JP5116481B2

JP5116481B2 - シトシンの化学修飾により微生物核酸を簡素化するための方法

Info

Publication number: JP5116481B2
Application number: JP2007543659A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ダグラス，スペンサー; ミクロス，ジョージ，ゲイバー，エル
Original assignee: ヒューマンジェネティックシグネチャーズピーティーワイリミテッド
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2005-12-05
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2025-12-05
Also published as: EP1828411A1; US8598088B2; ES2399054T3; BRPI0517131A2; US20090042732A1; US7833942B2; KR20070090230A; CN101111606A; IL183622A0; CA2589668C; DK1828411T3; WO2006058393A1; CN101111606B; MX2007006610A; EP1828411B1; KR101293713B1; US20110136098A1; EP1828411A4; BRPI0517131B1; JP2008521413A

Description

技術分野
本発明は、微生物の検出のための核酸検出アッセイに関する。本発明は、微生物検出のために特異的リガンドの使用と組み合わせて微生物ゲノムの複雑さを低減することを目的とした核酸の化学処理のための方法にも関する。

背景技術
現在、特異的核酸分子の検出のために多数の手順が利用可能である。これらの手順は、典型的には標的核酸と、長さで短いオリゴヌクレオチド（２０塩基またはそれ未満）から何キロベース（ｋｂ）もの配列の範囲でありうる核酸プローブとの間の配列依存的なハイブリダイゼーションに依存する。

核酸配列の集団から特異的配列を増幅するための最も広く用いられる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法である(Dieffenbach, C and Dveksler, G. eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)。この増幅方法では、相補的ＤＮＡ鎖上および増幅されるべき領域のいずれかの末端にて一般に長さが２０〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを使用することで変性された一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成がプライミングされる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた変性、プライマーハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ鎖合成の連続サイクルにより、プライマー間の配列の指数関数的増幅が可能である。ＲＮＡ配列をまず逆転写酵素を用いた複製によって増幅することで相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）複製物が生成されうる。ゲル電気泳動、標識プローブを伴うハイブリダイゼーション、引き続く（例えば酵素結合アッセイによる）同定を可能にするタグ付プライマーの使用、および標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション時にシグナルを生成する蛍光タグ付プライマーの使用（例えばＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎ系）を含む種々の手段により、増幅ＤＮＡ断片の検出が可能である。

ＰＣＲと同様、特異的ヌクレオチド配列の検出および増幅を目的とした種々の他の技術が開発されている。一例としてリガーゼ連鎖反応が挙げられる（1991 , Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193）。

別の例として１９９２年に最初に記載された等温増幅が挙げられ(Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D.「制限酵素／DNAポリメラーゼ系によるｉｎｖｉｔｒｏでのＤＮＡの等温増幅」 PNAS 89: 392-396 (1992))、鎖置換増幅（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）と称される。それ以来、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ配列を複製するが対応するゲノムＤＮＡを複製しない転写媒介増幅（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）を含む多数の他の等温増幅技術についての記載がなされている(Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD and Gingeras TR. 「レトロウイルス複製後にモデル化された多酵素反応によるｉｎｖｉｔｒｏでの核酸の等温増幅」 PNAS 87: 1874-1878 (1990): Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA 「HIV-1感染の診断用に最適化されたｉｎｖｉｔｒｏでの酵素による核酸の等温増幅」 J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273-86）。

他のＤＮＡに基づく等温技術には、ＤＮＡポリメラーゼが環状鋳型に方向付けられたプライマーを伸長させるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）(Fire A and Xu SQ. 「短いサークルのローリング複製」 PNAS 92: 4641-4645 (1995))、標的検出用に環状プローブを用いる分岐増幅（ＲＡＭ）(Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, lsenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. 「等温分岐増幅法によるトラコーマクラミジアの検出：フィージビリティ・スタディ」 J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(1): 128-32.)およびより最近では、熱の代わりにヘリカーゼを用いてＤＮＡ鎖を巻き戻すヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）(Vincent M, Xu Y, Kong H. 「ヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅」 EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800.) が含まれる。

最近、ＤＮＡ増幅の等温法についての記載がなされてきている（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D.「制限酵素／DNAポリメラーゼ系によるｉｎｖｉｔｒｏでのＤＮＡの等温増幅」 PNAS 89: 392-396 (1992))。従来の増幅技術は、標的分子の変性および再生のサイクルを増幅反応の各サイクルで継続させることに依存している。ＤＮＡの熱処理によってある程度のＤＮＡ分子の剪断が生じることから、ＤＮＡが例えば発達中の胚細胞由来の少数の細胞からのＤＮＡの単離など限定的である場合、または特にＤＮＡが既に組織切片、パラフィンブロックおよび古いＤＮＡ試料などの断片化形態である場合、この加熱−冷却サイクルによってＤＮＡがさらに損傷を受け、かつ増幅シグナルの低下がもたらされる可能性がある。等温法は、さらなる増幅から得られる鋳型として働く一本鎖分子を生成するための鋳型ＤＮＡの継続する変性に依存するのではなく、一定温度での特異的制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分子の酵素によるニッキングに依存する。

鎖置換増幅（ＳＤＡ）と称される技術は、特定の制限酵素における半修飾ＤＮＡの未修飾鎖をニッキングする能力および５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼにおける下流の鎖に対する延長能および置換能に依存する。次いで、センス反応からの鎖置換がアンチセンス反応のための鋳型としての働きをする、センスおよびアンチセンス反応を連結することにより、指数関数的増幅が行われる(Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D.「制限酵素／DNAポリメラーゼ系によるｉｎｖｉｔｒｏでのＤＮＡの等温増幅」 PNAS 89: 392-396 (1992))。かかる技術は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D.「制限酵素／DNAポリメラーゼ系によるｉｎｖｉｔｒｏでのＤＮＡの等温増幅」 PNAS 89: 392-396 (1992), 「ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎およびＨＰＶ−１６」 Nuovo G. J., 2000）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Spears PA, Linn P, Woodard DL and Walker GT. 「トラコーマクラミジアの同時鎖置換増幅および蛍光偏光検出」 Anal. Biochem. 247: 130-137 (1997))の増幅の成功のために用いられている。

これまでＳＤＡの使用は、修飾鎖上であれば酵素切断に抵抗性を示すヘミホスホロチオエートＤＮＡ二本鎖を生成するため、ホスホロチオエートヌクレオチドの修飾に依存しており、消化ではなく酵素によるニッキングが生じ置換反応が促進される。しかし最近になり、数種類の「ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）」酵素の設計が行われている。これらの酵素は、従来の様式でＤＮＡを切断することなく、一方のＤＮＡ鎖上にニックを生じさせる。「ニッカーゼ」酵素は、Ｎ．Ａｌｗ１(Xu Y, Lunnen KD and Kong H. 「ドメインスワッピングによるニッキングエンドヌクレアーゼＮ．ＡｌｗＩの設計」 PNAS 98: 12990-12995 (2001))、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ(Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. 「制限エンドヌクレアーゼの特異的ＤＮＡニッキング活性の特徴づけ」 N.BstNBI. Biol Chem. 2000 Nov;381 (11 ):1123-5.)およびＭｌｙ１(Besnier CE, Kong H. 「Ｍｌｙ１エンドヌクレアーゼのオリゴマー形成状態を変化させることによるニッキング酵素への変換」 EMBO Rep. 2001 Sep;2(9):782-6. Epub 2001 Aug 23)を含む。したがって、かかる酵素を使用すれば、ＳＤＡ法が簡素化されることになる。

さらに、熱安定性を示す制限酵素（Ａｖａ１）と熱安定性を示すＥｘｏ−ポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）の併用によってＳＤＡは改良されている。この併用により、この技術を用いて特有の単一の複製分子が増幅されうるように、１０^８倍の増幅から１０^１０倍の増幅へ反応の増幅効率が高まることが判明している。熱安定性を示すポリメラーゼ／酵素の併用の結果得られる増幅因子は約１０^９である(Milla M. A., Spears P. A., Pearson R. E. and Walker G. T. 「鎖置換増幅における制限酵素Ａｖａ１およびＥｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼの使用」 Biotechniques 1997 24:392- 396)。

これまであらゆる等温ＤＮＡ増幅技術は、初期の二本鎖鋳型ＤＮＡ分子が増幅の開始に先立ち変性されることを必要とする。さらに、増幅は各プライミング事象から１回開始されるのみである。

直接検出のため、標的核酸は、最も一般的には、標的配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーション（サザンおよびノーザンブロッティング）に先立ち、ゲル電気泳動によるサイズを基準に分離され、固体支持体に移動される。プローブは、天然核酸あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）または固定化核酸（ＬＮＡ）またはインターカレーティング核酸（ＩＮＡ）などの類似体でありうる。プローブは、（例えば^３２Ｐで）間接標識されるかまたは直接検出法が用いられる場合がある。間接法は通常、ビオチンもしくはジゴキシゲニンなどの「タグ」のプローブへの取り込みに依存し、次いでプローブは酵素結合性の基質変換または化学発光などの手段によって検出される。

広く用いられている核酸の直接検出のための別の方法は「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブが固体支持体に連結され、溶液中の標的核酸が結合プローブとハイブリダイズする。結合していない標的核酸が洗い流され、結合した核酸が標的配列にハイブリダイズする第２のプローブを使用して検出される。検出には上で概説したように直接法または間接法を用いることができる。かかる方法の例として、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を用いる例である「分岐ＤＮＡ」シグナル検出系が挙げられる(1991, Urdea, M. S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 24,197-200)。核酸配列の直接検出を目的として核酸ハイブリダイゼーションを用いる急成長分野は、ＤＮＡマイクロアレイ分野である(2002, Nature Genetics, 32, [Supplement]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendall, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544)。このプロセスでは、短いオリゴヌクレオチド（典型的にはアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）システムにおける２５−ｍｅｒｓ）からより長いオリゴヌクレオチド（典型的にはアプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）のプラットフォームにおける６０−ｍｅｒｓ）や、ｃＤＮＡクローンなどのさらにより長い配列に及ぶ範囲でありうる個々の核酸種が、固体支持体に格子パターンで固定されるかあるいは固体支持体上にフォトリソグラフィー的に合成される。次いで、タグが付加されるかまたは標識された核酸集団がアレイとハイブリダイズし、アレイ内の各スポットとのハイブリダイゼーションのレベルが定量化される。化学発光などの他の検出系の使用が可能であるが、最も一般的には、ハイブリダイゼーションにおいて放射性標識または蛍光標識された核酸（例えばｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ）が使用される。

核酸配列の直接検出を目的として核酸ハイブリダイゼーションを用いる急成長分野はＤＮＡマイクロアレイである(Young RA 「DNAアレイによる生物医学的発見」 Cell 102: 9-15 (2000); Watson 「新ツール：新型ハイテク捜査」 Science 289:850-854 (2000))。このプロセスでは、オリゴヌクレオチドから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンなどのより長い配列に及ぶ範囲でありうる個々の核酸種が固体支持体に格子パターンで固定される。次いで、タグが付加されるかまたは標識された核酸集団がアレイとハイブリダイズし、アレイ内の各スポットのハイブリダイゼーションのレベルが定量化される。他の検出系が用いられたが、最も一般的には、ハイブリダイゼーションにおいて放射性標識または蛍光標識された核酸（例えばｃＤＮＡ）が使用された。

細菌、酵母および真菌などの微生物を検出するための従来の方法は、選択的な栄養培地上での微生物の培養と、それに続く、従来の光学顕微鏡下で見られる、大きさ、形状、胞子生成、生化学または酵素反応などの特徴および（グラム染色などの）特異的染色特性に基づく微生物の分類を含む。ウイルス種は、分化した組織または細胞内で成長し、次いで電子顕微鏡によって判定されたそれらの構造と大きさに基づいて分類する必要がある。かかる技術の主な欠点は、かかるアプローチの有用性を制限する従来の培養または細胞条件下で成長するのは微生物のすべてではないという点である。例えば髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびインフルエンザ桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（全部が髄膜炎を誘発し、それらの中で髄膜炎菌は髄膜炎と劇症髄膜炎菌血症のいずれも誘発する）などの細菌の場合、３つの種全部は培養することが困難である。最大７日間にわたり毎日定期的に血液培養ボトルが検査され、継代培養が必要とされる。インフルエンザ桿菌は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとヘミンの双方を含有する特定の培地およびチョコレート寒天プレート上での成長を必要とする。血液培養物は、トリプチカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅｓｏｙｂｒｏｔｈ）または脳心臓浸出物（ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎ）およびポリアネトールスルホン酸ナトリウムなどの様々な添加物の添加を必要とする。重度の食中毒およびフロッピーベビー症候群を誘発するボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）などの微生物における毒素の同定には、食物抽出物または培養上清のマウスへの注射および２日後での結果の可視化が含まれる。さらに、特定の培地上での潜在的な微生物の培養には１週間かかる。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシン（食中毒ならびに皮膚感染、血液感染、肺炎、骨髄炎、関節炎および脳膿瘍の原因）は、イオン交換樹脂を介する毒素の選択的吸収またはモノクローナル抗体を用いた逆受身ラテックス凝集（ＲｅｖｅｒｓｅＰａｓｓｉｖｅＬａｔｅｘＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）によって微量に検出される。それに対し、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）は血液感染をもたらし、病院内の機器や床・壁・天井（ｓｕｒｆａｃｅｓ）および医療設備や医療器具を汚染する。

