を可能にするため、ＤＮＡはシス調節配列に作動可能なように連結する。そのような調節配列は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合することが可能で、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することが可能である。本発明を定義する目的で、シス調節配列には３’末端でＫｏｚａｋコンセンサス配列およびコード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）が続いており、上流へ（５’方向へ）と伸びて、バックグラウンドより上の検出レベルで転写を開始するのに必要最小限の塩基またはエレメントを含んでいる。シス調節配列内では、転写開始部位並びにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の結合を担うタンパク質結合モチーフが見られる。そのような調節配列の選択は、当業者には自明である。適当なシス調節配列は、真核生物、好ましくは哺乳類、の遺伝子から、または哺乳類が感染するウイルスに由来する遺伝子から得ることができる。例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよび、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）末端繰り返し配列（ＭＬＶ-ＬＴＲ）などのレトロウイルスの長い末端反復配列に存在するシス調節配列が挙げられる。
【００２５】
本発明のＤＮＡ構築物の好ましい態様では、ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするＤＮＡは、ヒトサイトメガロウイルス前初期１プロモーターに作動可能なように連結している。
【００２６】
本発明に従うＤＮＡ構築物は、好ましくは、さらにターミネーター配列をコード領域の３’末端に含む。真核細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩによるｍＲＮＡ合成は、一般に「ＴＡＴＡ−ボックス」から短い距離の下流に位置する明確な開始部位を有するが、明確な終止シグナルはない。転写領域の３’末端の上流に見られるポリ（Ａ）シグナルは、ｍＲＮＡの３’末端の開裂およびポリアデニル化において重要な役割を担っており[Keller（1995）, No end yet to messenger RNA 3' processing, Cell 81, 829-832]、転写の終止にも関わっているが、このポリ（Ａ）シグナルの下流の配列もｍＲＮＡ転写の終止において役割を担っていると考えられる。これらの配列は、転写複合体の遅延または休止に関わっている[Vandenbergh（1991）, An apparent pause site in the transcription unit of the rabbit alpha-globin gene, J. Mol. Biol. 220, 255-270]。効率的な終止およびポリアデニル化はｍＲＮＡに安定性を与えるので、終止シグナルは（ウシ成長ホルモン遺伝子の下流に見られるのと同様に）真核発現ベクターにしばしば含まれる。
【００２７】
本発明のＤＮＡ構造物の好ましい態様では、ＢＶＤＶ構造タンパク質のポリタンパク質をコードするＤＮＡの後にウシ成長ホルモン終止配列が続く。
【００２８】
実際的見地から、ウイルスのベクターの使用は以下の理由により好都合である：
・ウイルスベクターは、挿入遺伝子上でコードされるタンパク質を高いレベルで発現することができる；
・組換えウイルスを、サブユニットワクチンよりも低いコストで、適当な宿主細胞において高い力価で製造することができる；
・宿主に投与すると、組換えウイルスが挿入遺伝子上でコードされるタンパク質を発現し、宿主においてこれらのタンパク質が大量に産生される；
・挿入遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞内で発現し、そのためＭＨＣクラスＩ分子によって効率的に提示され、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する；
・ＢＶＤＶゲノムのすべての構造タンパク質を発現することができ、修飾された生きたウイルスワクチンに匹敵するが、例えば野生型への復帰のような、そのようなワクチンが通常遭遇するような危険を有しない、ウイルス様粒子を形成することができる；
