JP5902145B2

JP5902145B2 - リン酸化アミノ酸、合成リン酸化ペプチド及び胃石タンパク質を含む安定な非晶質炭酸カルシウム

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Publication number: JP5902145B2
Application number: JP2013269224A
Authority: JP
Inventors: ベントフ、シュムエル; サギ、アミル; ベルマン、アミル; シェフテル、アッサフ
Original assignee: アモルフィカルリミテッド
Priority date: 2007-10-22
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2028-10-22
Also published as: CA2703111C; CN104530208B; US10328100B2; PL2211873T3; EP2251018A2; JP5453283B2; ES2528901T3; DK2211873T3; EP2211873B1; WO2009053967A1; EP2211873A1; HK1209429A1; ES2393041T3; CA2703111A1; EP2251018B1; US20100310677A1; US20160045546A1; CN104530208A; EP2251018A3; JP2014061006A

Description

本発明は、非晶質炭酸カルシウムを含む組成物及びこれを調製する方法に関し、さらに、リン酸化アミノ酸又はペプチドを含む組成物に関する。特に、前記ペプチドは、ＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ１２を含む甲殻類タンパク質から選択される。非晶質炭酸カルシウム及びリン酸化アミノ酸又はペプチドを含む、医薬組成物及び栄養補助食品組成物が提供される。

発明の背景
カルシウムは、シグナル伝達において中心的な役割の一つを演じており、さらに生体系における重要な構成要素である。原生動物から脊椎動物まで、蓄積したカルシウム塩は、動物の堅い身体構造の維持に役立っており、リン酸カルシウムは脊椎動物の内骨格の主要な成分であり、炭酸カルシウムは無脊椎動物の外骨格である。主要構成物質としての炭酸カルシウム無機質を含む石灰化外骨格は、棘皮動物、軟体動物及び節足動物の間に広範囲に及ぶもので、保護をもたらし、カルシウムの貯蔵庫として働いている。一部の甲殻類は、炭酸カルシウムを非晶質状態で一時的に貯蔵し、特に脱皮後の新たな外骨格構造の石灰化の間にすばやく動員するために、より良好に利用できるようにしている。通常、非晶質の無機塩は熱力学的に不安定なので、生体（例えばザリガニの）における非晶質炭酸カルシウムの形成は、かなり興味深い。非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）は、その結晶多形（主にカルサイト、アラゴナイト）に形態変化する傾向がある。ＷＯ２００５／１１５４１４は、ヒトの摂取に容易に利用できる安定なＡＣＣを含む組成物を提供するため、甲殻類の器官を採用している。カルシウムの代謝及び生体力学的な一般的重要性に鑑み、また、ＡＣＣが、栄養補助食品として、潜在的により可溶型で吸収型の炭酸カルシウムなので、本発明の目的は、非晶質炭酸カルシウムを調製する新規の方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、安定なＡＣＣを含む医薬組成物及び栄養補助食品組成物を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、説明が進むと共に明らかになろう。

発明の概要
本発明は、非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）と、リン酸化アミノ酸及びリン酸化ペプチドから選択される少なくとも１つの成分とを含む組成物に関する。前記リン酸化アミノ酸及びリン酸化ペプチドは、ホスホ−セリンもしくはホスホ−スレオニン、又は両方を含んでもよい。前記リン酸化アミノ酸及びリン酸化ペプチドは、本発明の組成物中の炭酸カルシウムの非晶質形態を安定化する。本発明の一つの側面では、前記リン酸化ペプチドは、甲殻類の胃石に由来する。一つの態様では、本発明の組成物は、ＡＣＣ、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸又はペプチド、及びキチン又はキトサンを含む。

別の側面では、本発明は、新規の甲殻類ペプチド、及び炭酸カルシウムの結晶状態に影響を及ぼす際のその使用、並びに製剤の調製におけるその使用に関する。本発明は、また、前記ペプチドの機能性フラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｒａｇｍｅｎｔ）にも関する。以下に関連する単離されたタンパク質としては、ＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ１２（ＧＡＰは、胃石タンパク質（ｇａｓｔｒｏｌｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎ）の略である）があり、本明細書では、前記新規のタンパク質の推定アミノ酸配列が提供され、これらは、配列番号１〜４と表される。本発明は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２４からなる群から選択される配列を基本的に有する、単離され精製された甲殻類ペプチド及びその相同体を提供する。本発明による配列相同体（ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇ）は、配列の少なくとも９０％が保存される、任意の挿入、欠失及び置換があるペプチドである。本発明は、サブ配列をその配列に含む、単離され精製されたペプチドをさらに含み、前記サブ配列は、上述の甲殻類ＧＡＰペプチドのフラグメントであり、好ましくは、サブ配列が、少なくとも１０アミノ酸長である。前記サブ配列は、例えば、配列番号２〜８、配列番号１０〜１６及び配列番号１８〜２３、又は配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２４の配列の他のフラグメントから選択される配列を有してもよい。本発明は、上記に定義した１つもしくは複数のペプチド、又はその誘導体、変異体もしくは機能フラグメント、あるいはその混合物を、非晶質炭酸カルシウム（ＡＣＣ）と共に含む組成物を提供する。前記ペプチドは、前記組成物中の前記炭酸カルシウムの非晶質形態を安定化する。本明細書で用いる用語「機能的に同等なフラグメント、誘導体又は変異体」は、ペプチドの炭酸カルシウム結晶化の抑制能力を妨げない修飾を施されたペプチドを含んでいる。

本発明は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７及び配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、並びにその配列が相同であり、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するペプチドを対象とする。本発明によるペプチドをコードするＤＮＡ配列も、同様に本発明の一部である。本発明で提供されるものは、上記に定義したペプチド又はその誘導体を含有する炭酸カルシウム調製物である。

本発明の好ましい態様では、ＡＣＣを含む炭酸カルシウム調製物が提供され、前記調製物は、少なくとも１カ月は安定である。安定な非晶質炭酸カルシウムの調製方法が開示され、この方法は、カルシウムを含む可溶性塩と、炭酸源と、リン酸化アミノ酸又はリン酸化ペプチドとを水相において任意の順序で混合することを含む。前記炭酸源は、例えば、液相に溶解した炭酸塩を含んでもよく、前記炭酸源は、気体の二酸化炭素を含んでもよい。

本発明では、上記の前記組成物を含む医薬製剤が提供され、この医薬製剤は、本明細書で定義した１つもしくは複数のリン酸化アミノ酸もしくはリン酸化ペプチド、又はその誘導体、変異体もしくは機能性フラグメント、あるいはその混合物をＡＣＣと共に含有する。本発明の他の側面では、上記の前記組成物は、例えば、食品添加剤などの栄養補助食品製剤として好都合に使用される。前記医薬製剤は、好ましくは経口投与され、充填剤、溶媒又は添加剤を含んでもよい。前記医薬製剤は、好ましくは、疼痛、増殖性疾患、神経障害、免疫不全、循環器疾患、肺疾患、栄養障害、繁殖障害、筋骨格障害及び歯科疾患からなる群から選択される状態の治療に用いられる。前記治療が、原因因子の消失又は症状の軽減につながることがある。前記増殖性疾患は、例えば、乳癌又は気管支癌であってもよい。前記治療には、腫瘍細胞の増殖低下又は増殖阻害を含めてもよい。前記疼痛に関して、疼痛は、術後疼痛、負傷後の疼痛、癌に付随する疼痛及び神経因性疼痛であってもよい。言及した神経障害は、例えば、脱髄疾患、痴呆及び運動障害から選択される。前記状態は、多発性硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病から選択される変性疾患であってもよい。前記状態には、骨障害又は骨髄障害を含めてもよく、例えば、骨折又は骨粗鬆症であってもよい。前記状態は、神経変性疾患であってもよい。

