JP5366286B2 - 高濃度糖類混合物を用いた遺伝子発現の誘発 - Google Patents

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Description

本出願は、2002年9月10日に提出されたU.S.仮出願No.60/409,466(Attorney Docket No.GC774P)に対し優先権を主張する。これらの全ては、引用によりここに援用する。
連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述
この研究の一部はU. S.エネルギー省の請負契約No.DE-AC36-99GO010337の国立リニュウアブルエネルギー研究所の下請契約No.ZCO-0-30017-01により資金援助された。それに応じて、米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
本発明は、細胞培養からのタンパク質の生産を改善する方法に関係する。本発明は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で、遺伝子からタンパク質生産量を劇的に増加させる培養成分及び条件を開示する。この改良された方法は、さまざまな非相同構築物はもちろんのこと、自然発生セルラーゼ遺伝子によりエンコードされたタンパク質の生産においても用いることができる。
糸状菌及びセルロース分解性細菌は、β-(1, 4)-グルコシド結合を加水分解してグルコースを生産する能力を有機体に与える、細胞外セルラーゼ酵素を生産する。これらの酵素は、有機体へ最も豊富な植物性糖類であるセルロースを成長に利用する能力を与える。
糸状菌、トリコデルマレーシは、セルロース酵素の最も効果的な生産体である。トリコデルマレーシのその能力は、燃料エタノール、衣類、界面活性剤、繊維、および他の製品等の商品の生産において有用である酵素を生産することに利用されてきた。
このトリコデルマレーシタンパク質のセルラーゼ分解性混合物は最も特徴的な微生物のセルラーゼ分解経路の中の一つである。これらの混合物からなるセルラーゼは、2の大きなカテゴリーに分類される：エンドグルカナーゼ(EG)及びセロビオハイドラーゼ(CBH)である。β-グルコシダーゼもまた、トリコデルマレーシのセルラーゼ混合物の一部である。
トリコデルマレーシは、その能力を非相同タンパク質の生産にも利用される。目的タンパク質をエンコードした遺伝子は、それらがトリコデルマレーシの誘発cbh1プロモーターと作動可能に結合したときに制御される。外来ポリペプチドはトリコデルマレーシの中で、cbh1の触媒作用領域及びリンカー領域を有する融合タンパク質として研究されてきた(Nyyssonen et al., Bio/technology 11:591-595,1993)。
セルラーゼシステムから成る遺伝子の発現は、転写レベルで調整及び制御される。このシステムのメンバーは、相乗的に作用し、上で述べたように、セルロースを可溶性オリゴ糖にする効率的な加水分解に必要である。
主要なトリコデルマのセルラーゼ遺伝子、cbh1、cbh2、egl1及びegl2の発現及び生産は、成長に利用可能な炭素源に依存している。このセルラーゼ遺伝子は、グルコースよって強く抑制されており、セルロース又は二糖ソホロースにより数千倍に誘発される。すなわち、主要なセロビオハイドラーゼ1(cbh1)の発現レベルは、グルコース含有培地と比較して、セルロース又はソホロース等の炭素源含有培地で数千倍に高められる(Ilmen et al., App. Environ. Microbio.,1298-1306,1997)。
セルラーゼ酵素の商業スケールでの生産は、バッチ培養、フェドバッチ培養及び灌流培養を含む固体及び浸水培養のいずれかによる。工業的セルラーゼ生産の最も困難で費用がかかる態様は、トリコデルマに対する適切な誘導因子を供給することである。研究室規模の実験では、商業的規模のセルラーゼ生成物は、固形セルロース上の菌類の成長によって、又は乳糖のような二糖類の誘導因子の存在下での微生物の培養により、誘発することができる。あいにく、工業的な規模では、これら両誘発方法は、セルラーゼ生産における高コストを結果として生じるという欠点を有する。
セルラーゼ合成は、セルロース誘発とグルコース抑制を受ける。従って、誘導プロモーターの制御下でセルラーゼ酵素又は非相同タンパク質の生産に影響する重要な要素はセルロース基質とグルコース濃度との適正バランスを維持することである；このことは制御された遺伝子産物の合理的な商業生産を得るために重要なことである。セルロースは効果的で安価な誘発因子であるが、トリコデルマが固形培地上で成長するときに、グルコース濃度を調節することが問題となる。セルロースの低い濃度では、グルコース生成は、アクティブな細胞成長と機能の代謝ニーズを満たすために過度に遅くなる。一方、グルコース生成が消費より早くなると、グルコース抑制によりセルラーゼ合成は停止する。従って、ゆるやかな基質添加及び、グルコース濃度を監視するための高価なプロセス制御機構が必要とされる(Ju and Afolabi,Biotechnol. Prog., 91-97,1999)。さらに、基質をゆっくり継続的に供給する場合には、最終的にセルロース系材料の固形物を生産することが困難である。
Allen及びMortensen (Biotechnol. Bioeng., 2641-45,1981)は、50%グルコース濃縮液で培養したアスペルギウス ホエニシス由来精製β-グルコシダーゼ200IU/mlが、炭素源を使用したとき、セルラーゼ生成を誘発する能力を有する溶液を生産することを示した。β-グルコシダーゼの精製は時間を費やすと共に高価である。加えて、これらの著者は、最近の研究における量と比較して、20倍以上のグルコシダーゼを使用した。
誘発素材としてのセルロースの使用に関するいくつかの問題は、可溶性基質の使用及び乳糖又はソホロース等の誘発物の使用によって解決することができる。ラクトースは誘発物及び炭素源として機能するためには、高濃度で供給されなければならない(Seiboth, et al., Mol. Genet. Genomics, 124-32,2002参照)。ゲンチオビオースも誘発物として役立つ。ソホロースはセルロースより強力な誘発物質であるけれども、高価で、製造が難しい。従って、ソホロースは取り扱い及び管理が固体セルロースより容易であるにもかかわらず、セルラーゼ生産コストを法外に高価にする。従って、ソホロースは商業用のセルラーゼ生産に関しては非現実的である。明らかに、糸状菌、例えば、トリコデルマレーシ中にセルラーゼを生産する安価な方法を提供する便利な可溶性基質組成物に対するニーズが存在する。
加えて、安価な誘発因子と共に、内因性または外因性のどちらかの遺伝子を発現するための誘発プロモーターを調節する能力は大きな商業的利点である。
発明の概要
セルラーゼ全体調製物が濃縮グルコース溶液に添加され、この調製物がすくなくとも50℃から約65℃で培養されるとき、セルラーゼ遺伝子発現の誘発に適切な量を含む糖混合物が生産されることが発見された。驚くべきことに、この得られた複合混合物(糖混合物)は、さらなる精製を必要せずに、セルラーゼ生成物を十分に誘発する能力を有していた。グルコースがトリコデルマレーシ中のセルラーゼ遺伝子の抑制物質として作動するので、この発見は驚くべきである。この発見は、ラクトース又は精製ソホロースよりも安価で、トリコデルマレーシのセルラーゼ生産に対する固形セルロースよりも取り扱いやすい、セルラーゼ遺伝子発現の誘発物質を供給する。
ある実施態様では、本発明は、(i) 約5%から約75%(wt/wt)のグルコース、好ましくは50%から70%グルコース及び(ii)約2g/Lから約10g/Lの総タンパク質、好ましくは、5g/Lのセルラーゼ全体調製物からなり、遺伝子発現を誘発する組成物内部で成形される前に約50℃から70℃で数日間インキュベートされる、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列制御下で発現する遺伝子発現を誘発する組成物を供給する。
他の実施態様では、この誘発供給組成物は、使用に先立ち、約50℃から約65℃で、好ましくは約55℃で48時間培養される。
他の実施態様では、この誘発供給組成物は、使用に先立ち、約50℃から約65℃で、好ましくは約65℃で72時間培養される。
好ましい実施態様では、セルラーゼ全体調製物と濃縮グルコース溶液の培養の結果生じる培養産物は、ソホロースを含む糖混合物である。他の好ましい実施態様ではこの培養産物はゲンチオビオースを含む糖混合物である。
ある実施態様では、本発明は、細胞培養が提供され、濃縮グルコース溶液中のセルラーゼ全体調製物の培養の結果生ずる誘発供給組成物が、誘発プロモーター配列に制御されている遺伝子発現の誘発に対して効果的な量を含む培地に添加されることを特徴とする、遺伝子発現が誘発プロモーター配列に制御されるタンパク質生産方法を提供する。
この改善された方法は、自然発生セルラーゼ遺伝子によってエンコードされたタンパク質だけでなくさまざまな非相同構築物からエンコードされるタンパク質の生産に用いることができる。そのような構築物は、目的タンパク質をエンコードしている遺伝子であり、誘発プロモーターに作動可能に連結する発現ベクターを含んでいる。ある実施態様では、この誘発プロモーターは、セルラーゼ遺伝子プロモーターである。第二の実施態様ではこの誘発なプロモーターは、ソホロース誘発プロモーターである。第三の実施態様では、この誘発プロモーターは、ゲンチオビオース誘発プロモーターである。１の側面においては、この誘発可能プロモーターはcbh1プロモーターである。
