JPH10509593A

JPH10509593A - ２の異種系におけるウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ３の血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ｈｎ）糖蛋白質の発現

Info

Publication number: JPH10509593A
Application number: JP8516849A
Authority: JP
Inventors: ハーネス，エリザベス・ジェイ; ワードリー，リチャード・シー
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-11-18
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-09-22
Also published as: WO1996016184A1; KR970707293A; EP0793728A1; AU706454B2; AU4500596A; CA2204252A1

Abstract

(57)【要約】ウシの呼吸器疾患と戦う新しいワクチンは、ウシ・パラインフルエンザウイルスの血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードするｃＤＮＡを、該蛋白質が対応するウイルスによって発現されるように、ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ１（ＢＨＶ−１）またはバキュロウイルスへ挿入することによって生産される。

Description

【発明の詳細な説明】２の異種系におけるウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ３の血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質の発現発明の背景発明の分野本発明は、ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ３(Bovine Parainfl uenza Virus Type 3)の分野およびその治療のためのワクチンに関する。情報の開示米国特許第４,８４７,０８１号［（ジョン・エム・ライス(John M．Rice))、１９８９年７月１１日発行）］米国特許第４,７０３,０１１号［(マロンおよびソール・キット(Malon and Sa ul Kit))、１９８７年１０月２７日発行］米国特許第４,９９２,０５１号［(マロンおよびソール・キット(Malon and Sa ul Kit))、１９９１年２月１２日発行］アール・ダブリュ・モルガン(R．W．Morgan)ら、アビアン・ディジージズ(Avi an Diseases)、３６：８５８−８７０（１９９２）、ワイ・サカイ(Y. Sakai)ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J．Virol.)、６３：３６６１−８（１９８９）、ティ・シオダ(T．Shioda)ら、バイロロジー(Virology),１６２：３３８−９６（１９８８）、エス・スズ(S．Suzu)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ( Nucleic Acids Res.),１５：２９４５−５８（１９８７）、カー・エル・ファン・ワイク・ソエリンフ(K．L．Van Wyke Coelingh)ら、バイロロジー(Virology) ，１６０：４６５−４７２（１９８７）。背景ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス−３（ＢＰＩＶ−３）はパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のパラミクソウイルス属(Paramyxovirus)に属する。ビリオンは多様の形がある、殻に包まれた粒子であって、一本鎖ＲＮＡゲノムを包含するヌクレオキャプシドを含む。ゲノムは、核蛋白質（ＮＰ）、マトリックス蛋白質（Ｍ）、融合蛋白質（Ｆ）、血球凝集素−ノイラミダーゼ蛋白質（ＨＮ）、およびラージ・プロテイン（Ｌ）の６のユニークな構造蛋白質の転写鋳型として働く。ＨＮおよびＦ蛋白質はスパイク-様構造としてビリオン表面から突出しており、感染した細胞の表面上でも発現する。ＨＮ蛋白質はアミノ末端で強疎水性であり、このドメインは、蛋白質をビリオンエンベロープおよび宿主細胞膜中に固定させる際に重要である。第二のドメインは、Ｃ−末端に近く、感染の初期の間に、シアル酸を含有する宿主細胞レセプターのビリオンへの付着を媒介する。（アール・エム・シャノツク(R．M．Chanock)ら、バイロロジー(Virology)、ビー・フィールズ(B．Fields)編(1990)）。血球凝集反応は、血清診断および実験的実験室研究において広く用いられているが、またこの型の相互作用の発現であり、この糖蛋白質が血球凝集素と命名された理由である。感染の後期に、ＨＮ蛋白質はまたノイラミニダーゼ活性によりビリオン表面からシアル酸残基を切断する。細胞への付着後、該ウイルスはヌクレオキャプシドを細胞質に輸送しなければならず、これは、第二の表面糖蛋白質であるＦ蛋白質によって媒介される。これは、ウイルスのリポ蛋白質エンベローブと、宿主細胞のリポ蛋白質表面との融合を引き起こす。Ｆ蛋白質は、感染した細胞の表面でも発現され、このことにより、接触感染した細胞と非感染細胞との融合が起こることを可能とし、シンシチウム形成および感染の拡大に導く。これらの２の蛋白質が感染プロセスで有する極めて重要な役割および感染細胞の表面上のそれらの存在は、それらを免疫系の明らかな標的とし、感染から回復した動物が、これらの両糖蛋白質に対する中和抗体を有することが研究によって示された。病原体としてのＢＰＩＶ−３の重要性は、ウシ呼吸器疾患複合体（ＢＲＤＣ）との関連である。ＢＲＤＣは、ウシの罹患および死亡の主たる原因であり、非常な経済的損失につながる。。共通に持たれる見地は、ウイルス、細菌およびストレスが相互作用して、疾患を引き起こすということである。最もよく関係するウイルスは、ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ−１（ＢＨＶ−１）、ＢＰＩＶ−３、ウシ・ウイルス性下痢ウイルスである。感染に対する感受性の増大につながるストレスにより、ウイルス病原体は気管上皮への初期の障害を引き起こすと考えられており、これは次いで細菌の侵入が起こし臨床的徴候をさらに悪化させる［アール・ジェイ・ヤンシー(R．J．Yancey),ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス(J Dairy Sci.),７６：２４１８−３６（１９９３）］。１以上のウイルス病原体が一度に関与するとしばしば推定されており、事実、ＢＲＤＣにおけるウイルス単離および血清学的証拠がこの見地を支持する。