非ウイルス微生物についても、グルコース、マルトースまたはスクロースなどの基質上での発酵反応の間での特異的アミノ酸または代謝産物の産生などのそれらの代謝特性に基づく分類が可能である。あるいは、微生物では抗生物質に対するそれらの感受性に基づく分類が可能である。細胞表面抗原に対する特異的抗体または毒素などの排泄タンパク質を使用しても微生物が同定または分類される。しかし、上記方法はいずれも、後の試験に先立つ微生物の培養に左右される。微生物の培養は高価で多大な時間を要し、選好性が低めの微生物による汚染または過成長を被る可能性もある。これらの技術はまた、確定診断に達するために同じ試料に対して多数の試験を行う必要がある点であまり洗練されているとはいえない。大部分の微生物は既知の培地内では容易に成長できず、それ故に微生物の異種の典型的な混合集団が野生でまたはより高等な生物に随伴して存在する場合には検出レベルを下回る。

病原微生物を検出および同定するための他の方法は、微生物による感染に応答して抗体が産生されるという血清学的アプローチに基づく。例えば髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）は、それらの莢膜多糖類における構造的な違いに基づいて分類可能である。これらは異なる抗原性を有し、５つの主な血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５）の判定を可能にする。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、かかる抗体の産生を評価可能である。これらの方法はいずれも、感染の過程において宿主動物によって産生される特異的抗体の存在を検出する。これらの方法は、宿主動物によって抗体が産生されるまである程度時間がかかることから非常に早期の感染が見逃されることが多いという欠点を有する。さらに、かかるアッセイを使用しても過去の感染と現在の（ａｃｔｉｖｅ）感染を確実に区別することはできない。

より最近では、感染疾患の診断における分子法の使用に多大な関心が寄せられている。これらの方法は、病原微生物の高感度かつ特異的な検出を提供する。かかる方法の例として、「分岐ＤＮＡ」シグナル検出系が挙げられる。この方法は、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を使用する例である(Urdea MS et al. 「ヒトＨＩＶおよび肝炎ウイルスの高感度な直接検出のための分岐ＤＮＡ増幅多量体」 Nucleic Acids Symp Ser. 1991 ;(24):197-200)。

細菌を検出および分類するための別の方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ配列の増幅である。１６ＳｒＲＮＡは、種々の臨床または環境試料中での細菌種の検出を目的としたＰＣＲ増幅アッセイにおける使用に適する標的であることが報じられており、かつ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が種特異的な多型性を示すことから様々な特異的微生物を同定するのに使用されていることが多い（Cloud, J. L., H. Neal, R. Rosenberry, C. Y. Turenne, M. Jama, D. R. Hillyard, and K. C. Carroll. 2002. J. Clin. Microbiol. 40:400-406）。しかし、細菌の純粋培養が必要とされ、試料はＰＣＲ増幅後にさらに配列決定されるかまたは種の判定のためにマイクロアレイ型デバイスにハイブリダイズされる必要がある（Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H, Nagai H, lto K, Kawaguchi R. J Clin Microbiol. 2003 Jun; 41(6):2605-15）。かかる方法は高価であり、多大な時間や労力を要する。

本発明者らは、任意の微生物種を対象とした一般的検出または初期スクリーニングアッセイに適合しうる、微生物を検出するための新たな方法を開発している。

発明の開示
一般的な態様では、本発明は、シトシンを修飾する作用物質で微生物核酸を処理し、かつ処理された核酸を増幅することでゲノムまたは核酸の簡素化（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ）形態を生成することにより、微生物ゲノムまたは核酸の塩基構成の複雑さを低減することに関する。

第１の態様では、本発明は、
シトシンを修飾する作用物質で微生物ゲノムまたは核酸を処理し、微生物核酸誘導体を形成する工程と、
微生物核酸誘導体を増幅することで微生物ゲノムまたは核酸の簡素化形態を生成する工程と、
を含む、微生物ゲノムまたは微生物核酸を簡素化するための方法を提供する。

第２の態様では、本発明は、
シトシンを修飾する作用物質で微生物由来のＤＮＡを含有する試料を処理し、微生物核酸誘導体を形成する工程と、
微生物核酸誘導体の少なくとも一部を増幅することで、対応する未処理の微生物核酸と比べてシトシンの総数が低下している、微生物または微生物型に特異的な核酸配列を含む簡素化された核酸分子を形成する工程と、
を含む、微生物に特異的な核酸分子を生成するための方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、
微生物からＤＮＡ配列を得る工程と、
実質的にアデニン、グアニンおよびチミンの塩基を有するように、各シトシンをチミンに変化させることによって微生物ＤＮＡ配列の変換を行うことにより、微生物ＤＮＡ配列の簡素化形態を形成する工程と、
微生物ＤＮＡの簡素化形態から微生物に特異的な核酸分子を選択する工程と、
を含む、微生物に特異的な核酸分子を生成するための方法を提供する。

第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載の方法によって得られる、微生物に特異的な核酸分子を提供する。

第５の態様では、本発明は、試験もしくはアッセイにおいて微生物に特異的な核酸分子に結合または該核酸分子を増幅するためのプローブあるいはプライマーを得ることを目的とした本発明の第３の態様に記載の方法の使用を提供する。

第６の態様では、本発明は本発明の第５の態様によって得られるプローブまたはプライマーを提供する。

第７の態様では、本発明は、試料中での微生物の存在を検出するための方法であって、
微生物を含有すると見られる試料から微生物ＤＮＡを得る工程と、
シトシンを修飾する作用物質によって微生物核酸を処理し、微生物核酸誘導体を形成する工程と、
所望の微生物に特異的な核酸分子の微生物核酸誘導体への増幅を可能にする能力を有するプライマーを提供する工程と、
微生物核酸誘導体に対して増幅反応を行うことで簡素化された核酸を形成する工程と、
所望の微生物に特異的な核酸分子を有する増幅核酸産物の存在についてアッセイし、所望の微生物に特異的な核酸分子の検出が試料中での微生物の存在を示す工程と、
を含む、方法を提供する。

ゲノムまたは微生物核酸がＤＮＡである場合、それを処理することでＤＮＡ誘導体を形成可能であり、次いで増幅することでＤＮＡの簡素化形態が形成される。

ゲノムまたは微生物核酸がＲＮＡである場合、微生物ゲノムまたは核酸の処理に先立ちそれをＤＮＡに変換してもよい。あるいは、微生物ＲＮＡを処理してＲＮＡ誘導体分子を生成してもよく、次いでそれは増幅に先立ちＤＮＡ誘導体分子に変換される。ＲＮＡからＤＮＡへの変換方法は周知であり、ｃＤＮＡを形成するための逆転写酵素の使用を含む。

微生物ゲノムまたは核酸を、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻、原生動物、スピロヘータ、または単細胞生物から入手してもよい。

微生物ゲノムまたは核酸を、タンパク質をコードする核酸、タンパク質をコードしない核酸、原核生物または単細胞真核微生物のリボソーム遺伝子領域から選択してもよい。好ましくは、リボソーム遺伝子領域は、原核生物における１６Ｓまたは２３Ｓおよび単細胞真核微生物の場合の１８Ｓおよび２８Ｓである。作用物質を、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択してもよい。好ましくは、作用物質は重亜硫酸ナトリウムである。

好ましくは、作用物質は、非相補的微生物核酸分子ではなく、２つの誘導体を形成する相補的二本鎖の微生物ゲノムＤＮＡの各鎖内でシトシンをウラシルに修飾する。好ましい形態では、シトシンは典型的には微生物核酸内で見られるようにメチル化されていない。

好ましくは、微生物核酸誘導体におけるシトシンの総数が対応する未処理の微生物ゲノムまたは核酸と比べて低下している。

好ましくは、微生物ゲノムまたは核酸の簡素化形態におけるシトシンの総数が対応する未処理の微生物ゲノムまたは核酸と比べて低下している。

好ましい一形態では、微生物核酸誘導体は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の塩基を実質的に有し、かつ対応する未処理の微生物ゲノムまたは核酸と実質的に総数が同じ塩基を有する。

別の好ましい形態では、微生物ゲノムまたは核酸の簡素化形態は、実質的にアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）の塩基からなる。

好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、またはシグナル増幅などの任意の適切な手段によって行われる。

本発明の第２の態様に記載の方法は、微生物に特異的な核酸分子を検出する工程をさらに含みうる。

好ましい形態では、微生物に特異的な核酸分子は、
微生物に特異的な核酸分子の標的領域に対する結合能を有する検出リガンドを提供し、かつ検出リガンドが標的領域に結合するのに十分な時間を与える工程と、
検出リガンドの標的領域に対する結合を測定し、微生物に特異的な核酸分子の存在を検出する工程と、
によって検出される。

別の好ましい形態では、微生物に特異的な核酸分子は、増幅産物を分離しかつ分離産物を可視化することによって検出される。好ましくは、増幅産物は電気泳動によって分離され、ゲル上の１つもしくは複数のバンドを可視化することによって検出される。

好ましくは、微生物に特異的な核酸分子は微生物内で自然発生しない。

好ましい形態では、微生物に特異的な核酸分子は、微生物の分類レベルを示す核酸配列を有する。微生物の分類レベルは、科、属、種、株、タイプ、あるいは同じもしくは異なる地理的集団または底生性集団由来の異なる集団を含むがこれらに限定されない。

本発明の第３の態様に記載の方法の好ましい形態では、２種以上の微生物ＤＮＡ配列の簡素化形態が得られ、かつ少なくとも１種の微生物に特異的な核酸分子を得るために２種以上の配列が比較される。

本発明の第７の態様の好ましい形態では、核酸分子は、
微生物に特異的な核酸分子の領域に対する結合能を有する検出リガンドを提供し、かつ検出リガンドが領域に結合するのに十分な時間を与える工程と、
検出リガンドの核酸分子に対する結合を測定し、核酸分子の存在を検出する工程と、
によって検出される。

別の好ましい形態では、核酸分子は、増幅産物を分離しかつ分離産物を可視化することによって検出される。

微生物がＤＮＡゲノムまたは微生物ゲノムを有しないかまたは核酸がＲＮＡ、例えばＲＮＡウイルスである場合には、ＤＮＡを作用物質で処理することを目的に、まずＲＮＡウイルスゲノムをｃＤＮＡに変換してもよい。ＲＮＡを処理することも可能であり、増幅に先立ちＲＮＡ誘導体がＤＮＡに変換される。

好ましくは、核酸誘導体はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）の塩基を実質的に有し、かつ対応する未修飾の微生物核酸と実質的に総数が同じ塩基を有する。重要なことには、核酸誘導体分子は、微生物ＤＮＡが任意のシトシン（Ｃ）にてメチル化されなかったことを前提として実質的にシトシンを有しない。

好ましくは、増幅された核酸誘導体はＡ、ＴおよびＧの塩基を実質的に有し、かつ対応する核酸誘導体（および未修飾の微生物核酸）と実質的に総数が同じ塩基を有する。増幅された核酸誘導体は簡素化された核酸と称される。

好ましい形態では、微生物に特異的な核酸分子は微生物の分類レベルを示す核酸配列を有する。微生物の分類レベルは、科、属、種、株、タイプ、あるいは同じもしくは異なる地理的集団または底生性集団由来の異なる集団を含みうる。細菌の場合、発明者らは、細菌、プロテオバクテリア；ベータプロテオバクテリア；ナイセリア目（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）；ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）；ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）などの一般に認められたスキーマに従うことができる。異なる集団は、微生物内部の細胞内形態（プラスミドもしくはファージミド）または病原性島などの微生物ゲノムの多形性の染色体領域内に存在するＤＮＡ分子内に存在する単一のヌクレオチド変化または変異に対して多形性を示しうる。