ある実施態様では、重要なタンパク質を生産するこの方法は、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン及び抗体を含む群から選択されるタンパク質を生産する。１の側面では、この方法は自然発生するセルラーゼ酵素であるタンパク質を生産するのに用いられる。他の側面では、この方法は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下では自然発生しないタンパク質を生産するのに用いられる。
他の実施態様では、タンパク質を生産するこの方法は、糸状菌を用いる。１の側面では、この菌類はトリコデルマである。他の側面では、この菌類はトリコデルマレーシである。
さらなる実施態様では、目的タンパク質を生産するこの方法は、セロビオース溶液へのセルロース全体調製物の添加により生成される誘発組成物を用いる。そして、このセルラーゼ-セロビオース溶液は少なくとも2日間、50℃から約70℃で誘発供給組成物を形成するために培養される。他の側面では、この溶液は50℃から約65℃で少なくとも2日間誘発供給組成物を形成するために培養される。この組成物は、適切な量のセルラーゼ遺伝子発に対する誘発物質を含んだ糖混合物である。
発明の詳細な説明
糸状菌トリコデルマレーシは、最も広範にわたり研究されたセルロース分解性の有機体である(例えば、Nevalainen and Penttila, Mycota, 303-319,1995参照)。工業的には、トリコデルマのセルロース分解酵素は、燃料エタノール、紙、レーヨン、セロファン、洗剤及び繊維を含む多くの目的に用いられている。セルロース分解酵素はまた、動物用飼料の栄養価を改善するため、及び、植物細胞からの重要成分の抽出を容易にするために用いられる(Mandels, Biochem. Soc. Trans., 414-16. 1985)。従って、これらの酵素は多くの有益な製品の生産において重要である。
トリコデルマにおけるセルラーゼ生成は、利用可能な炭素源に依存している。セルロース、ラクトース及び2糖ソホロースは、トリコデルマレーシによるセルロース合成を誘発する。反対に、グルコースが存在するとセルラーゼ遺伝子発現の強い抑制を生ずる。工業的規模生産のために適切な誘発物質を提供することはセルラーゼ酵素の高い生産コストを改善する主要な問題点である。
セルラーゼ全体調製物が濃縮グルコース溶液に添加され、この組成物が約50℃から約70℃で、好ましくは約50℃から約65℃で、少なくとも2日間培養されたとき、セルラーゼ遺伝子発現について適切な量の誘導物質を含む糖混合物、すなわち、誘発供給組成物、が得られることが発見された。この誘発供給組成物は、約2から25g/Lのソホロースを有している。加えて、この誘発供給組成物は約35g/Lから60g/Lゲンチオビオースを有している。驚くべきことに、この得られた混合物は、より一層のいかなる精製をも必要とない。そのままでセルラーゼ生産を誘発するのに十分なのである。この発見は、工業生産において必要とされるラクトース又は精製ソホロースに替わる安価な他の方法だけでなく、糸状菌中で誘発プロモーター制御タンパク質の生産のための固体セルロースに替わるより簡単な別の方法をも提供する。本発明の組成物はトリコデルマにおけるセルラーゼ生成に有用であることは明確である。
この誘発供給組成物の代替的生産方法において、最終発酵ブロス(セルラーゼ全体及び細胞)は(例えば、20％の)グルコース溶液へ添加される。この細胞の存在はソホロース形成には影響しない。従って、回収セルラーゼ(すなわち、細胞から単離したセルラーゼ調製物)を使用する必要はない。発酵の最後に存在しているこの酵素混合物は、細胞が含まれていても、使用することができる。
ある実施態様では、本発明は、糸状菌による目的タンパク質の生産に対しての誘発供給組成物として用いられる濃縮グルコース溶液及びセルラーゼ全体調製物からなる組成物を提供する。ある側面において、目的タンパク質はセルロース分解酵素である。他の側面において、この目的タンパク質は、非相同タンパク質である。ある実施態様では、この誘発供給組成物は、トリコデルマレーシにより生産されるセルラーゼ酵素を含む。セルラーゼ遺伝子はグルコースの存在により抑制されることが知られていることから、この溶液がセルラーゼ遺伝子発現の誘発に効果的であることは、驚くべきことである。
他の実施態様では、誘発供給組成物は、5%-75%(wt/wt)グルコース無菌液を調製することにより得られる。トリコデルレーシ由来セルラーゼ全体調製物は、最終濃度が2gから20g総タンパク質/Lになるように無菌グルコース溶液に添加される。この最終タンパク質濃度の幅は、0.5g/Lから50g/Lである。ある側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は1.5IU/ml以上である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は200IU/ml以下である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は1.5IU/ml及び200IU/mlの間である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は1.9IU/ml及び200IU/mlの間である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は9.3IU/ml及び200IU/mlの間である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は1.5IU/ml及び180IU/mlの間である。他の側面では、このグルコース溶液のβ-グルコシダーゼ活性は9.3IU/ml及び180IU/mlの間である。この溶液は50℃から70℃の温度で、好ましくは、50℃から65℃の間の温度で培養される。この溶液は、振とう下で8時間から7日間の間培養される。ある実施態様では、培養期間は2日間以上である。第二の実施態様では、インキュベーション期間は2日間である。第三の実施態様ではインキュベーション期間は3日間である。この最終的な無菌溶液は収穫され、発酵の栄養となる。ある実施態様では、この誘発供給物質は60%(wt/wt)のグルコース溶液を用いて調製される。他の実施態様では、誘発供給は最終濃度が2g総タンパク質/Lになるようにセルラーゼ全体調製物をグルコース溶液に添加することにより調製される。
本発明の他の目的は、宿主糸状菌を用いて、この糸状菌に対して非相同なタンパク質の発現又は分泌を提供することである。このタンパク質は、自然発生的セルラーゼタンパク質だけでなく変異体非相同タンパク質をも含んでいる誘発プロモーター配列によって発現が制御されている遺伝子を誘発することにより生産される。好ましい実施態様では、誘発プロモーター配列によって制御されているこのタンパク質は、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン又は抗体である。
以下の属を含む多種の糸状菌は発現宿主として用いられる：アスペルギウス、トリコデルマ、ニューロスポラ、ペニシリウム、セファロスポリウム、アキヤ(Achlya；ワタカビ)、ポドスポラ、エンダチア、ムコール、コクリオボールス及びピリキュラリア。具体的な発現宿主は、トリコデルマレーシ、例えば、NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767、トリコデルマビリデ、例えば、ATCC 32098及び32086、アスペルギウスニドゥランス(Yelton, M., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1470-1474; Mullaney, E. J. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45; John, M. A. and J. F. Peberdy (1984) Enzyme Microb. Technol. 6, 386-389; Tilburn, et al. (1982) Gene 26, 205-221; Ballance, D. J. et al., (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 112, 284-289; Johnston, I. L. et al. (1985) EMBO J. 4, 1307-1311))、アルペルギウスニガー(Kelly, J. M. and M. Hynes (1985) EMBO 4, 475479)、アスペルギウスアワモリ例えば、NRRL 3112、ATCC 22342、ATCC 44733、ATCC 14331 及び UVK 143f、アスペルギウスオザリエ、例えば、ATCC 11490、ニューロスポラクラッサ(Case, M. E. et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 76, 5259-5263; Lambowitz U.S. Pat. No. 4,486,553; Kinsey, J. A. and J. A. Rambosek (1984) Molecular and Cellular Biology 4, 117-122; Bull, J. H. and J. C. Wooton (1984) Nature 310, 701-704)を含む。
好ましい実施態様では、トリコデルマ、フミコーラ、フサリウム、アスペルギウス、ストレプトマイシン、サーモモノスポラ、バチルス又はセルロモナス種のメンバーである微生物宿主であることが好ましい。
I. 定義