この理由により、この病気を予防するため開発されたほとんどのウイルスワクチンは、これらのウイルスの各々に対して抗原を含む。ＢＤＲＣと関連するウイルス病原体に対するワクチンの広範囲の組合せが入手できるにかかわらず、この疾患複合体は依然ウシ産業の経済的損失の主たる源である。通常用いられるワクチン調製物は、不活化ウイルス（ＩＶ）および修飾された生きたウイルス（ＭＬＶ）のさまざまな組合せからなり、それぞれの調製物が安全性および効率を個々に調整する。しかしながら、全ての場合において、コンビネーションワクチンは、様々なウイルスワクチンの調製を別途に必要とし、これはかなり生産に複雑さと費用を加える。加えて、多数のウイルスワクチン調製物の様々な成分のための最適な貯蔵および投与プロトコルにおける相違は、幾つかの成分の潜在能力および安定性と妥協しうる。本発明は、ＢＤＲＣ複合体の成分によって引き起こされる、ＢＰＩＶ−３および／またはＢＨＶ−１の予防のために有効なワクチンを使用者に提供する。発明の概要本発明は、ウシにおいて呼吸器疾患と戦う新規なワクチンからなる。該ワクチンは、ウシ・パラインフルエンザウイルスの血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードするｃＤＮＡを、該蛋白質が対応するウイルスによって発現されるように、ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ１（ＢＨＶ−１）またはバキュロウイルスへ挿入することによって生産される。本発明は、複製する非病原性ウイルスからなり、これは、ウシ・ヘルペスウイルスタイプ１（ＢＨＶ−１）の適当な遺伝子座に挿入されそこで発現される血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＮＨ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せ、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＮＨ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子組合せがウシ・パラインフルエンザ・ウイルスタイプ３（ＢＰＩＶ−３）からのものであるウイルス、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せがＢＨＶ−１のチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され、そこで発現されるウイルスからなる。ウシ・パラインフルエンザウイルスタイプ−３（ＢＨＶ −３）によって引き起こされる病気の予防のためのワクチンであって、ウシ・ヘルペスウイルスタイプ１（ＢＨＶ−１）の適当な遺伝子座に挿入されそこで発現される血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＮＨ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せを含む複製する非病原性ウイルスからなるワクチン、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せがウシ・パラインフルエンザウイルスタイプ３（ＢＰＩＶ−３）からのものであるワクチン、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せがＢＨＶ−１のチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され、そこで発現されるワクチン。バキュロウイルス発現系中に挿入され、そこで発現される血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＮＨ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなるワクチン、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せがウシ・パラインフルエンザタイプ−３（ＢＰＩＶ−３）からのものであるワクチン。ウイルスワクチンのために適切な医薬組成物、担体、希釈剤、アジュバントもまた提供されるか、当業者によって理解されるであろう。図面の簡単な説明図１．ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子座におけるＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子（および他の遺伝子）の発現のためのシャトルベクターの構築。図２．バキュロウイルス発現系内でのＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子の発現のための組み換えバキュロウイルス導入ベクターの構築。図３．ＢＨＶ−１およびバキュロウイルスからのＢＰＩＶ−３ＨＮの発現を示す感染−細胞溶解物の免疫沈降。図４．ＢＨＶ−１およびバキュロウイルス組換え体におけるノイラミニダーゼ活性。本発明のさらなる記載および好ましい具体例定義以下で使用される全ての用語は当業者によって容易に理解されるであろう。多くの場合において、器具または試薬の製造者の名称は、器具または製造者の名称が挙げられた後で丸括弧の中に入って提供されるであろう。「プラスミド」、「クレノウ断片」、「平滑末端」、「トリス」のごとき試薬およびEDTAのごときキレート剤のような通常使用される用語は、さらに説明なしに言及される。本発明で使用される化合物の構築の定義において、標準的な分子生物学的技術が使用され、本明細書中に手短に名付けられる。これらの技術の詳細な説明はエフ・エム・アースベル(F．M．Ausubel)ら（１９９３）およびジェイ・サムブルック(J．Sambrook)ら（１９８９）の標準的実験マニュアルに見い出される。「ＢＶ」、「ＢＴ細胞」、「ＢＤＲＣ」、「ＢＰＩＶ−３」および「ＢＨＶ− １」のごとき、当業者が必ずしも容易に理解できない略語は全て、それらの最初の使用に基づき定義され、たいていさらに考察無しにその後用いられる。組成物および投与 −本発明の医薬的有効量のワクチンは、医薬的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントと共に、ウシ、羊およびヤギのごとき動物中においてＢＨＶ−１およびＢＰＩＶ−３に対するワクチンとして使用される。本発明中で有用である医薬上許容される担体または希釈剤の例は、ＢＨＶ−１に対する抗体を含まない、すなわちＢＨＶ−１につき血清学的に陰性である、約２.５ないし１５％の血清を含む、約ｐＨ７.０ないし７.４の、いかなる生理学的に緩衝された媒体をも含む。ガンマアルブミンを含有しない血清は、ガンマグロブリンを含む血清よりも好ましい。本発明で使用される血清の例は、胎児ウシ血清、子ヒツジ血清、馬血清、ブタ血清、およびヤギ血清を含む。約０.５ないし３.