本発明を用いて微生物およびウイルスゲノムの流動性を認識することも可能であり、かつ独立要素でありうるウイルスゲノムのキメラ性を認識することが可能であることから、新規に生じる株は、異なる動物由来のゲノム領域を再び類別することから生じる。例えば、他の哺乳類または鳥ウイルスゲノムから採取されるセグメントのキメラとしての新たなヒトインフルエンザ株が挙げられる。

方法を微生物の既知の核酸配列からｉｎｓｉｌｉｃｏで実施することが可能であり、元の配列内の１個もしくは複数個のシトシンがチミンに変換されて簡素化された核酸が得られることは理解されるであろう。変換された配列から配列同一性の判定が可能である。かかるｉｎｓｉｌｉｃｏにおける方法は処理および増幅工程を再現する。

微生物に特異的な核酸分子がこの方法によって任意の所定の微生物において得られている場合、プローブまたはプライマーを増幅反応における対象領域の増幅を保証するように設計してもよい。したがって、プローブまたはプライマーが設計されている場合、試料に対して臨床的または科学的アッセイを実施することで、所定の分類レベルで所定の微生物を検出することが可能になろう。

微生物に特異的な核酸分子は特有であるかまたは分類レベル内で高い類似性を有する可能性がある。本発明の１つの利点は、例えば、配列類似性が高い１個もしくは複数個の分子に対し、微生物の分類レベル間または分類レベル内での潜在的な塩基の相違を著しく簡素化できる点である。特異的プライマーまたは数が減少した変性プライマーを使用して所定の試料中の微生物に特異的な核酸分子を増幅してもよい。

シトシンを有する二本鎖ＤＮＡにおいて、処理工程により２個の核酸誘導体（各相補鎖に対して１個）が生成され、それぞれはアデニン、グアニン、チミンおよびウラシルの塩基を有する。２個の核酸誘導体は、二本鎖ＤＮＡの２本の一本鎖から生成される。２個の核酸誘導体は、好ましくはシトシンを全く有しないが、依然として元の未処理のＤＮＡ分子と同じ塩基の総数および配列長を有する。重要なことには、２個の核酸誘導体は互いに相補的でなく、増幅における上鎖および下鎖の鋳型を形成する。１本もしくは複数本の鎖を増幅における標的として用いることで簡素化された核酸分子の生成が可能である。核酸誘導体の増幅の間、核酸の対応する増幅された簡素化形態において上部鎖（または下鎖）内のウラシルがチミンによって置換される。増幅が継続するにつれて、新たな各相補鎖がアデニン、グアニン、チミンの塩基のみを有するようになることから上鎖（および／またはもし増幅される場合に下鎖）が希釈されることになる。

本発明のこの態様が、微生物に特異的な核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、および好ましくは厳しい条件下で微生物に特異的な核酸分子にハイブリダイズ可能な核酸分子も含むことが理解されるであろう。

本発明では、任意の微生物が所定の試料中に存在するか否かを判定するのに使用可能な、代表的な微生物型を示すプローブまたはプライマーを使用してもよい。さらに、微生物型に特異的なプローブを使用し、微生物の所定のタイプ、サブタイプ、変異体および遺伝子型の例を実際に検出するかまたは同定することが可能である。

任意の所定の微生物において微生物に特異的な核酸分子が得られているかまたは同定されている場合、プローブまたはプライマーを増幅反応における対象領域の増幅を保証するように設計してもよい。処理または変換によって配列の非対称性がもたらされることから、プライマー設計を目的とする、処理によって変換されたゲノム（以降、「核酸誘導体」と称される）の両鎖を分析可能であることに注目することは重要であり、それ故に同一遺伝子座の「上」鎖および「下」鎖（「ワトソン」鎖および「クリック」鎖としても知られる）の検出にとって異なるプライマー配列が必要とされる。したがって、変換直後に存在するものとしての変換されたゲノムである２つの分子集団および核酸誘導体が従来の酵素学的手段（ＰＣＲ）または等温増幅などの方法によって複製された後に生じる分子集団が存在する。プライマーは典型的には便宜上、変換された上鎖に対して設計されるが、下鎖に対してもプライマーを作製してもよい。したがって、試料に対して臨床的または科学的アッセイを実施することで所定の微生物を検出することが可能になろう。

核酸誘導体の特異的領域の増幅を可能にするようにプライマーまたはプローブを設計してもよい。好ましい形態では、プライマーは微生物に特異的な核酸分子の増幅をもたらす。

第７の態様では、本発明は、増幅反応のための１種もしくは複数種の試薬または成分とともに本発明の第５の態様に記載のプライマーまたはプローブを含む、微生物に特異的な核酸分子を検出するためのキットを提供する。

好ましくは、微生物は、Kingdom Protoctista by Margulis, L., et al 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston USAなど、いかに様々に分類されようと、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻、原生動物、スピロヘータ、単細胞生物、または任意の他の微生物、あるいはHarrisons Principles of Internal Medicine, 12^th Edition, edited by J D Wilson et al., McGraw Hill Incおよび後版で定義されたヒトに随伴する微生物から選択される。それは、ＯＭＩＭ、Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.govにおいて定義されたヒトの状態と関連して記載されたすべての微生物も含む。

微生物は、細胞内外で成熟もしくは胞子形態である、またはキメラ生物形態に関連する、または苔癬に関連した微生物または細菌膜に関連した微生物などの２種以上の生物形態の間で外部片利共生的に（ｅｃｔｏｃｏｍｍｅｎｓａｌｌｙ）存在する、病原体、自然発生的な環境試料、水生生物または空中浮遊生物（または液体または気体媒体中で存在するかもしくは運搬される生物）でありうる。

ＲＮＡウイルスまたはウイロイドの存在については、まずそれらのＲＮＡゲノムを逆転写によってｃＤＮＡ形態に変換し、次いで試薬によってｃＤＮＡを修飾することにより、アッセイすることが可能である。これにより、ＲＮＡウイルス中のシトシンに生じる任意のメチル化の問題が、逆転写酵素がそれらを正常なシトシンであるかの如く複製する際に克服される。

好ましくは、作用物質は非メチル化シトシンをウラシルに修飾し、次いでウラシルは核酸誘導体の増幅の間にチミンと置換される。好ましくは、シトシンを修飾するために使用される作用物質は重亜硫酸ナトリウムである。本発明の方法では、メチル化シトシンではなく、非メチル化シトシンを同様に修飾する他の作用物質もまた使用してもよい。例として、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、作用物質は、水の存在下でシトシンをウラシルに修飾する試薬である重亜硫酸ナトリウムである。

重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応して脱アミノ化を受けやすいスルホン化されたシトシン反応中間体を形成し、水の存在下でウラシルサルファイト（ｕｒａｃｉｌｓｕｌｆｉｔｅ）を生成する。必要であれば、亜硫酸基を弱アルカリ性の条件下で除去する結果としてウラシルを形成してもよい。したがって、可能性としてはすべてのシトシンがウラシルに変換されることになる。しかし、メチル化による保護に起因する試薬の修飾により、どのメチル化シトシンをも変換することはできない。

本発明を、同一細菌種の分離株間の膨大な想定外のゲノム変異によって明らかになる発生する問題の一部の回避に役立つように適合させてもよい（2005, Tettelin , H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 13950-13955;「ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalacticiae）の複数の病原性分離株のゲノム分析:微生物“全ゲノム（pan-genome）”の意味するもの」）。この細菌種のすべての分離株は、約８０％の遺伝子プールに加え、部分的に共有されかつ株特異的タンパク質をコードする遺伝子からなる可欠ゲノムを示す、タンパク質をコードする遺伝子の「コア」ゲノムを有する。本発明に記載の方法によって細菌集団内に存在する２３Ｓ遺伝子を処理することにより、発明者らは、すべての細菌分離株内に存在するタンパク質をコードしないコア成分を扱うことができる。

本発明は、まず生物が属する一般集団を決定することを目的とし、種レベルを超えるまたは種レベルでの初期の同一性が有用である場合での微生物についての臨床、環境、法医学、生物戦、または科学的アッセイに適する。例として、任意の生物における疾患（脊椎動物、無脊椎動物、原核または真核細胞、例えば植物および家畜の疾患、養魚場およびカキ養殖場などのヒトの食料源での疾患）の診断、スクリーニングあるいは体外受精診療施設内でのヒト胚細胞の産生もしくは動物飼育における細胞培養物または体外受精卵の汚染について判定する、自然または汚染状態である環境源のサンプリングが挙げられる。法医学的状況または生物戦に関連した微生物の検出は特に重要である。

本明細書全体を通し、もし文脈上、別の意味を必要としない場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられる要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を含むだけでなく、任意の要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を除外しないことを意味することが理解されるであろう。

本明細書中に含められている文書、行為、材料、デバイス、記事などに関するいずれの説明も、専ら本発明に対する文脈をもたらすことを目的とするものである。これらの事項のいずれかまたはすべてが、先行技術基盤の一部を形成しているとか、あるいは本発明の構築に先立ちオーストラリア内に存在したかのように本発明に関する分野における共通の一般的知識であったという承認として解釈されるべきものではない。

本発明がより明確に理解されうるように、好ましい実施形態が以下の図面および実施例と関連して記載されることになる。

本発明を実施するための形態
定義
本明細書において用いられる「ゲノムの簡素化」という用語は、ゲノム（または他の）核酸が４つの塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）からなる状態から修飾されることで、実質的に塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）を有するがやはり実質的に総数が同じ塩基を有することを意味する。

本明細書において用いられる「核酸誘導体」という用語は、塩基のＡ、Ｇ、ＴおよびＵ（または何らかの他の非Ａ、非Ｇもしくは非Ｔ塩基または塩基様実体（ｂａｓｅ−ｌｉｋｅｅｎｔｉｔｙ））を実質的に有し、かつ対応する未修飾の微生物核酸と実質的に総数が同じ塩基を有する核酸を意味する。微生物ＤＮＡ内の実質的にすべてのシトシンが、作用物質による処理の間、ウラシルに変換されていることになる。例えばメチル化などにより改変されたシトシンが必ずしもウラシル（または何らかの他の非Ａ、非Ｇもしくは非Ｔ塩基または塩基様実体）に変換されない場合があることは理解されるであろう。微生物核酸が典型的にはメチル化シトシン（または他のシトシン改変物）を有しないことから、処理工程では好ましくはすべてのシトシンが変換される。好ましくは、シトシンはウラシルに修飾される。

本明細書において用いられる「簡素化された核酸」という用語は、核酸誘導体の増幅後に結果的に得られる核酸産物を意味する。次いで、核酸誘導体内のウラシルは核酸誘導体の増幅の間にチミン（Ｔ）と置換されて簡素化された核酸分子が形成される。結果産物は、対応する未修飾の微生物核酸と実質的に総数が同じ塩基を有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組み合わせから構成される。

本明細書において用いられる「簡素化配列」という用語は、核酸誘導体を増幅して簡素化された核酸が形成された後に結果的に得られる核酸配列を意味する。得られる簡素化配列は、対応する未修飾の微生物核酸配列と実質的に総数が同じ塩基を有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、ＧおよびＴ）の組み合わせから構成される。

本明細書において用いられる「変換されていない配列」という用語は、処理および増幅に先立つ微生物核酸の核酸配列を意味する。変換されていない配列は、典型的には自然発生的な微生物核酸配列である。

本明細書において用いられる「修飾する」という用語は、シトシンの別のヌクレオチドへの変換を意味する。好ましくは、作用物質は非メチル化シトシンをウラシルに修飾し、核酸誘導体を形成する。

本明細書において用いられる「シトシンを修飾する作用物質」という用語は、シトシンを別の化学物質に変換する能力がある作用物質を意味する。好ましくは、作用物質は、シトシンをウラシルに修飾し、次いでウラシルは核酸誘導体の増幅の間にチミンと置換される。好ましくは、シトシンを修飾するために使用される作用物質は重亜硫酸ナトリウムである。メチル化シトシンではなく、シトシンを同様に修飾する他の作用物質もまた本発明の方法において使用してもよい。例として、重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、作用物質は、酸性の水性条件の存在下でシトシンをウラシルに修飾する試薬の重亜硫酸ナトリウムである。重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応して脱アミノ化の作用を受けやすいスルホン化されたシトシン反応中間体を形成し、水の存在下でウラシルサルファイトを生成する。必要であれば、亜硫酸基を弱アルカリ性の条件下で除去する結果としてウラシルを形成してもよい。したがって、可能性としてはすべてのシトシンがウラシルに変換されることになる。しかし、メチル化による保護に起因する試薬の修飾により、あらゆるメチル化シトシンを変換することはできない。シトシン（または任意の他の塩基）を、本発明によって教示される核酸誘導体を得るための酵素的手段によるならば修飾可能であることが理解されるであろう。