・一般に、生きたワクチンは死滅ワクチンよりも免疫原性が高い。
【００２９】
本発明は、ＢＶＤＶウイルス様粒子の構築に必要な因子およびＢＶＤＶ構造タンパク質をコードするウイルスベクターを提供する。
【００３０】
好ましい態様では、ウイルスベクターはウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）に代表される。
【００３１】
さらに好ましい態様では、糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）をコードする配列内に欠失を含むまたはｇＥをコードするゲノム領域を完全に欠いているＢＨＶ−１ベクターを、ＢＶＤＶウイルス様粒子を製造するために用いる。そのようなＢＨＶ−１ ベクターの例は、パスツール研究所（フランス）に受託番号Ｉ−１２１３で寄託されているＤｉｆｉｖａｃ−１が挙げられる。そのようなベクターの使用により、ダブルマーカー特性を有するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンの製造が可能である。本明細書に記載されたＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンで免疫された宿主、具体的にはウシは、ＢＨＶ−１およびＢＶＤＶには反応するが、ＢＨＶ−１ｇＥまたはＢＨＶ−１ｇＩ／ｇＥ複合体およびＢＶＤＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３またはｐ８０には反応しない抗体を産生する。このことにより、抗ＢＨＶ−１ｇＥまたは抗ＢＨＶ−１ｇＩ／ｇＥ抗体および／または抗ＢＶＤＶ抗体の存在を宿主の体液、具体的には鼻液サンプルおよび血清サンプル、において測定することにより、野生型ＢＨＶ−１および／または野生型ＢＶＤＶに感染した宿主、具体的にはウシを、このＢＶＨ−１／ＢＶＤＶワクチンでワクチン化しただけの宿主から区別することが可能である。
【００３２】
本発明のウイルスベクターの最も好ましい態様は、２０００年６月８日にパスツール研究所ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）（25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris, France）に受託番号Ｉ−２４８８として寄託されたＡ９−ＳＶ−１Ｆ９（ｓｙｎｔｈ. ＢＶＤＶカプシド；Ｄｉｆｉｖａｃ−１のｇＥ遺伝子座におけるＥrns、Ｅ１およびＥ２）に代表される。
【００３３】
本発明はさらに、上記のウイルスベクターを含む宿主細胞を提供する。このウイルスベクターは、感染またはトランスフェクションにより宿主細胞中へ導入することができる。適当な宿主細胞の例としては、胚性ウシ気管（ＥＢＴｒ）細胞またはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞である。
【００３４】
本発明はさらに、ＢＶＤＶウイルス様粒子および製薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む、ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して宿主を免疫するためのワクチンを提供する。本発明において有用な製薬的に許容し得る担体または希釈剤の例としては、炭化水素（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼイン等のタンパク質、ウシ血清または脱脂粉乳等のタンパク質含有試薬および緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）などの安定化剤が挙げられる。場合により、アジュバント活性を有する１またはそれ以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当なアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または酸化アルミニウムおよびサポニン等の油乳濁液が挙げられる。
【００３５】
投与すべき有用な有効量は、年齢、体重、投与形式およびワンチン化を試みる対象となる病原体のタイプに依存して変化するであろう。適当な投与量は、例えば約１０3〜１０7ｐｆｕ／動物であろう。
【００３６】
本発明のワクチンは、特に、鼻内、経皮、皮下または筋肉内で投与することができる。