「抗体」は、イムグロブリン遺伝子からのフレームワーク領域又は、抗原を認識しそれと特異的に結合する、それらの断片からなるポリペプチドであると定義される。確認されている免疫グロブリン遺伝子は、無数のイムノグロブリン免疫グロブリン可変部領域遺伝子と同様にカッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、およびミュー定常域遺伝子を含んでいる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかと分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、それらは順番にそれぞれ免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及び IgEと定義される。一般に、抗体の抗原結合領域またはその機能的等価物は結合の特定性と親和性においてとても重大である。Paul、Fundamental Immunology参照。
典型的なイムノグロブリン(抗体)構築単位は、4量体からなる。各4量体はポリペプチド鎖の2つの同一の対、から構成されており、各対は1の「軽」鎖(約25 kD)及び1の「重」鎖(約50-70 kD)を有している。個々の鎖のN末端は、主に抗原認識に関係する約100から110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域と定義される。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)はそれぞれ軽鎖及び重鎖と定義される。
「セルラーゼ」、「セルロース分解酵素」又は「セルラーゼ酵素」は、細菌性の又は菌類性エキソグルカナーゼ又はエキソセロビオハイドラーゼ、及び/又はエンドグルカナーゼ、及び/又はβ-グルコシダーゼを意味する。これらの3の異なる型のセルラーゼ酵素は相乗的に作用し、セルロース及びその誘導体をグルコースへ転化する。
木材腐敗菌であるトリコデルマ、堆肥バクテリアであるサーモモノスポラ(現サーモビヒダ)、バチルス及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び糸状菌フミコーラ、アスペルギウス及びフザリウムを含む多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を作る。これらの微生物から作られるこの酵素は、セルロースのグルコース転化有用な作用をする3タイプのタンパク質；エンドグルカナーセ(EG)、セロビオハイドラーゼ(CBH)、及びベータ-グルコシダーゼ(BG)の混合物である。
ここで用いる、「セルラーゼ全体調製物」及び「セルラーゼ全体組成物」は互換的に用いられ、自然発生及び非自然発生組成物の両方を定義する。「自然発生」組成物は、自然発生源によって生産されるものであって、1以上のセロビオハイドラーゼタイプ、1以上のエンドグルカナーゼタイプ及び1以上のβ-グルコシダーゼタイプから構成され、これらの組成物は自然発生源により生産された比率で存在する。自然発生組成物は、セルロース分解酵素に関して、成分酵素の比率が自然界の有機体によって生産されるものと変わらないように、修飾されていない有機体によって生産されたものである。
「非自然発生」組成物は、(1)自然発生の割合又は非自然発生の割合、すなわち、改変割合のどちらかの割合でセルロース分解酵組成物と結合している組成物；又は(2)1以上のセルロース分酵素を過剰発現するように又は発現しないように修飾された有機体；又は(3)少なくとも1のセルロース分解酵素が欠失するように修飾された有機体、によって生産された組成物を包含する。
本発明に有用なセルラーゼ全体混合物は、1以上の各種EGs及び/又はCBHsの欠失を有する。例えば、EG1は単独で、又は他のEGs及び/又はCBHsと共に欠失している。BGsはネイティブレベルと比較して過剰発現している場合もある。BGsの非相同発現もここでは意図している。
「炭素制限」は、微生物が、要求されたタンパク質を生産するのに十分な炭素を持っているけれども完全に生物の必要量、例えば成長維持(sustain growth)を満たすのには十分な炭素量ではないという状態をいう。従って、最大の量の炭素はタンパク質生産に用いられる。
ここで用いる、「プロモーター」又は「セルラーゼプロモーター」は下流遺伝子の転写に直接作用する核酸配列を言い、ここでは互換的に使用される。このプロモーターは、通常目的とする遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。所定の遺伝子を発現するために、その他の転写及び翻訳調節核酸配列(「制御配列」ともいう)とを組み合わせたプロモーターが必要である。通常、転写及び翻訳調節配列は、制限されないが、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列及びエンハンサー又は活性化配列を含む。1の側面では、このプロモーターは誘発プロモーターである。他の側面ではこのプロモーターはゲンチオビオース、セルロース及びソホロースから成る群より選択される誘発物質によって誘発される。他の側面では、このプロモーターは遺伝子バンク信託番号D86235に寄託されているトリコデルマレーシcbh1プロモーターである。他の側面では、この遺伝子はトリコデルマレーシ由来のcbh II又はキシラナーゼプロモーターである。
ここで用いる「プロモーター配列」は、目的とする発現に応じた特定の糸状菌によって認識されるDNA配列である。「プロモーター」は核酸の転写を指示する核酸制御配列でると定義される。ここで用いるように、プロモーターはポリメラーゼIIタイププロモーターの場合のTATAエレメントのように転写開始位置の近くの必要な核酸配列を含む。「構造」プロモーターは、大部分の環境及び発達可能条件の下で活性化するプロモーターである。「誘発」プロモーターは、環境の又は発達可能調節の下で活性化するプロモーターである。本発明に有用な誘発プロモーターの例は、トリコデルマレーシcbh1プロモーターである。「作動可能に結合する」という語は、第二配列に応じて核酸の転写を指示する、核酸発現制御配列(プロモータ又は転写因子結合部位の配列等)及び第二核酸配列との間の機能的な結合を言う。
プロモーターの例は、アスペルギウスアワモリ又はアスペルギウスニガーグルコアミラーゼ遺伝子(Nunberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4,2306-2315 ; Boel, E. et al. (1984) EMBO J. 3, 1581-1585)、ムコアミエヘイ(Mucormiehei(ケカビ)) カルボキシプロテアーゼ遺伝子、ここでは、 トリコデルマレーシセロビオハイドラーゼ I 遺伝子(Shoemaker, S. P. et al. (1984) European Patent Application No. EP00137280A1)、アスペルギウスニドュランスtrpC遺伝子(Yelton, M. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1470-1474 ;Mullaney, E. J. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199,37-45)、アスペルギウスニドュランスalcA遺伝子(Lockington, R. A. et al. (1986) Gene 33,137-149)、アスペルギウスニドュランスtpiA遺伝子(McKnight, G. L. et al. (1986) Cell 46,143-147)、アスペルギウスニドュランスamdS遺伝子(Hynes, M. J. et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3,1430-1439)、トリコデルマレーシxin遺伝子、 トリコデルマレーシcbh2遺伝子、トリコデルマレーシeg1 遺伝子、トリコデルマレーシeg2遺伝子、トリコデルマレーシeg3遺伝子、由来プロモータ及びSV40 初期プロモーター(early promoter)等の高等真核生物のプロモーター (Barclay, S. L. and E. Meller (1983) Molecular and Cellular Biology 3,2117-2130)を含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係で位置する場合に「作動可能に結合する」という。例えば、分泌リーダー(すなわち、シグナルペプチド)をエンコードするDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、当該ポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結し；プロモータ又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結し；或いは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置に存在する場合に、コード配列に作動可能に連結する、という。一般に、「作動可能に結合」とは、結合するDNA配列が隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接しかつリーディング・フェイス(reading face)中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適宜の制限部位における連結反応(ligation)により達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来法にしたがって合成オリゴヌクレオチド・アダプタ、又はリンカーを用いる。