核酸内塩基に対する化学的および酵素的修飾を可能にするのに、２つの幅広い一般的方法がある。したがって、天然酵素あるいはいまだ報じられていない人工的に構築されるかまたは選択される酵素により、本発明の修飾を行ってもよい。重亜硫酸塩の方法論などの化学的処理により、適切な化学的工程を介してシトシンをウラシルに変換してもよい。同様に、例えばシトシンデアミナーゼが変換を行うことで核酸誘導体を形成しうる。発明者らの知見によると、シトシンデアミナーゼに関する最初の報告は1932, Schmidt, G., Z. physiol. Chem., 208, 185である（1950, Wang, T.P., Sable, H.Z., Lampen, J.O., J. Biol. Chem, 184, 17-28,「シトシンヌクレオチドの酵素による脱アミノ化」も参照）。この初期の研究では、他のヌクレオ−デアミナーゼなしにシトシンデアミナーゼは得られなかったが、ワン（Ｗａｎｇ）らは酵母および大腸菌からかかる活性を精製することができた。したがって、シトシンの任意の酵素的変換によって核酸誘導体が形成され、最終的にシトシンとは異なる塩基の挿入がその位置での次の複製の間にもたらされ、簡素化されたゲノムが生成されることになる。誘導体とそれに続く簡素化されたゲノムを生成するための化学的および酵素的変換は、微生物の自然発生的な核酸内のプリンであれピリミジンであれ任意のヌクレオ塩基に適用可能である。

本明細書において用いられる「ゲノムまたは核酸の簡素化形態」という用語は、自然発生であれ合成であれ、通常４つの共通の塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣを有するゲノムまたは核酸が、ゲノム内のＣの大部分もしくはすべてが適切な化学修飾およびそれに続く増幅手順によってＴに変換されていることからこの段階では主に３つの塩基Ｇ、ＡおよびＴのみからなることを意味する。ゲノムの簡素化形態は、相対的なゲノムの複雑さが４つの塩基の基盤から３つの塩基組成物に向けて低減されることを意味する。

本明細書において用いられる「塩基様実体（ｂａｓｅ−ｌｉｋｅｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、シトシンの修飾によって形成される実体を意味する。塩基様実体は、核酸誘導体の増幅の間にＤＮＡポリメラーゼによって認識可能であり、ポリメラーゼにより、Ａ、ＧまたはＴが核酸誘導体内の塩基様実体の対向位置にある新たに形成された相補的ＤＮＡ鎖上に配置される。典型的には、塩基様実体は、対応する未処理の微生物核酸内のシトシンから修飾を受けているウラシルである。塩基様実体の例として、プリンであれピリミジンであれ、任意のヌクレオ塩基が挙げられる。

本明細書において用いられる「相対的な複雑さの低減」という用語は、プローブ長、すなわち同じ大きさの２つのゲノムにおいて、第１のゲノムが「変化しない状態」であって４つの塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣからなる一方、第２のゲノムが正確に同じ長さであっても一部のシトシン（望ましくはすべてのシトシン）がチミンに変換されている場合の所定の一まとまりの分子条件下における、特異的遺伝子座に対するプローブのハイブリダイゼーションの同じ特異性およびレベルを得るのに必要な平均プローブ長の増加に関する。試験される遺伝子座は、元の変換されていないゲノムおよび変換されたゲノムにおける同じ位置に存在する。平均で１１−ｍｅｒプローブが、４つの塩基Ｇ、Ａ、ＴおよびＣからなる４，１９４，３０４（４^１１が４，１９４，３０４に相当）個の塩基の正規のゲノム内で完全にハイブリダイズする特有の位置を有することになる。しかし、一旦４，１９４，３０４個の塩基のかかる正規のゲノムが重亜硫酸塩または他の適切な手段によって変換されていると、この段階ではこの変換されたゲノムは３つの塩基のみからなり、明らかに複雑さが低減される。しかし、ゲノムの複雑さにおけるこの低減の結果として、かつて発明者ら独自のものであった１１−ｍｅｒのプローブが簡素化されたゲノム内でハイブリダイズ可能である特有の部位をもはや有しないということである。この段階では、重亜硫酸塩変換の結果として新規に生じている１１個の塩基配列からなる多数の他の相当位置が存在する可能性がある。ここでは、元の遺伝子座を見出しかつハイブリダイズするのに１４−ｍｅｒのプローブが必要になる。当初、それが直感に反するように見られるかもしれないが、より多くのゲノムが同様と見られる（より類似した配列を有する）ことから、この段階で簡素化された３つの塩基からなるゲノムにおける元の位置を検出するのにプローブ長の増加が必要である。したがって、相対的なゲノムの複雑さの低減（または３つの塩基からなるゲノムの簡素さ）とは、元の特有部位を見出すためにより長いプローブを設計する必要があるという意味である。

本明細書において用いられる用語「相対的なゲノムの複雑さの低減」は、未修飾ＤＮＡと比較して微生物に特異性を示すことが可能なプローブ長の増加によって測定されうる。この用語は、微生物の存在を判定するのに用いられるプローブ配列のタイプについても包含する。これらのプローブは、例えばＰＮＡまたはＬＮＡにおける従来とは異なる骨格、あるいは例えばＩＮＡにおいて示された骨格に対して修飾された付加物を有する場合がある。したがって、ゲノムでは、プローブが例えばＩＮＡにおけるインターカレーティングシュードヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇｐｓｅｕｄｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）などの付加成分を有するか否かに無関係に、相対的な複雑さが低減していると考えられる。例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびこれらの混合物やこれらのハブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾物、例えばホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）、ホスホロジチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉａｔｅｓ）、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅｓ）、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅｓ）など（これらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。非天然ヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ザイロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ザイロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、[３．２．１]−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]−ＤＮＡ、ビシクロ[３．２．１]−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内部に含まれるヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。さらに、非リンを含有する化合物を、メチルイミノメチル、ホルムアセテート（ｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、チオホルムアセテート（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）およびアミドを有する連結基などの（これらに限定されない）ヌクレオチドへの連結のために使用することが可能である。特に核酸および核酸類似体は、１つもしくは複数のインターカレーターシュードヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｐｓｅｕｄｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＩＰＮ）を含みうる。ＩＰＮの存在は、核酸分子における複雑さの一部を示すものではなく、例えばＰＮＡにおけるその複雑さの骨格部分でもない。

「ＩＮＡ」とは、本明細書中に参照により援用される国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレットおよび国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（ユネスト（ＵｎｅｓｔＡ／Ｓ））の教示に記載のインターカレーティング核酸を意味する。ＩＮＡは、１種もしくは複数種のインターカレーターシュードヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。

「ＨＮＡ」とは、例えばVan Aetschot et al., 1995に記載の核酸を意味する。

「ＭＮＡ」とは、Hossain et al, 1998に記載の核酸を意味する。

「ＡＮＡ」はAllert et al, 1999に記載の核酸を示す。

「ＬＮＡ」は国際公開第９９／１４２２６号パンフレット（エキシコン（Ｅｘｉｑｏｎ））に記載の任意のＬＮＡ分子でありうる。好ましくは、ＬＮＡは国際公開第９９／１４２２６号パンフレットの要約書中に示された分子から選択される。より好ましくは、ＬＮＡはSingh et al, 1998, Koshkin et al, 1998またはObika et al., 1997に記載の核酸である。

「ＰＮＡ」は、例えばNielsen et al, 1991に記載のペプチド核酸を示す。

本明細書において用いられる「相対的複雑さの低減」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号１）の配列と同じ長さのＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）の配列の間の任意の数学的な複雑さの違いなど、塩基が生じる順序を示すのではなく、相対的ゲノムサイズ（および推定的にはゲノムの複雑さ）を有する元の再連結データを示すものでもない。このことはWaring, M. & Britten R. J.1966, Science, 154, 791-794; and Britten, RJ and Kohne D E., 1968, Science, 161 , 529-540およびそれらの中のCarnegie Institution of Washington Yearbook reportsを出所とする初期の参考文献によって科学論文に紹介されている。

本明細書において用いられる「相対的なゲノムの複雑さ」とは、分子プローブによって接近される、２つのゲノム内の塩基の変化しない位置を示す（元のゲノムと変換されていないゲノムの双方が不変位置の１〜ｎで塩基を有する）。特定のヒト女性の３０億塩基対のハプロイドヒトゲノムの場合、不変位置が１〜ｎ（ｎは３，０００，０００，０００）であると定義される。もし配列１〜ｎにおいてｉ^ｔｈ塩基が元のゲノム内でＣである場合、ｉ^ｔｈ塩基は変換されたゲノム内でＴである。

本明細書において用いられる「ゲノム核酸」という用語は、微生物（原核生物および単細胞真核生物）ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質をコードする核酸、タンパク質をコードしない核酸、ならびに原核生物および単細胞真核微生物のリボソーム遺伝子領域を含む。

本明細書において用いられる「微生物ゲノム」という用語は、染色体および染色体外核酸、ならびにプラスミド、バクテリオファージおよび最も幅広い意味での可動要素などのそのゲノムの一時的寄生物をカバーする。「ゲノム」は、例えばＳ．ｇａｌａｃｔｉａｅのようなコア成分を有するとともに、異なる分離株間で変化するコーディングおよび非コーディング要素を有する可能性がある。

本明細書において用いられる「微生物由来のＤＮＡ」という用語は、微生物から直接的に得られるか、あるいは逆転写酵素など既知であるかまたは適切な方法によって微生物ＲＮＡをＤＮＡに変換することにより間接的に得られるＤＮＡを含む。

本明細書において用いられる「微生物」という用語は、Kingdom Protoctista by Margulis, L., et al 1990, Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Publishers, Boston USAなど、いかに様々に分類されようと、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻、原生動物、スピロヘータ、単細胞生物、または任意の他の微生物を含むか、あるいはHarrisons Principles of Internal Medicine, 12^th Edition, edited by J D Wilson et al., McGraw Hill Incおよび後版で定義されたヒトに関連した微生物を含む。それは、ＯＭＩＭ、Online Mendelian Inheritance in Man, www.ncbi.govにおいて定義されたヒト疾患と関連して記載されたすべての微生物も含む。

本明細書において用いられる「微生物に特異的な核酸分子」という用語は、微生物に特異的な１つもしくは複数の配列を有する、本発明に記載の方法を用いて判定または取得されている分子を意味する。

本明細書において用いられる「微生物の分類レベル」という用語は、同じもしくは異なる地理的集団または底生性集団由来の科、属、種、株、タイプ、または異なる集団を含む。細菌の場合、細菌、プロテオバクテリア；ベータプロテオバクテリア；ナイセリア目；ナイセリア科；ナイセリア属などの一般に認められたスキーマが用いられる。異なる集団は、微生物内部の細胞内形態（プラスミドもしくはファージミド）内、または病原性島などの微生物ゲノムの多形性染色体領域内に存在するＤＮＡ分子内に存在する単一のヌクレオチド変化あるいは変異に対して多形性を示しうる。微生物およびウイルスゲノムの流動性は認識されており、ウイルスゲノムのキメラ性を含み、それは独立した核酸片の状態でありうる。それ故、異なる動物由来のゲノム領域の混ぜ合わせから新たに生じる株として、例えば他の哺乳類または鳥ウイルスゲノムから採取された断片のキメラとしての新たなヒトインフルエンザ株が挙げられる。

本明細書において用いられる「高い配列類似性」という用語は、相対的な配列の複雑さおよび尺度としてのプローブ長に関する上記定義を含む。

材料および方法
ＤＮＡの抽出
一般に、微生物ＤＮＡ（またはウイルスＲＮＡ）は任意の適切な供給源から入手可能である。例として、細胞培養物、培養液、環境試料、臨床試料、体液、液体試料、組織などの固体試料が挙げられるがこれらに限定されない。試料由来の微生物ＤＮＡを標準的手順によって入手可能である。適切な抽出の一例は以下の通りである。目的の試料を、７Ｍ塩酸グアニジン４００μｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭトリス／ＨＣＩｐＨ６．４、１％トリトン−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡの中に置く。試料を１．５ｍｌの使い捨て乳棒で十分に均一化し、６０℃で４８時間放置する。インキュベーション後、試料に対して５回のドライアイスでの凍結／解凍サイクルを５分／９５℃で５分間施す。次いで試料をマイクロチューブ内で２分間回転およびボルテックスし、細胞残屑をペレット化する。上清を無菌チューブ内に移し、希釈して塩濃度を低下させ、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、５０μｌの１０ｍＭトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡに再懸濁する。