【００３７】
本発明に従う好ましいワクチンは、ワクチン化された宿主において、ＢＶＤＶウイルス様粒子の細胞内での産生を導き、ＢＶＤＶ誘発性疾患に対して保護する有益な免疫反応を誘導するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換えウイルスベクターを含む。さらに、そのようなワクチンは、ＢＨＶ−１誘発性疾患も保護し、ｇＥを欠くＢＨＶ−１をベクターとして用いるならば、そのようなワクチンでワクチン化された宿主をＢＨＶ−１またはＢＶＤＶのいずれかに感染した宿主から区別することができる。
【００３８】
本発明はさらに、抗ＢＶＤＶ抗体の存在および／または不在を検出するための診断用キット、具体的には、生物学的な体液サンプル、具体的には鼻液サンプルまたは血清サンプル等の生物学的サンプルにおける抗ＢＶＤＶおよび抗ＢＨＶ−１抗体の存在および／または不在を検出するための診断用キットを提供する。これらの診断試験は、野生型ウイルスに感染した宿主と本明細書に記載のＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンでワクチン化されただけの宿主とを区別するために用いられる。
【００３９】
これらの診断試験において検出される抗ＢＨＶ−１および／または抗ＢＶＤＶ抗体は、ワクチンに存在しないウイルス抗原、特にＢＨＶ−１ｇＥおよびＢＨＶ−１ ｇＩ／ｇＥ複合体およびＢＶＤＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３またはｐ８０と反応する。
【００４０】
本発明はさらに、
（ａ）上記のＤＮＡ構築物をＢＶＤＶウイルス様粒子の構築のための因子をコードするウイルスベクター内へ挿入すること；
（ｂ）該ＤＮＡによってコードされるポリタンパク質を発現することが可能な適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｃ）該宿主細胞を適当な条件下で培養すること
を含むＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、
（ａ）上記のウイルスベクターで適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｂ）該宿主を適当な条件下で培養すること
を含むＢＶＤＶウイルス様粒子の製造方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、
（ａ）上記のＤＮＡ構造物をＢＨＶ−１のゲノムへ挿入すること、
（ｂ）該ベクターによってコードされるポリタンパク質を発現することが可能な適当な宿主細胞を感染させること、および
（ｃ）該宿主細胞を適当な条件下で培養すること
を含む、ＢＶＤＶウイルス様粒子の形成のための構造タンパク質のすべてをコードするＢＨＶ１／ＢＶＤＶ組換えウイルスの製造方法を提供する。
【００４３】
適当な宿主細胞は、感染性の培養細胞の上清を、これら細胞、例えばＥＢＴｒ細胞またはＭＤＢＫ細胞、の単層へ添加することによって、組換えウイルスで感染させることができる。例えば、１５０ｃｍ2の組織培養フラスコ内の単層で、培地を取り出した後に１〜３ｍＬのウイルス含有培養細胞（１０3〜１０7ｐｆｕ／ｍＬの範囲の力価）を添加することができる。２時間インキュベーションした後、新鮮な組織培養培地を添加して３０ｍＬにすることができる。感染後２〜３日で完全な細胞変性効果（ｃｐｅ）が見られ、培地において１０8ｐｆｕ／ｍＬまで認めることができる。
【００４４】
実施例
ＢＶＤＶ構造タンパク質のコード領域の構築
最近のＢＶＤＶ単離物の構造タンパク質のアミノ酸配列を決定するために、ヨーロッパにおいて最近単離されたＢＶＤＶ Ｉ型ＰＴ８１０株のヌクレオチド配列の５’側半分を標準的な方法を用いて確定した。
【００４５】
ヌクレオカプシドタンパク質Ｎおよび糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２のコード領域を、決定されたアミノ酸配列と公開されているＢＶＤＶ配列とを比較することにより同定した。これらのコード領域は、核のＢＨＶ−１によって発現したときに、スプライオセオームによって認識されプロセシングされ得る配列（スプライシングシグナル）を含んでいるであろう。従って、その配列は、コード化の潜在能力が影響を受けないと同時に、（潜在的な）スプライシングシグナルの大部分が除去されるように適合化された。適合化した配列は、合成により製造されたものであり、Ｎタンパク質の最初のアミノ酸を除いて元のＢＶＤＶ配列と同じアミノ酸をコードする。