本明細書において、「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するDNA断片を意味し、そのコード領域の前及び後の領域(例えば、5’非翻訳配列(5’UTR)又は 「リーダー」配列、及び3’UTR又は「トレーラー(trailer)」配列)、及び個々のコード部分(エキソン)間の介在配列(イントロン)を含んでも含まなくてもよい。
遺伝子は、治療に関して重要なタンパク質又はペプチド(例えば、成長因子、サイトカイン、リガンド、レセプター、及び阻害剤(抑制因子))、さらには、ワクチン及び抗体をエンコードする。当該遺伝子は、商業的に重要な工業用タンパク質又はペプチド、例えば酵素(プロテアーゼ、アミラーゼ及びグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、及びリパーゼ)をコード化することができる。当該遺伝子は、自然発生遺伝子、変異遺伝子、又は合成遺伝子である。
本明細書において、「組換え体」という語には、非相同核酸又はタンパク質の導入又は天然核酸又はタンパク質の変性により修飾された、細胞、核酸、タンパク質またはベクター又はそのように修飾された細胞由来の細胞についても用いられる。従って、例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に同一の形態では見られない遺伝子を発現し、或いは意図的な人間の介入の結果として発現しようがまたは全く発現されまいが、それがなければ異常発現する天然型遺伝子を発現する。
「分泌シグナル配列」とは、合成される細胞内の分泌経路を通して、より大きなポリペプチドを導くより大きなペプチドの構成物であるポリペプチド(分泌ペプチド)をエンコードしているDNA配列を意味する。このより大きなペプチドは、通常、分泌経路を通過する間に分泌性のペプチドを取り除くために切断される。
「誘発」は、「誘発物質」の存在に反応して、大きく増加した割合で、細胞又は有機体の中で、目的タンパク質の合成を結果として生じる遺伝子の転写を増加することを言う。目的タンパク質の誘発を測定するために、潜在的な誘発物質と共に処置された細胞は、誘発物質をともに処置されなかった対照サンプルと比較される。対照サンプル(誘発物質とともに処置されなかったサンプル)は、相対タンパク質活性値が100％であるとされる。ポリペプチドの誘発は、この活性値を対照(誘発物質とともに処置されなかったサンプル)と比較した場合、100％以上、110％以上、より好ましくは150％、より好ましくは200-500％(すなわち対照と比較して2から5倍活性が高い)、又はより好ましくは1000-3000％以上高くなる。
本発明の「糸状菌」は、真核微生物及び真菌門亜門に属する全ての糸状菌を含む(Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, New York: Wiley参照)。これらの菌類はキチン、セルロース、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁からなる栄養菌糸を有することが特徴である。本発明の糸状菌は形態的に、生理的に、および遺伝的に、酵母とは別個である。糸状菌による栄養生長は菌糸の伸長によるものであり、炭素異化は必然的に好気性である。一方、S. cerevisiaeなどの酵母による栄養生長は単細胞の葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は酵素である。S. cerevisiaeは非常に安定した複相の突起(prominent)を有している、一方、例えば、アスペルギウス及びニューロスポラのような糸状菌では、複層は成熟分裂の前にただ簡単に存在しているだけである。アスペルギウスニドゥランス及びニューロスポラクラッサはそれぞれ8及び7の染色体を有しているのに対してS. cerevisiaeは17の 染色体を有している 。S. cerevisiaeと糸状菌の違いについての近年の解説は、アスペルギルス及びトリコデルマのイントロンを処理するS. cerevisiaeの能力のないこと、及び糸状菌の多くの転写調節と認められる能力がないことを示唆している。
「グルコシダーゼ」は、最終生産物がグルコースである任意の酵素を言う。
「非相同」という語は、核酸の一部に関して用いる場合には、自然の中で同じ類縁同士の中では見られない、2以上のサブシークエンスからなる核酸のことをいう。この核酸は典型的には組替え技術によって、例えば、新しい機能的な核酸を作るようにアレンジされた無関係の遺伝子由来の2以上の配列、例えば1のソースからのプロモーター及び他のソースからのコード領域を用いて生産される。同様に、非相同タンパク質は、天然におけるお互いの同じ類縁同士には見られない2以上のサブシークエンスを言う(例えば、融合タンパク質)。
「培養生成物」は、特定の期間、ある高められた温度で保留又は培養された溶液を言う。
「誘発物質」は、細胞に大量の酵素又はこの誘発物質がない場合には別な方法で生産される他の物質を生産させる任意の成分をいう。
「誘発供給」は、目的とするタンパク質生産物の生産を引き起こすか誘発する微生物へ供給される溶液をいう。
本明細書で用いる「単離」又は「精製」は、必然的に関連している少なくとも1の成分から除去される核酸又はアミノ酸をいう。
II．目的タンパク質又は要求されるタンパク質
「目的タンパク質」及び「要求されるタンパク質」は、ここでは互換的に用いられる。本発明は明らかに細胞内及び/又は細胞外のタンパク質生産を高めるのに有用である。このタンパク質は、相同であるか、非相同である。本発明によって生産されるタンパク質は、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、抗体及び同種のものを含むがこれらに限定されない。
ホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インシュリン及び同種のものを含むがこれらに限定されない。
成長因子は、細胞表面のレセプターに結合して、主に細胞増殖及び/又は分化を活性化するタンパク質である。成長因子は、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、インシュリン様成長因子、形質転換成長因子及び同種のものが含まれるがこれらに限定されない。
サイトカインは、成長因子特有のファミリーである。白血球からはじめに分泌されるサイトカインは、体液及び細胞の両方の免疫反応だけでなく食細胞の活性化をも刺激する。サイトカインは、コロニー刺激因子、インターロイキン(IL-1(α及びβ)、IL-2からIL-13)及びインターフェロン(α、β及びγ)を含むがこれらに限られない。
ヒトインターロイキン-3(IL-3)は、133のアミノ酸残基を含む15 kDaのタンパク質である。IL-3は、骨髄培養から巨核球、好中球、および大食細胞の群体形成を刺激するコロニー刺激因子の一種である。
抗体は大量生産が望まれるいかなる種由来の免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない。この抗体はヒト抗体であることが好ましい。免疫グロブリンは、例えばG、A、M、E、又はDのいかなるクラスのものでもよい。
加えて、「目的タンパク質」又は「目的ポリペプタイド」とは宿主細胞により発現され、分泌されるタンパク質をいう。この目的タンパク質は、現在まで、原核生物の中で表現すると考えられている任意のタンパク質である。ある実施態様では、発現し分泌される目的タンパク質は、シグナルペプチドから成るタンパク質を含む。この目的タンパク質は、この宿主と相同であるかもしれないし、非相同であるかもしれない。例えば、この重要なタンパク質は分泌ポリペプチド、具体的には、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解性の酵素、酸化還元酵素、および植物壁分解酵素から選択される1の酵素である。これらの酵素の例は、アミラーゼ、 プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパー、ラッカーゼ、 フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、 クチナーゼ、 セルラーゼ、 ヘミセルラーゼ、 エステラーゼ、 ペルオキシダーゼ、 カタラーゼ、 グルコースオキシダーゼ、 フィターゼ、 ペゥチナーゼ、グルコシダーゼ、 イソメラーゼ、 トランスフェラーゼ、 ガラクトシダーゼ及びチキナーゼを含む。この分泌ポリペプチドは、ホルモン、成長因子、レセプター、ワクチン、抗体又は同種のものであるかもしれない。ある実施態様では、この分泌タンパク質はセルロース分解酵素である。
II. 分子生物学
ある実施態様では、本発明はトリコデルマレーシ由来セルラーゼ遺伝子プロモーターに制御された非相同遺伝子の発現を提供する。従って、本発明は組換遺伝学の分野のルーチン手技に依存している。本発明で用いる一般的手法を開示しているテキストは、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及び Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)を含む。
糸状菌のセルラーゼ遺伝子プロモーター配列から成る非相同遺伝子は通常、複製および／または発現に用いるトリコデルマレーシ細胞内の形質転換前に媒介ベクター中でクローン化される。これらの媒介ベクターは一般に原核生物のベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクターである。