特に、（各々の種に特異的な栄養所要量を有する）標準的な寒天プレート上で成長させたグラム陽性およびグラム陰性細菌からのＤＮＡ抽出を以下のように行った。

グラム陰性細菌からのＤＮＡ抽出におけるプロトコルは以下のようであった。
ａ）無菌のトゥースピックを使用し、細菌コロニーを培養プレートから無菌にした１．５ｍｌの遠心管内にこすり落とした。
ｂ）チオシアン酸グアニジン抽出緩衝液（７Ｍチオシアン酸グアニジン、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ７．６、１％トリトン−Ｘ−１００）１８０μｌを添加し、試料を混合して細菌コロニーを再懸濁した。
ｃ）２０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）のプロテイナーゼＫを添加し、試料を十分に混合した。
ｄ）試料を５５℃で３時間インキュベートし、細胞を溶解させた。
ｅ）水２００μｌを各試料に添加し、ゆっくりとしたピペット操作により試料を混合した。
ｆ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを添加し、試料を１５秒間で２回ボルテックスした。
ｇ）次いで、試料をマイクロチューブ内、１４，０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｈ）水相を無菌にした１．５ｍｌの遠心管に移した。
ｉ）フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）４００μｌを添加し、試料を１５秒間で２回ボルテックスした。
ｊ）次いで、試料をマイクロチューブ内、１４，０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｋ）水相を無菌にした１．５ｍｌの遠心管に移した。
ｌ）１００％エタノール８００μｌを各試料に添加し、試料を短時間ボルテックスし、次いで−２０℃で１時間放置した。
ｍ）試料をマイクロチューブ内、４℃、１４，０００ｒｐｍで４分間回転させた。
ｎ）ＤＮＡペレットを７０％エタノール５００μｌで洗浄した。
ｏ）試料をマイクロチューブ内、４℃、１４，０００ｒｐｍで５分間回転させ、エタノールを廃棄し、ペレットを５分間風乾した。
ｐ）最後にＤＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリス／ＨＣＩｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０に再懸濁した。
ｑ）溶液の吸光度を２３０、２６０、２８０ｎｍで測定することにより、ＤＮＡの濃度および純度を計算した。

グラム陽性細菌からのＤＮＡ抽出におけるプロトコルは以下のようであった。
ａ）無菌のトゥースピックを使用し、細菌コロニーを培養プレートから無菌にした１．５ｍｌの遠心管内にこすり落とした。
ｂ）２０ｍｇ／ｍｌのＬｙｓｏｚｙｍｅ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））１８０μｌおよびＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））２００μｇを各試料に添加し、試料を徐々に混合して細菌コロニーを再懸濁した。
ｃ）試料を３７℃で３０分間インキュベートし、細胞壁を分解した。
ｄ）次いで、グラム陽性細菌に対するＱＩＡａｍｐＤＮＡミニキットプロトコルに従って試料を処理し、ＤＮＡを抽出した。

患者由来の細胞学的試料からのＤＮＡ抽出
ａ）試料を手動で激しく振とうさせて沈降した細胞を再懸濁しかつ溶液の均一性を確保した。
ｂ）再懸濁した細胞４ｍｌを１５ｍｌのコスター（Ｃｏｓｔａｒ）遠心管に移した。
ｃ）管をスイングアウト（ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ）式バケットローター内、３０００×ｇで１５分間遠心した。
ｄ）ペレット化した細胞物質を乱さないように、上清を注意深くデカントして廃棄した。
ｅ）ペレット化した細胞を溶解緩衝液（１００ｍＭトリス／ＨＣＩｐＨ８．０、２ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０、０．５％ＳＤＳ、０．５％トリトン−Ｘ−１００）２００μｌに再懸濁し、溶液が均一になるまで十分に混合した。
ｆ）試料８０μｌを９６ウェルの試料調製プレートに移した。
ｇ）プロテイナーゼＫを２０μｌ添加し、溶液を５５℃で１時間インキュベートした（この手順により細胞溶解物が得られる）。

尿試料からのＤＮＡ抽出
ＱＩＡａｍｐＵｌｔｒａＳｅｎｓ（商標）ＶｉｒｕｓＨａｎｄｂｏｏｋに従い、尿の開始容量１ｍｌからＤＮＡを抽出した。

ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩処理
ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＤＮＡ重亜硫酸塩修飾キット（ヒューマン・ジェネティック・シグネチャーズ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓ）、オーストラリア）に従い、重亜硫酸塩処理を行った。下記も参照のこと。

意外なことに、例えばヒト細胞の試料中に微生物ＤＮＡが存在する場合、微生物ＤＮＡを核酸の他のソースから分離する必要性が全くないことが本発明者らによって見出されている。異なるＤＮＡタイプの膨大な混合物に対して処理工程を利用してもよく、さらに微生物に特異的な核酸についても本発明によって同定してもよい。複雑なＤＮＡ混合物中での検出の限界が標的核酸分子の単一の複製物に至るまで対応可能である標準的なＰＣＲ検出の限界であると推定される。

試料
本発明において任意の適切な試料を使用してもよい。例として、微生物培養物、臨床試料、獣医学的試料（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｓａｍｐｌｅｓ）、体液、組織培養試料、環境試料、水試料、流出物が挙げられるがこれらに限定されない。本発明が任意の微生物の検出に適応可能であることから、このリストは網羅的と考えるべきではない。

キット
本発明を様々なキットの形態でまたはキットの併用によって実施し、手動、半自動または完全にロボット化されたプラットフォームの点から具体化してもよい。好ましい形態では、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）またはＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）キット（ヒューマン・ジェネティック・シグネチャーズ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓＰｔｙＬｔｄ），オーストラリア）は、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボット化されたプラットフォームを使用して９６または３８４プレート内での核酸の変換を可能にする。

重亜硫酸塩処理
核酸の有効な重亜硫酸塩処理のための典型的なプロトコルを下記に示す。プロトコルにより、実質的にすべての処理されたＤＮＡが保持されることになる。本明細書では、この方法は、ヒューマン・ジェネティック・シグネチャーズ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓ）（ＨＧＳ）法とも称される。試料または試薬の容量または量が変化しうることは理解されるであろう。

重亜硫酸塩処理の好ましい方法を、本明細書中に参照により援用される米国特許出願第１０／４２８３１０号明細書またはＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９号明細書において見出すことができる。

望まれる場合に適切な制限酵素で予備消化可能なＤＮＡ２μｇに対し、２μｌ（１／１０容量）の３ＭＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ、作製後間もない）を最終容量が２０μｌになるように添加した。この工程により、重亜硫酸塩試薬が好ましくも一本鎖分子と反応することから二本鎖ＤＮＡ分子が一本鎖形態に変性される。混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。室温を超える温度でインキュベーションを用いることで変性の効率を改善してもよい。

インキュベーション後、２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（１０ＮＮａＯＨ４１６ｍｌを有する水２０ｍｌ中７．６ｇ；ＢＤＨＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ；作製後間もない）２０８μｌと１０ｍＭキノール（水５０ｍｌ中０．０５５ｇ、ＢＤＨＡｎａｌＲ＃１０３１２２Ｅ；作製後間もない）１２μｌを連続的に添加した。キノールは還元剤であり、試薬の酸化の低減を促進する。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の適切な還元剤を例とする他の還元剤もまた使用してもよい。試料を鉱油２００μｌとオーバーレイした。鉱油のオーバーレイは試薬の蒸発および酸化を防止するが必須ではない。次いで、試料を５５℃で一晩インキュベートした。あるいは、試料を、以下のように約４時間または一晩インキュベートしてサーマルサイクラー内でサイクル動作してもよい。ＰＣＲ装置内で、工程１として５５℃／２時間、工程２として９５℃／２分サイクル動作させる。工程１を約３７℃〜約９Ｏ℃の任意の温度で行い、５分〜８時間の長さで変化させてもよい。工程２を約７０℃〜約９９℃の任意の温度で行い、約１秒〜６０分の長さまたはそれより長い時間で変化させてもよい。

メタ重亜硫酸ナトリウムによる処理後、オイルを除去し、もしＤＮＡ濃度が低い場合、ｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌまたはグリコーゲン２μｌを添加した。これらの添加物は任意であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合、これらを使用することで標的ＤＮＡとの共沈によって得られるＤＮＡの収量を改善することが可能である。核酸量が０．５μｇ未満である場合、より効率的な核酸の沈降を目的とした担体としての添加物の使用は一般に望ましい。

イソプロパノールによるクリーンアップ処理を以下のように行った。水８００μｌを試料に添加し、混合し、次いでイソプロパノール１ｍｌを添加した。水または緩衝液は、反応槽内の重亜硫酸塩の濃度を塩が目的の標的核酸と共沈しないレベルまで低下させる。本明細書に開示されるように、塩濃度が所望の範囲未満に希釈される限り、希釈率は一般に約１／４〜１／１０００である。

試料を再び混合し、４℃で最低５分間放置した。試料をマイクロチューブ内で１０〜１５分間回転させ、ペレットを７０％ＥＴＯＨで２回洗浄し、各回ボルテックスした。この洗浄処理により、核酸と共沈した任意の残留塩が除去される。

ペレットを乾燥させておき、次いで５０μｌなどの適切な容量のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５で再懸濁した。ｐＨ１０．５の緩衝液が特に有効であることが判明している。試料を、核酸の懸濁に対する必要性に応じ、３７℃〜９５℃で１分〜９６時間インキュベートした。

重亜硫酸塩処理に関する別の例を、シトシンからウラシルへの変換に対する方法および材料を提供する国際公開第２００５０２１７７８号パンフレット（本明細書中に参照により援用される）に見出すことができる。一部の実施形態では、ｇＤＮＡなどの核酸は重亜硫酸塩およびトリアミンまたはテトラアミンなどのポリアミン触媒と反応する。場合により、重亜硫酸塩は重亜硫酸マグネシウムを含有する。他の実施形態では、核酸は、場合によってポリアミン触媒および／または第四アミン触媒の存在下で重亜硫酸マグネシウムと反応する。本発明の方法を実施するのに使用可能なキットも提供される。これらの方法を処理工程で用いれば本発明にも適することが理解されるであろう。

増幅
ＰＣＲ増幅を、重亜硫酸塩処理したゲノムＤＮＡを２μｌ含有する反応混合物２５μｌにおいてＰｒｏｍｅｇａＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ、６ｎｇ／μｌの各プライマーを使用して行った。増幅のために鎖特異的な入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを使用した。ＰＣＲプライマー１および４を使用して第１ラウンドのＰＣＲ増幅を行った（下記参照）。第１ラウンドの増幅後、増幅された物質１μｌをＰＣＲプライマー２および３を有する第２ラウンドのＰＣＲプレミックスに移し、上記のように増幅した。ＰＣＲ産物の試料を、９５℃で４分間の１サイクルの後、９５℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で２分間の３０サイクル；７２℃で１０分間の１サイクルといった条件下で、ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄＰＸ２サーマルサイクラー内で増幅した。

多重増幅
もし検出にとって多重増幅が必要である場合、以下の方法論を実施してもよい。

重亜硫酸塩処理したＤＮＡ１μｌを、反応容量２５μｌ中の以下の成分、すなわち×１Ｑｉａｇｅｎｍｕｌｔｉｐｌｅｘｍａｓｔｅｒｍｉｘ、５〜１００ｎｇの各々の第１ラウンド用のＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー、１．５〜４．０ｍＭＭｇＳＯ_４、４００μＭの各ｄＮＴＰおよび０．５〜２単位のポリメラーゼの混合物に添加する。次いで成分をホットリッドのサーマルサイクラー内で以下のようにサイクル動作させる。各増幅反応では、典型的には最大で２００の独立したプライマー配列がありうる。

次いで、第１ラウンドの増幅物から分注した１μｌを酵素反応混合物および適切な第２ラウンド用プライマーを有する第２ラウンドの反応管に移して第２ラウンドの増幅を行う。次いで上記のようにサイクル動作を行う。

プライマー
本発明において任意の適切なＰＣＲプライマーを使用してもよい。プライマーは、典型的には増幅対象の配列に対する相補配列を有する。プライマーは、典型的にはオリゴヌクレオチドであるが、オリゴヌクレオチド類似体であってもよい。