【００４６】
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株において、Ｎタンパク質の最初のアミノ酸はセリンであるが、合成されたコード領域の効率的な翻訳を可能するために、このアミノ酸をメチオニンで置換し、その上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列を存在させた。タンパク質コード領域を終止させるために、膜貫通領域のすぐ後ろで、Ｅ２タンパク質の推定カルボキシ末端の後ろに終止コドンを挿入した。クローニングを容易にするため、Ｓｔｕ Ｉ制限酵素によって認識される配列を合成配列の両側に加え、全長２７１５ヌクレオチドを得た。配列番号１参照。二本鎖ＤＮＡフラグメントを合成し、原核プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へクローニングして大腸菌において増殖させた。図１参照。
【００４７】
Ｄｉｆｉｖａｃ−１のｇＥ遺伝子座のためのＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え／発現カセットの構築
ｇＥ欠損Ｚａ株（ＷＯ ９２／２１７５１においてＤｉｆｉｖａｃ−１と新たに命名された）のＵS領域に見られる組換えの解析によって、糖タンパク質Ｅ遺伝子および隣のＵＳ９遺伝子の欠失およびＵＳ１.５遺伝子の一部の同時重複逆位が示された。この解析によってさらに組換え点の位置が示された[Rijsewijk et al. （1999）, Spontaneous BHV-1 recombinants in which the gI/gE/US9 region is replaced by a duplication/inversion of the US1.5/US2 region, Arch. Virol. 144, 1527-1537]。図２参照。
【００４８】
ｇＥ欠失の位置でまたはその近くで、Ｚａ株のゲノムにヘテロローガスな遺伝子を挿入するために、組換えカセットを構築した。この目的のため、ｇＩ遺伝子の部分をコードし、Ｚａ組換え点の４０ｂｐ上流で終わる０.８キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメント、およびＺａ組換え点から４０ｂｐ下流で始まりＵＳ１.５遺伝子の部分をコードする０.７キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメントを、それらの元の方向でｐＵＣ１８にクローニングした。この構築物をｐＭ４００と命名し、組換えフラグメントの間に発現カセットの挿入のための独特なＳｍａＩ部位を有する。図３参照。
【００４９】
ｐＭ４００のＳｍａＩ部位に、プラスミドｐＶＲ１０１２由来の１.９キロ塩基対のＢａｌ Ｉ−Ａｃｃ６５ Ｉフラグメントを、連結している組換えフラグメントと同じ方向でそのシス調節配列とともにクローニングした。これらのシス調節配列は、ヒトサイトメガロウイルス前初期１プロモーター（ｈＣＭＶＩＥｐ.）およびその５’非翻訳リーダー（５'ＵＴ）、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列（ＢＴ）である。得られた構築物をｐＳ２０５と命名し、プロモーター領域とターミネーター領域の間に独特なＥｃｏＲ Ｖ部位を有する。
【００５０】
ｐＳ２０５のＥｃｏＲ Ｖ部位において、ＢＶＤＶヌクレオカプシドタンパク質ＮおよびＢＶＤＶ糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードする２７０７塩基対のＳｔｕ Ｉフラグメントを、プロモーター／ターミネーターおよび連結している組換え配列と同じ方向にクローニングした。このＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え／発現カセットをｐＳ３１８と命名した。図３参照。
【００５１】
ＢＶＤＶ構造タンパク質のコード領域を発現するＢＨＶ−１組変えウイルスの構築および単離