本発明の一つの側面では、前記新規ペプチドのＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ１２又はその誘導体は、医薬品の製造に使用される。また、骨障害又は外傷の治療方法、並びに疼痛管理方法も提供され、この方法は、炭酸カルシウム、及び１つもしくは複数の前記新規ペプチド又はその誘導体を含む製剤を経口投与することを含む。本明細書で用いる用語「誘導体」には、アルキル化、エステル化、中和、環化又はオリゴマー化によって得られたペプチド生成物もまた含まれる。

本発明では、炭酸塩とカルシウム塩を含む混合物中で、炭酸カルシウムの結晶化を阻害する方法が提供され、この方法は、リン酸化アミノ酸又はリン酸化ペプチドのある量を、前記混合物に混合することを含む。前記リン酸化アミノ酸又はリン酸化ペプチドは、好ましくは、ホスホ−セリン又はホスホ−スレオニンを含んでいる。一つの態様では、本発明は、炭酸カルシウムの結晶化を阻害する方法を提供し、この方法は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７及び配列番号２４から選択される配列を有するペプチド、又はその相同体、機能性フラグメント、誘導体もしくは変異体、あるいはその混合物のある量を、結晶化又は沈殿析出混合物（precipitation mixture）に混合することを含む。本発明による炭酸カルシウムの結晶化を阻害する方法が提供され、この方法は、水に可溶なカルシウム塩を提供すること、並びに前記塩を、ＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ１２から選択されるペプチドもしくはその機能的に同等なフラグメント、又はその誘導体もしくは変異体、あるいはその混合物と接触させることを含む。

本発明の一つの側面では、炭酸カルシウムとリン酸化アミノ酸又はペプチドの混合物を含む食品添加剤又は機能性食品が提供される。一つの態様では、前記ペプチドは、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２４、及びその相同体又はフラグメントからなる群から選択される配列を有する。