プローブ
プローブは任意の適切な核酸分子または核酸類似体でありうる。例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）およびこれらの混合物やこれらのハブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾物、例えばホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホアミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートなど（これらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。非天然ヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ザイロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ザイロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、[３．２．１]−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]−ＤＮＡ、ビシクロ[３．２．１]−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内部に含まれるヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。さらに、非リンを含有する化合物を、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミドを有する連結基などの（これらに限定されない）ヌクレオチドへの連結のために使用することが可能である。特に核酸および核酸類似体は、１つもしくは複数のインターカレーターシュードヌクレオチドを含みうる。

好ましくは、プローブは、ＩＮＡを形成する１種もしくは複数種の内部ＩＰＮを有するＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。

電気泳動
Ｅ−Ｇｅｌシステムのユーザーガイド（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｄｏｃ）に従って試料の電気泳動を行った。

検出方法
所望の試料の状態を測定するのに可能な極めて多数の検出系が存在する。本発明では核酸分子を検出するための既知の系または方法であればいずれも使用可能であることが理解されるであろう。検出系には、以下のものが含まれるがそれらに限定されない。
Ｉ．１０から２００，０００に及ぶ個々の成分に対する選択が可能と思われるマイクロアレイ型デバイスに対する適切に標識したＤＮＡのハイブリダイゼーション。ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビード、磁気ビード、蛍光ビードもしくは膜などの任意の適切な固体表面上に、これらのアレイをＩＮＡ、ＰＮＡまたはヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアレイから構成できると思われる。
ＩＩ．サザンブロット型検出系
ＩＩＩ．例えばアガロースゲル、ＧｅｎｅＳｃａｎ分析などの蛍光読み出しといった標準的なＰＣＲ検出系。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、エチジウムブロミドなどのＤＮＡ染色試薬、サイバーグリーン（Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ）、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダー型デバイス、蛍光分光デバイス
ＩＶ．特異的増幅もしくは多重増幅されたゲノム断片またはそれに対する任意の変異におけるリアルタイムＰＣＲ定量
Ｖ．国際公開第２００４／０６５６２５号パンフレットの中で概説された蛍光ビーズ、酵素抱合体、放射性ビーズなどの検出系のいずれか
Ｖｌ．リガーゼ連鎖反応などの増幅工程または鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの等温ＤＮＡ増幅技術を利用する任意の他の検出系
ＶＩＩ．マルチフォトン検出系
ＶＩＩＩ．ゲルにおける電気泳動および可視化
ＩＸ．核酸を検出するのに使用されるまたは使用可能と思われる任意の検出プラットフォーム

インターカレーティング核酸
インターカレーティング核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズ可能な非天然型ポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、いくつかの望ましい特性を示すことから、プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸プローブに対する代替物／置換物としての候補である。ＩＮＡは、核酸にハイブリダイズすることで対応する天然核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定なハイブリッドを形成するポリマーである。それらはペプチドまたは核酸を分解することで知られる酵素に対する基質ではない。したがって、ＩＮＡであれば、生物学的試料中でより安定であることに加え、天然核酸断片よりも長い貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ−ｌｉｆｅ）を有するはずである。ＩＮＡの核酸とのハイブリダイゼーションは、イオン強度に強く依存する核酸ハイブリダイゼーションと異なり、イオン強度にほとんど依存せず、天然核酸の核酸に対するハイブリダイゼーションにとって極めて不適当な条件下の低いイオン強度で有利である。ＩＮＡの結合強度は、分子内に設計された挿入基の数、ならびに二本鎖構造の特異的な様式で積み重なった塩基間の水素結合からの通常の相互作用に依存する。配列の識別は、ＤＮＡを認識するＤＮＡの場合よりもＩＮＡを認識するＤＮＡの場合の方がより効率的である。

好ましくは、ＩＮＡは（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホアミダイトである。

ＩＮＡは、商業的に利用可能な形式で標準的なオリゴヌクレオチドの合成手順を適合させることによって合成される。ＩＮＡおよびそれらの合成の完全な定義について、本明細書中に参照により援用される国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレットおよび国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（ユネスト（ＵｎｅｓｔＡ／Ｓ））の中に見出すことができる。

ＩＮＡプローブと標準的核酸プローブの間には確かに多数の違いがある。これらの違いは、便宜上、生物学的、構造的、および物理−化学的な違いに分かれる。上記および下記で考察されるように、これらの生物学的、構造的、および物理−化学的な違いは、核酸が通常利用されている応用においてＩＮＡプローブの使用を試みる場合に予測不能な結果をもたらす場合がある。異なる組成物における相違点は、化学技術において観察されることが多い。

生物学的違いに関しては、核酸は、遺伝的伝達および発現の作用物質として生物種の生命における中心的役割を担う生物学的物質である。それらのｉｎｖｉｖｏでの特性は、かなりよく理解されている。しかし、ＩＮＡは最近開発された完全に人工的な分子であり、化学者の頭の中で考え出され、合成有機化学を用いて作製されたものである。それは既知の生物学的機能を全く有しない。

構造的には、ＩＮＡはまた核酸とは格段に異なる。双方ともに共通のヌクレオ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ）の利用が可能であるが、これらの分子の組成物は構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＩＮＡの骨格は、リン酸ジエステルリボースおよび２−デオキシリボース単位の反復からなる。ＩＮＡは、リンカー分子を介してポリマーに付着された１つもしくは複数の大きな均一分子を有する点でＤＮＡまたはＲＮＡと異なる。均一分子は、二本鎖構造をなすＩＮＡに対する相補的ＤＮＡ鎖内の塩基間に挿入する。

ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの物理／化学的な違いは重要でもある。ＩＮＡは同じ標的配列に結合する核酸プローブよりも迅速に相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡまたはＲＮＡの断片と異なり、もし挿入基が末端位置に位置しない場合、ＩＮＡのＲＮＡに対する結合は不十分である。相補的ＤＮＡ鎖上の挿入基と塩基の間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似体のＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のそれよりも高い。

ＤＮＡもしくはＲＮＡの断片またはＰＮＡなどの他の核酸と異なり、ＩＮＡは自己凝集または結合特性を示さない。

ＩＮＡは配列特異性を有する核酸にハイブリダイズすることから、ＩＮＡはプローブに基づくアッセイの開発にとっての有用な候補であり、特にキットおよびスクリーニングアッセイに適合する。しかし、ＩＮＡプローブは核酸プローブと同等ではない。それ故、プローブに基づくアッセイの特異性、感受性および信頼性を改善可能と思われる任意の方法、キットまたは組成物は、ＤＮＡを含有する試料の検出、分析および定量において有用となろう。ＩＮＡはこのために必要な特性を有する。

結果
微生物（細菌、ウイルスまたは真菌株など）の検出は、その種内の多数の微生物の各株によって阻害されることが多い。

本発明のｉｎｓｉｌｉｃｏでの一般的原理について、髄膜炎菌、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ桿菌、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌を用いて教示する（図１〜５）。本発明の一般的原理について、インフルエンザウイルスおよびロタウイルスを用いて教示している（図６および７）。

本発明を教示および支持するための一般的な生化学的データを、臨床的意義のあるグラム陽性およびグラム陰性細菌を用いて図８〜１８に記載する。

細菌
図１は、髄膜炎菌内のｉｇａプロテアーゼ遺伝子の３４個のヌクレオチド領域および淋菌内の対応する遺伝子座を示す（これらの領域はそれらの天然細菌ゲノム内に存在するものとする）（完全な分類；細菌；プロテオバクテリア；ベータプロテオバクテリア；ナイセリア目；ナイセリア科；髄膜炎菌、Ｚ２４９１血清型Ａおよび完全な遺伝子座の特徴；ｉｇａ、ＩｇＡＩプロテアーゼ；ＧｅｎｅＩＤ９０６８８９、ローカスタグ（ＬｏｃｕｓＴａｇ）ＮＭＡ０９０５；ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＣ_００３１１６．１；ＰＭＩＤ１０７６１９１９；Parkhill J et al., 2000, Nature, 404, 502- 506）。これら２つのナイセリア属の３４個のヌクレオチド配列の間には７４％の配列類似性がある。両方の細菌種内のこれらの領域を増幅するためにＰＣＲに基づくプライマーを作製するとしたら、５１２通りの組み合わせが可能な変性プライマーが必要となろう。ＰＣＲ増幅の一部として共通配列を使用するとしたら、それは３４個のヌクレオチド配列ＧＹＡＡＴＹＷＡＧＧＹＣＧＹＣＴＹＧＡＡＧＡＹＴＡＹＡＡＹＡＴＧＧＣ（配列番号３）であろう。この場合、異なる位置を指定するための標準的コードを以下に示す。Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｈ＝Ａ、ＴまたはＣ；Ｂ＝Ｇ、ＴまたはＣ；Ｖ＝Ｇ、ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＴまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣおよびＷ＝ＡまたはＴ。

しかし、これらの２つの種由来の細菌ＤＮＡを重亜硫酸塩試薬（シトシンのチミンへの変換をもたらす）で処理する場合、自然発生配列が、コーディングの可能性が全くなく天然に存在しない誘導配列に変換される。この段階で誘導配列は９７％の配列類似性を有する。ＰＣＲに基づくプライマーは、これらの細菌の遺伝子座双方におけるＰＣＲ増幅を１回の試験で可能なように設計されると、この段階では２つのプライマーのみを組み合わせる必要があるにすぎない。位置７の塩基のみがアデニンまたはチミン（Ｗで示される）である場合、組み合わせは配列ＧＴＡＡＴＴＷＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＡＴＧＧＴ（配列番号４）に基づくであろう。したがって、重亜硫酸塩変換により、相対的なゲノムの複雑さが５１２通りから２通りのプライマータイプへと低減される。この大幅な低減により、関連する細菌種からの同じ遺伝子座の増幅が簡素化される。

さらに、これら２種の細菌種由来の領域を増幅するのに場合によってＩＮＡプローブを使用し、再び同じ遺伝子座を使用することにより、利点がもたらされる。図２は、図１に示した髄膜炎菌および淋菌のｉｇａ遺伝子の同じ３４個のヌクレオチド領域を図示し、これはＩＮＡプローブをさらに用いてもプローブ長や複雑さが低減可能であるという対象範囲を追加的に明らかにしている。短いＩＮＡの１６ｍｅｒの配列ＡＧＧＹＣＧＹＣＴＹＧＡＡＧＡＹ（配列番号５）であれば、この領域を検出するのに１６通りの可能なプライマーの組み合わせが必要となろうが、重亜硫酸塩による変換後には、特有のプライマー配列ＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴ（配列番号６）で十分であろう。ＩＮＡ分子の利点は、骨格内に組み込まれるインターカレーティングシュードヌクレオチドのおかげで、標準オリゴヌクレオチドに対するＩＮＡのＴｍの増大により、正確な遺伝子座へのハイブリダイゼーションを非特異的結合と識別することが著しく容易になることである。そうであっても、標準オリゴヌクレオチドが依然として適切に機能することが理解されるであろう。

関連性が高い細菌種が類似の臨床症状をもたらす場合、重亜硫酸塩で変換したＤＮＡを再び使用して、特異的細菌タイプの存在についてアッセイするためのより簡素化したプローブを設計することができる。図３は、３種の細菌種内のｉｇａ遺伝子におけるＤＮＡアラインメントを示し、それらの１種であるインフルエンザ桿菌は異なる分類群由来である。細菌ＤＮＡの重亜硫酸塩処理により、プローブの組み合わせ数が極めて少なくなった。この比較は、１回の試験で関連性のない種についてのアッセイが可能であることの重要性を示す。髄膜炎菌とインフルエンザ桿菌の双方が髄膜炎を誘発することから、１回の試験で同じ臨床症状を誘発するすべての微生物についてアッセイ可能であることは有利である。

同じ分類群からの多数の異なる細菌種の分析は、本発明によってやはり容易になる。図４は、連鎖球菌群、すなわちストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・クリスタツス（Ｓ．ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・パラウベリス（Ｓ．ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・ベスチブラリス（Ｓ．ｖｅｓｔｉｖｕｌａｒｉｓ）およびストレプトコッカス・ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）の１０種の細菌種内のｔｕｆ遺伝子の４０個のヌクレオチドセグメントを示す。この領域は、１０種の間で約６８％の配列類似性を有し、１回の試験で１０種について同時にアッセイするのに１２，２８８通りのプライマーの組み合わせを必要とする。重亜硫酸塩変換された配列は、これらの種の間で８５％の配列類似性を有し、ここで必要とする可能なプライマーの組み合わせは単に６４通りである。