ＢＶＤＶヌクレオカプシドタンパク質ＮおよびＢＶＤＶ糖タンパク質Ｅrns、Ｅ１およびＥ２を発現するＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体（図４に記載）を構築するために、線状化したｐＳ３１８プラスミドおよびＺａ株のゲノムＤＮＡを標準的な方法に従ってウシ細胞中へ同時トランスフェクションし、同時トランスフェクションから４８時間後に細胞を凍結／融解し、想定される組換えウイルスを遊離させた。これら組換えウイルスを単離するために、細胞破片をペレット化し、上清を９６ウェルプレートにてウシ細胞を感染させるために用い、抗ＢＶＤＶＥ２ ＭＡｂ １６６を用いた免疫染色法により、ＢＶＤＶ陽性のウェルを同定した。ＢＶＤＶ Ｅ２陽性のウェルの培地中のウイルスを希釈し、別の９６ウェルのマイクロプレートにてウシ細胞を感染させ、ＢＶＤＶ Ｅ２陽性の１個のプラークに由来するウイルスを３回プラーク精製し、精製された組換え体を得た。このようにして得られた組換え体の１つをＡ９−ＳＶ−１Ｆ９と命名し、ＭＤＢＫ細胞にて８回パッセージして６種の異なるウシ細胞系での発現の安定性について試験した。図５参照。試験したウシ細胞系のすべてにおいて、８回パッセージしたにもかかわらず、ほぼすべてのプラークがＢＶＤＶ Ｅ２陽性であることが分かった。ＭＤＢＫ細胞において、ＢＶＤＶ Ｅ２陽性プラークのパーセントを求め、８回パッセージした後に依然として９０％を超えていることが分かった。
【００５２】
配列表および図面の説明
配列番号１および２
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のタンパク質Ｎ，Ｅrns、Ｅ１およびＥ２をコードする２７１５ヌクレオチドの長さの合成ＤＮＡフラグメントＰＴ８１０ＡＭ１０の配列を示す。ＤＮＡフラグメントの両側に制限酵素Ｓｔｕ Ｉの認識配列が付加され、スタートコドン（ＡＴＧ）の上流にＫｏｚａｋコンセンサス配列が挿入されている。ＰＴ８１０ＡＭ１０配列を普遍的遺伝コードを用いて翻訳し、コードされたアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に３文字コードで表記した。オープンリーディングフレームによってコードされるすべてのアミノ酸は、オープンリーディングフレームの最初のアミノ酸を除いてＢＶＤＶ ＰＴ８１０株においてみられるものと同一である。この最初のアミノ酸は、ＰＴ８１０ではセリン残基であり、ＰＴ８１０ＡＭ１０ではメチオニン残基に変わっている。タンパク質コード領域の末端の終止コドンは、ＤＮＡフラグメントのＳｔｕ Ｉ部位とオーバーラップしている。
【００５３】
配列番号３および４
タンパク質Ｎをコードする配列番号１の部分
【００５４】
配列番号５および６
タンパク質Ｅrnsをコードする配列番号１の部分
【００５５】
配列番号７および８
タンパク質Ｅ１をコードする配列番号１の部分
【００５６】
配列番号９および１０
タンパク質Ｅ２をコードする配列番号１の部分
【００５７】
図１
プラスミドＢＳＭ５８４の構造。２７１５ヌクレオチドの長さのＤＮＡフラグメントＰＴ８１０ＡＭ１０を原核プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。プラスミドＢＳＭ５８４を制限酵素Ｓｔｕ Ｉで消化することにより、２７０７ヌクレオチドの長さのフラグメントを遊離させ、ＢＨＶ−１組換え／発現カセットｐＳ２０５内へ挿入した。図３参照。
【００５８】
図２
上段：ＢＨＶ−１ゲノム、およびベクターとして用いたＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１株に見られる組換えの構造を示す図。野生型ＢＨＶ−１は約１３６キロ塩基対の長さであり、長い部分（Ｌ）と短い部分（Ｓ）を有する。短いフラグメントは斜線部分で示される逆位反復配列が隣接した独特なドメインを有する。
【００５９】
中段：独特な短いドメイン（Ｕｓ）において８個のオープンリーディングフレームが認められる：ＵＳ１.５、ＵＳ２、ＰＫ、ｇＧ、ｇＤ、ｇＩ、ｇＥおよびＵＳ９。
【００６０】
下段：天然のｇＥ欠失突然変異体ＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１（Ｄｉｆ.）において、ｇＥおよびＵＳ９遺伝子が欠失し、その代わりにＵＳ１.５遺伝子の部分が反復している。組換え点を矢印で示した。このＤｉｆｉｖａｃ−１突然変異体は、ＷＯ ９２／２１７５１およびRijsewijkらのArch. Virol. （1999）144, 1527-1537に記載されている。
【００６１】
図３