クローン遺伝子の高いレベルでの発現を得るために、好ましくは、ヘテロ遺伝子は、プロモーターから自然発生セルラーゼ遺伝子中と同じ距離に置かれる。しかしながら、本技術分野で知られているように、この距離についてのくらかの変動はプロモーターの機能を失わずに適応することができる。
その機能を変化させることなく、1以上のヌクレオチドの置き換え、転換、付加、削除によって天然のプロモーターを修飾することができることは本技術分野で公知である。本発明の実施はこのプロモーターのそのような変性を含むが、これらの方法によることを強いるわけではない。
この発現ベクター/構築物は、通常、非相同配列の発現に必要なすべての要素を含んだ転写ユニット又は発現カセットを含んでいる。典型的な発現カセットは、実際には、転写、リボゾーム結合領域、及び翻訳終了における効果的なポリアデニレーションに必要な、非相同核酸配列及びシグナルと作動可能に結びついているプロモーターを含んでいる。このカセットの付加的エレメントは、エンハンサー及び、ゲノムDNAが構造遺伝子として用いられるなら、スプライスドナーと受容部位としての機能を有するイントロンを含む。
本発明の実行は遺伝子構築物中のプロモーターの選択により限定されることはない。けれども、模範的なプロモーターは、トリコデルマレーシcbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1、およびxln2プロモーターである。
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な転写終了に備えて、構造遺伝子の下流に転写終了領域を含む。この終了領域はプロモータ配列と同じ遺伝子から得られる場合もあり、違う遺伝子から得られる場合もある。
どのような菌類性ターミネーターであっても、本発明において機能するけれども、好ましいターミネーターは：アスペルギウスニドゥランスtrpC遺伝子(Yelton, M. et al. (1984) PNAS USA 81: 1470-1474, Mullaney, E. J. et al. (1985) MGG 199: 37-45)、アスペルギウスアワモリ又はアスペルギウスニガーグルコアミラーゼ遺伝子(Nunberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2306, Boel, E. et al. (1984) EMBO J. 3: 1581-1585)、及びムコアミエヘイカルボキシルプロテアーゼ遺伝子(EPO Publication No. 0 215 594)由来のターミネーターを含む。
細胞内に遺伝情報を運ぶために用いる特定の発現ベクターは特に重要でない。真核細胞又は原核細胞内での発現に使われる任意の従来型ベクターが用いられる。標準的細菌性発現ベクターは、バクテリオファージλ及びM13だけでなく、pBR322に基づくプラスミド、pSKF、pET23D等のプラスミド、及びMBP、GST、及びLacZ等の融合発現システムを含む。エピトープタグ(例えばc-myc)は、また、単離を容易に行うために、組換タンパク質に添加することができる。
発現ベクターの中に典型的に含まれるエレメントもまた、組換プラスミドを包含するバクテリアの選択を可能にする抗生物質抵抗性をエンコードしている遺伝子であるレプリコン及び非相同配列の挿入を可能にする非必須領域内特有の制限サイトを含む。選択される特定の抗生物質抵抗性遺伝子は重要ではなく、本分野で知られている数多くの抵抗性遺伝子で任意のものが適切である。原核生物の配列は、それらがトリコデルマレーシの中のDNAの複製または組込みの妨げないようなものが、好ましくは選択される。
本発明の形質転換の方法は、安定した糸状菌ゲノム内への形質転換遺伝子の全部又は一部の組込みを結果として生じる。しかしながら、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持に帰結するような形質転換も意図される。
多くの標準的な形質転換方法は、非相同タンパク質を大量に発現するトリコデルマレーシ細胞系統を作出するために用いることができる。トリコデルマのセルラーゼ生産系統内へDNA構築物を導入するいくつかの既刊方法は、Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17: 169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164,を含み、アスペルギウスについては、Yelton, Hamer and Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, フミコーラについては Bajar, Podila and Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212, ストレプトマイシンにつては Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK 及び バチルスブリジデについては, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138に記載の方法を含む。
任意の宿主細胞内へ外来核酸配列を導入するよく知られた手順が用いられる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラストの融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム、顕微注射、血しょうベクター、ウイルスのベクター及び宿主細胞内へクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又は他の外来遺伝物質を導入するための本技術分野においてよく知られた方法を含む(上記Sambrook et al.参照のこと)。U. S. Patent No. 6,255, 115に開示されているアグロバクテリウム介在トランスフェクションも用いられる。少なくとも1の遺伝子を、非相同遺伝子を発現する能力を有している宿主細胞内へ導入することができる、特定の遺伝子工学手法のみが必要とされる。
発現ベクターが細胞内へ導入された後、形質転換細胞は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下における遺伝子発現に好ましい条件下で、培養される。形質転換細胞の大容量のバッチは、以下で述べる様に培養することができる。最終的には、生産物は、通常の方法により、培地から単離される。
従って、本発明は自然発生セルラーゼ遺伝子、融合DNA配列及び様々な非相同構築物を含んでいるセルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で発現する目的となるポリペプチドの発現と高分泌を提供する。
III. 糸状菌
糸状菌は、真菌門亜門及び卵菌類を形成する全ての糸状菌を含む。糸状菌は、菌糸の伸長及び有酸素が必須である炭素異化による栄養成長に用いられるキチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている、細胞壁を有する栄養菌糸を有することが特徴である。
本発明においては、糸状菌親細胞は、トリコデルマ、例えば、トリコデルマロンギブラキアタム(レーシ)、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギ、トリコデルマハルジアウム(Trichoderma harzianum)；ペニシリウムsp.；フミコーラインソランスを含むフミコーラsp.；クリソスポリウムルクノウエンスを含むクリソスポリウムsp.；グリゴクラディウムsp.；アスペルギウスsp.；フザリウムsp.、ニューロスポラsp.、ハイポクレアsp.及びエメリセラsp.を含むがこれらに限定されない。ここで用いるように、「トリコデルマ」又は「トリコデルマsp．」は、従来からトリコデルマとして分類されているか、又は、現時点でトリコデルマと分類されている任意の糸状菌系統を言う。
ある好ましい実施態様では、この糸状菌親細胞は、アスペルギウスニガー、アスペルギウスアワモリ、アスペルギウスアキュレアタス又はアスペルギウスニドゥランス細胞である。
他の好ましい実施態様では、この糸状菌親細胞は、トリコデルマレーシ細胞である。
V.タンパク質発現
本発明のタンパク質は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列で発現が制御される遺伝子を含む発現ベクターにて形質転換した培養細胞により生産される。本発明は、細胞内及び/又は細胞外タンパク質生産を高めることについて特に有用である。このタンパク質は、相同であるか、非相同である。本発明によって生産されるタンパク質は、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、抗体及び同種のものを含むがこれらに限定されない。
酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、フェノールオキシダーゼ、パーミアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ラッカーゼ、及びプロテインジスルフィドイソメラーゼ等の加水分解酵素を含むがこれらに限定されない。
ホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インシュリン及び同種のものを含むがこれらに限定されない。
成長因子は、細胞表面のレセプターに結合して、主に細胞増殖及び/又は分化を活性化するタンパク質である。成長因子は、血小板由来成増殖子、表皮増殖因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様成長因子、形質転換成長因子及び同種のものが含まれるがこれらに限定されない。