同じ細菌種に属する異なる株の分析もまた本発明によって簡素化される。図５は、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシン遺伝子の２３個のヌクレオチドセグメントを図示する。この遺伝子領域の天然配列は、全部で７種の株の間に５６％しか配列類似性を有さず、１５３６通りのプライマーの組み合わせを必要とする一方、重亜硫酸塩で変換した配列は７４％の配列類似性を有し、必要とするプライマーの組み合わせは単に６４通りである。

ウイルス核酸分析および相対的なゲノムの複雑さの低減
相対的なゲノムの複雑さを低減する原理を、ＤＮＡゲノムを有するインフルエンザウイルスなどのウイルス群と同様に、（ＲＮＡは逆転写酵素によってＤＮＡに変換され、次いでそれによって重亜硫酸塩処理されうることから）ＲＮＡゲノムを有するウイルス群にも適用してもよい。ウイルス検出への適用を例示するため、分節ＲＮＡゲノムを有する、インフルエンザウイルス株（オルトミクソウイルス科（ＦａｍｉｌｙＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ））のノイラミニダーゼ遺伝子およびロタウイルス株（レオウイルス科（ＦａｍｉｌｙＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ））の表面タンパク質をコードするＶＰ４遺伝子の両ウイルスを使用している。インフルエンザウイルスの分類は複雑であり、例えばタイプＡ、ＢおよびＣが抗原特性に基づき、かつさらなるサブタイプが複製起点部位、単離年、単離数およびサブタイプに基づいている。これにより、第一にインフルエンザウイルスを集団として同定し、次いで結果的にかなり下位の分類レベル（ｓｕｂ−ｓｕｂ−ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ）の分析にまで掘り下げられるという需要が高まる。

ロタウイルスの分類もまた複雑である。ロタウイルス血清型の数は多く、ＰおよびＧ血清型という認められた２つの主な血清型を伴う。最小でも１４種の異なるＧ血清型が存在し、小児医学ではそれらを明確に検出することが重要である。世界中のほぼすべての小児が、３歳になるまでに既に少なくとも１回ロタウイルスによる感染を、たとえこれらの感染が不顕性であり、胃腸管に対して軽度の作用を有するにすぎない場合であっても被っていると推定される。

臨床レベルでのインフルエンザによる感染の結果はよく知られており、ほぼ毎冬で罹患率および死亡率が有意な状況である。しかし、特にストレプトコッカス・ニューモニエ、インフルエンザ桿菌および黄色ブドウ球菌による感染後に重度の二次合併症が発症しうる。肺炎合併症が細菌およびウイルス感染症の特徴が混ざり合うことから発症しうることや、速やかな抗生治療が有効な治療でありうることから、ウイルス感染症と細菌感染症の双方について同時分析できることが有利であることは極めて明らかである。

９種の異なるインフルエンザ株における相対的なゲノムの複雑さの低減について図６に示す。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の２０個のヌクレオチド領域をそのＤＮＡ形態で示す。これらの９種の単離物の間には５０％の配列類似性がある。重亜硫酸塩変換後、配列類似性は７５％に増加している。その元の形態では、これらの９種の株を分析するには２０４８通りの可能なプライマーの組み合わせが必要であると思われる一方、重亜硫酸塩変換後に必要なプライマーの組み合わせは４８通りにすぎない。

３種の異なるロタウイルス株のＶＰ４遺伝子における相対的なゲノムの複雑さの低減について図７に示す。ＶＰ４遺伝子の２０個のヌクレオチド領域は、変換前に５２％および変換後に７４％の配列類似性を有する。プライマーの組み合わせ数は５１２から３２に減少する。

病院や病理学実験室で一般に遭遇する臨床的意義のある微生物種を用いた、微生物を検出する一手段として微生物ゲノムを簡素化するｉｎｓｉｌｉｃｏでのアプローチを支持する分子データを図８〜１５に図示する。

もし試料中に存在するのがグラム陽性細菌かまたはグラム陰性細菌かを初期に決定できるとしたら、それは汚染性微生物の迅速な検出にとって明らかな利点であり、臨床的意義が大きい。本明細書に記載の方法では、異なる細菌種の２３Ｓリボソーム遺伝子を用いたかかる試験が提供され、増幅反応を介し、簡素化したゲノム上でプライマーセットを利用することによりグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の検出を可能にするかかるプライマーが生成される。２３Ｓ配列は、例えば上記Ｓ．ｇａｌａｃｔｉａｅの例において見られる一部の細菌ゲノムに任意に付加される一部のタンパク質コーディング配列とは異なり、すべての細菌種内で生じることから、かかる高レベルの識別にとって望ましい。多数のタンパク質をコードする微生物配列は、ゲノムの「がらくた（ｆｌｏｔｓａｍａｎｄｊｅｔｓａｍ）」に類するものであり、それらの有用性は、異なる微生物株、タイプまたは単離物などのより低いレベルの分類カテゴリの間、あるいはウイルスの場合、異なるタイプまたは新しく生じた変異体の間で識別することにある。これら成分すべての正規および簡素化されたゲノム配列、タンパク質をコードしないリボソームＲＮＡ遺伝子、および細菌のタンパク質をコードするｒｅｃＡ遺伝子をそれぞれ図１５および１６に示す。２３Ｓ細菌アンプリコンに対する増幅反応の実施に使用されるプライマー配列を表１に示す。ｒｅｃＡアンプリコンに対する増幅反応の実施に使用されるプライマー配列を表２に示す。すべてのプライマーを重亜硫酸塩で処理したＤＮＡに対して作製し、５’から３’の向きで示す。

表１は、グラム陽性（Ｐｏｓ）、グラム陰性（Ｎｅｇ）の検出用プライマーを生成するためのアラインメントを用いた、２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の重亜硫酸塩で簡素化したＤＮＡの増幅に用いられる適切な細菌用プライマー配列を示す。さらに、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｐ）（Ｍｙｃ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ）（Ｓｔａｐｈ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ）（Ｓｔｒｅｐ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｐｐ）（ＮＧ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（ＣＴ）、ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（ＥＣ）およびストレプトコッカス・ニューモニエの特異的検出用にプライマーを設計した。

以下の記号は以下の塩基付加を指定する。Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｈ＝Ａ、ＴまたはＣ；Ｂ＝Ｇ、ＴまたはＣ；Ｖ＝Ｇ、ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＴまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣおよびＷ＝ＡまたはＴ。

使用されるすべてのプライマーは重亜硫酸塩で簡素化したＤＮＡ配列に基づいた。

表２は、特有の細菌の分類を目的とした、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＳＥ）、レイ菌（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｓｃｅｓｅｎｓ）（ＳＭ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（ＥＣ）およびエンテロコリティカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（ＹＥ）由来の、アラインメントを用いた、ｒｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子由来の簡素化ＤＮＡの増幅に用いられる細菌用プライマー配列を示す。

表１は、グラム陽性（Ｐｏｓで示す）細菌およびグラム陰性（Ｎｅｇで示す）細菌の検出用の最適なプライマーを生成するための多重アラインメントを用いた、２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の重亜硫酸塩で簡素化したＤＮＡの増幅に用いられる細菌用プライマー配列を示す。さらに、種の群および個々の種の特異的検出用にもプライマーを設計した。これらの細菌用プライマー群に対し、大腸菌および肺炎桿菌（ＥＣ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｐｐ（ＮＧ）、クラミジア（ＣＴ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ）のように指定する。下位指定のＦおよびＲのは、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーである。さらに、２種以上の可能な塩基が所定のヌクレオチド位置で必要である場合、塩基の縮重が、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ；Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ；Ｈ＝Ａ、ＴまたはＣ；Ｂ＝Ｇ、ＴまたはＣ；Ｖ＝Ｇ、ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＴまたはＣ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｍ＝ＡまたはＣ；およびＷ＝ＡまたはＴのコードによって与えられる。繰り返して言えば、本発明において用いられるすべてのプライマーは重亜硫酸塩で簡素化したＤＮＡ配列に基づいている。

表２は、特有の細菌の分類を目的とした、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、表皮ブドウ球菌（ＳＥ）、レイ菌（ＳＭ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（ＥＣ）およびエンテロコリティカ菌（ＹＥ）由来の、アラインメントを用いた、ｒｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子由来の重亜硫酸塩で簡素化したＤＮＡの増幅に用いられる細菌用プライマー配列を示す。

図８は、グラム陽性およびグラム陰性細菌のゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示し、ここで適切にサイジングしたアンプリコンはアガロースゲル電気泳動による特異的な長さのバンドとして検出される。矢印は、マーカーのレーン（Ｍ）内を動く、標準的なサイジングしたマーカーに対するアンプリコンの想定サイズを示す。グラム陰性細菌に特異的なプライマーを使用すると、大腸菌、淋菌、肺炎桿菌、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）における６種のグラム陰性のレーン１〜６（上パネル）に限ってバンドが出現する。グラム陽性細菌に特異的なプライマーを使用すると、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカッス・キシロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｘｙｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエおよび溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）における６種のグラム陽性のレーン７〜１２（下パネル）に限ってバンドが出現する。

図９は、（この例では）大腸菌および肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）という２種のみのグラム陰性細菌種を由来とするアンプリコンを検出するように設計した、ゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。増幅方法論の特異性について、大腸菌および肺炎桿菌を示すレーン１および３におけるアンプリコンの存在、ならびにレーン２およびレーン４〜１２において増幅産物が存在しないこと（これら１０個の空のレーンは試験で用いられる細菌の残りの１０種を示す）によって図示する。

図１０は、１種のみのナイセリア細菌群に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。ゲノムを簡素化する方法論の特異性について、淋菌を示すレーン２のみにおけるアンプリコンの存在およびレーン１およびレーン３〜１２において増幅産物が存在しないこと（これら１１個の空のレーンは試験で用いられる細菌の残りの１１種を示す）によって図示する。

個々の微生物種の分析においては、タンパク質をコードする遺伝子についても、微生物の異なる株が問題の遺伝子配列におけるそれらの存在／非存在に対して多形性を示さないという条件で必要に応じて用いてもよい。

図１１は、大腸菌の細菌ｒｅｃＡ遺伝子に対するプライマーの使用について図示する。アンプリコンの特異性を、レーン１における正確にサイジングしたアンプリコンの存在および細菌の他の１１種を示す残りのレーン２〜１２においてそれが存在しないことによって図示する。

図１２のデータは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）などのより大きい細菌群のメンバーを明らかにするプライマーの特異性をさらに図示する。ブドウ球菌に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からＰＣＲによって得られた増幅産物は、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌およびスタフィロコッカッス・キシロサスを示すレーン８、９および１０でのみアンプリコンを示す。レーン１〜７およびレーン１１〜１２において増幅産物が存在しないことは反応の特異性を証明している。９つの空のレーンは、試験で用いられる９種の非ブドウ球菌細菌を示す。

図１３は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）細菌に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。連鎖球菌に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子領域からＰＣＲによって得られた増幅産物は、ストレプトコッカス・ニューモニエおよび溶血性連鎖球菌を示すレーン１１および１２でのみアンプリコンを示す。レーン１〜１０において増幅産物が存在しないことは反応の特異性を示している。これらの１０個の空のレーンは、試験で用いられる１０種の非連鎖球菌細菌を示す。

図１４は、表皮ブドウ球菌（レーン８）のｒｅｃＡ遺伝子のゲノム的に簡素化した領域由来のタンパク質をコードする遺伝子からＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。２つのバンド（矢印）は、第１ラウンド（上部バンド）および第２ラウンド（下部バンド）のＰＣＲ増幅から得られた繰り越し（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）アンプリコンを示す。レーン１〜７および９〜１２においてアンプリコンが存在しないことは方法の特異性を示し、タンパク質をコードする遺伝子を特殊環境下でゲノムの非コーディング成分の代わりに使用することで１種の細菌種に限って検出がなされるという点を強調している。

図１５は、クラミジアのゲノム的に簡素化した２３Ｓリボソーム遺伝子を標的にする特異的プライマーを用いたアンプリコンの検出を示す。ＤＮＡの開始量が少ないことからＰＣＲ反応を２通りに行った。レーン番号５は、既知の陰性の個人の尿から抽出したＤＮＡであった。２通りのうちのいずれかでバンドが出現したことは、クラミジアＤＮＡの存在に対する陽性反応であると考えられた。

図１６は、大腸菌由来の２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の正規のヌクレオチド配列および図示目的として全シトシンがチミンと置換されている場合のゲノムの簡素化後の同配列を示す。