０％の間の量の、ブタアルブミンまたはウシ血清アルブミン（以後「ＢＳＡ」と呼ぶ）のごとき血清蛋白質は、血清代替物として使用できる。しかしながら、ワクチン接種される動物中でアレルギー反応を誘導するであろう担体または希釈剤だは外来蛋白質の使用を避けるのが望ましい。医薬上許容されるアジュバントの例は、水中の油、油中の水、サポニン、およびリポ多糖（ＬＰＳ）等の、非−複製抗原を増強するために通常使用されるものである。該ウイルスは、リン酸緩衝液、グルタミン酸塩、カシトン、およびショ糖またはソルボースを含むか、リン酸緩衝液、乳糖、デキストランおよびグルタミン酸塩を含む通常のいずれかの安定化溶液中に希釈されていてもよい。本発明のワクチンウイルスは、７０℃ないし−９０℃にて少くとも１０⁵ないし１０⁶ＰＦＵ／ｍｌの力価にて、あるいは凍結乾燥状態で、２℃ないし７℃にて、保存されるのが好ましい。凍結乾燥ウイルスは、滅菌蒸留水で、またはゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢまたはストレプトマイシンのごとき保存剤を含む水性希釈剤を使用して、使用のために復元することができる。投与されるべき有用な用量は、ワクチン接種される動物の年令、体重および種ならびに投与の様式に依存するであろう。適当な用量は、例えば、約１０^4.5ないし１０⁷ＰＦＵ／動物、好ましくは１０^4.5ないし１０^5.5ＰＦＵであり得る。本発明のワクチンは、鼻孔内、膣内、および筋肉内投与され得る。鼻孔的投与は、ＢＨＶ−１成分に対してより好ましい投与の様式であり、筋肉内投与は、バキュロウイルス成分の投与のより好ましい様式である。本発明の化合物および該化合物の調製本発明の化合物の調製で使用する具体的な方法を以下に示す。これらの方法は、いかなる当業者にも、特許請求された発明を再現することを可能とするであろう。代替方法は、クローニング、形質転換、組織培養および免疫学的検出を含めたこれらの様々な操作に対し可能であり、標準的な実験マニュアルに記載されている［エフ・エム・アースベル(F．M．Ausubel)ら（１９９３）およびジェイ・サムブルック(J．Sambrook)ら（１９８９）］。これらの代替方法もまた、当業者が本発明を再現することを可能とするであろう。ＢＰＩ−３ＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローンは、当該分野でよく知られた方法あるいはワイ・サカイ(Y．Sakai)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジー(J．Vi rol.)，６３：３６６１−８（１９８９）およびエイチ・シバタ(H．Shibata)ら、バイロロジー(Virology)，１５５：６８８−９６（１９８６）（ここに引用して本明細書の一部とする）に記載された方法により構築することができる。このｃＤＮＡは、前記した手法により得られるか、または東京大学のヒロシ・シバタ (HIroshi Shibata)博士から得られるが、ＢＨＶ−１およびバキュロウイルス（ＢＶ）中での組換えおよび発現のためのシャトルベクター中に挿入される。ＢＨＶ−１中への導入のためには、ＨＮ遺伝子をシャトルベクターｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex-１（この構築はこの節に記載される）に挿入する。該挿入は、ＨＮ遺伝子が、ＢＨＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子を破壊するようになされる。バキュロウイルス発現のためには、ＨＮ遺伝子を、ポリヘドロンプロモーターの制御下、標準的で、商業的に入手可能なシャトルベクター(ＰＶＬ１３９２、ファルミンゲン(Pharmingen)、サンディエゴ(San Diego)、カリフォルニア(CA))に挿入する。シャトルプラスミドの、その各ウイルスゲノムとの共トランスフェクションに続き、ｔｋ−陰性ＢＨＶ−１およびポリヘドロン陰性ＢＶを単離し、ＨＮ遺伝子の存在をサザンハイブリダイゼーションでスクリーニングし、ＨＮの発現をラジオ免疫沈降によりスクリーニングする。細胞およびウイルスウシ鼻甲介（ＢＴ）細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ＡＴＣＣ、ロックビレ(Rodkville)、メリーランド州(MD))から入手可能である。ＢＴ細胞は、ペニシリン、ストレブトマイシン、必須でないアミノ酸および１０％馬血清を補足した、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中で増殖させる。チミジンキナーゼ欠損ウサギ皮膚細胞（ＲａｂＢＵ）は、ソール・キット(Saul Ki t)およびマロン・キット(Malon Kit)により提供された;しかしながら、ＢＨＶ− １の増殖を支持するいかなる他のチミジンキナーゼ欠損細胞系も、本発明を再現するのに使用可能である。ｔｋ欠損細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中で増殖させ、定期的に１００μｇ／ｍｌ５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＤＵＲ，シグマ(Sigma),セント・ルイス(St．Louis)，ミズーリ州（ＭＯ））中で継代した。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ＳＦ９)細胞は、ペニシリン、ストレプトマイシン、フンギゾンおよび１０％ウシ胎児血清を補足したグレース培地（完全）(Grace's Media)(complete)中で増殖させた。組織培養培地、補足物および血清は全てギブコ/ビーアールエル(Gibco/BRL)(グランド・アイランド(Grand Islan d)、ニューヨーク州(NY))から得た。ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ１（ＢＨＶ −１）株「アイオワ(Iowa)」は、ナショナル・アニマル・ディージースセ・センター・オブ・ザ・ユーエスエイディーエー(National Animal Diasease Center o f the USDA)(アメス（Ames）、アイオワ(Iowa))から得られた。他のＢＨＶ−１株も使用可能である。ウシ・パラインフルエンザウイルスタイプ３（ＢＨＩＶ− ３）のＳＦ−４攻撃株は、ナショナル・ベタラネリ・サービシズ・ラボラトーリ (National Veterinary Services Laboratory)(アメス(Ames)、アイオワ(IA))から得られた。本発明の効果は、しかしながら、ＢＰＩＶ−３病のためのいかなる有効な攻撃モデルに対しても示すことができる。ウイルスは、当業者によく知られた標準的方法により増殖させ、力価ーを計算した。最初のプラーク単離は、０.８％アガロースの下で行い、プラーク精製は、９６ウェルプレート中での限界希釈により達成した。分子クローニングおよびＤＮＡ精製技術記載された分子クローニング技術のために使用される方法は、標準的文献［エフ・エム・アースベル(F．