サイトカインは、成長因子特有のファミリーである。白血球から第一に分泌されるサイトカインは、体液及び細胞の両方の免疫反応だけでなく食細胞の活性化をも刺激する。サイトカインは、コロニー刺激因子、インターロイキン(IL-1(α及びβ)、IL-2からIL-13)及びインターフェロン(α、β及びγ)を含むがこれらに限られない。
ヒトインターロイキン-3(IL-3)は、133のアミノ酸残基を含む15 kDaのタンパク質である。IL-3は、骨髄培養から巨核球、好中球、および大食細胞の群体形成を刺激するコロニー刺激因子の一種である。
抗体は大量生産が望まれる種由来の免疫グロブリンをも含むがこれらに限定されない。この抗体はヒト抗体であることが特に好ましい。免疫グロブリンは、例えばIgG、IgM、IgA、IgE、又はIgDのいかなるクラスのものでもよい。
本発明における目的タンパク質は、他の非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した目的タンパク質を含むキメラ分子を形成することによって修飾されるかもしれない。ある実施態様では、アンチタグ抗体に対するエピトープを提供するタグポリペプチドと目的タンパク質の融合から成るそのようなキメラ分子は、選択的に結合することができる。このエピトープタグは、通常、目的タンパク質のアミノ又はカルボキシ末端に設置される。
さまざまなタグポリペプチド及びそれら個々に対する抗体は本技術分野においてよく知られている。例は、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；HIS6及び金属キレート化タグ、フルHAタグ(the flu HA tag)ポリペプチド及びその抗体12CA5(Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988))；c-mycタグ及び8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10(Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616 (1985))；それに加えて、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインD(gD)及びその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6): 547-553 (1990))を含む。他のタグポリペプチドは、FLAG-ペプチド(Hopp et al., BioTechnology 6: 1204-1210 (1988))；KT3エピトープペプチド(Martin et al., Science 255: 192-194 (1992))；チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J.Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991))；及びT7遺伝子10プロテインペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6393-6397 (1990))を含む。
代替的な実施態様では、このキメラ分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定部位と目的タンパク質との融合から成る。キメラ分子の二価形成について、融合はIgG分子のFc領域に結合する。
前記遺伝子の発現に適切な条件は、本発明の誘発供給組成物を培地に供給することである。タンパク質生産についての最良の条件は、宿主細胞の選択及び発現させるタンパク質の選択に伴い様々である。そのような条件はルーチン実験または最適化を通じて当業者が容易に確かめることができるものである。
目的タンパク質は、通常、発現の後に精製され又は単離される。この重要なタンパク質は、サンプルの中に存在している成分に応じて、当業者によく知られている様々な方法で単離又は精製される。標準的な精製方法は、電気泳動、イオン交換、疎水性、親和性、及び逆相HPLCクロマトグラフィーを含む、分子学的、免疫学的及びクロマトグラフ技術及びクロマトフォーカシングを含む。例えば、目的タンパク質は、標準抗体重要タンパク質抗体カラムを使って、精製される。限外濾過と透析濾過の技術も、タンパク質濃縮に関して有益である。適切な精製技術に関する一般的な説明に関してはScopes, Protein Purification (1982)参照のこと。必要な精製度は、目的とするタンパク質の使用に応じて様々である。精製が必要でない場合もある。
IV. 発酵
本発明は、菌類と細菌を培養するための発酵方法に依存している。セルラーゼ酵素を生産するための発酵方法はそれ自体、本技術分野でよく知られている。例えば、バッチ培養、フェドバッチ培養及び灌流培養を含む固体及び浸水培養のいずれかにより生産することができる。
培養は、1以上の特定の微生物種の開始接種材料はもちろんのこと、水溶性ミネラル塩培地、有機成長因子、炭素及びエネルギー源物質、酸素分子を含む成長培地で行われる。
炭素とエネルギー源、酸素、同化窒素、および微生物の接種材料に加えて、適切な微生物の生成を確実にし、炭素の同化と微生物の遺伝子変換過程におけるエネルギーを最大化し、発酵培地の中で最大の細胞密度を持つ最大の細胞収率を達成するために、適切な割合における適切な量のミネラル栄養分の供給が必要とされる。
水溶性ミネラル組成物は、本技術分野で知られているように、用いられる微生物及び基質に部分的に依存して、広い幅で変化する。このミネラル培地は、当該技術分野で知られているように、適切な可溶性同化可能イオン及び結合形態中に、窒素源に加えて、適量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、およびナトリウムを含んでおり、好ましくは、適切な可溶性同化形態中において、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、およびヨウ素など微量元素及び、他のものを含む。
発酵反応は酸素分子が必須の有酸素過程であり、この酸素分子は、微生物のある生存様式における生育を促進するのに有効で適切な酸素分圧とともに、空気、高酸素含有気体、又は精製酸素分子等の分子酸素含有ガス(これらは、発酵管内の内容物を維持するために供給される)より供給される。事実上、酸素で処理された炭化水素基質の使用により、微生物の成長に対する酸素要求は減少する。しかしながら、基質の同化作用と対応する微生物の成長は酸化過程であるので、分子酸素は成長に対して供給されなければならない。
通気速度はかなりの範囲で変えることが可能であるが、通気は、1分あたりの発酵槽内液体体積あたりに含む酸素ガスの体積(使用圧力及び25℃において)が、通常、約0.5から10、好ましくは0.5から7の幅で行われる。この量は、反応器から供給される通常の酸素含量の空気に基いており、精製酸素の場合には、1分あたりの発酵槽内液体体積あたりに含む酸素ガスの体積(使用圧力及び25℃において)は、約0.1から1.7、好ましくは約0.1から1.3である。
微生物の遺伝子変換過程で用いられる圧力は、幅広く変えることができる。通常、圧力は、約0から50psg、好ましくは、約0から30psg、より好ましくは、最終的な設備と操業費用対酸素溶解度のバランスとして、少なくとも大気圧をわずかに上回る圧力である。大気圧より高い圧力は、次々に細胞の生長率を増大することができる水溶性発酵の中で溶存酸素濃度を増大させる傾向があるという利点を有する。しかし、同時に、高気圧は設備と操作コストを増やす。
発酵温度は幾分変えることができるが、トリコデルマレーシのような糸状菌に対しての温度は、約20℃から40℃、一般的に好ましくは、約25℃から34℃の間の温度であり、選択された微生物の系統に依存している。
微生物もまた、同化窒素源を必要とする。この同化窒素源は、微生物による代謝の利用に適切な物の中に放出された窒素を利用可能にする任意の窒素化合物である。タンパク質水解物等の様々な有機窒素化合物が用いられる一方で、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニウムピロリン酸塩、塩安等のアンモニウム塩等の安価な窒素含有化合物又は他の様々なアンモニア化合物を利用することができる。アンモニアガス自身は大容量の操作に便利であり、適切な量を水溶性発酵(発酵培地)に通気するバブリングによって利用することができる。同時に、アンモニアは、pH調整を補助するためにも用いることができる。
水溶性微生物発酵(発酵混合物)中のpHレンジは、通常、約2.0から8.0の間である。糸状菌においては、pHは、通常、約2.5から8.0の範囲内である；トリコデルマレーシにおいては、pHは、通常、約3.0から7.0の範囲内である。特定の微生物に対する好ましいpHレンジは、特定の微生物と同様に、用いられた培地に依存してある程度の幅を有している、従って、このレンジは当業者が容易に見つけることができる培地中の変化に伴い幾分変化する。
発酵槽中の発酵混合物の平均的な保持時間は、用いる発酵温度及び培養物に部分的に依存してかなり変化するが、通常は、約24から500時間、好ましくは、約24から400時間の範囲の中にある。
発酵は、炭素含有基質が、制限因子としてコントロールされることにより行われることが好ましく、それにより、炭素含有基質の細胞に対する効率のよい転化の提供及び、適量の非転化基質による細胞の汚染を避けることができる。いかなる微量成分も容易に洗い落とせるので、後者は水溶性の基質については問題ではない。それは水溶性でない基質の場合に問題となり、適当な洗浄ステップ等の追加製品処理ステップを必要とする場合もある。