図１７は、大腸菌由来のｒｅｃＡ遺伝子の正規のヌクレオチド配列および図示目的として全シトシンがチミンと置換されている場合のゲノムの簡素化後の同配列を示す。

要するに、微生物源由来の重亜硫酸塩で処理したＤＮＡは、ゲノム的に簡素化したプライマーを用いて増幅される場合、オリゴヌクレオチドまたはＩＮＡなどの修飾核酸であると、試料中で任意のタイプの微生物を見出すための最高レベルの検出系を提供し、それはヒト臨床物質由来の試料であるかまたは汚染水などの環境源由来の別の極端な状況にある。本発明については、広範な異なる細菌種や臨床的意義のあるウイルスに対して実証されている。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはその近縁種などの単細胞真核微生物の検出は、本方法を単純に拡張したものである。それは、１８または２８Ｓリボソーム配列などの類似のゲノム配列ソースあるいは上記のように所定の種、タイプ、株または変異体もしくは多型に対して特異的なタンパク質をコードするコーディング配列を必要とする。

本発明に記載の検出系の実際の意味もまた重要である。本明細書において詳細に記載された原理が増幅用ＰＣＲを用いて示されている一方、当該技術で既知の任意の方法論を介して読み出しを連携させてもよい。重亜硫酸塩処理がゲノムの複雑さを低減し、それ故に微生物のさらなるクラスを対象とした、検出器の数がより少ない（という特徴を備えた）マイクロアレイ上での試験が可能になることから、現在重視されているマイクロアレイ検出系とともに、ゲノム的に簡素化されたＤＮＡを用いることで微生物のはるかに広大な範囲を検出することができるであろう。

もし、例えばマイクロアレイが２５０，０００種程度の異なる微生物を１回の試験で検出するように構築されなければならないとしたら、現行の方法論は検出プラットフォームの物理的制限によって圧倒されることから、十分な実用的検出プラットフォームを提供できないであろう。しかし、ゲノムの簡素化を併せるならば、小型マイクロアレイは１０００種程度の異なる高レベルの細菌カテゴリを検出可能であろう。次いで、あくまで初期試験において陽性であったそれらの群を代表するものを有する別のアレイを用いれば、かかる試験からの陽性について評価することができるであろう。

当業者であれば、特定の実施形態において示されるように、極めて多くの変異および／または修飾が、幅広く記載された本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく本発明に対してなされうることを理解するであろう。したがって、本実施形態は、例示としてかつ限定されることなく、あらゆる点から考えられるべきである。

ゲノムの簡素化の前後における髄膜炎菌および淋菌のｉｇａ遺伝子の一部のアラインメントを示す。図に示されるように、ゲノムの簡素化に先立ち、ナイセリア種のユニバーサルな検出にとって全部で５１２通りのプローブの組み合わせ（７４％の配列類似性）が必要であるのに対し、核酸誘導体を形成する簡素化後では、単に２通りの組み合わせ（９７％の配列類似性）で十分であると思われる（配列番号は各配列の後に列挙される）。ＩＮＡプローブが標準オリゴヌクレオチドプローブより短い長さを有しうることから簡素化配列の配列類似性をさらに高めるためのＩＮＡプローブの使用を示す。ゲノムの簡素化方法をＩＮＡプローブと組み合わせると、標的配列に対して１００％の配列類似性を有するプローブの選択および使用が可能になる（配列番号は各配列の後に列挙される）。ナイセリアおよびヘモフィルス由来のｉｇａ遺伝子のアラインメントを用いた、近縁種である種間の区別をするためのゲノムの簡素化について示す。図に示されるように、本発明の方法は、種特異的プローブを生成するためのゲノム物質の簡素化を可能にする。さらに、それはゲノムＤＮＡを簡素化するが、ナイセリア種と、近縁種であるヘモフィルス種の間の区別も可能にする（配列番号は各配列の後に列挙される）。連鎖球菌の異なる１０種におけるゲノムの簡素化の前後での連鎖球菌のｔｕｆ遺伝子のアラインメントについて示す。処理前には、ｔｕｆ遺伝子のユニバーサルプライマーにとって全部で１２，２８８通りのプローブの組み合わせが必要であると思われる。ゲノムの簡素化後、ユニバーサルな検出にとって必要とされるプローブの組み合わせは６４通りにすぎないと思われる。さらに、配列類似性は簡素化前には６７．５％にすぎず、簡素化後には８５％に高まる（配列番号は各配列の後に列挙される）。ゲノムの簡素化の前後でのブドウ球菌のエンテロトキシン遺伝子のアラインメントについて示す。重亜硫酸塩処理前には、ブドウ球菌のエンテロトキシン遺伝子のユニバーサルプライマーにとって全部で１，５３６通りのプローブの組み合わせが必要であると思われる。ゲノムの簡素化後、ユニバーサルな検出にとって必要とされるプローブの組み合わせは６４通りにすぎないと思われる（配列番号は各配列の後に列挙される）。ゲノムの簡素化の前後での様々なインフルエンザ株のインフルエンザ群ＡおよびＢのノイラミニダーゼ遺伝子のアラインメントについて示す。処理前には、群ＡおよびＢのノイラミニダーゼ遺伝子のユニバーサルプライマーにとって全部で２，０４８通りのプローブの組み合わせが必要であると思われる。ゲノムの簡素化後、ユニバーサルな検出にとって必要とされるプローブの組み合わせは４８通りにすぎないと思われる。さらに、配列類似性は簡素化前には５０％にすぎず、簡素化後には７５％に高まる（配列番号は各配列の後に列挙される）。ゲノムの簡素化の前後でのロタウイルスＶＰ４遺伝子のアラインメントについて示す。処理前には、ロタウイルスＶＰ４遺伝子のユニバーサルプライマーにとって全部で５１２通りのプローブの組み合わせが必要であると思われる。ゲノムの簡素化後、ユニバーサルな検出にとって必要とされるプローブの組み合わせは３２通りにすぎないと思われる（配列番号は各配列の後に列挙される）。グラム陽性およびグラム陰性細菌のゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示し、ここでは適切なアンプリコンがアガロースゲル電気泳動による特異的長さのバンドとして検出される。矢印は、マーカーレーン（Ｍ）内を動く、標準的なサイジングされたマーカーに対するアンプリコンの想定される大きさを示す。グラム陰性細菌に特異的なプライマーを用いると、６種のグラム陰性のレーンのみにバンドが出現する（上パネル）。グラム陽性細菌に特異的なプライマーを用いると、６種のグラム陽性のレーンのみにバンドが出現する（下パネル）。大腸菌（レーン１）および肺炎桿菌（レーン３）のゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。増幅の特異性は、残りの１０種の細菌由来の増幅産物が存在しないことによって図示される。ナイセリアに特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子のゲノム的に簡素化された領域由来のタンパク質をコードする遺伝子からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。アンプリコンの特異性は、大腸菌のｒｅｃＡアンプリコンの存在および他の１１種の細菌からのその出現がないことによって図示される。ブドウ球菌に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。連鎖球菌に特異的なプライマーを用いた、ゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子領域からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。表皮ブドウ球菌のｒｅｃＡ遺伝子のゲノム的に簡素化された領域由来のタンパク質をコードする遺伝子からのＰＣＲによって得られた増幅産物を示す。２つのバンド（矢印）は、第１ラウンド（上部バンド）および第２ラウンド（下部バンド）のＰＣＲ増幅から得られた繰り越しアンプリコンを示す。トラコーマクラミジアのゲノム的に簡素化された２３Ｓリボソーム遺伝子を標的にする特異的プライマーを用いたアンプリコンの検出を示す。表皮ブドウ球菌由来の正規のゲノム配列およびゲノム的に簡素化された２３ＳｒＤＮＡ配列を示す（配列番号は各配列の後に列挙される）。大腸菌ｒｅｃＡ遺伝子のゲノム配列およびゲノム的に簡素化された配列を示す（配列番号は各配列の後に列挙される）。

Claims

微生物ゲノムまたは微生物核酸に特異的な核酸を検出するための方法であって、
前記微生物ゲノムまたは微生物核酸を重亜硫酸塩で処理することによって、天然にはシトシンによって占有される位置の実質的にすべてがウラシルによって占有される前記微生物ゲノムの誘導体または微生物核酸の誘導体を生成することにより、前記微生物ゲノムまたは微生物核酸の塩基の複雑さを低減する工程と、
前記微生物ゲノムの誘導体または微生物核酸の誘導体を増幅して、ウラシルがチミンに置換された簡素化された微生物ゲノムまたは簡素化された微生物核酸を得る工程であって、前記簡素化された微生物ゲノムまたは簡素化された微生物核酸はある微生物に特異的な核酸を含む工程と、
微生物特異的な核酸を検出する工程であって、微生物特異的な核酸の検出は、前記微生物ゲノムまたは微生物核酸を有する微生物が存在することを示す工程と、
を含む、方法。
前記方法の実施に先立ち微生物ＲＮＡをＤＮＡに変換する工程を含む請求項１に記載の方法。
微生物ＲＮＡに対して前記方法を実施することで、ＲＮＡ分子の誘導体を生成し、次いで前記ＲＮＡの誘導体を変換してＤＮＡ分子の誘導体を形成する工程を含む請求項１に記載の方法。
前記重亜硫酸塩が、重亜硫酸ナトリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、またはシグナル増幅によって行われる請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸が、微生物固有の一もしくは複数のヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物ゲノムまたは微生物核酸が、ファージ、ウイルス、ウイロイド、細菌、真菌、藻、原生動物、スピロヘータ、または単細胞生物から得られるものである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物ゲノムまたは微生物核酸が、タンパク質をコードする核酸、タンパク質をコードしない核酸、原核生物または単細胞真核微生物のリボソーム遺伝子領域から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記リボソーム遺伝子領域が、原核生物の１６Ｓまたは２３Ｓおよび単細胞真核微生物の１８Ｓまたは２８Ｓである請求項８に記載の方法。
前記簡素化された微生物ゲノム又は簡素化された微生物核酸が、
前記配列の実質的にすべてのシトシンをチミンに変化させることで、実質的にアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）から選択される塩基のみを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子がリアルタイムＰＣＲによって検出される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子がマイクロアレイ検出系によって検出される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子が、
前記微生物特異的な核酸分子の標的領域に結合可能な検出リガンドを提供し、かつ前記検出リガンドが前記標的領域に結合するのに十分な時間を与える工程と、
前記検出リガンドの前記標的領域に対する結合を測定し、前記微生物特異的な核酸分子の存在を検出する工程と、
によって検出される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子が、増幅産物を分離し、かつ前記分離された産物を可視化することによって検出される請求項１３に記載の方法。
前記増幅産物が電気泳動によって分離され、かつゲル上の一もしくは複数のバンドを可視化することによって検出される請求項１４に記載の方法。
前記簡素化された核酸分子が、実質的にシトシンを全く有しない請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子が、前記微生物において自然発生しない請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子が、前記微生物の分類レベルを示す核酸配列を有する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物の前記分類レベルが、同一もしくは異なる地理的集団または底生性集団由来の科、属、種、株、タイプ、あるいは異なる集団を含む請求項１８に記載の方法。
試料中での微生物の存在を検出するための方法であって、
シトシンをウラシルに修飾する重亜硫酸塩で微生物核酸を処理して微生物核酸誘導体を形成する工程と、
配列番号：７〜１４４から選択される配列を有し、所望の微生物特異的な核酸分子の前記微生物核酸誘導体への増幅を可能にする能力を有するプライマーを提供する工程と、
前記プライマーを用いて前記微生物核酸誘導体に対して増幅反応を行うことで簡素化された核酸を形成する工程と、
所望の微生物特異的な核酸分子を有する増幅核酸産物の存在についてアッセイする工程であって、前記所望の微生物特異的な核酸分子の検出が前記微生物の存在を示す、工程と、
を含む、方法。
前記重亜硫酸塩が、重亜硫酸ナトリウムである、請求項２０に記載の方法。
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、またはシグナル増幅によって行われる請求項２０または２１に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子がリアルタイムＰＣＲによって検出される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物特異的な核酸分子がマイクロアレイ検出系によって検出される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸分子が、
前記核酸分子の一領域に結合可能な検出リガンドを提供し、かつ前記検出リガンドが前記領域に結合するのに十分な時間を与える工程と、
前記検出リガンドの前記核酸分子に対する結合を測定し、前記核酸分子の存在を検出する工程と、
によって検出される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸分子が、増幅産物を分離しかつ前記分離された産物を可視化することによって検出される請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。