M．Ausubel)ら（１９９３）およびジェイ・サムブルック(J．Sambrook)ら（１９８９）］に見い出すことができる。制限および修飾酵素は、ニュー・イングランド・バイオラブズ((New England Biolabs)、ビバルリー(Beverly)、マサチューセッツ州(MA))、ギブコ/ビーアールエル(Gibco/BRL)、タカラ((TaKaRa)マディソン、ウィスコンシン州(WI))またはベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ((Boehringer Mannheim Biochemicals)(ＢＭＢ)、インディアナポリス(Indianapolis)、(インディアナ州(IN))のごとき供給者から購入可能であり、製造者の記述に従い使用すべきである。組換えプラスミドはＤＨ５ αのごとき受容可能なイー・コリ(E．coli)に形質転換する。凍結した受容可能細胞は、ギブコ／ビーアールエル(Gibco/BRL)または他の提供者から購入可能である。アガロースゲルから切り出したＤＮＡ断片は、キアエックス(Qiaex)(キアゲン(Qiagen)、チャットワース(Chatworth)、カリフォルニア (CA))を使用するか、または他の方法により精製可能である。プラスミドＤＮＡはキアゲンカラム(Qiagen solumns)(キアゲン(Qiagen))または他の方法により精製可能である。ＢＨＶ−１ＤＮＡは、実質的にはWallboomersおよびTer Shegett によって記載される方法(J．M．Wallboomersら，Virology,74:256-258(1976))により、感染ＢＴ細胞からヨウ化ナトリウム勾配上で精製されるか、あるいは小スケールの調製に対しては、エンゲル（Engel）らによって記載された「ミニ−プレップ」法（ジェィ・ビイ・エンゲル(J．P．Engel)ら、バイロロジー(Virology) ,192:112-120(1993)によって、感染したＢＴ細胞から精製される。ウイルスＤＮＡ制限消化物のＤＮＡハイブリダイゼーションは、ジーニアス・キット(Genius Kit)(ＢＭＢ)によって提供されるジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン試薬を用いて、または他の適用できる方法によって行う。以前にクローン化されたＤＮＡ断片プラスミドＤＮＡは、ベクターｐＵＣ１８にクローン化されたＢＨＶ−１ＨｉｎｄIII「Ａ」断片(クーパー(Cooper)株由来)の、２.７ｋｂのサブフラグメントである。このプラスミドは、当該分野でよく知られた方法により、または、ここに引用して本明細書の一部とする、ジェイ・イー・メイフィールドら(J．E．M ayfield et al.)の、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J．Virol)、４７：２５９ −２６４（１９８３）によって記載される方法により組み立てることができる。このＳａｌＩ断片は、完全なチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＨＳＶ−１ＵＬ２４遺伝子のＢＨＶ−１ホモログ、およびＢＨＶ−１糖蛋白質Ｈ遺伝子の小さい部分を含む（エル・ジェイ・ベロ(L.J.Bello)ら、バイロロジー(Virology)、１８９：４０７−４１４（１９９２）、ジェイ・ジー・ヤコブソン（J.G.Jacobson ）ら、バイロロジー(Virology)、６３：１８３９−１８４３（１９８９）、エイ・エル・メイアー（A.L.Mayer）ら、ビオシミカ・ビオフィジカ・アクタ(Biochi m Biophys Acta)、１０９０：２６７−９（１９９１）、ジェイ・シー・ウィットベック(J.C.Whitbeck)ら、バイロロジー（Virology），２００：２６３ −２７０（１９９４））。４２４ｂｐ欠失は、ＢｇｌIIおよびＸｈｏＩで消化し、満たした末端を平滑末端連結させることによってなされる。この操作によりＢｇｌII部位が再生し、得られたプラスミドはｐＨＡＳ４ＤＢＸと命名される。ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子座における外来遺伝子の発現のためのシャトルベクターの創製ＢＨＶ−１中での様々な異なるウイルス抗原を発現させるために、シャトルベクターであるｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex-1を創製して、外来遺伝子の、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子座への組換えを可能とした。このベクターの構築は図１で詳しく述べる。ｐＨＡＳ４で始まり、完全なｔｋの遺伝子およびいずれかの側にフランキング領域を含む２.７ｋｂのＢＨＶ−１ＳａｌＩ断片。ｐＨＡＳ４(ｐＵＣ１８ベクターにクローン化。当業者によく知られたＤＮＡクローニングベクター (ジェイ・サムブルック(J．Sambrook)ら、(１９８９)))に存在する一つのＨｉｎｄIII制限酵素部位を、ＨｉｎｄIIIで消化し、末端を満たし、再連結することによって除去した。酵素ＢｇｌIIおよびＸｈｏＩで消化し、付着末端を満たし、得られた平滑末端を再連結することによって、４２４ｂｐの欠失をｔｋ遺伝子で行い（この操作はＢｇｌII制限部位を再生する）、プラスミドｐＨＡＳ４ＤＢＸを得る。このＢｇｌII制限部位に、ヒト・サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の即時型初期プロモーターおよびウシ・成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル（これらは発現されるべき外来遺伝子の挿入のための唯一のＨｉｎｄIII制限部位によって隔てられている）からなる発現カセットを挿入する（アール・ジェイ・ブリジュー(R．J．Brideau)ら、ジャーナル・オブ・ジェネテック・バイロロジー(J Gen Virol)，７４：４７１−４７７（１９９３））。このシャトルベクターはｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex-1と呼ばれる。図１に示されるように、このベクター中のプロモーター／ポリアデニル化シグナルカセットは、本来のｔｋ遺伝子の向きと反対の転写の向きに挿入される。ＨＮ遺伝子は、ＭＲ株からのクローン化されたＭＲ２−９ｔｒであった（ワイ・サカイ(Y.Sakai)ら、ジェイ・バイロル(J．Virol.),６３：３６６１−８（１９８９）、エイチ・シブタ（H.Shibuta）ら、バイロロジー(Virology),１５５：６８８−９６(１９８)）。このｃＤＮＡは、オカヤマおよびバーグタイプのクローニングベクター（エイチ・オカヤマ(H.Okayama)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイロロジー(Molec Cel Biol)，２：２６１−１７０（１９８２））にクローン化された完全なＨＮｍＲＮＡを含む。