上で述べたように、このレベルに到達する時間は重要ではなく、行われる発酵過程及び特定の微生物により、時間は変化する。発酵培地の中でどのように炭素源濃度を決定するか及び、炭素源が要求されたレベルに達しているかどうかを決定することは本技術分野においてよく知られている。
発酵はバッチ操作または連続的操作として実施することができるけれども、フェドバッチ操作は、制御の容易さ、均一な量の生産及び用いる全設備の経済的な観点から最も好ましい。
必要ならば、炭素及びエネルギー源物質の一部または全部及び/又はアンモニアのような、同化可能炭素源の一部は、発酵槽への水溶性ミネラル培地の供給に先駆けて、この水溶性ミネラル培地に添加することができる。
反応器内への個々の流れは、予め決められた速度又は、炭素又は栄養基質濃度、pH、溶解酸素、発酵槽からの排ガスの中の酸素または二酸化炭素、光の透光度の測定による細胞密度等の、モニタリングからの結果に応じて制御される。様々な物質のこの供給速度は、炭素とエネルギー源の効率的な利用との一致した可能な限り急速な細胞増殖速度、基質チャージと関連する微生物細胞の可能な限り高い収率を得るために変化可能である。
バッチまたは好ましくはフェドバッチ操作のどちらかにおいて、すべての設備、反応器、または発酵手段、導管またはコンテナ、配管、付随循環又は冷却装置、及び同種のものは、約120℃で,少なくとも15分間の蒸気にて最初に滅菌される。この滅菌反応器は、酸素を含む必要な全ての栄養素及び炭素含有基質の存在下で、選択された微生物の培地を接種される。現在のところ、15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye, フランス)を用いての操作が好ましいけれども、用いられる発酵槽の型は重要ではない。
発酵ブロスからのセルラーゼ酵素の収集及び精製は、それ自体、本技術分野で知られている手法により行うことができる。この発酵ブロスは、通常、好ましくは本技術分野で知られている手段によって発酵ブロスから単離された目的とする酵素生産物だけでなく、細胞、様々な懸濁物及び他のバイオマス汚染物を含む細胞壊死断片を含んでいる。
単離の適切な過程は、例えば、遠心分離、限外濾過、透析、精密濾過、回転式吸引濾過及び無細胞の濾液を得るために知られている方法を含む。発酵ブロス又は無細胞濾液は、限外濾過、蒸発、または析出等の技術を用いた結晶化に先立って、さらに濃縮することが望ましい。
上澄液または濾液のタンパク様成分の沈澱は、例えば硫酸アンモニウムのような塩によって行うことができ、引き続いて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、又はこれらと同等と認められる他の方法のような各種のクロマトグラフにより精製される。
実施例
以下の例は、本発明を説明するために提供されるが、請求の範囲に記載されている発明を制限するためのものではない。
実施例1
この実施例は、トリコデルマレーシのセルラーゼ遺伝子の発現を刺激する誘発供給組成物の調製方法を示す。この培養は、pH5.0の溶液で行われた。ベータグルコシダーゼに対する培養は、pH4.0-6.5が最も良いことがわかった。
(i)60％(w/w)グルコース溶液は、2.2バールの圧力下、121℃で30分滅菌された。
(ii)無菌セルラーゼ全体調製物は、最終濃度が10gタンパク質/Lとなるようにグルコース溶液に添加された。
(iii)グルコース及びセルラーゼ全体混合物は、75RPMの振とう混合で、65℃で3日間で温められた。
(iv)培養に続いて、無菌液は発酵供給のための適切な容器に収穫された。
最終誘発供給組成物は、16.1のg/Lソホロース、47.5g/Lゲンチオビオース、および約600g/Lグルコースを有していた。他の糖類は存在するかもしれないが、測定されなかった。
誘発供給組成物は、20％及び60％のグルコース溶液から調製された。より高いグルコース溶液は、より高い最終ソホロース濃度を有していた。
セルラーゼ全体調製物は、最終濃度2gから10gタンパク質/Lで使用された。総タンパク質のより高い方が、より高い最終ソホロース濃度を有していた。図6を参照のこと。結局のところ、溶液がより長い期間にわたり培養されるならば、セルラーゼ全体調製液のより低い濃度でのより長い反応は同じソホロースレベルに到達することが予測される。
培養温度もまたソホロース生産に影響を及ぼす。例えば、ソホロース濃度は、65℃で培養されたときには、50℃で培養されたときの2倍であった。
実施例2
以下の例は、どのようにグルコース/ソホロースの栄養供給が行われ、発酵の間にセルラーゼ酵素を生み出すために使われるかを詳説する。
I. グルコース/ソホロース供給の生産
60％(w/w)グルコース溶液は、融解され、121℃、30分間、滅菌された。温度は65℃に低められて、10gのタンパク質(トリコデルマレーシ由来セルラーゼ全体調製物)/Lが添加された。この混合物は、ゆっくり撹拌されて65℃で3日間保持された。このソホロース含有量は60％グルコース溶液中12g/Lと測定された。
II. 発酵
0.8 L 培地は種子フラスコとして、1.5mlのトリコデルマレーシRL-P37凍結胞子懸濁液を接種された。このフラスコは、0.4Lずつ2つに分注され、48時間後に2の異なる15 L Biolafitte発酵槽内の2×7Lの発酵培地に移された。この成長培地は以下の組成からなっていた：
Figure 0005366286
発酵槽は25℃、750RPM、および8標準L／分(SLM)気流で行われた。
グルコース/ソホロースは、試験タンクのバッチ段階にあるグルコースの代わりに添加され、精製グルコースは対照に用いられた。このバッチグルコースは、細胞が成長を停止し炭素制限が始まるポイントである約20時間後に消費された。40％グルコース/ソホロース供給は、0.25g/分で添加され、40％精製グルコースは、対照タンクに添加された(上で説明した栄養供給物から希釈されたもの)。セルラーゼ生産と直接関係する(本発明の完全な細胞外タンパク質とセルラーゼ活性との比較に基づく)全タンパク質はグルコース/ソホロースのタンクの中のバッチ段階の直後に誘発され、グルコース制御タンクの中の段階の後では誘発されなかった。従って、セルラーゼ全体によるグルコースの前処理は、トリコデルマレーシRL-P37によるグルコースの上のセルラーゼを産するために必要とされている。図1を参照のこと。
実施例3
以下の実施例は、どのようにしてグルコース/ソホロース供給がなされ、発酵の間の糸状菌由来非相同タンパク質に用いられるかを詳述する。
誘発供給組成物は実施例1の方法を用いて調製された。
形質転換トリコデルマレーシに用いる発現プラスミドは次のとおりに構成される。目的タンパク質をエンコードしている遺伝子の終了部は、T4DNAポリメラーゼによって鈍化され、トリコデルマ発現ベクター、遺伝子発現に対するCBH Iプロモーター及びターミネーター、及び形質転換に対する選択マーカーとしてのトリコデルマpyr4遺伝子を含むpTEXのPmel制限サイト(本明細書に引用して援用するPCT国際公開公報WO69/23982参照)に挿入された。CBHIプロモーター含有DNA断片、重要なタンパク質をエンコードする遺伝子、CBHIターミネーター及びマーカーpry4はゲルから単離され、4の主要なセルラーゼ遺伝子欠失トリコデルマレーシウリジン栄養要求株の形質転換に用いられる(米国特許No.5,472,6863参照)。形質転換体は、50mlのプロフロ培地(Proflo medium)上で、28℃から30℃で、4日間、振とうフラスコ内で成長し、重要なタンパク質発現は本技術分野でよく知られている方法を用いて分析された。プロフロ培地(Proflo medium)は、(g/l)プロフロ22.5(g/l)；ラクトース30.0(g/l)；(NH4)2SO4 6.5(g/l)；KH2PO4 2.0(g/l)；MgSO47H2O 1.4(g/l)；CoCl2 0.2(g/l)；CaCO3 0.72(g/l)；微量金属保存溶液 1.0m/l及び10％Tween80 2.0ml/lからなる。使用された微量金属保存溶液は、FeSO4-7H2O 5.0(g/l)；MnSO4-H2O 1.6(g/l)；ZnSO4-7H2O 1.4(g/l)；CoCl2-6H2O 2.8(g/l)からなる。
振とうフラスコは実施例2で述べたように、分注され、15L発酵槽内に設置された。目的タンパク質の発現は誘発供給組成物により誘発されたが、グルコース溶液では発現されなかった。
実施例4
この実施例は、誘発供給組成物による生産物に関してどのように酵素が固定化されるかを詳述する。
β-グルコシダーゼを含むセルラーゼ全体ブロスは、米国特許No.5,541,097に記載の方法に従い固定化される。簡単に説明すると、10mgベントナイトを、10％PEIを11ml含んだ500mlの水に添加した。これとは別に、20mlのセルラーゼ全体(200g総タンパク質/L)がpH5.5の0.02M酢酸緩衝溶液250mlに添加された。引き続き、4.44mlの50％グルタルアルデヒド(フィッシャー、試薬用)は、pHが5.5である間に、酵素溶液に添加された。2時間後、この酵素複合体は、総容量が750mlになるように、ベントナイト混合物に添加された。この混合物は、一晩4℃で撹拌された。この混合物はそれから、ブフナー漏斗で収集され、大量の水で洗浄された。この固体は、それから175gmの最終重量で、0.02Mの緩衝酢酸溶液に再懸濁された。