本発明の上記並びに他の特徴及び利点は、以下の例及び添付された図を参照して、より容易に明らかとなろう。

胃石の可溶性タンパク質の単離、ＧＡＰ６５の精製及び部分配列を示す図である。分子量基準タンパク質と比較した、胃石の可溶性タンパク質プロフィールのＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色（左）、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーによって精製し、クーマシー、「ステインオール（ｓｔａｉｎｓａｌｌ）」及び「ｐａｓ」で染色したＧＡＰ６５含有画分１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（右）である。胃石の可溶性タンパク質の単離、ＧＡＰ６５の精製及び部分配列を示す図である。トリプシン消化後にナノスプレー法でＱｔｏｆ２によって得られた、ＧＡＰ６５のクロマトグラムである。顕著なピークからのペプチドの配列は、ＭＳ／ＭＳ分析を通して得られた。ＧＡＰ６５の完全な推定アミノ酸配列及びその生物情報分析を含む図である。ＧＡＰ６５のオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列表である。太字は、予測シグナル配列、灰色の囲みは、推定リン酸化部位、７２番及び１７３番のアミノ酸の濃い囲みは、予測されたＯ−グリコシル化部位、薄い囲みは、予測されたＮ−グリコシル化部位である。ＧＡＰ６５の完全な推定アミノ酸配列及びその生物情報分析を含む図である。予測されたドメインを示す、ＧＡＰ６５の配列の模式図である。すなわち、ＣｈｔＢＤ２は、キチン結合ドメイン２、ＬＤＬａは、低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン、最後のドメインは、多糖体の脱アセチル化酵素のドメインである。ＧＡＰ６５の完全な推定アミノ酸配列及びその生物情報分析を含む図である。リポタンパク質受容体に対する相同性にもとづく、ＬＤＬａドメインの３Ｄ構造である。左は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質由来の補体様反復配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｌｉｋｅｒｅｐｅａｔ）ＣＲ３のＮＭＲ構造であり、右は、ＧＡＰ６５のＬＤＬａドメインの予測構造である。ＧＡＰ６５の特異的発現、及び誘発された未脱皮期（ｐｒｅｍｏｌｔ）中の胃石の円柱上皮におけるこの局在化を示す画像である。ＲＴ−ＰＣＲを用いて未脱皮期中のＧＡＰ６５発現の検出をした画像である。ＲＮＡは、胃石板上皮（ｇａｓｔｒｏｌｉｔｈｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｄｉｓｃ）、肝膵臓、表皮下組織、精管及び胃壁から採取し、伸長因子２（Ｅｆｔ２）を使用してＲＮＡ抽出の再確認を行い、対照はゲノム混入用のものを用いた。ＧＡＰ６５の特異的発現、及び誘発された未脱皮期中の胃石の円柱上皮におけるこの局在化を示す画像である。誘発した未脱皮期及び無処置の脱皮間期（ｉｎｔｅｒｍｏｌｔ）の雄における、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＡＰ６５発現の局在化を示す。左画面は、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したものを示し、中画面は、ネガティブコントロールのセンス−ＧＡＰ６５プローブを示し、２つの右画面は、特定の領域をできるだけ拡大したＧＡＰ６５のアンチセンスプローブを示し、横棒は、誘発した未脱皮期のセンスプローブでは、１００μｍを表すが、それ以外は２００μｍを表す。ＧＡＰ６５サイレンシング後の胃石板中のＧＡＰ６５（ＧＡＳＰ６５と表す）の相対転写量（エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリア、エクジソン及びＣ．クワドリカリナタス（Ｃ．ｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）のビテロゲニン（ＣｑＶｇ）のｄｓＲＮＡ、並びにエクジソンキャリア及びｄｓＲＮＡキャリア（左から右）を注入したザリガニの胃石板中の、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いたＧＡＰ６５転写量の相対定量）を示すグラフである。アルファベットは、統計的有意性を表す。ＧＡＰ６５サイレンシング後の胃石の形態学的変形を示す写真である。典型的な胃石は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡの両方（左）、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアの両方（中）、エクジソンキャリア及びｄｓＲＮＡキャリア（右）の両方を注入したザリガニから切断した。ザリガニから切断した胃石全体の側面写真である。ＧＡＰ６５サイレンシング後の胃石の形態学的変形を示す写真である。典型的な胃石は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡの両方（左）、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアの両方（中）、エクジソンキャリア及びｄｓＲＮＡキャリア（右）の両方を注入したザリガニから切断した。切断前の上記胃石のＸ線写真（背面像）である。ＧＡＰ６５サイレンシング後の胃石の形態学的変形を示す写真である。典型的な胃石は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡの両方（左）、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアの両方（中）、エクジソンキャリア及びｄｓＲＮＡキャリア（右）の両方を注入したザリガニから切断した。切断前の上記胃石のＸ線写真（背面像）である。ＧＡＰ６５の遺伝子サイレンシング後の、胃石の構造的変形の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真を示す図である。典型的な胃石は、エクジソン＋ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ（左）及びエクジソン＋ｄｓＲＮＡキャリア（右）を注入したザリガニから切断した。無機質及びマトリックスの配置を示す胃石中央部の断面像である（×５０）。ＧＡＰ６５の遺伝子サイレンシング後の、胃石の構造的変形の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真を示す図である。典型的な胃石は、エクジソン＋ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ（左）及びエクジソン＋ｄｓＲＮＡキャリア（右）を注入したザリガニから切断した。無機質及びマトリックスの配置を示す胃石中央部の断面像である（×２００）。ＧＡＰ６５の遺伝子サイレンシング後の、胃石の構造的変形の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真を示す図である。典型的な胃石は、エクジソン＋ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ（左）及びエクジソン＋ｄｓＲＮＡキャリア（右）を注入したザリガニから切断した。ナノレベルの小球を含む無機質の配置を示す図である（×１５０００）。ＧＡＰを含めないエクジソンは、胃石が正常な外観を示したが、エクジソン＋ＧＡＰ６５ｄｓＲＮＡで処理した胃石は、変形している。胃石の精製タンパク質の存在／不在下において試験管内沈殿した、炭酸カルシウムのＳＥＭ画像である。ＧＡＰ６５が豊富な画分を有する炭酸カルシウム沈殿物（左）、対照としてトリプシンの当量で沈殿した炭酸カルシウム（右）である。胃石の精製タンパク質の存在／不在下において試験管内沈殿した、炭酸カルシウムのＳＥＭ画像である。５０〜５００ｎｍのナノ粒子を有する典型的な非晶質構造を示す、沈殿後４０日経過したＡＣＣのＳＥＭ画像である。ＧＡＰ６５が豊富な画分との沈殿によって得られた、ＡＣＣのラマンスペクトルである。ＧＡＰ６５が豊富な画分との沈殿によって得られた、炭酸カルシウムのラマンスペクトルである。ＧＡＰ６５が豊富な画分との沈殿によって得られた、ＡＣＣのラマンスペクトルである。沈殿２７日後のスペクトルである。６．５カ月経過したＡＣＣ（ＧＡＰ６５で誘発した）とカルサイトの、ラマンスペクトル（１０８５ピーク付近）の比較図である。トリプシン消化後に、ナノスプレー法でＱｔｏｆ２によって得られた胃石タンパク質の部分配列決定を示す、クロマトグラムである。ペプチドの配列は、顕著なピークからＭＳ／ＭＳ分析を経て得られた。ＧＡＰ２２を示すスペクトルである。トリプシン消化後に、ナノスプレー法でＱｔｏｆ２によって得られた胃石タンパク質の部分配列決定を示す、クロマトグラムである。ペプチドの配列は、顕著なピークからＭＳ／ＭＳ分析を経て得られた。ＧＡＰ２１を示すスペクトルである。トリプシン消化後に、ナノスプレー法でＱｔｏｆ２によって得られた胃石タンパク質の部分配列決定を示す、クロマトグラムである。ペプチドの配列は、顕著なピークからＭＳ／ＭＳ分析を経て得られた。ＧＡＰ１２を示すスペクトルである。胃石抽出物の存在下で、塩化カルシウム及び炭酸ナトリウムの溶液から沈殿した、炭酸カルシウムのラマンスペクトルである。ＧＡＰタンパク質のアミノ酸組成を示す表１である。ＧＡＰ２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びオープンリーディングフレームの対応する推定アミノ酸配列を示す図である（星印は終止コドンを示し、灰色で強調した配列は非翻訳領域、Ｎ末端の推定シグナルペプチドには下線を引いてある）。ＧＡＰ２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びオープンリーディングフレームの対応する推定アミノ酸を示す図である（記号は、図１３のものと同様な意味である）。ＧＡＰ配列に関する図である。ＧＡＰ２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びオープンリーディングフレームの対応する推定アミノ酸を示す図である。記号は、図１３のものと同様な意味である。ＧＡＰ配列に関する図である。ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１の配列アライメントを示す図である。２つのタンパク質のアミノ酸の位置は右及び左に示し、配列相同性は「＊」、保存的置換は「：」、半保存的置換は「．」で示した。例９において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１０において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１１において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１２において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１３において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１４において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１５において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１６において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１７において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１８において詳細に説明するラマンスペクトルである。例１９において詳細に説明するラマンスペクトルである。例２０において詳細に説明するラマンスペクトルである。例９により調製された試料のラマンスペクトルである。記載したように、これらの試料は沈殿後に室温で保存した。例１０により調製された試料のラマンスペクトルである。記載したように、これらの試料は沈殿後に室温で保存した。例１８により調製された試料のラマンスペクトルである。記載したように、これらの試料は沈殿後に室温で保存した。例１９により調製された試料のラマンスペクトルである。記載したように、これらの試料は沈殿後に室温で保存した。例２０により調製された試料のラマンスペクトルである。記載したように、これらの試料は沈殿後に室温で保存した。

本発明の詳細な説明
これまでに、いくつかのリン酸化アミノ酸又はペプチドが、試験管内の炭酸カルシウムの沈殿に影響を及ぼし、炭酸カルシウムの非晶質形態の生成につながることが分かった。特に、前記ペプチドが、チェラックス・クワドリカリナタス（Ｃｈｅｒａｘｑｕａｄｒｉｃａｒｉｎａｔｕｓ）の未脱皮期後半の胃石に存在する数種のタンパク質を含む場合、この作用が観察された。約６５ｋＤａ、２２ｋＤａ、２１ｋＤａ及び１２ｋＤａの見掛けの分子量を有するペプチドは、非晶質炭酸カルシウム物質のナノ粒子の沈殿を誘発する。これに比して、不活性なタンパク質はＣａＣＯ_３の結晶を与える。ナノ粒子は、非晶質ＣａＣＯ_３に典型的なラマンシフトを示す。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥで推定された見掛け分子量により、それぞれＧＡＰ６５、ＧＡＰ２２、ＧＡＰ２１、ＧＡＰ１２で表される上記のタンパク質は、ＡＣＣの沈殿及び安定化に関係している。前記の４つのタンパク質を含有する胃石抽出物は、炭酸カルシウムの結晶化を阻害し、炭酸カルシウム（ＡＣＣ）の非晶質形態を安定化する。ＡＣＣは、ＣａＣｌ_２、Ｎａ_２ＣＯ_３及び胃石抽出物を含有する溶液から調製したＣａＣＯ_３の沈殿物中で、ラマンスペクトル法により検出した（図１１）。ＡＣＣの存在は、約１０８０ｃｍ^−１における顕著なピークの存在によって確認される。ＧＡＰ遺伝子の発現は、胃石板上皮及び表皮下組織（両方は、角質に関連する組織である）に特異的であることが分かった。ＲＴ−ＰＣＲ法による、数種の標的組織のＧＡＰペプチドの特異的発現もまた検討した。例えば、ＧＡＰ６５の発現はより多くの角質関連組織で見つかり、一方、ＧＡＰ２２の発現はこれとは異なり胃石板上皮で見つかった。