このＨＮ遺伝子クローンは、当該分野で公知の方法か、またはワイ・サカイ(Y.Sakai)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)，１５：２９２７−４４（１９８７）に記載される方法により得ることができるか、あるいは構築することができる。組換えＢＨＶ−１およびバキュロウイルスの創製組換えＢＨＶ−１を得るために、注目する配列を含む単位長のウイルスＤＮＡおよびプラスミドを、グラハムおよびファン・デル・エブ（Graham and Van der Eb）ら(アール・エル・グラハム(R.L.Graham))ら、バイロロジー(Virology),５２：４５６−４６７(１９７３)）によって記載され、ローレンスら(ダブリュー・シー・ローレンス（W.C.Lawrence）ら、ジェイ・バイロル（J.Virol），６０：４０５−１４（１９８６）によって修飾されたリン酸カルシウム法によってＢＴ細胞に共コトランスフェクトする。共トランスフェクションに先立ち、シャトルプラスミドは、Ｓｓｅ８３８７Ｉでの消化により線状化し、得られた線状化断片を、キアエックス・グラス・マトリックス(Qiaex glass matris)(キアゲン(Qi agen))を製造者の提供する方法により使用することによって酵素から精製する。共トランスフェクションから生じたｔｋ陰性ウイルスは、１００ｕｇ／ｍｌＢＤＵＲの存在下でＲａｂＢＵで２回継代することにより選択する。選択されたＢＤＵＲ耐性ウイルスは、次いで、ＢＴ細胞上（ＢＤＵＲの非存在下）、限界希釈により３回プラーク精製する。バキュロゴールド・システム（BaculoGold System(ファルミノゲン(Pharminog en),サン・ディエゴ(San Diego)，カリフォルニア州(CA))は、製造者によって提供されるプロトコルを用いて、組換えバキュロウイルス（ＢＶ）の創製に用いることができる。この系において、注目する外来遺伝子を担うシャトルプラスミドを、シャトルプラスミド上のフランキング領域の組換えによって救済したゲノムのみが野生型細胞で生存可能なように、ＡｃＮＰＶの欠損ゲノムと共に共トランスフェクトする。かくして、トランスフェクションからのウイルスの子孫は、プラーク精製され、注目する遺伝子の発現のためにスクリーニングされるだけでよい。感染細胞の代謝的ラベリング免疫沈降のため（このセクションで後に記載される）、細胞をＢＨＶ−１またはＢＰＩＶ−３で感染させることができ、ＳＦ９細胞を、５−１０の感染多重度で、組換えＢＶによって感染させることができる。ＢＴ細胞の感染のためには、正常な培地を、感染８時間後に、１０％の冷メチオニンおよび１００ｕＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニン（５０ｍＣＩ／ｍＭｏｌ）、アマシャム（Amersham），アーリントン・ハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州(IL))を含む培地と置換し、細胞はさらに２４時間標識する。ＳＦ９感染細胞のためには、感染２４時間後に、培地は、１００ＵＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含む、メチオニンを含まないグレースの培地(Grace's media)で置換し、ラベリングはさらに２４時間継続させる。ノイラミニダーゼアッセイノイラミニダーゼ活性は、マイアーズら(Meyers et al.)(アール・ダブリュ・マイアーズら（R.W.Meyers）)、アナル・バイオケム（Anal Biochem）、１０１：１６６−１７４（１９８０））の方法により、蛍光基質２’−（４−メチルウムベリフェリル）−ａ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸(シグマ(Sigma))を用いて分析する。分析はｐＨ５.１で行い、これは、シブタ(Shibuta)ら(エイチ・シブタ(H.Shibuta)ら、インフェクト・イムノ(Infect Immun)，４１：７８０−７８８（１９８３））によりＢＰ１３株ＭＲのＨＮ蛋白質に対して最適であることが示されている。手短に言えば、２２５ｃｍ²フラスコのＢＴ細胞（約６×１０⁶細胞）を、１のＭＯＩにて注目するＢＨＶ−１ウイルスで感染させ、感染は、１００％のＣＰＥが観察されるまで（約３６時間）進められる。ＳＦ９細胞のスピナーフラスコ（約５×１０⁷細胞）を、注目するバキュロウイルスで１のＭＯＩにて感染させ、感染は４８時間進行させる。収穫後、様々な収穫された細胞ペレットを１.０ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、ドライアイス／エタノール浴中の３回の凍結／解凍サイクルに付し、次いで、１２０００×ｇで１５分間４℃にて遠心する。得られた上清は、ＢＣＡプロテイン・アッセイ（BCA protein assay）( ピアス(Pierce),ロックフォード(Rockford).イリノイ州(IL))を使用して１ｍｇ／ｍｌに調整する。蛋白質試料（各５０ｕｇ）を、次いで、８０ｍｍｏｌｅの基質と共に、１００μｌの全容量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.１）中、３７℃にて０−６０分間インキュベートする。反応は、３.０ｍＭの２５０ｍＭグリシン（ｐＨ１０.４）の添加により停止させ、蛍光の強度は、パーキン・エルマー・エルエス５０−ビー・ルミネッセンス・スペクトロホトメーター(Perki n Elmer LS50-V luminescence spectrophotometer)(３６０ｎｍでの励起、１０. ０ｎｍのスリット幅、発光、４４０ｎｍ、２.５ｎｍのスリット幅）上、または適当な他の適当な器具で読むことができる。４−メチルウムベリフェロン（シグマ（Sigma）のナトリウム塩を標準として用いることができ、上記の条件下で、０.２ｎｍｏｌｅから１０ｎｍｏｌｅの間の直線範囲が得られる。免疫学的方法免疫沈降のために、³⁵Ｓ−メチオニンで標識した感染したまたは偽感染の細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０.１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび１ｍｇ／ｍｌのオブアルブミン）中、１時間室温にて可溶化し、次いで、不溶性画分を、１５Ｋ×ｇで１０分間、室温にて微量遠心機中で遠心により除去する。次いで、清澄化された溶解物を、４℃で１時間ゆらすことによって、１００μｌのプロテイン・エイ・セファロース・４Ｂ(protein A Sepha rose 4B)(ファルマシア(Pharmacia)、１００ｍｇ／ｍｌのＴｒｉｓ-緩衝セーライン，ｐＨ８.０)で予備吸着させる。予備吸着マトリックスを取り出した後、溶解物を適量の抗血清（通常２０−２５μｌ、未希釈）と混合し、４℃にて２時間ゆらしながらインキュベートする。