セルラーゼ全体は5以上の酵素を含んでおり、それぞれ異なる活性を有していることから、固定化後に残存している酵素活性を測定することは難しい(固定化酵素は、大麦小麦粉スラリーの粘性を減らすことから、セルラーゼ活性は、存在すると知られていた)。それゆえ、セルラーゼ増量分は、どれだけの活性が残存しているのかではなく、どれだけの酵素が固定化されているのかに基づいて決定される。最終スラリーは0.022gタンパク質/gスラリーと決定された。
固定化酵素からのソホロース生産は、２の異なる酵素増量及びグルコース濃度によって決定された：
1) 23gスラリー+29.5ml 67%(w/w)グルコース=10g/Lタンパク質増量＠40.7%グルコース
2) 7.6gスラリー+ 44.8ml 67%(w/w)グルコース=3. 2g/Lタンパク質増量＠60%グルコース
個々の52.5ml容量は250ml三角フラスコに添加され、100RPMの振とう撹拌で、65℃で数日間培養された。
2のケースの個々のソホロース生産速度は、固定化酵素として添加された同量の酵素溶液が添加された対照より低かった(図2-3)。酵素活性のいくつかは酵素が固定化されるときにその活性を失うことが仮定されるから、この結果は驚くべきことではない。しかしながら、固定化による増量は、酵素がグルコース/ソホロースが供給された複数のバッチを生産するのに用いることができることを示す。図4はグルコース溶液外に遠心分離した固定化酵素及び上で示した実験の繰り返し、1回目及び2回目の試験において、同じ最終濃度ソホロース力価が達成されたことを示している。このことは、少なくとも2回の使用及び同様にそれ以上の使用においても、酵素活性は残存しているということを示している。それゆえ、固定化によるいくつかの酵素活性のロスがあったとしても、この酵素の複数回使用しうる能力は、セルラーゼ固定に、グルコース/ソホロース生産に対する最も魅力的な代替法を与える。
実施例5
この実施例は、出発炭素源としてのセロビオースの使用を伴う誘発供給組成物の生産が、どのように行われるのかを詳述する。
この実施例は、以下に述べることを除いては、ソホロース生産の他の実施例と正確に同じ方法で行われた。図5は、25％セロビオースと、25％グルコースのソホロース生産についての比較である。
ソホロースが自然界においての「本当の」誘発物質であるなら、グリコシル転移経由でソホロースを成形することを要求されるトリコデルマレーシは、事実上グルコースの適度なレベルに遭遇することすら稀であるので、ソホロースはセロビオースから形成される必要があると考えられる。図5は10g/Lセルラーゼとともに培養された25%(w/w)セロビオースに関して、25%のグルコースと比較した結果を示す。セロビオースからのソホロース生産は10g/Lでピークを示し、グルコース単独による生産の3倍の濃度であった。しかしながら、その後、ソホロースはグルコース単独のよる生産と同じレベルにまで低下した(4.1g/L対2.5g/L)。この反応は、セロビオースのすべてが約29時間で切断された後に、残っていったすべてのグルコースと平衡状態に近づいているソホロースを示すようである。
多量のソホロースを成形するために、βグルコシダーゼ酵素が十分な濃度のグルコースと遭遇することは、自然界では非常にありえないことである。細胞が、セルロースの分解産物であるセロビオースの高濃度と遭遇することはよくあることである。図5は、3倍ほどのソホロースがグルコースからよりもセロビオースから生産されることを示している。約29時間で、セロビオースが完全にグルコース及び他のグリコシル転化産物に転化されると同時に、ソホロースレベルは低下するようである(セロビオースのデータは示していない)。このことは、セロビオースが2のグルコースに切断箇所において、活性部位が脱離する前に、再配列及びグリコシル転化が起こるという仮説を支持するものである。セロビオースの実験を続けるにつれ、ソホロースの切断速度は、グルコース転移グリコシル化からのソホロース形成の速度よりも高く、このソホロースレベルは、グルコースレベルが2.5g/Lに対して4.1g/Lと、グルコースレベルに低められた。このデータは、少量のソホロースがβ-グルコシダーゼによるセロビオースの切断により形成されるという可能性を強く支持している。
ここで述べた実験及び実施例は、説明に役立てるだけのものであり、当業者により提案されるであろうわずかな種々の修正及び改変は、本出願の精神及び範囲内及び添付の請求項の範囲内であることが理解されうる。ここに引用されたすべての出版物、特許、および特許出願はすべての目的のためにそれらの全部を参照によって本発明に組み込む。
図1は、グルコース組成物(◆；ひし形)と比較した本発明の誘発組成物(□；白四角)の供給に対する野生型のT.レーシ(RL-37)(Sheir-Neiss and Montenecourt,Appl. Microbio. Biotechnol., 46-53,1984参照のこと)のセルラーゼ生成への効果を説明する。 図2は、酵素溶液(◆；ひし形)と比較した固定化酵素(□；白四角)によるソホロース生産における違いを説明したグラフである。最終グルコース濃度は約40%である。タンパク質増量(loading)は10g/Lであった。詳細は実施例4を参照のこと。 図3は、酵素溶液(△；三角)と比較した固定化酵素(■；黒四角)によるソホロース生産における違いを説明したグラフである。最終グルコース濃度は約60%である。タンパク質増量(loading)は3.2g/Lであった。詳細は実施例4を参照のこと。 図4は、図2及び3で述べた同じ固定化酵素を用いた実験の1回目の実施と2回目の実施との結果を比較したグラフである。固定化酵素は2回目の実施において、1回目の実施の後に保持していた活性まで回復した。記号は: □ (白四角), 10g/L 実験の1回目の実施; ◆(ひし形), 10g/L 実験の2回目の実施; △ (三角), 3.2g/L 実験の1回目の実施; X, 3.2g/L 実験の2回目の実施、である。 図5は、25%グルコースと比較した25%セロビオース中のソホロース生成を示したグラフである。25%(重量パーセント)セロビオース中のソホロース生成は、□；白四角又は25%グルコース溶液(w/w)中のソホロース生成は、●；円で示す。 図6は、60%グルコース溶液(重量パーセント)中の異なったセルラーゼ全体増加分に対するソホロース生成を示したグラフである。△(三角)、2.5g/L、■(黒四角)、5.0g/L、◆(ひし形)、7.5g/L、X、10g/Lセルラーゼ全体。

Claims (22)

  1. a.トリコデルマレーシ由来セルラーゼ全体調製物（β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオハイドロラーゼの混合物）とグルコース溶液とを混合し、1.5IU/ml乃至180IU/mlのβ−グルコシダーゼ活性を有する第一混合物を得る工程
    b.５０乃至７０℃の温度で、８時間乃至５００時間の間行われる上記a.で得られた第一混合物を培養する工程
    からなる、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列制御下で発現する遺伝子発現を誘発するための、2g/L乃至25g/Lのソホロース及び／又は35g/L乃至60g/Lのゲンチオビオース及びグルコースを含む誘発供給組成物を生産する方法。
  2. グルコース溶液が5％から75％(wt/wt)グルコースからなる濃縮グルコース溶液である請求項1の方法。
  3. グルコース溶液が50％から75％(wt/wt)グルコースからなる濃縮グルコース溶液である請求項1の方法。
  4. 溶液が48時間から72時間の間で培養される請求項１の方法。
  5. 請求項1の誘発供給組成物を用いた宿主細胞の提供からなるタンパク質を生産する方法。
  6. 生産されるタンパク質が内因性セルラーゼである請求項5の方法。
  7. 目的タンパク質をエンコードする遺伝子と作動可能に結合しているプロモーターからなる発現構築物により宿主細胞が形質転換された請求項5の方法。
  8. プロモーターがセルラーゼ遺伝子プロモーターである請求項7の方法。
  9. プロモーターがトリコデルマレーシ由来cbh1プロモーターである請求項8の方法。
  10. プロモーターがソホロース誘発プロモーターである請求項7の方法。
  11. プロモーターがゲンチオビオース誘発プロモーターである請求項7の方法。
  12. 目的タンパク質が宿主細胞に対して非相同タンパク質である請求項7の方法。
  13. 非相同タンパク質が、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン及び抗体からなる群より選択される請求項12の方法。
  14. 宿主細胞が糸状菌である請求項5の方法。
  15. 糸状菌が、トリコデルマ、フミコーラ、フザリウム、アスペルギウス、ニューロスポラ、ペニシリウム、セファロスポリウム、アキヤ(Achlya)、ポドスポラ、エンダチア、ムコール、クコリオボールス、ピリキュラリアからなる群から選択される請求項14の方法。
  16. 菌類がトリコデルマspp.である請求項15の方法。
  17. 菌類がトリコデルマレーシである請求項16の方法。
  18. 菌類がペニシリウムspp.である請求項15の方法。
  19. 菌類がペニシリウムフニクロスムである請求項15の方法。
  20. 宿主細胞が細菌である請求項5の方法。
  21. 細菌が、ストレプトミセス、サーモモノスポラ、バシルス、セルロモナスからなる群より選択される請求項20の方法。
  22. トリコデルマレーシ由来セルラーゼ全体調製物（β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオハイドロラーゼの混合物）が固定化される請求項1の方法。
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