対応する遺伝子のｃＤＮＡ配列が得られ、これらの推定されるタンパク質が見つかった（図２、１３〜１５）。４つの全てのタンパク質は、Ｎ末端でシグナルペプチドを含有することが分かった（図１３〜１５の下線部、図２の太字のアミノ酸）。同様に、保存ドメインのデータベースの検索により、ＧＡＰ６５は、キチン結合ドメイン２、低密度リポタンパク質受容体ドメインクラスＡ及び多糖体脱アセチル化酵素ドメインの３つの保存ドメインを含有することが明らかになった。他方、ＧＡＰ１２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ２２は、既知のいずれのドメインとも、顕著な類似性を示していない。ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１のＢｌａｓｔアライメント（Ｂｌａｓｔａｌｉｎｇｍｅｎｔ）により、これらのタンパク質の推定アミノ酸配列において、４６．３％の同一性が明らかになった（図１５）。推定タンパク質の物理化学的分析によって明らかになったことは、ＧＡＰ１２、２１及び６５の計算分子量は、予想より小さく、それぞれ９．９、１９．５及び６０．８ｋＤａであり、一方、ＧＡＰ２２の分子量は２８．６ｋＤａと予想より大きかったことである（表１）。ＧＡＰ１２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ６５は、酸性のｐＩを有し、したがって、胃石の生理的ｐＨ（ｐＨ８．５近辺）でマイナスに帯電している。ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１は、非極性の脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン及びバリン）を高率で有し、極性であるが帯電していないアミノ酸のプロリン（表１に灰色で強調されている）を高率で有する。ＧＡＰ６５は、酸性アミノ酸の含有量が多い。ＧＡＰ２２は、塩基性のｐＩを有し、したがって、胃石の生理的ｐＨでプラスに帯電している。この主な特徴は、極性であるが帯電していないアミノ酸のプロリン及びプラスに帯電しているアルギニンの高い割合にある。

これらの新規タンパク質の特別な特徴により、本発明において、炭酸カルシウムの結晶化を阻害する方法もまた提供され、この方法は、ＧＡＰ６５もしくはこの機能性フラグメント、その誘導体又は変異体のある量を、結晶化又は沈殿析出混合物に混合することを備える。本発明の他の側面では、炭酸カルシウムの結晶化を阻害する方法が提供され、この方法は、水に可溶なカルシウム塩を、ＧＡＰ６５もしくは機能性フラグメント、その誘導体又は変異体と接触させることを含む。

ＧＡＰ６５は、胃石の溶解性のタンパク質抽出物から、イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、約１２ｍｏｌ％のＡｓｐ＋Ｇｌｕを含有しマイナスに帯電している、配列番号１にもとづくグリコペプチドであることを確認した。ＭＳ−ＭＳによるペプチドの配列決定により７つのオリゴペプチドのサブ配列（配列番号２〜８、図１Ｂ）が得られ、これらを、胃石上皮板のｍＲＮＡにもとづいてＧＡＰ６５をコードする遺伝子の完全配列を取得するため、縮重プライマーの構築に使用した。合計推定アミノ酸配列は、５４８アミノ酸長のペプチドであることが分かった（配列番号１；図２Ａ）。ＧＡＰ６５の配列の生物情報分析では、３つの既知ドメイン（図２Ｂ）、すなわち、２９〜１０２位アミノ酸のキチン結合ドメイン２（ＣｈｔＢＤ２）、１２２〜１５９位アミノ酸の低密度リポタンパク質受容体ドメインクラスＡ（ＬＤＬａ）、及び１９５〜３３２位アミノ酸の多糖体脱アセチル化酵素ドメインの存在が示唆された。ＬＤＬａドメインは、予測されたカルシウム結合性を有する。ＧＡＰ６５の発現は、前期脱皮期間のザリガニの数種の標的組織でＲＴ−ＰＣＲ法により試験を行い、胃石板上皮及び表皮下組織で検出した（両組織は、角質関連組織である）（図３Ａ）。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、誘導した未脱皮期及び誘導しない脱皮間期のザリガニの、胃石板におけるＧＡＰ６５発現の局在化を視覚化した（図５Ｂ）。ＧＡＰ６５ｄｓＲＮＡを用いたサイレンシング後の、胃石板上皮における相対ＧＡＰ６５転写量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した（図４）。胃石生成におけるＧＡＰ６５の役割を、脱皮間期のザリガニに対するＧＡＰ６５ｄｓＲＮＡの生体内注入を使用したＲＮＡｉ法により試験した（図５）。胃石生成の開始は、エクジソンの注入により達成させた。胃石の形態学的変形は、ＧＡＰ６５ｄｓＲＮＡ及びエクジソンの両方を注入したザリガニで観察することができた（図５Ａは切断した胃石、図５Ｂ及び５ＣはＸ線画像）。

ＧＡＰ６５は、本質的に、ザリガニの胃石の微細構造に影響を及ぼすことが分かった。ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡをエクジソンと共に注入するか、又はエクジソンのみを注入したザリガニから切断した胃石の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真から、ＧＡＰ６５の不在で引き起こされた極度な構造異常が明らかになった（図６）。小球内でのＡＣＣのまとまり及び小球サイズは、胃石の高密度の凝縮のために重要であり、ＧＡＰ６５の不在は、正常な胃石と比較すると、小球が大きく、凝縮の少ない構造につながってしまう。

バイオミネラリゼーション過程におけるＧＡＰ６５の役割を解明するために、試験管内で炭酸カルシウムを沈殿させ、ＡＣＣの安定性を試験した。沈殿物の電子顕微鏡写真は、ＧＡＰ６５が豊富な画分の存在／非存在下の沈殿物では、炭酸カルシウムの様々な多形の組成物を際立って示した（図７）。ＧＡＰの不在、すなわち不活性タンパク質の存在下における炭酸カルシウムの沈殿物は、急激な結晶化をもたらし、１０μｍ程の大きさのカルサイト及び／又はバテライトの結晶が生じた。他方、ＧＡＰ６５の存在下の炭酸カルシウムの沈殿物からは、４０〜６０ｎｍの小球からなる薄層として観察された、非晶質ＣａＣＯ_３が得られた。前記小球中の炭酸カルシウムの非晶質性は、ラマンスペクトルによって確認され、１０７０ｃｍ^−１において、顕著なＡＣＣピークを示し、さらに粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いると、結晶性物質由来の回折ピークがないことが示された。試験管内の沈殿により生成したＡＣＣの小球中のＧＡＰ６５の存在は、小球からタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同定で確認した。