各試料に対して、５０μｌのプロテインＡセファロースを添加され、４℃にてのゆらしをさらに１時間継続する。かくして、免疫複合体をプロテインＡセファロースに吸着させ、ＨＯ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＮＰ４０，およびデオキシコール酸ナトリウム）で３回洗浄し、次いで、２−メルカプトエタノール（シグマ）を含む５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、５分間沸騰させ、免疫複合体をマトリックスから解離させる。試料を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびフルオログラフィーにより解析する。実施例ＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子を２の異種系で発現させる；組換えヘルペスウイルスおよび組換えバキュロウイルスを記載する。組換え蛋白質は、抗原性および電気泳動移動度については天然のＨＮにたいへん類似しており、以下の実施例に例示されるように、天然のＮＨに期待されるノイラミニダーゼ活性を保持する。実施例１．ＢＰＩＶ−３ＨＮのＢＨＶ−１への導入および組換えウイルスの選択ＢＰＩＶ−３ＨＮｃＤＮＡクローンおよびそのＢＨＶ−１シャトルベクターへの挿入のマップを図１に示す。ＢＨＶ−１へのクローニングのために、ＨＮ遺伝子をｃＤＮＡクローニングベクターからＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで除去する（この断片は、ｃＤＮＡのクローニングから保有された３’ポリＡテイルを含み、また、ベクター中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化領域の小さい部分も含む）。ＨｉｎｄIII部位はＡＴＧ開始コドンの８０ｂｐ上流にある。図１ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIにより生じたインサートの突出する一本鎖末端を満たした後に、ＨＮ遺伝子を、ｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex-1の同様に満たしたＨｉｎｄIII部位に連結する。プラスミドを含むインサートの形質転換および選択により、ＨＮ遺伝子およびベクター内の非対称部位の制限マッピングによって、ＣＭＶプロモーターに対してインサートの適切な向きを決定する。ＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子を含む線状化ＢＨＶ−１シャトルベクターを、プラスミドのＢＴ細胞および単位長のＢＨＶ−１株「Ｉｏｗａ」ＤＮＡへの共トランスフェクションを介し、野生型ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子座と組み換える。「Ｉｏｗａ」は、ＢＨＶ−１の高度に毒性のある病気単離株である。加えて、プラスミドｐＨＡＳ４ＤＢＸ（挿入したプロモーターまたは遺伝子を含まないＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子の欠失したバージョンを含む）をＢＨＶ−１Ｉｏｗａで共トランスフェクションし、挿入した遺伝子の無いｔｋ欠失対照ウイルスを得る。これらの共トランスフェクションからのｔｋ陰性の子孫を、ＢＤＵＲの存在下で、ＲａｂＢＵ細胞での継代により選択し、単離する。これらのウイルスからのＤＮＡを、制限消化および、ＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子またはｐＨＡＳ４のいずれかをプローブとして用いるサザーンハイブリダイゼーションのために単離する。ＢＤＵＲ耐性トランスフェクション子孫から、ＨＮ遺伝子と個々にハイブリダイズした二つのＢＨＶ−１ウイルスクローン、ＨＮ１６およびＨＮ２１が単離された。この後者のウイルスは、ＢＨＶＤ_tkＨＮとして動物実験（以下の「本発明の有用性」参照）で言及する。これらのクローンにおけるｐＨＡＳ４断片のサイズの低下によって評価して、ｔｋ欠失を含むいくつかのＢＤＵＲ耐性トランスフェクション子孫も単離した。代表的なウイルスを単離し、ＩｏｗａＤｔｋと呼んだ（ＢＨＶＤ_tkとして動物実験で言及する）。実施例２．ＢＰＩＶ−３ＨＮのバキュロウイルスへの導入および組換えウイルスの選択ＢＶ系での発現のため、本発明者らは、ＨＮ遺伝子を、ポリヘドリンをベースとする導入ベクターであるｐＶＬ１３９２にクローン化した。図２はこのベクターへのＮＨの挿入を示す。ＨＮ遺伝子をＨｉｎｄIIIで消化し、一本鎖突出末端をクレノウで満たし、次いで、インサートを、プラスミドベクターｐＳＰ７２から、ＢａｍＨＩでの消化により切り出す。プラスミドｐＶＬ１３９２をＢｇｌII で消化し、末端をクレノウ断片で満たし、次いで、プラスミドをＢａｍＨＩで消化する。ＨＮインサートを、一つの平滑末端および一つの付着末端を介して、消化したｐＶＬ１３９２ベクターに連結し、発現のために正しい向きを保証する。ＨＮ遺伝子は、ｐＶＬ１３９２に適当にクローン化されたが、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＤＮＡのＳＦ９細胞への共トランスフェクションを介してＡｃＮＰＶゲノムへ組み換える。実施例３．ＢＨＶ−１およびバキュロウイルスにおけるＨＮ蛋白質の発現および生物学的活性の証明ウイルスＨＮ２１およびＨＮ１６に感染したＢＴ細胞およびバキュロ−ＨＮに感染したＳＦ９細胞は、ラジオ免疫沈降によって判断すると、高レベルのＨＮ蛋白質を発現した。代謝的に標識した感染細胞溶解物を、ＢＰＩＶ−３（ＮＶＳＬ、アメス（Ａｍｅｓ）、アイオワ（ＩＡ）から得られた）に対するポリクローナル・ウシ抗血清とインキュベートした。図３に示すように、ＢＶ／ＨＮトランスフェクションから精製した代表的なウイルスクローン（レーン６、バキュロＨＮと表される）と共に、ＨＮ２１、ＨＮ１６（レーン３およびレーン４）は、天然のＢＰＩＶ−３ＨＮ（レーン２）と同時に移動するように見えた、大量の約７０ＫＤのＢＰＩＶ−３免疫反応性蛋白質を発現した。この蛋白質は、野生型ＢＨＶ−１感染（レーン１）または偽感染ＢＴ細胞中に存在しないだけでなく（データは示さず）、不適切な組換えバキュロウイルスで感染したＳＦ９細胞中にも存在しなかった（レーン５）。ＢＨＶ−１およびバキュロウイルスで発現されたＮＨ抗原の豊富さは、天然ＮＨに対するこれらの糖蛋白質のサイズを正確に定めることを困難とした。しかしながら、ＢＨＶ−１およびバキュロウイルス発現物質を用いた引き続いてのラジオ免疫沈降は、ＢＨＶ−１ＨＮ蛋白質が、実際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、天然のＨＮ蛋白質と共に移動するが、一方、バキュロウイルス発現物質は、わずかにより迅速に移動することを示した（データは示さず）。