プラスミドｐＳ３１８の組換え／発現カセットを示す図。いずれもＤｉｆｉｖａｃ−１株から単離された、ｇＥ遺伝子座の上流側から０.８キロ塩基対のＢｓａ Ｉ（Ｂ）フラグメントおよびｇＥ遺伝子座の下流側から０.７キロ塩基対のＢｓａ Ｉフラグメントを、それぞれ原核プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ ＩＩ部位およびＥｃｏＲ Ｉ部位にクローニングした。０.８ｋｂｐのＢｓａ ＩフラグメントをＨｉｎｃ ＩＩ部位に挿入するために、Ｂｓａ Ｉフラグメントの平滑末端を作成し、０.７ｋｂｐのＢｓａ ＩフラグメントをＥｃｏＲ Ｉ部位へ挿入するために、標準的な方法を用いてＥｃｏＲ Ｉリンカーをこのフラグメントに付加した。得られたプラスミドをｐＭ４００と命名した。ｐＭ４００のＳｍａＩ部位において、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ１プロモーター／エンハンサー（ｈＣＭＶＩＥｐ.）および同プロモーターの５’非翻訳領域（５'ＵＴ）およびウシ成長ホルモンターミネーター（ＢＴ）配列を含むプラスミドｐＶＲ１０１２から得られたフラグメントを挿入した。得られたプラスミドをｐＳ２０５と命名した。ｐＳ２０５の独特なＥｃｏＲ Ｖ部位へ、プラスミドＢＳＭ５８４由来の２７０７ｂｐのＳｔｕ Ｉフラグメントを挿入した。得られたクローンをプラスミドｐＳ３１８と命名し、同時トランスフェクション実験において、このプラスミドを用いて、ＢＶＤＶ遺伝子をＺａのｇＥ遺伝子座（Ｄｉｆｉｖａｃ−１）へ組換えさせた。図４参照。
【００６２】
図４
ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のすべての構造タンパク質をコードするＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９を示す図である。上段にはＢＨＶ−１ゲノムの構造を示した。中段には、短い独特な領域を含むＥｃｏＲ Ｉフラグメントをすべての遺伝子の位置とともに示し、下段には、ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株の構造タンパク質をコードする２７０７ｂｐの長さのＢＶＤＶ発現カセットを示した。ＢＶＤＶのオープンリーディングフレームの上流にはＩＥ１プロモーター／エンハンサー領域（ｈＣＭＶＩＥ１ｐ.）およびこのプロモーターの５'非翻訳（５'ＵＴ）リーダーが存在し、ＢＶＤＶオープンリーディングフレームの下流には、ウシ成長ホルモンターミネーター配列（ＢＴ）が存在している。このカセットをｇＥ遺伝子座のこのゲノムに見られる組換え点の４０ｂｐ上流のＤｉｆｉｖａｃ−１ゲノムに周りの遺伝子と同じ方向で挿入した。
【００６３】
図５
ＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９で感染させ、感染から４日後に抗ＢＶＤＶ Ｅ２ＭＡｂ １６６で染色したＭＤＢＫ細胞の単層のＩＰＭＡ。感染細胞は、抗体によって染色されている丸いプラークを形成しているが、周りの細胞は染色されていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドＢＳＭ５８４の構造。
【図２】 上段：ＢＨＶ−１ゲノム、およびベクターとして用いたＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１株に見られる組換えの構造を示す図。中段：独特な短いドメイン（Ｕｓ）において８個のオープンリーディングフレームが認められる：ＵＳ１.５、ＵＳ２、ＰＫ、ｇＧ、ｇＤ、ｇＩ、ｇＥおよびＵＳ９。下段：天然のｇＥ欠失突然変異体ＺａまたはＤｉｆｉｖａｃ−１（Ｄｉｆ.）において、ｇＥおよびＵＳ９遺伝子が欠失し、その代わりにＵＳ１.５遺伝子の部分が反復している。組換え点を矢印で示した。
【図３】 プラスミドｐＳ３１８の組換え／発現カセットを示す図。
【図４】 ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株のすべての構造タンパク質をコードするＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９を示す図である。上段にはＢＨＶ−１ゲノムの構造を示した。中段には、短い独特な領域を含むＥｃｏＲ Ｉフラグメントをすべての遺伝子の位置とともに示し、下段には、ＢＶＤＶ ＰＴ８１０株の構造タンパク質をコードする２７０７ｂｐの長さのＢＶＤＶ発現カセットを示した。
【図５】 ＢＨＶ−１／ＢＶＤＶ組換え体Ａ９−ＳＶ−１Ｆ９で感染させ、感染から４日後に抗ＢＶＤＶ Ｅ２ＭＡｂ １６６で染色したＭＤＢＫ細胞の単層のＩＰＭＡ。