ＧＡＰ６５の存在下の沈殿で得られたＣａＣＯ_３の沈積物は、始めに偏光顕微鏡によって特徴付けし、カルサイト、バテライト及びＡＣＣを同定した。観察結果は、ラマンスペクトル法及び粉末ＸＲＤによって確認した。ＡＣＣは、全ＣａＣＯ_３の少なくとも約５０％を構成していた。ＡＣＣは、室内条件で、少なくとも１カ月は安定性を維持した。

すなわち、本発明は、炭酸カルシウムの結晶状態に影響を及ぼす、ザリガニにおけるカルシウム代謝に関連する新規のタンパク質を提供する。提供されるのは炭酸カルシウム結晶化の阻害方法であるところ、この方法は、ＧＡＰタンパク質、又はその機能的に同等なフラグメント、誘導体もしくは変異体のある量を、結晶化又は沈殿析出混合物に混合することを含む。本発明は、前記の新規タンパク質を沈殿析出混合物に混合して、すなわちＣａＣＯ_３の沈殿が起こる混合物、および前記タンパク質がないと結晶物質の沈殿が起こる混合物に混合して、ＡＣＣを調製する方法に関する。このような混合物の限定されない例としては、炭酸ナトリウム溶液を加えた、ＧＡＰ６５を含む塩化カルシウム水溶液が挙げられる。もちろん、イオン源の種類だけでなく、これらの成分の混合順序も変えることができる。混合物中のＧＡＰ６５濃度は、例えば、ＣａＣＯ_３の重量を基準として約０．０５〜５ｗｔ％とすることができる。沈殿混合物中のＧＡＰ６５濃度は、例えば、約１〜１００μｇ／ｍｌとすることができる。

本発明では、ＡＣＣ及びリン酸化アミノ酸又はペプチド、例えばＧＡＰタンパク質、を含む組成物が提供される。本発明の重要な側面では、カルシウム代謝又はカルシウムシグナリングに関連する疾患の治療のために、ＡＣＣ及びリン酸化アミノ酸又はペプチド（例えば、ＧＡＰタンパク質又はその誘導体）の安定化量を含む製剤が提供される。製剤は、好ましくは、経口投与で使用される。本発明の製剤は、治療手段として、治療補助として又は栄養補助食品として使用される。

本発明の好ましい態様では、本発明により調製されるＡＣＣは、カルシウム代謝又はカルシウムシグナリングに関連する状態を治療するための製剤中に含まれる。前記状態は、疼痛、増殖性疾患、神経障害、免疫疾患、循環器疾患、肺疾患、栄養障害、繁殖障害、筋骨格障害及び歯科疾患からなる群から選択することができる。前記治療に、疾患症状を緩和することを含めてもよい。前記増殖性疾患は、肉腫、癌腫、リンパ腫及び黒色腫から選択できる。前記癌腫は、例えば、乳癌又は気管支癌である。前記治療は、腫瘍の縮小、腫瘍成長の阻止、又は腫瘍における細胞増殖の低下もしくは阻害につながりうる。前記疼痛は、術後痛、傷害後疼痛、癌に付随する疼痛及び神経因性疼痛から選択することができる。前記神経障害は、脱髄疾患、痴呆及び運動障害から選択することができる。すなわち、前記障害は、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病又は他の変性疾患である。治療される前記状態には、骨折又は骨粗鬆症などの骨又は骨髄障害を含めることができる。好ましい態様では、本発明の組成物は、神経変性疾患の治療に使用される。

本発明は、ＡＣＣ、及びリン酸化アミノ酸（ＰＡＡ）又はリン酸化ペプチド（ＰＰ）の安定化させる量を含む組成物に関し、例えば、これらは、１つ又は複数のＰＡＡを含む組成物、あるいはＧＡＰペプチド又はその機能性フラグメント、誘導体もしくは変異体などの１つ又は複数のＰＰを含む組成物である。本発明は、また、医薬品としてもしくは医薬品の製造に又は食品添加物として使用するための、ＰＡＡ又はＧＡＰなどのＰＰで安定化されるＡＣＣにも関する。

ＡＣＣの調製方法には、
ｉ）カルシウムイオン（ＣａＣｌ_２溶液を用いて）で水性溶液を生成するステップと、
ｉｉ）溶解性又は不溶性の「添加剤」（ホスホアミノ酸、キトサン、キチン、合成ペプチド、リン酸化ペプチド／タンパク質又はそのフラグメントなど）を加えるステップと、
ｉｉｉ）炭酸イオン（Ｎａ_２ＣＯ_３溶液、又は、例えば、ＣＯ_２もしくは（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３の様な別の炭酸源を用いて）を加えるステップと、
ｉｖ）振盪するステップと、
ｖ）ＣａＣＯ_３スラリーを沈殿させる（遠心分離、濾過などによる）ステップと、
ｖｉ）スラリーを脱水する（凍結乾燥器、空気流、噴霧乾燥などによる）ステップと
を含めることができる。
生成物の分析には、非晶質性を検証するために、様々な方法（ＸＲＤ、電子線回折、ＳＥＭのような）により得られたＣａＣＯ_３を試験することを含めてもよい。ラマン分光法（ＲＳ）は、ＡＣＣの特性を示す最も効率的で信頼できる方法であることが分かった。本明細書で報告した無機物のラマンシフト特性では、炭酸塩のピークが１０８０ｃｍ^−１にあり、この幅広の形状はＡＣＣを示しこの含有量に比例している。リン酸塩のピークは、９５０ｃｍ^−１にあり、試料中のリン酸塩の含有量と比例している。しかし、１０８０〜９５０ｃｍ^−１の間の割合は比例するが、ＣＯ_３ ^２−／ＰＯ_４ ^３−比を直接示すものではない。

炭酸カルシウムが沈殿する溶液中のカルシウム及び炭酸イオンは、通常、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲にあった。リン酸化アミノ酸（ＰＡＡ）のカルシウムに対するモル比は、通常、０．０１〜０．５の範囲にあった。より高濃度なＰＡＡは、自発的な沈殿を阻害した。キトサンを存在させる場合、その範囲は、０．０３〜０．３ｗｔ％とした。

種々のタンパク質分解酵素（トリプシン、パパイン及び放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロテアーゼ）によって、脱塩したチェラックス（Ｃｈｅｒａｘ）の胃石から抽出したペプチドは、ＡＣＣの生成を誘発した。ホスホアミノ酸及びホスホペプチドは、ＡＣＣの生成を誘発でき、これを安定化できることを示唆している。インタクトなタンパク質は、別の機能を有する可能性がある。ラマンスペクトル及びＥＤＳ分析は、不溶性のマトリックス（ＩＳＭ）全体によって誘発されたＡＣＣに類似するリン酸カルシウムが、かなりの量あることを示しており、ＩＳＭ中のリン酸塩がタンパク質に結合していることを示唆している。

沈殿した炭酸カルシウムは、非晶質／結晶状態を長期間にわたり調べた。本発明の方法で得られたＡＣＣの試料は、室温で７カ月以上にわたり安定であり、非晶質状態を維持することが分かった。