本発明者らはいずれの種類の糖複合体分析も行わなかったが、同じ細胞系で増殖したＰＩ−３およびＢＨＶ−１発現蛋白質が、同様に修飾されることを期待する。バキュロウイルスが発現した物質のより小さいサイズは、容易に説明される。というのは、Ｎ連結糖鎖付加部位を認識し修飾するが、昆虫細胞は脊椎動物細胞で観察される複合オリゴ糖を合成しないからである。ＢＨＶ−１およびＢＶにおいて発現されるＢＰＩＶ−３ＨＮ蛋白質の生物学的活性を試験するために、本発明者らは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性につき感染細胞溶解物を分析した。ウイルスＨＮ２１およびバキュロＨＮは、共に、２ ’−（４−メチルウムベリフェリル）−ａ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の加水分解により測定し場合、有意なＮＡ活性を示した（図４）。この活性は、ＢＨＶ−１ＩｏｗａＤｔｋウイルスおよびＢＨＶ−１ｇIII蛋白質を発現している組換えバキュロウイルスからなる陰性対照には存在しなかった。本発明者らは、本発明者らがウイルス蛋白質を単離し、ＮＡの分析をするために用いた条件下では、本発明者らが陰性対照として用いたＳＦ−４ＢＰＩＶ− ３株ではＮＡの活性を検出できなかった。株ＭＲは、他のＢＰＩＶ−３株と比較して、有意に高いＮＡ活性を有することが公知であるが（エイチ・シブタ(H.S hibuta)ら、Infect Immun ４１：７８０−７８８（１９８３））、このことは、我々の組換え体におけるＳＦ−４と比較した高レベルのＮＡ活性を説明するであろう。実際、以前の研究により、いくつかのＢＰＩＶ−３株において、ＮＡ活性を検出することは非常に難しいことが示された(エイチ・シブタ(H.Shibuta)ら、インフェクト・イムノ(Infect Immun)３４：２６２−２６７（１９８１）)。しかしながら、本発明者らは、これらの結果から、ＨＮ２１およびＢＶＨＮは、生物学的に活性なＨＮ蛋白質を発現すると結論を下すことができる。発明の有用性本発明は、ＢＰＩＶ−３およびＢＨＶ−１によって引き起こされた病気の予防のために有効なワクチンを使用者に提供しようとするものである。病原体としてのＢＰＩＶ−３の重要性は、ウシ・呼吸器疾患複合体（ＢＲＤＣ）とのその関連である。本発明のワクチンは、病気の、好ましくは予防を通した治療を意図してなされている。予防する、または予防のために、出願人は、受容者を病気の兆候から遠ざけておく、または、病気の影響を軽減することを意図し、これは典型的な病気の状態を避けることである。予防は、病気の発病を停止し、妨げまたは遅らせるための決定的な作用を意味する。予防は、以下の概念を含むことができる：妨げる、失敗させる；遮る、可能なら禁ずる、妨げるまたは起こらないようにする。「起こらないようにする」は、病気の状態の発病が、起こらないか、または病気の病原が、病気の状態を引き起こすには非常に無力であることを示唆する。予防するまたは予防は、病気の状態が機先を制されることを意味することができ、病気を予防または妨げるための予想しての行為が起こったが、病気を作り出す状態が未だ除去されてないことを意味する。本発明の有用性は、ＢＰＩＶ−３病に対する有効な保護を提供するためのワクチンの能力によって示される。この病気のためのワクチン接種は、ＨＮ糖蛋白質に対する強い中和抗体を誘導することを含む。本発明は、組換えバキュロウイルスおよび組換えウシ・ヘルペスウイルスを含めた異なる具体例からなる。これらの組換えウイルスは、ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス−３からのＨＮ蛋白質を発現し、かくして、ワクチン接種された動物に保護的効力を与える。８ないし１２週令の初乳をあまり与えられなかった子ウシを、ワクチン接種間に別々の収容設備中で飼い、抗原投与の前に一緒に一つの群とした。ワクチン接種前に、動物を、ＢＶＤＶおよびＢＰＩＶ−３の両抗体を有しないことを確認するために試験した。１９の動物を５の群に分けた。群１（３匹の動物）はＢＨＶＤｔｋ対照ウイルスを摂取させ、群２（５匹の動物）はＢＨＶＤｔｋ−ＨＮウイルスを摂取させ、群３（５匹の動物）はバキュロ−ＨＮウイルスで感染したＳＦ９細胞を摂取させ、群４（３匹の動物）は、陰性対照バキュロウイルスで感染したＳＦ９細胞を摂取させ、群５（３匹の動物）は、ワクチン接種されていない対照として供した。２×１０⁷のＳＦ９細胞を摂取した動物を、２８日の間隔をあけて、２回の時に分けて、組換えまたは対照バキュロウイルスで予め７２時間感染させた。２ｍｌ体積中での接種を皮下投与した。ＢＨＶ−１ウイルスを、２８日の間隔をあけて、２回の時に分けて、経鼻的に、２ｍｌの体積にて、１０⁶ＴＣＩＤ５０／子ウシの割合で与えた。全ての動物を、４×１０⁷ＢＰＩＶ−３で経鼻的なワクチン接種の４２日後に、抗原投与した。動物を、ワクチン接種の２１および４２日後に採血して、ＢＰＩＶ−３に対する血清中和抗体のレベルを見積もった。抗原投与後、ワクチン効力を、鼻の分泌物（抗原投与の１４日後に、滅菌綿棒を用いて動物から単離した）中に放出された攻撃ウイルスの継続と量を測定することによって評価した。ワクチン接種に対する不利な兆候は見られなかった。表Ｉは、様々な調製物でワクチン接種した動物の５０％血清中和力価の逆数を示す。動物２４８１、２４７８、および２４８９はＢＨＶ−１対照ワクチンを接種した。動物２４７２、２４９３、２４７９、２４６２、および２４３５は、組換えＢＨＶ−ＨＮウイルスを接種した。動物２４７７、２４４８７、２４７６および２４９４は組換えバキュロ−ＮＨウイルスを接種した。動物２４８８、２４８０および２４８２はバキュロウイルス対照として供した。動物２１５２および２１７５は非ワクチン接種対照として供した。ＨＮ組換えウイルスを接種した動物は、ＢＰＩＶ−３に対する血清中和抗体の増加したレベルを示し、本発明の両具体例の免疫原性を示す。動物は、抗原投与後、臨床的な病気の兆候をほとんど示さないか、または全く示さなかった。また、本発明で特許請求するＨＮ組換えウイルスを接種した動物は、攻撃ウイルスの放出の持続によって示されるように、攻撃から保護された。表 II。ウイルスの放出は、攻撃後のそれぞれの日に対し、四角内の描影により図示し、７および１４日におけるウイルス排出のパーセントは、表の右の二の欄に示す。三の対照群、ＢＨＶΔ_tk、バキュロ対照および非ワクチン接種対照は、２５％の組換えバキュロからの単離割合で、７４％の組換えヘルペスからの単離割合で、最初の７日にわたって採取された試料の８６および９５％に単離された。この、単離割合における顕著な低下は、１４日の単離割合で再び観察された。また、ウイルス単離割合の低下と同様、鼻の分泌物中で見いだされた攻撃ウイルスの量は、ＢＨＶ−１ＤｔｋＨＮおよびバキュロＨＮウイルスでワクチン接種された子ウシにおける対照と比較して低下した（データは示さず）。図面の完全な記述図１．ＢＨＶ−１ｔｋ遺伝子座におけるＢＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子（および他の遺伝子）の発現のためのシャトルベクターの構築。