【配列表】
Claims (19)
- ポリタンパク質としてＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ、Ｅ rns 、Ｅ１およびＥ２をコードするポリヌクレオチド配列からなる単離されたＤＮＡであって、該コード配列は修飾されてスプライシングシグナルが除去されている、単離されたＤＮＡ。
- コードされたポリタンパク質が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡに転写されたときに、−２２よりも大きいスコアを有するスプライスアクセプター部位および−１３.１よりも大きいスコアを有するスプライスドナー部位を欠いている、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。
- 前記ＤＮＡ分子が、前記ポリタンパク質の発現が制御可能なシス調節配列に作動可能なように連結する、請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたＤＮＡ。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ分子。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなるウイルスベクター。
- ＢＨＶ−１、または糖タンパク質ｇＥをコードする遺伝子が全部または一部欠失しているＢＨＶ−１欠損突然変異体をさらに含んでなる請求項６記載のウイルスベクター。
- パスツール研究所ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１２１３として寄託されたＤｉｆｉｖａｃ−１である、請求項７記載のウイルスベクター。
- ＢＶＤＶポリタンパク質をコードする配列がＢＨＶ−１のｇＥ遺伝子座に位置する、請求項７記載のウイルスベクター。
- パスツール研究所ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−２４８８として寄託されたＡ９−ＳＶ−１Ｆ９である、請求項９記載のウイルスベクター。
- 配列番号１のヌクレオチド番号１７〜ヌクレオチド番号２７１０のヌクレオチドを含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
- シス調節配列が、ヒトサイトメガロウイルス前初期１プロモーターおよび５’非翻訳リーダーである、請求項４記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 終止配列をさらに含む請求項４記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 終止配列が、ウシ成長ホルモン終止配列に由来する、請求項１３記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項６〜１０のいずれかに記載のウイルスベクターを含む宿主細胞。
- （ａ）請求項７〜１０のいずれかに記載のウイルスベクターで適当な宿主細胞を感染させ、
（ｂ）該宿主細胞を適当な条件下で培養し、および
（ｃ）組換えウイルスを単離する
ことを含む、ＢＶＤＶ構造タンパク質Ｎ、Ｅ rns 、Ｅ１およびＥ２のコード配列を含んでなるＢＨＶ−１ウイルスの調製方法。 - 請求項１６の方法に従って調製した組換えウイルスと製薬的に許容し得る担体とを混合することを含む、ワクチンの製造方法。
- 請求項１６の方法に従って調製した組換えウイルスおよび製薬的に許容し得る担体を含むワクチン。
- ＢＨＶ−１ウイルスを含むＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチンであって、糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）をコードする遺伝子が全部または一部欠失しており、請求項１または４のポリオリヌクレオチドがその欠失した位置でまたはその近くで挿入されており、該ワクチンが宿主動物の区別を可能にするダブルマーカー特性を有し、野生型ＢＨＶ−１および／または野生型ＢＶＤＶによる感染を、このＢＶＨ−１／ＢＶＤＶワクチンでワクチン化しただけの宿主から区別することが可能である、ＢＨＶ−１／ＢＶＤＶワクチン。
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