例
（例１）
チェラックス・クワドリカリナタスの胃石は、［ＷＯ２００５／１１５４１４］に記載されているように調製した。未脱皮期後半の胃石由来の可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離すると、少なくとも顕著な６つの異なるタンパク質の存在が明らかになり（図１Ａ、左）、最も豊富な存在は約６５ｋＤａの大きさであった（胃石タンパク質６５、ＧＡＰ６５）。胃石の可溶性タンパク質の全含有量からＧＡＰ６５の更なる精製を、ＤＥＡＥのクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、ＮａＣｌ濃度を１Ｍまで勾配をかけて行った。ＧＡＰ６５の溶出は、ＮａＣｌが３００ｍＭの時に始まったが、主に６００ｍＭにおいて継続した（画分１７）。ＧＡＰ６５を豊富に含む画分１７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、図１Ａの右に示すように、クーマシー（非特異的なタンパク質染色）、「ステインオール」（マイナスに帯電しているタンパク質の染色）及び「ｐａｓ」（糖タンパク質の染色）で染色した。これらの染色から、ＧＡＰ６５について、この豊富な画分中の主要なタンパク質であり、マイナスに帯電している糖タンパク質であることが示唆される。ＧＡＰ６５のトリプシン消化後にナノスプレー法でＱｔｏｆ２を用いて分離し、ＭＳ−ＭＳを用いてペプチドの配列決定を行い、７つの予測ペプチド配列を作り（図１Ｂ）、これらを、胃石板上皮のｍＲＮＡにもとづいてＧＡＰ６５をコードする遺伝子の完全配列を取得するため、縮重プライマーの構築に使用した。図２Ａは、タンパク質のＮ末端の予測シグナル配列（太字）を示す、ＧＡＰ６５のオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列を説明している。ＧＡＰ６５の全アミノ酸の約４．６％を可能性のあるリン酸化部位（灰色の囲み）として予測したが、他方、わずか３つの予測Ｎ−糖鎖付加部位（３つの文字を含む薄い囲み）及びわずか２つの予測Ｏ−糖鎖付加部位（アミノ酸番号７２及び１７３における濃い囲み）だけが見つかった。負電荷は、タンパク質の約１２ｍｏｌ％を構成する酸性残基のアスパラギン酸及びグルタミン酸から一部生じる。ＧＡＰ６５配列の生物情報分析により、２９〜１０２位アミノ酸のキチン結合ドメイン２（ＣｈｔＢＤ２）、１２２〜１５９位アミノ酸の低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン（ＬＤＬａ）、１９５〜３３２位アミノ酸の多糖体の脱アセチル化酵素ドメインの３つの既知ドメイン（図２Ｂ）の存在が示唆された。図２Ｃは、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質由来の補体様反復配列ＣＲ３のＮＭＲ構造に対する相同性にもとづいた、ＬＤＬａドメインの予測３Ｄ構造を明らかにしている。このＬＤＬａドメインは、予測カルシウム結合性を有するＧＡＰ６５中唯一の既知のドメインである。

（例２）
ＧＡＰ６５の特異発現は、未脱皮期のザリガニの数種のターゲット組織において、ＲＴ−ＰＣＲにより試験した（図３Ａ）。ＧＡＰ６５の発現は、胃石板上皮及び表皮下組織（両方とも、角質の関連組織である）において検出された。ＧＡＰ６５の発現は、肝膵臓、胃壁及び精管では、検出されなかった。誘発した未脱皮期及び誘発しない脱皮間期のザリガニの胃石板におけるＧＡＰ６５発現の、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる位置特定は、図３Ｂに提示してある。左画面は、胃石板のヘマトキシリン−エオシン染色を示し、中画面は、発現が検出されない対照のセンスプローブである。２つの右画面は、特定の領域をできるだけ拡大したアンチセンスプローブを示す。アンチセンスプローブにより、ＧＡＰ６５の発現は、誘発したザリガニ胃石板の円柱上皮細胞においてのみ検出できることが明らかであるが、誘発しない脱皮間期のザリガニでは、この発現は検出されなかった。

（例３）
ＧＡＰ６５ｄｓＲＮＡを用いたサイレンシング後の胃石板上皮における相対ＧＡＰ６５転写量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定し、図４に示した。ＧＡＰ６５濃度は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリア、エクジソン及びＣ．クワドリカリナタスのビテロゲニン（ＣｑＶｇ）のｄｓＲＮＡを注入したザリガニ、並びに両キャリアを注入した対照において評価した。配列特異的サイレンシングの対照として働く肝膵臓特異的な遺伝子であるＣｑＶｇは、主として妊娠した雌で見つかる。エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡを注入したザリガニの転写量は、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアを注入したザリガニで見出された量に比べ、かなり低かった。エクジソン及びＣｑＶｇのｄｓＲＮＡを注入したザリガニにおいて、ＧＡＰ６５の転写量は、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアの注入群で検出された量とほぼ同じであった。対照であるキャリアを注入したザリガニでは、ＧＡＰ６５の転写量は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡを注入したザリガニで見られた量よりも高かったが、エクジソン及びｄｓＲＮＡ並びにエクジソン及びＣｑＶｇのｄｓＲＮＡを注入した両ザリガニで検出した量より低かった。しかし、キャリアの対照群は、他の３つの群と統計学的に有意な差はなかった。

（例４）
胃石生成におけるＧＡＰ６５の役割を試験するために、脱皮間期のザリガニに対するＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡの生体内注入を用いたＲＮＡｉ技術を適用した。胃石生成の開始は、エクジソンの注入により達成した。図５では、エクジソン＋ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡの両方、エクジソン＋ｄｓＲＮＡキャリアの両方、又はエクジソン及びｄｓＲＮＡの両キャリアを注入した、ザリガニの胃石を見ることができる。図５Ａは、各処置群から切断した代表的な胃石の側面写真である。この写真からは、ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ及びエクジソンの両方を注入したザリガニにおける、胃石の形態学的変形が観察できるが、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアだけを注入したザリガニでは、胃石は、変形がなく正常に見えた。キャリアを注入した対照では、胃石は、未発達又は成長初期段階に見えた。図５Ｂは、ザリガニ及び切断前の胃石の背面のＸ線画像を示し、他方、図５Ｃは、パネルＢの画像のコントラストのより強い画像を提示している。ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ及びエクジソンの両方を注入したザリガニでは、無機質がより低密度な検出領域がいくつか記録されたが、他方、胃石板形状の構造は、保持されていた。エクジソン＋ｄｓＲＮＡキャリアを注入したザリガニでは、胃石は、無機質の密度に影響がみられず正常に見えた。キャリアの対照の胃石は、小さすぎてＸ線画像化による検出はできなかった。