ｐＨＡＳ４はＢＨＶ−１ゲノムからのＤＮＡ断片である。該断片中にコードされる遺伝子および遺伝子の断片が認められる。ｐＨＡＳ４ＤＢＸは、ｔｋ遺伝子でなされた４２４ｂｐの欠失を示す。ｐＨＡＳ４ＤＢＸに挿入された様々なカセットを標識する。ｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex1は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターとウシ・成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルのｔｋ欠失への挿入によって作製された。ｐＨＡＳ４ＤＢＸ_ex1：：ＨＮ（底部）において、ＨＮの転写の方向は矢印で示される。図２．ＢＰＩＶ−３ＮＨ遺伝子のバキュロウイルス発現系での発現のための組換えバキュロウイルス導入ベクターの構築。上部：ｐＶＬ１３９２、外来遺伝子の発現のための、ポリヘドリンプロモーターに基づく導入ベクター。下部：ＨＮ遺伝子のこのベクターへの挿入。図３．ＢＰＩＶ−３ＨＮのＢＨＶ−１およびバキュロウイルスからの発現を示す感染細胞溶解物の免疫沈降。免疫沈降物は、ＢＰＩＶ−３に対するポリコーナル抗血清（ウシ由来）で沈降した。レーン１−４は、代謝的に標識された感染（または偽感染）ＢＴ細胞であり、レーン５および６は、代謝的に標識された感染したＳＦ−９細胞であった。レーン１：偽感染細胞、レーン２：ＢＰＩＶ−３株ＳＦ４（ＨＮ蛋白質は約７０ｋＤにて泳動する）、レーン３：ＨＮ１６（組換えＢＨＶ−１）、レーン４：ＨＮ２１（組換えＢＨＶ−１）、レーン５：対照バキュロウイルス（不適切な組換え体）、およびレーン６：バキュロＨＮ。図４．ＢＨＶ−１およびバキュロウイルス組換え体におけるＨＮ活性。グラフは、様々なウイルス調製物の凍結−解凍溶解物によって触媒される、２’−（４ −メチルウムベリフェリル）−ａ−Ｄ−Ｎ−アセチルメルアミン酸基質からの、経時的４−メチルウムベリフェロン（４−ＭＵＢＦ）の酵素的放出を示す。Ｘ軸は分での時間である。Ｙ軸は、放出された４−ＭＵＢＦのナノモルである。キー：白抜き四角、ＨＮ２１（ＢＨＶＤ_tk−ＨＮ）；黒ダイアモンド、バキュロＨＮ；白抜き丸、ＢＨＶＤｔｋ；黒四角、バキュロ−ｇＣ（ＢＨＶ−１のｇＣ蛋白質を発現する組換えバキュロウイルス、ここで陰性対照として用いられる）；黒丸、ＢＰＩＶ−３。放出されたＭＵＢＦのナノモルは、４−ＭＵＢＦ濃度一対−蛍光強度の標準曲線から計算した（ｒ＝０.９９９）。遺伝物質の寄託本発明は、本発明の一つの態様の一つの例示として意図される、本明細書中に開示した具体例の寄託された物質によってその範囲かせ限定されるべきでなく、これらの多くは機能的に同等であって、本発明の範囲内にある。実際、本明細書中で示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、これまでの記載から、当業者に明らかであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲の範囲内にある。ヌクレオチドとペプチドに与えられる全ての塩基対とアミノ酸残基の数は、おおよそのものであり、記載の目的のために使用されることも理解されるべきである。全ての刊行物を引用して本明細書の一部とする。当業者は、本発明の様々な具体例の全てを、書かれた記述のみを用いることにより再び構築することが可能てあるはずである。しかしながら、完全さのために、実施可能性を保証し、および、他人が本発明を製造し使用するあらゆる機会を提供するために、本発明のある遺伝的構築物は、ブダペスト条約に基づいて、知られた寄託機関に寄託した。ウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、１２３０１・パークローン・ドライブ，ロックビレ、メリーランド、ジップコード２０８５２、ユーエスエイ(12301，Parklawn Drive， Rockville，Maryland，zip code 20852，USA)に寄託した。この寄託物は、アップジョン・カンパニーによりＵＣＶＲ−５９と示され、寄託機関により以下の番号を与えられた、ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２４７８、これは、本明細書中に”ＨＮ２１”または”ＢＨＶＤｔｋＨＮ”と記載されたウイルスに対応する。この寄託は、１９９４年９月１４日にアメリカン・タイプカルチャー・コレクション (American Type Culture Collection)寄託機関に受理された。表

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ１（ＢＨＶ−１）のいずれかの適当な遺伝子座に挿入され、発現される、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる複製非病原性ウイルス。２．ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ３（ＢＰＩＶ−３）由来の血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる請求項１記載のウイルス。３．ＢＨＶ−１のチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され、発現される、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる請求項２記載のウイルス。４．ウシ・ヘルペスウイルス・タイプ１のいずれかの適当な遺伝子座に挿入され、発現される、血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せを含む、複製非病原性ウイルスからなる、ウシ・パラインフルエンザウイルス・タイプ−３によって引き起こされる病気の予防のためのワクチン。５．ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ−３（ＢＰＩＶ−３）からの血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる請求項４記載のワクチン。６．ＢＨＶ−１のチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入され、発現される血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる請求項５記載のワクチン。７．バキュロウイルス発現系に挿入され、発現される、ウシ・血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなるワクチン。８．ウシ・パラインフルエンザ・ウイルス・タイプ−３（ＢＰＩＶ−３）からの血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子の組合せからなる請求項７記載のワクチン。