（例５）
ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ及びエクジソンを注入したザリガニ、並びにエクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアだけを注入したザリガニから切断した胃石の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を、図６に提示する。図６Ａ、Ｂは、胃石の中心部を通る断面の画像を示している。ＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡ及びエクジソンを注入したザリガニの胃石では、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアのみを注入したザリガニの胃石に比べて、重度の構造的異常が観察できる。エクジソン及びキャリアを注入した胃石で観察された、高密度の無機質の層状構造は、エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡを注入したザリガニの胃石においては、中空のストローに似ているゆるくまとまった無機質の柱状構造に置き換わっている。小球におけるＡＣＣのまとまり及び小球サイズは、胃石の高密度の凝縮にとって重要である。２つの処置間の小球サイズを比較した１５０００倍の拡大画像を、図６Ｃに提示する。エクジソン及びＧＡＰ６５のｄｓＲＮＡを注入したザリガニの低密度配列の胃石では、小球サイズは、約１００〜３００ｎｍの範囲にあり、一方、エクジソン及びｄｓＲＮＡキャリアを注入したザリガニの胃石に沈積した正常なＡＣＣでは、小球は、よりせまいサイズ分布にあり、４０〜６０ｎｍの範囲にあった。

（例６）
バイオミネラリゼーションの過程におけるＧＡＰ６５の役割を解明するために、ＡＣＣの安定性を試験する、試験管内の炭酸カルシウム沈殿分析を設定した。図７では、ＧＡＰ６５の存在下及び他のタンパク質（トリプシン）の存在下での、炭酸カルシウムの沈殿結果が提示される。図７ＡのＳＥＭ画像は、各処置における、炭酸カルシウムの際立った多形を示している。ＧＡＰ６５の存在下での炭酸カルシウムの沈殿は非晶質形状の沈積をもたらし、これは１００〜５００ｎｍの小球からなる薄層として観察された。同様な条件の下であるが、トリプシン存在下で行った沈殿実験では、急速な結晶化が付随する結果となり、カルサイト及びバテライト球晶の大きな１０μｍの単結晶として観察された。図７Ｂは、ＧＡＰ６５の存在下で沈殿した炭酸カルシウム中のＡＣＣの特質を裏付けている。ラマン分析は、１０７０ｃｍ^−１において明瞭な幅広のピークを有する、ＡＣＣの際立ったスペクトルを示している。試験管内の沈殿によって生成したＡＣＣの小球中のＧＡＰ６５の存在は、沈殿物の無機質画分由来のタンパク質を精製し、これを、元のＧＡＰ６５が豊富な画分と比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価することにより確認した。

（例７）
ＧＡＰ６５と共に沈殿したＡＣＣの安定性を、室温で保持した試料におけるラマンスペクトル分析により試験した。１００μｌの１ＭのＣａＣ１_２を１０ｍｌの再蒸留水に加えた（最終濃度：１０ｍＭ）。タンパク質抽出溶液（１．２μｇ／μｌ）から８０μｌを分取し加えた（最終濃度、約１０μｇ／ｍｌ）。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（最終濃度：１０ｍＭ）を加え、激しく振盪した。バイアルを、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＣａＣＯ_３の沈積物は、初めに偏光顕微鏡によってカルサイト、バテライト及びＡＣＣの混合物として特徴付けた。観察結果は、ラマンスペクトル分析によって確認した。ＡＣＣは、薄い「殻」の形状であり、全ＣａＣＯ_３の少なくとも約５０％を含んでいると推定された。ＡＣＣは、沈殿後１日、２７日、６．５カ月目のＡＣＣのラマンスペクトル（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）が示すように、室内条件で、少なくとも１カ月は安定性を維持した。６．５カ月経過後のＡＣＣのラマンスペクトル（１０８５ピーク近辺）とカルサイトを比較すると（図９）、外見的には、混合物はＡＣＣ及びバテライトを含むことを示していた（１０８５のピークにある肩を、おそらくバテライトを特徴付けるピーク分離の始まりであると考えた場合）。

（例８）
胃石抽出物は、炭酸カルシウムの結晶化を阻害し、炭酸カルシウムの非晶質形状（ＡＣＣ）を安定させる。ＡＣＣは、ＣａＣｌ_２、Ｎａ_２ＣＯ_３及び胃石抽出物を含有する溶液から調製したＣａＣＯ_３沈殿物のラマンスペクトル分析によって検出した（図１１）。ＡＣＣの存在は、約１０８０ｃｍ^−１における際立つ幅広のピークの出現によって確認される。５６０におけるピークは、ガラス基質によって生じる。ＧＡＰ遺伝子の発現は、胃石板上皮及び表皮下組織（両方とも角質関連組織である）に特異的であることが分かった。数種のターゲット組織におけるＧＡＰ２１、ＧＡＰ２２及びＧＡＰ６５の特異的発現は、例２の記述と同様に、ＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた。ＧＡＰ２１及びＧＡＰ６５の発現は、両角質関連組織において見つかった。ＧＡＰ２２の発現は、胃石板上皮でのみ見つかった。対応する遺伝子のｃＤＮＡ配列を取得し、これらの推定タンパク質が見つかった（図１３〜１５）。４つの全てのタンパク質は、そのＮ末端にシグナルペプチドを含有することが分かった（図１３〜１５における下線部及び図２の太字のアミノ酸）。保存ドメインのデータベースに対する類似性検索によって、ＧＡＰ６５は、キチン結合ドメイン２、低密度リポタンパク質受容体クラスＡドメイン及び多糖体の脱アセチル化酵素のドメインの３つの保存ドメインを含有することが明らかになった。一方、ＧＡＰ１２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ２２は、既知のいずれのドメインとも、顕著な類似性を示さない。

ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１のＢｌａｓｔアライメントにより、これらのタンパク質の推定アミノ酸配列における４６．３％の同一性が明らかになった（図１５Ｂ）。推定タンパク質の物理化学的分析によって明らかになったことは、ＧＡＰ１２、２１及び６５の計算分子量は予想より小さく、それぞれ９．９、１９．５及び６０．８ｋＤａであり、一方、ＧＡＰ２２の分子量は予想より大きく、２８．６ｋＤａであったことである（表１、図１２）。ＧＡＰ１２、ＧＡＰ２１及びＧＡＰ６５は、酸性のｐＩを有し、したがって、胃石の生理的ｐＨ（ｐＨ８．５近辺）でマイナスに帯電している。ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１は、非極性の脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン及びバリン）を高率で有し、極性であるが帯電していないアミノ酸のプロリン（表１に灰色で強調されている）を高率で有する。及びプラスに帯電しているアルギニンを高率で有している。ＧＡＰ６５は、酸性アミノ酸の含有量が多いが、他の識別できる特徴はない。ＧＡＰ２２は、塩基性のｐＩを有し、したがって、胃石の生理的ｐＨでプラスに帯電している。この主な特徴は、極性であるが帯電していないアミノ酸のプロリン及びプラスに帯電しているアルギニンの高い割合である。生物情報分析によると、ＧＡＰ１２及びＧＡＰ２１は、甲殻類におけるカルシウム沈殿に関係することが知られている他のタンパク質と、アミノ酸組成にいくつかの類似点があることを示す。

（例９）
１００μｌの１ＭのＣａＣ１_２を１０ｍｌの再蒸留水（ＤＤＷ）に加え、１０ｍＭの最終濃度を得た。２００μｌのＰ−セリン（Ｐ−ｓｅｒ）溶液（１００ｍＭ）を、この溶液に加え、２ｍＭのＰ−ｓｅｒを得た。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３を加え（最終濃度：１０ｍＭ）、続いて激しく振盪した。バイアルを、室温で４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。溶液の上部を除去し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図１６）。試料を室温で保存し、沈殿の５カ月後にＡＣＣの安定性を試験した（図２８）。

（例１０）
１００μｌの１ＭのＣａＣｌ_２を１０ｍｌのＤＤＷに加えた（最終濃度：１０ｍＭ）。１００μｌのＰ−スレオニン（Ｐ−Ｔｈｒ）溶液（１００ｍＭ）を、この溶液に加え、１ｍＭのＰ−Ｔｈｒを得た。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_２を加え（最終濃度：１０ｍＭ）、続いて激しく振盪した。バイアルを、室温で４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。溶液の上部を除去し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図１７）。試料を室温で保存し、沈殿の４．５カ月後にＡＣＣの安定性を試験した（図２９）。

（例１１）
１００μｌの１ＭのＣａＣｌ_２を１０ｍｌのＤＤＷに加えた（最終濃度：１０ｍＭ）。２００μｌのＰ−セリン溶液（１００ｍＭ）を、この溶液に加えた。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_２を加え（最終濃度：１０ｍＭ）、続いて激しく振盪した。バイアルを、室温で４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。溶液の上部を除去し、沈殿物を液体窒素中で凍結し、凍結乾燥器で凍結乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図１８）。

（例１２）
例１１に記載した条件は、ＣａＣｌ_２及びＮａ_２ＣＯ_３の最終濃度を、１０ｍＭから１００ｍＭに変えることにより変更した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図１９）。

（例１３）
例１０に記載した条件は、脱水方法を、流動空気から凍結乾燥に変えることにより変更した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２０）。

（例１４）
２０ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、２ｍＭのＰ−Ｓｅｒを含み、キトサン（３ｗｔ％、０．２Ｍの酢酸に溶解）を、カルシウム添加後の最終濃度０．３ｗｔ％に、沈殿析出用溶液に加えた系である。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２１）。

（例１５）
例１４に記載した条件は、最終濃度が０．５ＭのＣａＣｌ_２、０．５ＭのＮａ_２ＣＯ_３及び３ｍＭのＰ−ｓｅｒを使用することにより変更した。この組成物は、濃度の上限を表す。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２２）。

（例１６）
胃石を、内分泌学的に誘発した未脱皮期にあるザリガニから切断し、重量を量り、蒸留水で洗い、−２０℃で保持した。外側のあらゆる残留物質を除去するために、胃石の外層を掻取った後に、胃石を液体窒素を用いて凍結し、乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし粉末にした。脱ミネラル化を、２０ｍｌの０．０２Ｍ酢酸アンモニウム、０．５ＭのＥＧＴＡ中で、氷上でｐＨ７．０にして、胃石粉末の各グラムをかき混ぜることにより行った。ＣａＣＯ_３の溶解が完了してから、懸濁液を遠心分離し（２０００ｒｐｍ、１５〜２０分間、４℃）、上清を採取した。残りの不溶性マトリックス（ＩＳＭ）は、石灰化溶液への添加剤として使用した（ステップｉｉ）。２００μｌのＩＳＭ（推定：約３０μｇタンパク質）を、１０ｍＭのＣａＣｌ_２及び１０ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３を含む１０ｍｌの結晶化用混合物に加え、続いて、空気流で脱水した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２３）。

（例１７）
例１６に記載した条件の変更を、ＣａＣｌ_２及びＮａ_２ＣＯ_３の最終濃度を１０ｍＭから２０ｍＭに変え、ＩＳＭの量を１００μｌ（約１５μｇタンパク質）に変え、さらに、凍結乾燥して脱水することにより行った。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２４）。

（例１８）
キチン質不溶相からキチンに結合しているタンパク質（水素結合により結合しているものまたは共有結合により結合しているもののいずれも）を遊離させ、得られたペプチドのＡＣＣの誘発及び安定化における活性を示すために、ＩＳＭを数種のタンパク質分解酵素で処理した（図２５）。

２８ｍｌの酢酸アンモニウム（２ｍＭ）を７ｍｌのＩＳＭに加えた。この溶液の１０ｍｌを、酢酸アンモニウム（２ｍＭ）中で１０ｍｌのトリプシンと混合した（３．８ｍｇ／ｍ１）。ＩＳＭの懸濁液をタンパク質分解酵素と共に、渦流条件下４℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、バイアルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＳＭの消化されたタンパク質を含有する上清を除去し、上清ｌｍｌ（１００μｌの不溶性マトリックス及び約１５０μｇのタンパク質と等価）を１０ｍ１のＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）に加えた。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（最終濃度：１０ｍＭ）を加え、続いて激しく振盪した。バイアルを４０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣを示した（図２５）。試料を室温で保存し、沈殿の７カ月後にＡＣＣの安定性を試験した（図３０）。

（例１９）
２８ｍｌの酢酸アンモニウム（２ｍＭ）を７ｍｌのＩＳＭに加えた。この溶液の１０ｍｌを、１０ｍｌのストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐ６９１１、０．６ｍｇ／ｍｌ）由来のプロテアーゼと、酢酸アンモニウム（２ｍＭ）中で混合した。ＩＳＭの懸濁液をタンパク質分解酵素と共に、渦流条件下で４℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、バイアルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＳＭの消化されたタンパク質を含有する上清を除去し、上清ｌｍｌを１０ｍ１のＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）に加えた。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（最終濃度：１０ｍＭ）を加え、続いて激しく振盪した。バイアルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣのピーク（１０８０における）と、おそらくリン酸カルシウムである別の第２のピーク（９５０におけるピーク）を示した（図２６）。試料を室温で保存し、沈殿の７カ月後にＡＣＣの安定性を試験した（図３１）。

（例２０）
２８ｍｌの酢酸アンモニウム（２ｍＭ）を７ｍｌのＩＳＭに加えた。この溶液の１０ｍｌを、１０ｍｌのパパイン（０．２６ｍｇ／ｍｌ）と、酢酸アンモニウム（２ｍＭ）中で混合した。ＩＳＭの懸濁液をタンパク質分解酵素と共に、渦流条件下で、４℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、バイアルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＳＭの消化されたタンパク質をこの時点で含有する上清を除去し、上清ｌｍｌを１０ｍｌのＣａＣｌ_２（１０ｍＭ）に加えた。１００μｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３（最終濃度：１０ｍＭ）を加え、続いて激しく振盪した。バイアルを４０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、沈殿物をスライドガラス上に塗りつけて、すぐに空気流で乾燥した。ＲＳは、ＡＣＣと、おそらくリン酸カルシウムを示した（図２７）。試料を室温で保存し、沈殿の７カ月後にＡＣＣの安定性を試験した（図３２）。

本発明は、いくつかの具体的な例に関して記載してきたが、多くの改変及び変形が可能である。したがって、本発明は、添付のクレームの範囲において、具体的に記載されたもの以外の方法で実現してよいことを理解されたい。

Claims

単離され精製されたリン酸化ペプチドであって、甲殻類の胃石又は角質（cuticle）からのものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチド。