JP6236498B2 - 非対称性干渉ｒｎａの組成物およびその使用 - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９６８，２５７号、２００８年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０２９，７５３号、および２００８年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／０３８，９５４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

低分子または短鎖の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）による遺伝子サイレンシングは、分子生物学の強力なツールとして出現し、治療目的に用いられる潜在力を保持している（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；ＫｉｍおよびＲｏｓｓｉ、２００７年）。

理論的には、ＲＮＡｉを用いて、任意の疾患遺伝子を特異的かつ強力にノックダウンまたはサイレンシングすることができる。疾患原因遺伝子が同定される場合、治療目的に対するＲＮＡｉの可能な適用は広範にわたり、遺伝疾患、エピジェネティック疾患、および感染性疾患を含む。

しかし、顕著な送達の問題以外に、ＲＮＡｉベースの薬剤の開発は、ｓｉＲＮＡの限られた効力、インターフェロン様反応およびセンス鎖を介するオフターゲット遺伝子のサイレンシングなど、ｓｉＲＮＡの非特異的な効果、ならびにｓｉＲＮＡ合成の法外であるかまたは高額の経費といった難題に直面している。ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの効力は、哺乳動物細胞内の大半の遺伝子について、約５０％以下に限られている。これらの分子の製造は高価（アンチセンスのデオキシヌクレオチドの製造よりもはるかに高価）であり、不十分であり、化学修飾を必要とする。最後に、合成ｓｉＲＮＡの細胞外投与がインターフェロン様反応を誘発しうるという観察により、ＲＮＡｉベースの研究およびＲＮＡｉベースの治療薬開発に対する障壁がさらに重大なものとなっている。

ＲＮＡｉは、合成短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒにより後にｓｉＲＮＡへと切断される短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする遺伝子エレメントにより選択的に誘発される。遺伝子サイレンシングの生化学的機構は、未だ完全には理解されているわけではないが、マルチタンパク質ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を伴うと考えられる。ＲＩＳＣは、アンチセンスのｓｉＲＮＡ鎖に結合し、これを巻き戻し、組込み、次いで、完全に相補的なｍＲＮＡを認識し標的にしてこれを切断し、これにより、遺伝子発現を低下させる。強力な遺伝子サイレンシング（１〜１０日間）は、ＲＩＳＣ複合体の触媒特性に起因する。ＲＮＡｉの威力は、達成されうる絶妙な特異性から生じる。しかし、オフターゲットのＲＮＡｉ効果が生じることが知られている。別の主要な副作用は、ｓｉＲＮＡによるインターフェロン様反応の活性化であり、これは、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介される。ｓｉＲＮＡがインターフェロン様反応を誘導する能力は、おもに、その長さにより決定される（同上）。

哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングの場合、当技術分野の教示によれば、哺乳動物細胞内において有効であり、細胞の生来の「抗ウイルス」反応を回避するｓｉＲＮＡ構造は、１９〜２１ヌクレオチドの長さと両末端における３’突出とを有する、対称な二本鎖ＲＮＡである（同上）。その分野では、この「最適な」構造でもなおインターフェロン応答を誘発し、ＲＮＡｉベースの研究およびＲＮＡｉベースの治療薬の開発に対して重大な難題を提起しうることがいまや十分に確立されている（Ｓｌｅｄｚら、２００３年）。

より良好な効力および効能、迅速な作用の発現、より良好な持続性、およびより短いＲＮＡ二重鎖の長さを有する新規のｓｉＲＮＡの設計により、非特異的なインターフェロン様反応を回避し、ＲＮＡｉ治療薬の研究および医薬開発のための合成経費を軽減する、哺乳動物細胞における有効なＲＮＡｉへの新たな手法を開発する必要が存在する。

本明細書で引用される参考文献は、優先権が主張される本発明に対する先行技術として容認されるわけではない。

本発明は、哺乳動物細胞における強力な遺伝子サイレンシングを誘導することが可能であり、本明細書では非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と称する、新たなクラスの低分子二重鎖ＲＮＡの驚くべき発見についての発明である。この新たなクラスのＲＮＡｉ誘導剤の特徴は、２本のＲＮＡ鎖の長さの非対称性である。このような新たな構造設計は、遺伝子サイレンシングを実施するのに機能的に強力であるだけでなく、現在の技術水準で最新のｓｉＲＮＡを上回る複数の利点ももたらす。ａｉＲＮＡは、現行のｓｉＲＮＡよりもはるかに短い長さのＲＮＡ二重鎖構造を有することが可能であり、これにより、合成の経費が軽減され、長さに依存する非特異的なインターフェロン様反応の誘発が除去／軽減されるという利点がある。加えて、ａｉＲＮＡ構造の非対称性により、センス鎖を介するオフターゲット効果が除去／軽減される。さらに、ａｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングの誘導において、ｓｉＲＮＡよりも有効であり、強力であり、発現が迅速であり、持続性である。ａｉＲＮＡは、生物学研究、バイオテクノロジー産業および製薬産業におけるＲ＆Ｄ研究、ならびにＲＮＡｉベースの治療を含む、現行のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが適用されているかまたは用いられることが意図されるすべての領域において用いることができる。

本発明は、二重鎖ＲＮＡ分子を提供する。二重鎖ＲＮＡ分子は、１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第１鎖と１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第２鎖とを含み、該第２鎖が該第１鎖と実質的に相補的であり、該第１鎖と二本鎖領域を形成し、該第１鎖が１〜９ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有し、前記二重鎖ＲＮＡ分子は、真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である。一実施形態において、該第１鎖は標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む。さらなる実施形態において、該第１鎖は標的ｍＲＮＡ配列と少なくとも７０％相補的な配列を含む。別の実施形態において、該真核生物細胞は、哺乳動物細胞または鳥類細胞である。

一実施形態において、該５’突出配列の少なくとも１つのヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。

一実施形態において、該二本鎖領域のＧＣ含量は２０％〜７０％である。

一実施形態において、該第１鎖は１９〜２２ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該第１鎖は２１ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第２鎖は１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該第１鎖は２１ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第１鎖は２〜４ヌクレオチドの３’突出を有する。またさらなる実施形態において、該第１鎖は３ヌクレオチドの３’突出を有する。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する。さらなる実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである。またさらなる実施形態において、該骨格修飾リボヌクレオチドは、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する。一実施形態において、該ホスホジエステル結合は、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される。別の実施形態において、該ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである。

一実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、非天然塩基または修飾塩基である。別の実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、イノシンまたはトリチル化塩基を含む。

さらなる実施形態において、該ヌクレオチド類似体は、２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮから選択される基により置換され、各Ｒが独立にＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、糖修飾リボヌクレオチドである。

一実施形態において、該第１鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、該少なくとも１つのデオキシヌクレオチドは、３’突出、５’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある。別の実施形態において、該第２鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。

本発明はまた、細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または生物を請求項１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、該二本鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的の遺伝子または核酸に対して該二重鎖ＲＮＡ分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む方法も提供する。さらなる実施形態において、前記接触させるステップは、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖ＲＮＡ分子を導入するステップを含む。またさらなる実施形態において、導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、または局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される。別の実施形態において、導入するステップは、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む。

一実施形態において、該調節する方法は、細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するのに用いられる。

一実施形態において、該調節する方法は、疾患または望ましくない状態を治療または予防するのに用いられる。

一実施形態において、該標的遺伝子は、哺乳動物における疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する。さらなる実施形態において、該標的遺伝子は病原性微生物の遺伝子である。またさらなる実施形態において、該標的遺伝子はウイルス遺伝子である。別の実施形態において、該標的遺伝子は腫瘍関連遺伝子である。さらに別の実施形態において、該標的遺伝子は、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である。

本発明は、研究用試薬を提供する。該試薬は、二重鎖ＲＮＡ分子を含む。

本発明は、キットをさらに提供する。該キットは、１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第１のＲＮＡ鎖と１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第２のＲＮＡ鎖とを含み、該第２鎖が該第１鎖と実質的に相補的であり、該第１鎖と二重鎖ＲＮＡ分子を形成することが可能であり、該二重鎖ＲＮＡ分子が１〜９ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有し、前記二重鎖ＲＮＡ分子は、真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である。

本発明はまた、二重鎖ＲＮＡ分子を調製する方法も提供する。該方法は、該第１鎖および該第２鎖を合成するステップと、該二重鎖ＲＮＡ分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、合成された鎖を組み合わせるステップとを含む。一実施形態において、請求項３５に記載の方法は、合成するステップの間、合成するステップの後から組み合わせるステップの前において、または組み合わせるステップの後において、該二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む。別の実施形態において、該ＲＮＡ鎖は、化学合成されるか、または生物学的に合成される。

本発明は、発現ベクターを提供する。該ベクターは、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された二重鎖ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含む。一実施形態において、ベクターは、第１の発現制御配列に作動可能に連結された、第１鎖をコードする第１の核酸と、第２の発現制御配列に作動可能に連結された、第２鎖をコードする第２の核酸とを含む。別の実施形態において、ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。

本発明はまた、細胞も提供する。一実施形態において、細胞はベクターを含む。別の実施形態において、細胞は二重鎖ＲＮＡ分子を含む。さらなる実施形態において、細胞は、哺乳動物、鳥類、または細菌の細胞である。

本発明は、二重鎖ＲＮＡ分子を提供する。該二重鎖ＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、該第１鎖が該第２鎖よりも長く、該第２鎖が該第１鎖と実質的に相補的であり、該第１鎖と二本鎖領域を形成し、前記二重鎖ＲＮＡ分子は、真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である。一実施形態において、該二重鎖ＲＮＡ分子の該２つの末端は、１〜１０ヌクレオチドの３’突出、０〜１０ヌクレオチドの５’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される。別の実施形態において、該第１鎖は標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。代替的な実施形態において、該第２鎖は標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。一実施形態において、該真核生物細胞は、哺乳動物細胞または鳥類細胞である。別の実施形態において、該二重鎖ＲＮＡ分子は、単離二重鎖ＲＮＡ分子である。

一実施形態において、該第１鎖は、１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’突出とを有する。

別の実施形態において、該第１鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’突出と平滑末端とを有する。

さらに別の実施形態において、該第１鎖は、１〜１０ヌクレオチドの５’突出と平滑末端とを有する。

代替的な実施形態において、該ＲＮＡ二重鎖は、１〜８ヌクレオチドの２つの５’突出、または１〜１０ヌクレオチドの２つの３’突出を有する。

一実施形態において、該第１鎖は、１２〜１００ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第１鎖は、２１ヌクレオチドの長さを有する。

別の実施形態において、該第２鎖は、５〜３０ヌクレオチド、１２〜２２ヌクレオチド、１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第２鎖は、１５ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該二本鎖領域が２７ｂｐである場合、該ＲＮＡ分子の両末端が独立に３’突出または５’突出であるとの条件つきで、該第１鎖は１２〜３０ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１０〜２９ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、該第１鎖は１８〜２３ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する。

別の実施形態において、該第１鎖は１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する。

代替的な実施形態において、
該第１鎖が

であり、
該第２鎖が最長で１７ヌクレオチドの長さを有するか、または該第１鎖との少なくとも１つのミスマッチを含有するか、または少なくとも１つの修飾を含有するとの条件つきで、
該第１鎖は１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該第１鎖は２１ヌクレオチドの長さを有し、該第２鎖は１２〜１７ヌクレオチドまたは１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該第１鎖は、該第２鎖よりも１〜１０ヌクレオチド長い。

一実施形態において、該３’突出は、２〜６ヌクレオチドの長さを有する。

別の実施形態において、該５’突出は、０〜５ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、該遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉、翻訳の調節、およびＤＮＡのエピジェネティック調節の１もしくは２つ、または全てを含む。

一実施形態において、該二重鎖ＲＮＡ分子は、前記第１鎖および第２鎖の少なくとも１つにおいてニックをさらに含む。

別の実施形態において、該二本鎖領域は、１つまたは複数のヌクレオチドのギャップを含む。

一実施形態において、５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドは、該標的ｍＲＮＡ配列と相補的ではない。

別の実施形態において、該５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートしている。

一実施形態において、ＲＮＡ分子は、マッチしないかまたはミスマッチする少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む。

別の実施形態において、該二本鎖領域のＧＣ含量は２０〜７０％である。

一実施形態において、３’突出および／または５’突出は、分解に対して安定化される。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する。さらなる実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態において、該骨格修飾リボヌクレオチドは、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する。別の実施形態において、該ホスホジエステル結合は、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される。さらに別の実施形態において、該ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである。

一実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、非天然塩基または修飾塩基を含む。別の実施形態において、該少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体は、イノシンまたはトリチル化塩基を含む。

さらなる実施形態において、該ヌクレオチド類似体は糖修飾リボヌクレオチドであり、２’−ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮから選択される基により置換され、各Ｒは独立にＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。

一実施形態において、該第１鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、該少なくとも１つのデオキシヌクレオチドは、３’突出、５’突出、および該第１鎖の５’端に近接する二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある。別の実施形態において、該第２鎖は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。

本発明はまた、細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法を提供する。該方法は、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または生物を請求項１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、該二本鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対して該二本鎖ＲＮＡにより実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む。さらなる実施形態において、前記接触させるステップは、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖ＲＮＡ分子を導入するステップを含む。またさらなる実施形態において、導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、または局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される。別の実施形態において、導入するステップは、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む。一実施形態において、該調節する方法は、細胞または生物における遺伝子の発現を調節するのに用いられる。

別の実施形態において、該調節する方法は、疾患または望ましくない状態を治療または予防するのに用いられる。

一実施形態において、該標的遺伝子は、ヒトまたは動物の疾患と関連する遺伝子である。さらなる実施形態において、該遺伝子は病原性微生物の遺伝子である。またさらなる実施形態において、該標的遺伝子はウイルス遺伝子である。別の実施形態において、該遺伝子は腫瘍関連遺伝子である。

さらに別の実施形態において、標的遺伝子は、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である。

該調節する方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける薬物標的を研究するのに用いられる。

本発明は、二重鎖ＲＮＡ分子を含む試薬を提供する。

本発明は、キットをさらに提供する。該キットは、第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖を含み、該第１鎖が該第２鎖よりも長く、該第２鎖が該第１鎖と実質的に相補的であり、該第１鎖と二重鎖ＲＮＡ分子を形成することが可能であり、前記二重鎖ＲＮＡ分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である。

本発明はまた、請求項１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、該第１鎖および該第２鎖を合成するステップと、二重鎖ＲＮＡ分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、合成された鎖を組み合わせるステップとを含む方法も提供する。一実施形態において、それらのＲＮＡ鎖は、化学合成されるか、または生物学的に合成される。別の実施形態において、該第１鎖および該第２鎖は、個々にまたは同時に合成される。

一実施形態において、該方法は、合成するステップの間、合成するステップの後から組み合わせるステップの前において、または組み合わせるステップの後において、該二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む。

本発明は、医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、活性作用物質としての、少なくとも１種の二重鎖ＲＮＡ分子と、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、コレステロール、脂質、およびリポイドからなる群から選択される１種または複数種の担体とを含む。

本発明はまた、治療法も提供する。該方法は、有効量の本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。一実施形態において、該医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、吸入投与、局所投与、経口投与、および局所投与からなる群から選択される経路を介して投与される。

一実施形態において、該第１鎖は、発生遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および酵素遺伝子、ならびに接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインまたはその受容体、成長／分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体、キナーゼ、シグナル伝達物質の遺伝子、ウイルス遺伝子、感染性疾患の遺伝子、ＡＢＬ１、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、およびＹＥＳ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＡＣＰデサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼもしくはペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、ｋ−ＲＡＳ、β−カテニン、Ｒｓｋ１、ＰＣＮＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、サバイビン、ｍＴＯＲ、ＰＴＥＮ、Ｐａｒｐ１、またはｐ２１からなる群から選択される遺伝子の標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む。

別の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、

［表中、Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣはヌクレオチドであり、ａ、ｔ、ｇ、およびｃはデオキシヌクレオチドである。］
からなる群から選択される。

本発明は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を有する第１の二重鎖ＲＮＡ分子を修飾する方法を提供する。該方法は、該アンチセンス鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有するように、センス鎖の長さを短くするステップと、第２の二重鎖ＲＮＡ分子を形成するステップとを含み、第１の二重鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの特性が改善される。一実施形態において、該特性は、サイズ、効力、効能、発現速度、持続性、合成経費、オフターゲット効果、インターフェロン応答、および送達からなる群から選択される。別の実施形態において、該方法は、該第２の二重鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で、該アンチセンス鎖と該短くしたセンス鎖とを組み合わせるステップをさらに含む。さらなる実施形態おいて、該第１の二重鎖ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡであるか、またはｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡであるか、またはｓｉＲＮＡ前駆体である。

本発明は、発現ベクターを提供する。該ベクターは、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された請求項１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含む。一実施形態において、該発現ベクターは、第１の発現制御配列に作動可能に連結された、該第１鎖をコードする第１の核酸と、第２の発現制御配列に作動可能に連結された、該第２鎖をコードする第２の核酸とを含む。別の実施形態において、該発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクターであるか、または細菌の発現ベクターである。

本発明はまた、細胞も提供する。一実施形態において、細胞は発現ベクターを含む。別の実施形態において、細胞は二重鎖ＲＮＡ分子を含む。さらに別の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、または細菌細胞である。

本発明の他の特徴および利点は、異なる例を含む、本明細書で提供されるさらなる説明から明らかである。提示される例は、本発明を実施するのに有用な、異なる成分および方法を例示する。該例は、優先権が主張される本発明を制限するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するのに有用な他の成分および方法を同定し、用いることができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第１鎖と１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第２鎖とを含み、
前記第２鎖が前記第１鎖と実質的に相補的であり、前記第１鎖と二本鎖領域を形成し、
前記第１鎖が１〜９ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能な二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目２）
前記第１鎖が、標的ｍＲＮＡ配列と少なくとも７０％相補的な配列を含む、項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目３）
前記５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドが、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される、項目１に記載のＲＮＡ分子。
（項目４）
前記二本鎖領域のＧＣ含量が３０％〜７０％である、項目１に記載のＲＮＡ分子。
（項目５）
前記第１鎖が１９〜２３ヌクレオチドの長さを有する、項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目６）
前記第１鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する、項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目７）
前記第２鎖が１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する、項目６に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８）
前記第２鎖が１５ヌクレオチドの長さを有する、項目６に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目９）
前記第１鎖が２〜４ヌクレオチドの３’突出を有する、項目８に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１０）
前記第１鎖が３ヌクレオチドの３’突出を有する、項目８に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１１）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１２）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１３）
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目１２に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１４）
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目１３に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１５）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基である、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１６）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１７）
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮから選択される基により置換され、各Ｒが独立にＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１８）
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１９）
前記第１鎖が、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目２０）
前記少なくとも１つのデオキシヌクレオチドが、３’突出、５’突出、および二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある、項目１９に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目２１）
前記第２鎖が、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む、項目１１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目２２）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目１に記載のＲＮＡ分子。
（項目２３）
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、
前記二本鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子、核酸に対して前記二重鎖ＲＮＡ分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む方法。
（項目２４）
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖ＲＮＡ分子を導入するステップを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、または局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
細胞または生物における遺伝子の機能または有用性を決定するための、項目２３に記載の方法の使用。
（項目２８）
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目２３に記載の方法の使用。
（項目２９）
前記標的遺伝子が、哺乳動物における疾患、病理学的状態、または望ましくない状態と関連する、項目２３に記載の使用。
（項目３０）
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目２３に記載の使用。
（項目３１）
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目２３に記載の使用。
（項目３２）
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目２３に記載の使用。
（項目３３）
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目２３に記載の使用。
（項目３４）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を含む試薬。
（項目３５）
１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第１のＲＮＡ鎖と１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第２のＲＮＡ鎖とを含み、
前記第２鎖が前記第１鎖と実質的に相補的であり、前記第１鎖と二重鎖ＲＮＡ分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖ＲＮＡ分子が１〜９ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有し、
前記二重鎖ＲＮＡ分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
（項目３６）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
前記第１鎖および前記第２鎖を合成するステップと、
前記二重鎖ＲＮＡ分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
（項目３７）
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＲＮＡ鎖が、化学合成されるか、または生物学的に合成される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
（項目４０）
第１の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第１鎖をコードする第１の核酸と、第２の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第２鎖をコードする第２の核酸とを含む、項目３９に記載の発現ベクター。
（項目４１）
項目３９に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
（項目４２）
項目３９に記載のベクターを含む細胞。
（項目４３）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を含む細胞。
（項目４４）
哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である、項目４３に記載の細胞。
（項目４５）
第１鎖および第２鎖を含み、
前記第１鎖が前記第２鎖よりも長く、
前記第２鎖が前記第１鎖と実質的に相補的であり、前記第１鎖と二本鎖領域を形成し、
真核生物細胞内における選択的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能である、二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目４６）
前記二重鎖ＲＮＡ分子の２つの末端が、１〜１０ヌクレオチドの３’突出、０〜１０ヌクレオチドの５’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目４７）
前記第１鎖が標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目４８）
前記第１鎖が、１〜８ヌクレオチドの３’突出と１〜８ヌクレオチドの５’突出とを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目４９）
前記第１鎖が、１〜１０ヌクレオチドの３’突出と平滑末端とを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５０）
前記第１鎖が、１〜１０ヌクレオチドの５’突出と平滑末端とを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５１）
前記ＲＮＡ二重鎖が、１〜８ヌクレオチドの２つの５’突出を有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５２）
前記ＲＮＡ二重鎖が、１〜１０ヌクレオチドの２つの３’突出を有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５３）
前記第１鎖が１２〜１００ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５４）
前記第１鎖が１２〜３０ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５５）
前記第１鎖が１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５６）
前記第１鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５７）
前記第１鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５８）
前記第２鎖が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目５９）
前記第２鎖が１２〜２２ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６０）
前記第２鎖が１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６１）
前記第２鎖が１５ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６２）
前記二本鎖領域が２７ｂｐである場合、前記ＲＮＡ分子の両末端における突出が独立に３’突出または５’突出であるとの条件つきで、前記第１鎖が１２〜３０ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１０〜２９ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６３）
前記第１鎖が１８〜２３ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６４）
前記第１鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６５）
前記第１鎖が
であり、
前記第２鎖が最長で１７ヌクレオチドの長さを有するか、または前記第１鎖との少なくとも１つのミスマッチを含有するか、または少なくとも１つの修飾を含有するとの条件つきで、
前記第１鎖が１９〜２５ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６６）
前記第１鎖が２１ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６７）
前記第１鎖が２１ヌクレオチドの長さを有し、前記第２鎖が１４〜１６ヌクレオチドの長さを有する、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６８）
前記第１鎖が前記第２鎖よりも１〜１０ヌクレオチド長い、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目６９）
前記３’突出が２〜６ヌクレオチドの長さを有する、項目４６に記載のＲＮＡ分子。
（項目７０）
前記５’突出が０〜５ヌクレオチドの長さを有する、項目４６に記載のＲＮＡ分子。
（項目７１）
前記遺伝子サイレンシングが、ＲＮＡ干渉、翻訳の調節、およびＤＮＡのエピジェネティック調節の１もしくは２つ、または全てを含む、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目７２）
前記第１鎖および前記第２鎖の少なくとも１つにおいてニックをさらに含む、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目７３）
前記二本鎖領域が１つまたは複数のヌクレオチドのギャップを含む、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目７４）
５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドが、前記標的ｍＲＮＡ配列と相補的ではない、項目４７に記載のＲＮＡ分子。
（項目７５）
５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドが、Ａ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目７６）
ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、コレステロール、およびアプタマーからなる群から選択される実体とコンジュゲートしている、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目７７）
マッチしないかまたはミスマッチする少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目７８）
前記二本鎖領域のＧＣ含量が２０〜７０％である、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目７９）
３’突出および／または５’突出が、分解に対して安定化される、項目４５に記載のＲＮＡ分子。
（項目８０）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含有する、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８１）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８２）
前記骨格修飾リボヌクレオチドが、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合において修飾を有する、項目８１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８３）
前記ホスホジエステル結合が、少なくとも１つの窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、項目８２に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８４）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、非天然塩基または修飾塩基を含む、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８５）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体が、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８６）
前記ヌクレオチド類似体が糖修飾リボヌクレオチドであり、その２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮから選択される基により置換され、各Ｒが独立にＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８７）
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホチオエート基を含有する骨格修飾リボヌクレオチドである、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８８）
前記第１鎖が少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目８９）
前記少なくとも１つのデオキシヌクレオチドが、３’突出、５’突出、および前記第１鎖の５’端に近接する二本鎖領域からなる群から選択される１つまたは複数の領域内にある、項目８８に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目９０）
前記第２鎖が少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む、項目８０に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目９１）
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞または鳥類細胞である、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目９２）
前記二重鎖ＲＮＡ分子が単離二重鎖ＲＮＡ分子である、項目４５に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目９３）
細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法であって、
選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下において、前記細胞または前記生物を項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップと、
前記二本鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的遺伝子または核酸に対して前記二本鎖ＲＮＡ分子により実施される選択的な遺伝子サイレンシングを媒介するステップと
を含む方法。
（項目９４）
前記接触させるステップが、選択的な遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物中または生物内の標的細胞へと前記二重鎖ＲＮＡ分子を導入するステップを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記導入するステップが、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、感染、注射、経口投与、吸入、局所投与、および局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記導入するステップが、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノエマルジョン、脂質、およびリポイドからなる群から選択される、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用を含む、項目９３に記載の方法。
（項目９７）
細胞または生物における遺伝子の発現を調節するための、項目９３に記載の方法の使用。
（項目９８）
疾患または望ましくない状態を治療または予防するための、項目９３に記載の方法の使用。
（項目１００）
前記標的遺伝子がヒトの疾患または動物の疾患と関連する遺伝子である、項目９３に記載の使用。
（項目１０１）
前記標的遺伝子が病原性微生物の遺伝子である、項目９３に記載の使用。
（項目１０２）
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、項目９３に記載の使用。
（項目１０３）
前記標的遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、項目９３に記載の使用。
（項目１０４）
前記標的遺伝子が、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化からなる群から選択される疾患と関連する遺伝子である、項目９３に記載の使用。
（項目１０５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける薬剤標的の研究のための、項目９３に記載の方法の使用。
（項目１０６）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を含む試薬。
（項目１０７）
第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖を含み、
前記第１鎖が前記第２鎖よりも長く、
前記第２鎖が前記第１鎖と実質的に相補的であり、前記第１鎖と二重鎖ＲＮＡ分子を形成することが可能であり、
前記二重鎖ＲＮＡ分子が真核生物細胞内における配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能なキット。
（項目１０８）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
前記第１鎖および前記第２鎖を合成するステップと、
前記二重鎖ＲＮＡ分子が形成され、これにより、配列特異的な遺伝子サイレンシングを実施することが可能となる条件下で、その合成された鎖を組み合わせるステップと
を含む方法。
（項目１０９）
前記合成するステップの間、前記合成するステップの後から前記組み合わせるステップの前において、または前記組み合わせるステップの後において、前記二重鎖ＲＮＡ分子内に少なくとも１種の修飾ヌクレオチドまたはその類似体を導入するステップをさらに含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＲＮＡ鎖が化学的に合成されるか、または生物学的に合成される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１１）
前記第１鎖および前記第２鎖が、個々にまたは同時に合成される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１２）
活性作用物質としての、少なくとも１種の項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子と、医薬担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、コレステロール、脂質、およびリポイドからなる群から選択される１種または複数種の担体とを含む医薬組成物。
（項目１１３）
有効量の項目１１２に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む治療法。
（項目１１４）
前記医薬組成物が、静脈内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、吸入投与、局所投与、および局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）投与からなる群から選択される経路を介して投与される、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記第１鎖が、発生遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および酵素遺伝子、ならびに接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインまたはその受容体、成長／分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体、キナーゼ、シグナル伝達物質の遺伝子、ウイルス遺伝子、感染性疾患の遺伝子、ＡＢＬ１、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、およびＹＥＳ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＡＣＰデサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼもしくはペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄｅａｓｅ）、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、ｋ−ＲＡＳ、β−カテニン、Ｒｓｋ１、ＰＣＮＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、サバイビン、ｍＴＯＲ、ＰＴＥＮ、Ｐａｒｐ１、またはｐ２１からなる群から選択される遺伝子の標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的な配列を含む、項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１１６）
［表中、Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣはヌクレオチドであり、ａ、ｔ、ｇ、およびｃはデオキシヌクレオチドである。］
からなる群から選択される、二重鎖ＲＮＡ分子。
（項目１１７）
二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を有する第１の二重鎖ＲＮＡ分子を修飾する方法であって、前記アンチセンス鎖が１〜８ヌクレオチドの３’突出と０〜８ヌクレオチドの５’突出とを有するように、前記センス鎖の長さを短くするステップと、第２の二重鎖ＲＮＡ分子を形成するステップとを含み、
前記第１の二重鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの特性が改善される方法。
（項目１１８）
前記第２の二重鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で、前記アンチセンス鎖とその短くしたセンス鎖とを組み合わせるステップをさらに含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記第１の二重鎖ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡであるか、またはｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡであるか、またはｓｉＲＮＡ前駆体である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含む発現ベクター。
（項目１２１）
第１の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第１鎖をコードする第１の核酸と、第２の発現制御配列に作動可能に連結された、前記第２鎖をコードする第２の核酸とを含む、項目１２０に記載の発現ベクター。
（項目１２２）
項目１２０に記載の発現ベクターは、ウイルスの発現ベクター、真核生物の発現ベクター、または細菌の発現ベクターである。
（項目１２３）
項目１２０に記載の発現ベクターを含む細胞。
（項目１２４）
項目１に記載の二重鎖ＲＮＡ分子を含む細胞。
（項目１２５）
項目１２４に記載の細胞は、哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である。

図１Ａは、第１鎖上に３’突出と５’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図１Ｂは、第１鎖上に３’突出と５’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造、および二重鎖中のニックを示す図である。図１Ｃは、第１鎖上に３’突出と５’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造、および第２鎖中のギャップを示す図である。 図２Ａは、第１鎖上に平滑末端、および５’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｂは、第１鎖上に平滑末端、および３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｃは、二重鎖の両末端上に３’突出を有し、かつ第１鎖が第２鎖より長い、二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。図２Ｄは、二重鎖の両末端上に５’突出を有し、かつ第１鎖が第２鎖より長い、二重鎖ＲＮＡ分子の構造を示す図である。 ａｉＲＮＡ（非対称性干渉ＲＮＡ）によるβ−カテニンの遺伝子サイレンシングの誘導を示す図である。図３Ａはオリゴの確認を示す図である。アニーリング後、オリゴを２０％ポリアクリルアミドゲルによって確認した。レーン１、２１ｎｔ／２１ｎｔ；レーン２、１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン３、１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン４、１３ｎｔ／１３ｎｔ；レーン５、１３ｎｔ／２１ｎｔ；レーン６、１４ｎｔ／１４ｎｔ；レーン７、１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン８、１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン９、１５ｎｔ／１５ｎｔ；レーン１０、１５ｎｔ／２１ｎｔ。

図３Ｂは、遺伝子サイレンシングにおけるオリゴの影響を示す図である。ＨｅＬａ細胞を２００，０００細胞／ウエルで６ウエル培養プレートに平板培養した。２４時間後、それらをスクランブルｓｉＲＮＡ（レーン１）、２１−ｂｐｓｉＲＮＡ標的化Ｅ２Ｆ１（レーン２、特異性の対照として）またはβ−カテニンを標的とする２１−ｂｐｓｉＲＮＡ（レーン３、陽性対照として）、または異なる長さの混合物：１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン４）；１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン５）；１３ｎｔ／２１ｎｔ（レーン６）；１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン７）；１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン８）；１５ｎｔ／２１ｎｔ（レーン９）の同じ濃度のａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間で採取した。β−カテニンの発現はウエスタンブロットによって決定した。Ｅ２Ｆ１およびアクチンは対照として使用する。
遺伝子サイレンシングの媒介における、塩基置換有りまたは無しのａｉＲＮＡオリゴの構造−活性関係を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示したａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後４８時間で溶解物を生成した。ウエスタンブロットを実施してβ−カテニンおよびアクチンのレベルを検出した。ｓｉはβ−カテニンｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを表す。それぞれのレーン上の数値ラベルは表３中のａｉＲＮＡオリゴに対応する。 遺伝子サイレンシングの媒介における、塩基置換有りまたは無しのａｉＲＮＡオリゴの構造−活性関係を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示したａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後４８時間で溶解物を生成した。ウエスタンブロットを実施してβ−カテニンおよびアクチンのレベルを検出した。ｓｉはβ−カテニンｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを表す。それぞれのレーン上の数値ラベルは表３中のａｉＲＮＡオリゴに対応する。 ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズムの分析を示す図である。

図６ａは、示した日数でａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における、β−カテニンｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す図である。

図６ｂは、ｍＲＮＡの切断および予想ＰＣＲ産物を示す、β−カテニンの５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲの概略を示す図である。

図６ｃは、ａｉＲＮＡによって媒介されたβ−カテニン切断産物を、４または８時間ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞から５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって増幅したことを示す図である。
ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズムの分析を示す図である。

図６ｄは、５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ断片を配列決定することによって確認したβ−カテニンｍＲＮＡ切断部位の概略を示す図である。

図６ｅは、ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの差次的ＲＩＳＣローディング効率を示す図である。ｐＣＭＶ−Ａｇｏ２を用いたトランスフェクション後４８時間でＨｅｌａ細胞にａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした。Ａｇｏ２はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのトランスフェクション後に示した時間時点で免疫沈降させ、ノーザンブロット分析を実施してＡｇｏ２／ＲＩＳＣ結合小ＲＮＡのレベルを決定した。（以下に示す）Ａｇｏ２のレベルはＩＰ後にウエスタンブロットによって決定した。

図６ｆは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に対するＡｇｏ２またはＤｉｃｅｒのノックダウンの影響を示す図である。細胞はスクランブルａｉＲＮＡ（Ｃｏｎ）またはａｉＲＮＡ標的化Ｓｔａｔ３（ａｉ）を用いたトランスフェクションの２４時間前に、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎ）、またはｓｉＲＮＡ標的化Ａｇｏ２（ｓｉＡｇｏ２）、またはＤｉｃｅｒ（ｓｉＤｉｃｅｒ）でトランスフェクトした。細胞を採取し、ａｉＳｔａｔ３トランスフェクション後４８時間でウエスタンブロット分析を実施した。
ｓｉＲＮＡと比較したＲＩＳＣへのａｉＲＮＡの取り込みの利点を示す図である。

図７Ａは、ａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡより良い効率でＲＩＳＣに進入することを示す図である。Ａｇｏ２発現プラスミドでトランスフェクトした細胞を、示した時間ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞溶解後、Ａｇｏ２を免疫沈降させ、ＲＮＡを免疫沈降物から抽出し、１５％アクリルアミドゲル上で分離した。移動後、膜をプローブとハイブリダイズさせてａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの２１ｍｅｒアンチセンス鎖を検出した。ＩｇＧ対照レーンは、Ａｇｏ２免疫沈降物と比較したシグナルの欠如を示す。

図７Ｂは、ａｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ中に存在しないことを示す図である。（Ａ）からの膜を剥離し、再度プローブ処理してトランスフェクトしたオリゴのセンス鎖を検出した。（Ａ）および（Ｂ）中の絵図は、膜上のセンス鎖（上側の鎖）、アンチセンス鎖（下側の鎖）、または二重鎖の位置を示す。
ａｉＲＮＡによるＲＩＳＣローディングのメカニズムの図である。

図８Ａは、ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡおよびＡｇｏ２の異なる鎖間の相互作用の免疫沈降分析を示す図である。過剰発現Ａｇｏ２を含有するＨｅｌａＳ−１０溶解物を、^３２Ｐ末端標識センス鎖またはアンチセンス鎖を含有する示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。（＊）は標識の位置を示す。Ａｇｏ２免疫沈降後、ＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分離し、フィルムに感光させた。Ａｇｏ２結合ＲＮＡはペレット画分中に示され、一方非Ａｇｏ２結合ＲＮＡは上清（Ｓｕｐ）中に残る。

図８Ｂは、ａｉＲＮＡ活性におけるセンス鎖切断の役割を示す図である。細胞はａｉＲＮＡで、または位置８（予想されるＡｇｏ２切断部位）が２’−Ｏ−メチルであるセンス鎖を有するａｉＲＮＡで、または対照として位置９が２’−Ｏ−メチルであるセンス鎖を有するａｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡをトランスフェクション後４時間で回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施して残りのβ−カテニンｍＲＮＡの相対的レベルを決定した。
ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの競合分析を示す図である。

図９Ａは、^３２Ｐ末端標識アンチセンス鎖を含有するｓｉＲＮＡ二重鎖およびａｉＲＮＡ二重鎖を示す図である。（＊）は標識の位置を示す。

図９Ｂは、非放射能のａｉＲＮＡはＡｇｏ２に関して標識ｓｉＲＮＡと競合しないことを示す図である。過剰発現Ａｇｏ２を含有するＨｅｌａＳ−１０溶解物は、Ａｇｏ２の免疫沈降前に^３２Ｐ末端標識ｓｉＲＮＡおよび非放射能のａｉＲＮＡ二重鎖または非放射能のｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。次いでＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分析した。

図９Ｃは、非放射能のｓｉＲＮＡはＡｇｏ２に関して標識ａｉＲＮＡと競合しないことを示す図である。Ｂ中で使用したのと同じＳ−１０溶解物を、Ａｇｏ２の免疫沈降前に^３２Ｐ末端標識ａｉＲＮＡおよび非放射能のａｉＲＮＡ二重鎖または非放射能のｓｉＲＮＡ二重鎖とインキュベートした。次いでＲＮＡを単離し、１５％アクリルアミドゲル上で分析した。
ＲＩＳＣローディングおよび成熟ＲＩＳＣの生成において観察した差を示す、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのモデルを示す図である。 アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの非対称性ＲＮＡ二重鎖（ａｉＲＮＡ）が、強力、有効、迅速、および持続的遺伝子サイレンシングを誘導したことを示す図である。

図１１Ａは、β−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡおよびβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡの配列および設計を示すダイアグラムを示す図である。

図１１Ｂは、様々な長さのａｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの誘導を示す図である。β−カテニンタンパク質レベルを、示したａｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした細胞においてウエスタンブロットによって分析した。
アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの非対称性ＲＮＡ二重鎖（ａｉＲＮＡ）が、強力、有効、迅速、および持続的遺伝子サイレンシングを誘導したことを示す図である。

図１１Ｃは、ａｉＲＮＡがβ−カテニンタンパク質欠乏の誘導においてｓｉＲＮＡより強力かつ有効であることを示す図である。Ｈｅｌａ細胞は示した濃度でβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡまたはβ−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、細胞溶解物を作製し、ウエスタンブロット分析を行った。

図１１Ｄは、ａｉＲＮＡがβ−カテニンＲＮＡレベルの低減においてｓｉＲＮＡより有効、迅速、および持続的であることを示す図である。細胞はノーザンブロット分析前に示した日数１０ｎＭの１５ｂｐのａｉＲＮＡまたは２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
ａｉＲＮＡが迅速かつ強力なサイレンシングを媒介することを示す図である。

図１２Ａは、β−カテニンを標的化するために使用したａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの配列および構造を示す図である。

図１２Ｂは、対照ａｉＲＮＡまたはβ−カテニンを標的とするａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のβ−カテニンｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。ＲＮＡはトランスフェクション後の示した時間で回収した。
ａｉＲＮＡが迅速かつ強力なサイレンシングを媒介することを示す図である。

図１２Ｃは、示した時間数の、対照、ａｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す図である。

図１２Ｄは、示した時間の、対照、ａｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す図である。
複数の標的に対する遺伝子サイレンシングの効力および持続性におけるｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡの比較を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は（ａ）β−カテニン、１０ｎＭ、（ｂ）Ｓｔａｔ３、（ｃ）ＥＦ２、または（ｄ）ＮＱＯ１、２０ｎＭを標的化するスクランブルｓｉＲＮＡ（ｃ）、ａｉＲＮＡ（ａｉ）、またはｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。ＲＮＡおよびタンパク質を示した時間時点で精製し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルに関して分析し、タンパク質レベルはウエスタンブロットによって分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータはｓｉＣｏｎトランスフェクト細胞に正規化する。 複数の標的に対する遺伝子サイレンシングの効力および持続性におけるｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡの比較を示す図である。Ｈｅｌａ細胞は（ａ）β−カテニン、１０ｎＭ、（ｂ）Ｓｔａｔ３、（ｃ）ＥＦ２、または（ｄ）ＮＱＯ１、２０ｎＭを標的化するスクランブルｓｉＲＮＡ（ｃ）、ａｉＲＮＡ（ａｉ）、またはｓｉＲＮＡ（ｓｉ）でトランスフェクトした。ＲＮＡおよびタンパク質を示した時間時点で精製し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルに関して分析し、タンパク質レベルはウエスタンブロットによって分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータはｓｉＣｏｎトランスフェクト細胞に正規化する。 ａｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、複数の細胞系中の様々な遺伝子に対して有効であることを示す図である。

図１４ａは、ａｉＲＮＡ二重鎖は、異なる哺乳動物細胞系中のβ−カテニンの標的化においてｓｉＲＮＡより有効であることを示す図である。

図１４ｂは、４８時間２０ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のＮｂｓ１、サバイビン、Ｐａｒｐ１、ｐ２１のウエスタンブロット分析を示す図である。
ａｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、複数の細胞系中の様々な遺伝子に対して有効であることを示す図である。

図１４ｃは、４８時間２０ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来のＲｓｋ１、ＰＣＮＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲ、およびＰＴＥＮのウエスタンブロット分析を示す図である。

図１４ｄは、ａｉＲＮＡによるｋ−Ｒａｓの対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを示す図である。ウエスタンブロット分析によって、野生型ｋ−Ｒａｓを標的化するａｉＲＮＡを、ｋ−Ｒａｓ野生型（ＤＬＤ１）とｋ−Ｒａｓ突然変異体（ＳＷ４８０）細胞系の両方においてｋ−Ｒａｓのサイレンシングに関して試験した。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。

図１５ａは、モック処理したＰＢＭＣまたは１６時間β−カテニンのｓｉＲＮＡ二重鎖またはβ−カテニンのａｉＲＮＡ二重鎖でインキュベートしたＰＢＭＣにおける、インターフェロン誘導性遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。

図１５ｂは、モックトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞または２４時間ＥＦ２のａｉＲＮＡまたはＥＦ２のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞または２４時間サバイビンのａｉＲＮＡまたはサバイビンのｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞における、インターフェロン誘導性遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。

図１５ｃは、既知のインターフェロン応答関連遺伝子の発現の変化に関するマイクロアレイ分析を示す図である。ａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞およびｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から単離した全てのＲＮＡを、マイクロアレイによって分析した。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。

図１５ｄは、センス鎖媒介のオフターゲット遺伝子サイレンシングがａｉＲＮＡに関して検出されないことを示す図である。細胞はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとＳｔａｔ３（センスＲＮＡ）を発現するプラスミドまたはアンチセンスＳｔａｔ３（アンチセンスＲＮＡ）を発現するプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後２４時間でＲＮＡを回収し、Ｓｔａｔ３センスＲＮＡまたはＳｔａｔ３アンチセンスＲＮＡの相対的レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって決定した（挿入図）。

図１５ｅは、ヒト血清中でのａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ二重鎖の安定性を示す図である。ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ二重鎖は、ゲル電気泳動前に示した量の時間３７℃で１０％ヒト血清中においてインキュベートした。残存する二重鎖（対照の％）を示している。
センス鎖、免疫刺激によるオフターゲット遺伝子サイレンシングの欠如、およびａｉＲＮＡの血清中安定性を示す図である。

図１５ｆは、ａｉＲＮＡ二重鎖によって媒介される遺伝子特異的サイレンシングに関して提案されるモデルを示す図である。
ＳＷ４８０ヒト結腸異種移植マウスモデルにおけるβ−カテニンに対するａｉＲＮＡの強力な抗腫瘍活性を示す図である。樹立皮下ＳＷ４８０ヒト結腸癌を有する免疫抑制マウスに、毎日０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合無関連ｓｉＲＮＡを静脈内（ｉｖ）に与えた。腫瘍の大きさを治療中定期的に評価した。それぞれの時点は６個の腫瘍の平均値±ＳＥＭを表す。 ＨＴ２９ヒト結腸異種移植マウスモデルにおけるβ−カテニンに対するａｉＲＮＡの強力な抗腫瘍活性を示す図である。樹立皮下ＨＴ２９ヒト結腸癌を有する免疫抑制マウスに、１日おきに０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合無関連ｓｉＲＮＡを静脈内（ｉｖ）に与えた。腫瘍の大きさを治療中定期的に評価した。それぞれの時点は５個の腫瘍の平均値±ＳＥＭを表す。

本発明は、真核生物細胞における選択的遺伝子サイレンシングをもたらすことができる非対称性二重鎖ＲＮＡ分子に関する。一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は第１鎖および第２鎖を含む。第１鎖は第２鎖よりも長い。第２鎖は第１鎖と実質的に相補的であり、第１鎖と二本鎖領域を形成する。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、１〜８ヌクレオチドの３’突出および１〜８ヌクレオチドの５’突出、１〜１０ヌクレオチドの３’突出および平滑末端、または１〜１０ヌクレオチドの５’突出および平滑末端を有する。別の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、１〜８ヌクレオチドの２つの５’突出または１〜１０ヌクレオチドの２つの３’突出を有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、１〜８ヌクレオチドの３’突出および１〜８ヌクレオチドの５’突出を有する。なおさらなる実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、単離された二重鎖ＲＮＡ分子である。

一実施形態において、第１鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’突出、および１〜１０ヌクレオチドの５’突出または５’−平滑末端を有する。別の実施形態において、第１鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’突出、および１〜１０ヌクレオチドの５’突出を有する。代替の実施形態において、第１鎖は、１〜１０ヌクレオチドの３’突出、および５’−平滑末端を有する。

一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ヌクレオチド、１２〜３０ヌクレオチド、１５〜２８ヌクレオチド、１８〜２７ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、または２１ヌクレオチドの長さを有する。

別の実施形態において、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチド、１２〜２６ヌクレオチド、１３〜２０ヌクレオチド、１４〜２３ヌクレオチド、１４または１５ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は５〜１００ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は３〜３０ヌクレオチドの長さを有する；または、第１鎖は１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は３〜２９ヌクレオチドの長さを有する；または、第１鎖は１２〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は１０〜２６ヌクレオチドの長さを有する；または、第１鎖は１５〜２８ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する；または、第１鎖は１９〜２７ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は１４〜２３ヌクレオチドの長さを有する；または、第１鎖は２０〜２２ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は１４〜１５ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は２１ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は１３〜２０ヌクレオチド、１４〜１９ヌクレオチド、１４〜１７ヌクレオチド、１４または１５ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長い。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、１〜１０個のマッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態において、マッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチドは、３’ 陥凹（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）末端にあるかまたはその近くにある。代替の実施形態において、マッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチドは、５’ 陥凹末端にあるかまたはその近くにある。代替の実施形態において、マッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチドは二本鎖領域にある。別の実施形態において、マッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチド配列は１〜５ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、マッチしないかまたはミスマッチするヌクレオチドはループ構造を形成する。

一実施形態において、第１鎖または第２鎖は、少なくとも１つのニックを含み、または２つのヌクレオチド断片によって形成される。

一実施形態において、遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉、翻訳の調節、およびＤＮＡのエピジェネティック調節のうちの１もしくは２つ、または全てを介して達成される。

本明細書および特許請求の範囲において使用するとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、文脈から明らかに他に指示がない限り、複数の対象を含む。例えば、用語「細胞」には、細胞の混合物を含む複数の細胞が含まれる。

本明細書中で使用するとき、「二本鎖ＲＮＡ」、「二重鎖ＲＮＡ」または「ＲＮＡ二重鎖」とは、２つの鎖であって、少なくとも１つの二本鎖領域を有するＲＮＡを指し、二本鎖領域内または２つの隣接する二本鎖領域間のいずれかに少なくとも１つのギャップ、ニック、バルジ、および／またはバブルを有するＲＮＡ分子が含まれる。１つの鎖が２つの二本鎖領域間にギャップまたはマッチしないヌクレオチドの一本鎖領域を有する場合、その鎖は、複数の断片を有する鎖であると考えられる。本明細書で使用される二本鎖ＲＮＡは、末端または両末端のいずれかに末端突出を有することができる。いくつかの実施形態において、二重鎖ＲＮＡの２つの鎖は、ある種の化学的リンカーを介して連結され得る。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡により明らかに別段に指示されていない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「ａ ｃｅｌｌ」は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。

本明細書で使用する場合、「二本鎖ＲＮＡ」、「二重鎖ＲＮＡ」、または「ＲＮＡ二重鎖」は、２本の鎖のＲＮＡ、および少なくとも１つの二本鎖領域を有するＲＮＡを指し、二本鎖領域内、または２つの隣接する二本鎖領域の間に、少なくとも１つのギャップ、ニック、バルジ、および／またはバブルを有するＲＮＡ分子を含む。１本の鎖が、２つの二本鎖領域の間にギャップまたは非対応ヌクレオチドの一本鎖領域を有する場合、その鎖は、複数の断片を有するとみなされる。二本鎖ＲＮＡは、ここで使用する場合、いずれかの末端または両末端に末端突出を有することができる。いくつかの実施形態において、二重鎖ＲＮＡの２本の鎖は、ある特定の化学リンカーを介して連結することができる。

本明細書で使用する場合、「アンチセンス鎖」は、標的メッセンジャーＲＮＡに対して実質的な配列相補性を有するＲＮＡ鎖を指す。アンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ分子の一部、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖の一部、または一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡでありうる。

用語「単離された」または「精製された」は、本明細書で使用する場合、その天然の状態に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して求められる。

本明細書で使用する場合、「調節すること」およびその文法的な等価用語は、増大させること、または減少させること（例えば、サイレンシング）、言い換えれば、上方制御すること、または下方制御することを指す。本明細書中で使用するとき、「遺伝子サイレンシング」とは、遺伝子発現の減少を指し、標的遺伝子の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の遺伝子発現の減少を指してもよい。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、それだけに限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含めた任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、これは、特定の治療のレシピエントとなる。一般に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書で互換的に使用される。

「治療すること」、または「治療」、または「治療すること」、または「軽減すること」、または「軽減するため」などの用語は、本明細書で使用する場合、（１）診断された病的状態または障害の症状を治癒、減速し、和らげ、および／または診断された病的状態または障害の進行を停止する治療手段、ならびに（２）標的にされる病的状態または障害の発症を予防し、または遅らせる予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。したがって、治療を必要とするものには、既に障害を有しているもの、障害を有しやすいもの、および障害が予防されるべきものが含まれる。患者が、以下のうちの１つまたは複数を示す場合、対象は、本発明の方法によって順調に「治療」される：癌細胞の数の低減、または完全な欠如；腫瘍サイズの低減；軟部組織および骨への癌の伝播を含めた、周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害または欠如；腫瘍転移の阻害または欠如；腫瘍増殖の阻害または欠如；特定の癌に関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の低減；ならびに生活の質の改善。

本明細書で使用する場合、用語「阻害すること」、「阻害すること」、およびこれらの文法的な等価用語は、生物活性の脈絡において使用されるとき、生物活性の下方制御を指し、これは、タンパク質の産生、または分子のリン酸化などの標的にされる機能を低減、または排除することができる。特定の実施形態において、阻害は、標的にされる活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の低減を指す。障害または疾患の脈絡において使用されるとき、この用語は、症状の発症の予防、症状の軽減、または疾患、病状もしくは障害の排除における成功を指す。

本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補性」は、２つの核酸の間であって、２つの二本鎖領域の間の末端突出またはギャップ領域などのいずれの一本鎖領域でもない、塩基対形成した二本鎖領域における相補性を指す。相補性は、完全である必要はなく、例えば、２つの核酸の間で任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの数が多すぎて、最低のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でさえ、まったくハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、この配列は、実質的に相補性の配列ではない。２つの配列が、本明細書で「実質的に相補性」と呼ばれるとき、これらの配列は、選択された反応条件下でハイブリダイズするために、互いに十分に相補的であることを意味する。特異性を実現するのに十分な、核酸の相補性とハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの関係は、当技術分野で周知である。２本の実質的に相補性の鎖は、例えば、完全に相補的でありえ、またはハイブリダイゼーション条件が、例えば、対形成配列と非対形成配列の間の識別を可能にするのに十分である限り、１つから多くのミスマッチを含むことができる。したがって、実質的に相補性の配列は、二本鎖領域において、１００、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０パーセントもしくはそれ未満、またはその間の任意の数値の塩基対の相補性を有する配列を指すことができる。

本明細書で使用する場合、ａｎｔａｇｏｍｉｒはｍｉＲＮＡ阻害剤であり、内因性ｍｉＲＮＡのサイレンシングにおいて使用することができる。本明細書で使用する場合、模倣剤または模倣体は、ｍｉＲＮＡアゴニストであり、機能等価物として内因性のｍｉＲＮＡを置換するために使用することができ、それによってそのような内因性のｍｉＲＮＡによって影響される経路を上方制御する。

１．ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉと省略される）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の標的破壊に関する細胞プロセスである。ｓｓＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの遺伝子転写物である。ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡに相補的である配列を有する遺伝子の発現に特異的に干渉することができる転写後の遺伝子サイレンシングの形態である。ｄｓＲＮＡ標的のアンチセンスＲＮＡ鎖は、リボヌクレアーゼによる切断に関するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの相補的遺伝子転写物を標的にする。

ＲＮＡｉプロセスにおいて、長鎖ｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質であるＤｉｃｅｒによって、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖形態に加工される。ｓｉＲＮＡは、ガイド（またはアンチセンス）鎖とパッセンジャー（またはセンス）鎖に分離される。ガイド鎖は、リボヌクレアーゼを含む多タンパク質複合体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。次に、複合体は、破壊のための相補的遺伝子転写物を特異的に標的にする。

ＲＮＡｉは、多くの真核生物に共通した細胞プロセスであることが示されている。ＲＩＳＣ、およびＤｉｃｅｒは、真核生物ドメインの全体で保存されている。ＲＮＡｉは、ウイルスおよび他の外来遺伝物質への免疫反応において役割を果たすと考えられている。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、生物学において様々な役割を果たす短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の一種である。最も顕著には、低分子干渉ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが特定の遺伝子の発現に干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。さらに、ｓｉＲＮＡはまた、抗ウイルス機構またはゲノムのクロマチン構造の形成などのプロセスにおいて役割を果たす。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、５’−リン酸末端および３’−ヒドロキシル末端に２〜３ヌクレオチドの３’突出を含む短い（１９〜２１ｎｔ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を有する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、３０％程度の哺乳動物遺伝子を制御する、内因性の、一本鎖または二本鎖の約２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子の一種である（Ｃｚｅｃｈ、２００６年；Ｅｕｌａｌｉｏら、２００８年；Ｍａｃｋ、２００７年）。ｍｉＲＮＡは、翻訳をブロックするかまたは転写的分解を引き起こすことによってタンパク質産生を抑制する。ｍｉＲＮＡは、２５０〜５００個の異なるｍＲＮＡを標的にする場合がある。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の産物である、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ消化の産物である。

本明細書中で使用するとき、ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ｍｉＲＮＡ阻害剤であり、内因性ｍｉＲＮＡのサイレンシングに用いることができる。本明細書中で使用するとき、模倣体はｍｉＲＮＡアゴニストであり、模倣体を用いてｍｉＲＮＡを置換し、ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることができる。

Ｄｉｃｅｒは、ＲＮａｓｅＩＩＩリボヌクレアーゼファミリーのメンバーである。Ｄｉｃｅｒは、長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、通常、３’末端に２塩基の突出を有する約２０〜２５ヌクレオチドの長さの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖二本鎖ＲＮＡ断片に切断する。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉経路の第１段階を触媒し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成を開始し、その触媒成分であるａｒｇｏｎａｕｔｅは、配列がｓｉＲＮＡガイド鎖の配列に相補的であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解することができるエンドヌクレアーゼである。

本明細書中で使用するとき、有効なｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉを誘発して、標的遺伝子の転写物の分解に効果的であるｓｉＲＮＡである。標的遺伝子に相補的なｓｉＲＮＡの全てが、ＲＮＡｉを誘発して、遺伝子の転写物の分解に効果的であるとは限らない。実際に、時間消費のスクリーニングは、通常、有効なｓｉＲＮＡ配列を特定することを必要とする。一実施形態において、有効なｓｉＲＮＡ配列は、９０％を超えて、８０％を超えて、７０％を超えて、６０％を超えて、５０％を超えて、４０％を超えて、または３０％を超えて標的遺伝子の発現を減少させることができる。

本発明は、ｓｉＲＮＡ様の結果をもたらし、またｍｉＲＮＡ経路の活性を調節するために用いることができる非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）と呼ばれる新規な構造足場を提供する（詳細には、名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ Ｄｕｐｌｅｘ ａｓ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｍｉｍｅｔｉｃ ｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」に基づく、本出願と同日に出願された共有に係るＰＣＴおよび米国特許出願において説明され、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ａｉＲＮＡの新規の構造的設計は、遺伝子調節を行うことにおいて機能的に強力であるだけでなく、現況技術のＲＮＡｉ調節因子（主にアンチセンス、ｓｉＲＮＡ）に対していくつかの利点も提供する。これらの利点の中で、ａｉＲＮＡは、現在のｓｉＲＮＡコンストラクトよりはるかに短い長さのＲＮＡ二重鎖構造を有することができ、これは、合成費用を低減し、宿主細胞からの非特異的インターフェロン様免疫応答の長さ依存性誘発を阻止、または低減するはずである。ａｉＲＮＡ中のより短い長さのパッセンジャー鎖はまた、ＲＩＳＣにおけるパッセンジャー鎖の意図されない取り込みも排除または低減し、その結果としてｍｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングにおいて観察されるオフターゲット効果を低減するはずである。ａｉＲＮＡは、バイオテクノロジー産業および医薬産業、ならびにｍｉＲＮＡに基づく診断および治療における生物学研究、Ｒ＆Ｄを含めて、現在のｍｉ−ＲＮＡに基づく技術が適用されているか、適用されることが企図されているすべての範囲において使用することができる。

２．ａｉＲＮＡ構造足場
Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、いくつかの非対称性二重鎖ＲＮＡ分子、ならびに対称性ｓｉＲＮＡ分子を試験した（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ）。非対称性二重鎖ＲＮＡ分子は、対応するｓｉＲＮＡ分子とともに表１に列挙される。

しかしながら、対応する対称性ｓｉＲＮＡ分子と比較すると、非対称性二重鎖ＲＮＡ分子は、選択的遺伝子サイレンシング（上記）をもたらすことができない。

本発明は、配列特異的な遺伝子サイレンシングをもたらすことができる非対称性二重鎖ＲＮＡ分子に関する。一実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、ここで、第２鎖は、第１鎖と実質的に相補的であり、第１鎖を含む二本鎖領域を形成し、第１鎖は第２鎖よりも長い；ただし、Ｅｌｂａｓｈｉｒ（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ）に開示された非対称性二重鎖ＲＮＡ分子、具体的には表１に列挙された非対称性二重鎖ＲＮＡ分子を除く。このＲＮＡ分子は、二本鎖領域と、５’突出、３’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される２つの末端とを含む。ＲＮＡ鎖は、マッチしないかまたは不完全にマッチしたヌクレオチドを有することができる。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖よりも少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖よりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖よりも２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖よりも２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖よりも３〜１０ｎｔ長い。

一実施形態において、二本鎖領域は３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は１０〜１９ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐであり得る。

一実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、いずれのミスマッチおよびバルジも含まない。別の実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、ミスマッチおよび／またはバルジを含む。

一実施形態において、第１鎖は、

であり、第２鎖は最長で１７ヌクレオチドの長さを有するか、または第１鎖と少なくとも１つのミスマッチを含むか、または少なくとも１つの修飾を含む。

代替の実施形態において、第１鎖は、

ではない。

一実施形態において、第１鎖は標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である配列を含む。別の実施形態において、第２鎖は標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である配列を含む。

本発明は、遺伝子サイレンシングをもたらすことができる非対称性二本鎖ＲＮＡ分子に関する。一実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、ここで、第２鎖は、第１鎖と実質的に相補的であるか、または部分的に相補的であり、第１鎖および第２鎖は少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、第１鎖は第２鎖よりも長い（長さの非対称性）。本発明のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二本鎖領域と、５’突出、３’突出、および平滑末端からなる群から独立に選択される２つの末端とを有する（例えば、図１Ａ、２Ａ〜２Ｄを参照されたい）。

１個のヌクレオチドの変更、付加および欠失が分子の機能性に非常に影響を与え得る低分子ＲＮＡ調節因子を作製する分野において（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ）、ａｉＲＮＡ足場は、各々の鎖およびそれぞれの３’突出において対称である２１ｎｔの二本鎖ＲＮＡの古典的なｓｉＲＮＡ構造とは区別される構造プラットホームを提供する。さらに、本発明のａｉＲＮＡは、以下の実施例に含まれるデータによって示されるように、ＲＮＡｉベースの調査および薬剤開発において現在直面している支障を克服することができる新しい種類の低分子調節因子の設計に切望される新しいアプローチを提供する。例えば、ｓｉＲＮＡを構造的に模倣するａｉＲＮＡのデータは、ａｉＲＮＡが、遺伝子サイレンシングの誘導において、ｓｉＲＮＡよりも効果的であり、強力であり、速やかに発現し、耐久性があり、および特異的であることを示す。

本発明のＲＮＡ分子の任意の一本鎖領域は、２つの二本鎖領域間に任意の末端突出およびギャップを含み、化学的な修飾または二次構造のいずれかを介して、分解に対して安定化し得る。ＲＮＡ鎖は、マッチしないかまたは不完全にマッチしたヌクレオチドを有することができる。各鎖は、１つまたは複数のニック（核酸骨格中の切断、例えば図１Ｂを参照）、ギャップ（１つまたは複数の欠けているヌクレオチドを含む断片化された鎖、例えば図１Ｃを参照）、および修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有してもよい。単にＲＮＡ分子における任意または全てのヌクレオチドは化学的に修飾され得るだけでなく、各鎖は、その機能性を高めるために１つまたは複数の部分、例えば１つまたは複数のペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリマーなどとコンジュゲートされてもよい。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より３〜１０ｎｔ長い。

一実施形態において、第１鎖、または長い鎖は、５〜１００ｎｔ、または好ましくは１０〜３０ｎｔもしくは１２〜３０ｎｔ、またはより好ましくは１５〜２８ｎｔの長さを有する。一実施形態において、第１鎖は、長さが２１ヌクレオチドである。一実施形態において、第２鎖、または短い鎖は、３〜３０ｎｔ、または好ましくは３〜２９ｎｔもしくは１０〜２６ｎｔ、またはより好ましくは１２〜２６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、第２鎖は、１５ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１９ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。

一実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、いずれのミスマッチまたはバルジも含まず、２本の鎖は、二本鎖領域内で互いに完全に相補的である。別の実施形態において、ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、ミスマッチおよび／またはバルジを含む。

一実施形態において、末端突出は１〜１０ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、末端突出は１〜８ヌクレオチドである。別の実施形態において、末端突出は３ｎｔである。

２．１． ５’突出および３’突出の両方を有する二重鎖ＲＮＡ分子
図１Ａを参照すると、本発明の一実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子は、第１鎖上に５’突出および３’突出の両方を有する。ＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、実質的に相補性の配列を有する少なくとも１つの二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。第１鎖上で、二本鎖領域に隣接して、５’末端および３’末端の両方上に非対応の突出が存在する。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも２ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は第２鎖より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より３〜１０ｎｔ長い。

一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１８ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、３〜２８ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、３〜１９ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜２４ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１９ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｎｔの長さを有する。別の実施形態において、第２鎖は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８ｎｔの長さを有する。

一実施形態において、第１鎖は、２１ｎｔの長さを有し、第２鎖は、１５ｎｔの長さを有する。

一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜８ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、５’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

一実施形態において、３’突出の長さは、５’突出の長さに等しい。別の実施形態において、３’突出は、５’突出より長い。代替の実施形態において、３’突出は、５’突出より短い。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、約１５ｎｔの実質的に相補性の配列の二本鎖領域、３ｎｔの３’突出、および３ｎｔの５’突出を含む。第１鎖は２１ｎｔであり、第２鎖は１５ｎｔである。一特徴では、様々な実施形態の二本鎖領域は、完全に相補性の配列からなる。代替の特徴では、二本鎖領域は、少なくとも１つのニック（図１Ｂ）、ギャップ（図１Ｃ）、および／またはミスマッチ（バルジもしくはループ）を含む。

一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１９ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。２つ以上の二本鎖領域が存在することができる。

一実施形態において、第１鎖はアンチセンス鎖であり、これは、切断によるかまたは翻訳抑制による遺伝子サイレンシングのために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの実質的に相補性の遺伝子転写物を標的にすることができる。

また、本発明は、１８〜２３ヌクレオチドの長さを有する第１鎖、および１２〜１７ヌクレオチドの長さを有する第２鎖を含む二重鎖ＲＮＡ分子を提供し、ここで、第２鎖は、第１鎖と実質的に相補的であり、第１鎖とともに二本鎖領域を形成し、第１鎖は、１〜９ヌクレオチドの３’突出、１〜８ヌクレオチドの５’突出を有し、前記二重鎖ＲＮＡ分子は、真核生物細胞において選択的遺伝子サイレンシングをもたらすことができる。一実施形態において、第１鎖は、標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である配列を含む。

一実施形態において、第１鎖は、長さが２０、２１、または２２ヌクレオチドである。別の実施形態において、第２鎖は、長さが１４、１５、または１６ヌクレオチドである。

一実施形態において、第１鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、第２鎖は、長さが１５ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、第１鎖は、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドの３’突出を有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は３ヌクレオチドの３’突出を有する。

２．２． 第一鎖に平滑末端、および５’突出または３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および５’突出または３’突出を含む（例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。このＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。

一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを有する。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１８ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。この二本鎖領域は、他の実施形態に関して記載したものと同様の特徴を有することができ、必ずしもここで繰り返されない。例えば、二本鎖領域は、完全に相補性の配列からなり、または少なくとも１つのニック、ギャップ、および／またはミスマッチ（バルジまたはループ）を含むことができる。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より４〜１０ｎｔ長い。

一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１９ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１９ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および３’突出を含む（例えば、図２Ｂを参照されたい）。

一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜８ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜６ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

代替の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、平滑末端、および５’突出を含む（例えば、図２Ａを参照されたい）。

一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、５’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

２．３． ２つの５’突出、または２つの３’突出を有する二重鎖ＲＮＡ分子
一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの３’突出、または２つの５’突出を含む（例えば、図２Ｃおよび２Ｄを参照されたい）。ＲＮＡ分子は、第１鎖および第２鎖を含み、第１鎖と第２鎖は、二本鎖領域を形成し、第１鎖は、第２鎖より長い。

一実施形態において、二本鎖領域は、３〜９８ｂｐの長さを含む。さらなる実施形態において、二本鎖領域は、５〜２８ｂｐの長さを有する。なおさらなる実施形態において、二本鎖領域は、１０〜１８ｂｐの長さを有する。二本鎖領域の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｂｐとすることができる。

一実施形態において、第１鎖は、第２鎖より少なくとも１ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎｔ長い。別の実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２０〜１００ｎｔ長い。さらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より２〜１２ｎｔ長い。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、第２鎖より４〜１０ｎｔ長い。

一実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、第１鎖は、５〜１００ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１０〜３０ｎｔの長さを有し、第２鎖は、３〜１８ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態において、第１鎖は、１２〜２６ヌクレオチドの長さを有し、第２鎖は、１０〜１６ヌクレオチドの長さを有する。

代替の実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの３’突出を含む（例えば、図２Ｃを参照されたい）。この二本鎖領域は、他の実施形態に関して記載したのと同様の特徴を有する。

一実施形態において、３’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、３’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、３’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖領域、および２つの５’突出を含む（例えば、図２Ｄを参照されたい）。

一実施形態において、５’突出は、１〜１０ｎｔの長さを有する。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜６ｎｔの長さを有する。なおさらなる実施形態において、５’突出は、２〜４ｎｔの長さを有する。一実施形態において、３’突出は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｔの長さを有する。

３．ａｉＲＮＡの設計
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、研究手段として広く使用され、薬剤候補として開発される。（例えば、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ、Ｎｏｖｉｎａ ＆ Ｓｈａｒｐ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４巻：４５７〜４６７頁（２００３年）；Ｋｉｍ ＆ Ｒｏｓｓｉ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ８巻：１７３〜１８４頁（２００７年）；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ６巻：４４３〜４５３頁（２００７年）；Ｃｚｅｃｈ、ＮＥＪＭ ３５４巻：１１９４〜１１９５頁（２００６年）；およびＭａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５巻：６３１〜６３８頁（２００７年）を参照されたい）。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子、すなわち、ａｉＲＮＡは、当分野で既知のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡから導出することができる。

本発明は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを変換してａｉＲＮＡにする方法を提供する。この変換は、最初の分子と比較して改善された、少なくとも１つの特性を有する、新しい二重鎖ＲＮＡ分子をもたらす。この特性は、サイズ、効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）、効能（ｐｏｔｅｎｃｙ）、開始速度、耐久性、合成費用、オフターゲット効果、インターフェロン応答、または送達とすることができる。

一実施形態において、最初の分子は、ｓｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡ分子である。二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二本鎖領域を形成する、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）およびセンス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）を含む。この方法は、アンチセンス鎖がセンス鎖より長いように一方または両方の鎖の長さを変更するステップを含む。一実施形態において、センスパッセンジャー鎖が短縮される。別の実施形態において、アンチセンスガイド鎖が伸長される。なおさらなる実施形態において、センス鎖が短縮され、アンチ鎖が伸長される。無傷またはサイズが変更されたアンチセンスおよびセンスＲＮＡ鎖は、合成し、ａｉＲＮＡ分子が形成される条件下で組み合わせることができる。

さらなる実施形態において、この方法は、二重鎖ＲＮＡ分子が、１〜６ヌクレオチドの３’突出、および１〜６ヌクレオチドの５’突出のうちの少なくとも１つを有して形成されるように、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の長さを変更するステップを含む。

あるいは、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、新規に設計することができる。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子ウォークの方法などの、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのための設計方法を利用して設計することができる。

本発明のＲＮＡ分子は、バイオインフォマティクス手法を用いて設計し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することによって、標的遺伝子に対するその調節効力、および任意のオフターゲット効果の存在を判定することができる。これらの研究に基づいて、次いでＲＮＡ分子の配列を選択し、修飾することによって、標的遺伝子に対する調節効力を改善し、オフターゲット効果を最小限にすることができる。（例えば、Ｐａｔｚｅｌ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １２巻：１３９〜１４８頁（２００７年）を参照されたい）。

３．１． 二重鎖ＲＮＡ分子中の非対応領域またはミスマッチ領域
ａｉＲＮＡ二重鎖の２つの一本鎖は、例えば、１つまたは複数のミスマッチを含む、少なくとも１つの非対応の領域、または不完全に対応した領域を有することができる。一実施形態において、非対応の、または不完全に対応した領域は、平滑末端を有する末端領域、３’−凹部または５’突出を有する末端領域、および５’凹部または３’突出を有する末端領域を含めた、ＲＮＡ分子の少なくとも１つの末端領域である。本明細書で使用する場合、末端領域は、１つの末端および隣接する範囲を含む、ＲＮＡ分子の領域である。

一実施形態において、非対応の領域、または不完全に対応した領域は、ａｉＲＮＡ分子の二本鎖領域内にある。さらなる実施形態において、非対称性ＲＮＡ二重鎖は、非対応のバルジまたはループ構造を有する。

３．２． 二重鎖ＲＮＡ分子内の配列モチーフ
本発明のａｉＲＮＡ分子の設計において、総ＧＣ含量は変化し得る。一実施形態において、二本鎖領域のＧＣ含量は、２０〜７０％である。さらなる実施形態において、Ｇ−Ｃ対形成は、Ａ−Ｕ対形成より強いので、鎖の分離をより容易にするために、二本鎖領域のＧＣ含量は、５０％未満、または好ましくは３０〜５０％である。

末端の突出でのヌクレオチド配列、いくつかの実施形態において、例えば、５’末端は、任意の鋳型配列（例えば、標的ｍＲＮＡ配列）から独立に設計することができ、すなわち、標的ｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣剤の場合）、または標的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ阻害剤の場合）と実質的に相補的である必要はない。一実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の、例えば５’または３’での突出は、「ＡＡ」、「ＵＵ」または「ｄＴｄＴ」モチーフを有し、これは、いくつかの他のモチーフと比較して、効力の増大を示した。一実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の５’突出は、「ＡＡ」モチーフを有する。別の実施形態において、より長い鎖またはアンチセンス鎖の３’突出は、「ＵＵ」モチーフを有する。

３．３．ヌクレオチド置換
本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドの１つまたは複数は、デオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と置換することができる。置換は、ＲＮＡ分子内のどこにおいても、例えば、一方もしくは両方の突出領域、および／または二本鎖領域で起こり得る。場合によっては、置換により、ＲＮＡ分子の物理的特性、例えば、鎖親和性、溶解度、およびＲＮａｓｅ劣化に対する抵抗力、または別の方法で増強された安定性が増強される。

一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドである。骨格修飾リボヌクレオチドは、別のリボヌクレオチドとのホスホジエステル結合内の修飾を有することができる。一実施形態において、ＲＮＡ分子内のホスホジエステル結合は、修飾されることによって、少なくとも１個の窒素ヘテロ原子および／または硫黄ヘテロ原子を含む。一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、非天然（ｕｎｕｓｕａｌ）塩基または修飾塩基である。一実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは類似体は、イノシン、またはトリチル化塩基である。

さらなる実施形態において、ヌクレオチド類似体は、糖修飾リボヌクレオチドであり、この中で２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、およびＣＮからなる群から選択される基によって置換され、各Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルおよびアルキニルからなる群から独立に選択され、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される。

一実施形態において、ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含む骨格修飾リボヌクレオチドである。

４．有用性
また、本発明は、細胞または生物における遺伝子発現を調節する方法を提供する（サイレンシング法）。この方法は、選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる条件下で前記細胞または生物を二重鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップ、二本鎖ＲＮＡに実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対して、前記二重鎖ＲＮＡ分子により実施される選択的遺伝子サイレンシングを媒介するステップとを含む。

一実施形態において、接触するステップは、選択的遺伝子サイレンシングを行うことができる培養物または生物中の標的細胞に前記二本鎖ＲＮＡ分子を導入するステップを含む。さらなる実施形態において、導入するステップは、トランスフェクション、リポフェクション、感染、エレクトロポレーション、または他の送達技術を含む。

一実施形態において、サイレンシング法は、細胞または生物の遺伝子の機能または有用性を決定するために用いられる。

サイレンシング法は、細胞または生物における遺伝子の発現を調節するために用いることができる。一実施形態において、その遺伝子は、疾患、例えばヒト疾患もしくは動物疾患、病態、または望ましくない状態と関係する。さらなる実施形態において、その遺伝子は、病原微生物の遺伝子である。なおさらなる実施形態において、その遺伝子はウイルス遺伝子である。別の実施形態において、その遺伝子は腫瘍関連遺伝子である。

代替の実施形態において、遺伝子は、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、感染性疾患、増殖性疾患、代謝性疾患、免疫媒介性障害、アレルギー性疾患、皮膚疾患、悪性疾患、消化管障害、呼吸器障害、心血管障害、腎障害、リウマチ障害、神経障害、内分泌障害、および老化と関連する遺伝子である。

４．１ 研究手段
本発明のＲＮＡ分子は、遺伝子機能を発見するための遺伝子操作されたノックアウトモデルとは対照的に、動物モデルにおける遺伝子の「ノックダウン」を作るために用いることができる。また、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて遺伝子をサイレンシングするために用いることができる。例えば、ａｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトすることができる。ａｉＲＮＡは、薬剤研究および開発における、薬物標的／経路同定および検証、ならびに他の生物医学研究における研究ツールとして１に用いることができる。

４．２ 治療的使用
本発明のＲＮＡ分子は、（Ｃｚｅｃｈ、２００６年；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、２００３年；ＫｉｍおよびＲｏｓｓｉ、２００７年；Ｍａｃｋ、２００７年）に要約された疾患を含む様々な疾患または望ましくない状態の治療およびまたは予防のために用いることができる。

一実施形態において、本発明は、癌治療として、または癌を予防するために用いることができる。本発明のＲＮＡ分子を用いて、細胞増殖または他の癌表現型と関連した遺伝子をサイレンシングするかまたはノックダウンさせることができる。これらの遺伝子の例は、ｋ−Ｒａｓ、β−カテニン、Ｎｂｓ１、ＥＦ２、Ｓｔａｔ３、ＰＴＥＮ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲ、Ｒｓｋ１、ＰＣＮＡ、Ｐａｒｐ１、サバイビン、ＮＱＯ１、およびｐ２１である。具体的には、ｋ−Ｒａｓおよびβ−カテニンは、結腸癌の治療遺伝子である。これらの癌遺伝子は活性であり、多数の臨床症例に関係している。

また、これらのＲＮＡ分子を用いて、非癌遺伝子標的をサイレンシングするかまたはノックダウンさせることができる。また、本発明のＲＮＡ分子は、眼疾患（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ））；感染症（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ＲＣＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デング熱、ウェストナイルウイルス）；呼吸器疾患（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、喘息、嚢胞性線維症）；神経系疾患（例えば、ハンチンドン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、疼痛）；心臓血管疾患；代謝性疾患（例えば、糖尿病）；遺伝病；ならびに炎症状態（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、リウマチ様疾患、自己免疫障害）、皮膚疾患を治療または予防するために用いることができる。

様々な遺伝子は、本発明の非対称性二重鎖ＲＮＡ分子を用いてサイレンシングすることができる。一実施形態において、第１鎖は、発生遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、および酵素遺伝子、ならびに接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウイングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインまたはその受容体、成長／分化因子またはその受容体、神経伝達物質またはその受容体、ＡＢＬＩ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３およびＹＥＳ）（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＡＣＰデサチュラーゼまたはヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴａｓｅ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼまたはペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、ｋ−ＲＡＳ、β−カテニン、Ｒｓｋ１、ＰＣＮＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、サバイビン、ｍＴＯＲ、ＰＴＥＮ、Ｐａｒｐ１、またはｐ２１の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の標的ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である配列を含む。

本発明は、疾患または望ましくない状態を治療するための方法を提供する。この方法は、疾患または望ましくない状態と関連した遺伝子の遺伝子サイレンシングをもたらすための非対称性二重鎖ＲＮＡ分子を用いることを含む。

４．３ 薬剤へのＲＮＡ分子（ａｉＲＮＡ）の変換
４．３．１ ＲＮＡ分子の修飾
裸のＲＮＡ分子は、相対的に不安定であり、ｉｎ ｖｉｖｏでは相対的に速やかに分解され得る。化学的修飾は、本発明のＲＮＡ分子に導入され、ＲＮＡ分子の半減期を改善し、さらには、ＲＮＡ分子の生物活性を低下させずに遺伝子標的化の非特異的な作用のリスクを低下させることができる。

ＲＮＡ分子の修飾は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、およびＲＮＡｉを含む様々なＲＮＡ分子の安定性を改善するために調査されている（ＣｈｉｕおよびＲａｎａ、２００３年；Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、２００３年；ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；ＫｉｍおよびＲｏｓｓｉ、２００７年；Ｍａｃｋ、２００７年；Ｚｈａｎｇら、２００６年；ならびにＳｃｈｍｉｄｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５巻：２７３〜２７５頁（２００７年）。

当業者に既知の任意の安定化修飾を使用することによって、本発明のＲＮＡ分子の安定性を改善することができる。本発明のＲＮＡ分子内で、化学修飾は、リン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート連結）、リボース（例えば、ロックされた核酸、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン、２’−Ｏ−メチル（ｍｔｈｙｌ））、および／または塩基（例えば、２’−フルオロピリミジン）に導入することができる。そのような化学修飾のいくつかの例を以下に要約する。

血清中でエンドヌクレアーゼ活性に対する抵抗力を増大させる、２’−Ｏ−メチルプリンおよび２’−フルオロピリミジンなどの、リボースの２’位での化学修飾を採用することによって、本発明のＲＮＡ分子を安定化することができる。修飾を導入するための位置は、ＲＮＡ分子のサイレンシング効力を著しく低減することを回避するために、慎重に選択されるべきである。例えば、ガイド鎖の５’末端上の修飾は、サイレンシング活性を低減し得る。一方、２’−Ｏ−メチル修飾を、二本鎖領域での２本のＲＮＡ鎖の間に交互に配置することによって、遺伝子サイレンシング効力を保存しながら安定性を改善することができる。２’−Ｏ−メチル修飾は、インターフェロンの誘発を排除または低減することもできる。

別の安定化修飾は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結である。例えば、３’突出での、ＲＮＡ分子中へのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結の導入は、エキソヌクレアーゼに対する保護を提供することができる。

ＲＮＡ分子中へのデオキシリボヌクレオチドの導入も、製造費用を低減し、安定性を増大させることができる。

一実施形態において、３’突出、５’突出、またはその両方が、劣化に対して安定化される。一実施形態において、ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたはその類似体を含む。さらなる実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、その糖、骨格、塩基、またはこの３つの任意の組合せにおいて修飾される。

一実施形態において、ヌクレオチド類似体は、糖修飾リボヌクレオチドである。さらなる実施形態において、ヌクレオチド類似体の２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮから選択される基によって置換され、各Ｒは独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。

代替の実施形態において、ヌクレオチド類似体は、ホスホチオエート基を含む骨格修飾リボヌクレオチドである。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、第１鎖は、１〜６つのデオキシヌクレオチドを含む。なおさらなる実施形態において、第１鎖は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。別の実施形態において、３’突出は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、５’突出は、１〜３つのデオキシヌクレオチドを含む。代替の実施形態において、第２鎖は１〜５つのデオキシヌクレオチドを含む。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含む３’突出または５’突出を含む。別の実施形態において、ＲＮＡの３’突出および／または５’突出は、デオキシヌクレオチドからなる。

一実施形態において、二重鎖ＲＮＡ分子は、実体とコンジュゲートしている。さらなる実施形態において、実体は、ペプチド、抗体、ポリマー、脂質、オリゴヌクレオチド、およびアプタマーからなる群から選択される。

別の実施形態において、第１鎖と第２鎖は、化学リンカーによって結合されている。

４．４． ＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ送達
ＲＮＡｉの治療用途にとっての１つの主な障害は、標的細胞へのｓｉＲＮＡの送達である（ＺａｍｏｒｅおよびＡｒｏｎｉｎ（２００３年））。様々な手法が、ＲＮＡ分子、特にｓｉＲＮＡ分子の送達のために開発された（例えば、（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００３年；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００７年）。当業者に既知の任意の送達手法を、本発明のＲＮＡ分子の送達のために使用することができる。

送達における主な問題点として、血清中の不安定性、非特異的な分布、組織障壁、および非特異的なインターフェロン応答が挙げられる（Ｌｕ ＆ Ｗｏｏｄｌｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３７巻：９３〜１０７頁（２００８年））。そのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ対応物と比較して、ａｉＲＮＡ分子はいくつかの利点を有し、これは、より広い範囲の方法を送達目的のために利用可能にするはずである。第１に、ａｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ対応物より小さいように設計することができ、したがって、任意のインターフェロン応答を低減または排除することができる。第２に、ａｉＲＮＡは、より強力であり、より速く開始し、より有効であり、より長く持続し、したがって、治療目的を実現するのに、より少ない量／投与量のａｉＲＮＡを必要とする。第３に、ａｉＲＮＡは二本鎖であり、一本鎖のアンチセンスオリゴおよびｍｉＲＮＡより安定であり、これらは、化学的にさらに修飾されることによって、安定性を増強することができる。したがって、本発明のＲＮＡ分子は、様々な全身的または局所的な送達経路を介して対象中に送達することができる。いくつかの実施形態において、本発明の分子は、静脈内（Ｉ．Ｖ．）および腹腔内（ｉｐ）を含む全身送達経路を介して送達される。他の実施形態において、本発明の分子は、局所的な送達経路、例えば、鼻腔内、硝子体内、気管内、脳内、筋肉内、関節内、および腫瘍内を介して送達される。

送達技術の例として、裸のＲＮＡ分子の直接注射、コレステロールなどの天然リガンドへのＲＮＡ分子の結合、またはアプタマー、リポソーム調合送達、および抗体−プロタミン融合タンパク質への非共有結合が挙げられる。他の担体の選択肢には、正に帯電した担体（例えば、陽イオン性の脂質およびポリマー）ならびに様々なタンパク質担体が含まれる。一実施形態において、本発明の分子の送達は、陽イオン性リポソーム複合体またはポリマー複合体系に基づくリガンド標的送達系を使用する（Ｗｏｏｄｌｅら Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７４巻：３０９〜３１１頁；Ｓｏｎｇら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（６号）：７０９〜７１７頁（２００５年）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻（８号）：１００２〜１００７頁（２００５年））。

一実施形態において、本発明の分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、コラーゲン担体、例えば、アテロコラーゲンと製剤化される。アテロコラーゲンは、ｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅによって消化されることから保護し、徐放を可能にすることが報告されている（Ｍｉｎａｋｕｃｈｉら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２巻：ｅ１０９頁（２００４年）；Ｔａｋｅｉら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４巻：３３６５〜３３７０頁（２００４年））。別の実施形態において、本発明の分子は、ナノ粒子と製剤化され、またはナノエマルジョン、例えば、ＲＧＤペプチドリガンド標的ナノ粒子を形成する。異なるｓｉＲＮＡオリゴを、同じＲＧＤリガンド標的ナノ粒子中で混合することによって、いくつかの遺伝子を同時に標的にすることができることが示された（Ｗｏｏｄｌｅら Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｏｄａｙ ８巻（補遺１）：３４〜４１頁（２００５年））。

ウイルスベクターも、本発明のＲＮＡ分子の送達のために使用することができる。一実施形態において、レンチウイルスベクターが、安定な発現のためにゲノムに組み込むＲＮＡ分子導入遺伝子を送達するために使用される。別の実施形態において、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、ゲノムに組み込まれないで、エピソーム発現を有するＲＮＡ分子導入遺伝子を送達するために使用される。

さらに、本発明のＲＮＡ分子の送達のために、細菌を使用することができる。（Ｘｉａｎｇら、（２００６年））。

５．医薬組成物および製剤
本発明は、医薬組成物をさらに提供した。医薬組成物は、活性薬剤として、少なくとも１つの非対称性二重鎖ＲＮＡ分子と、医薬的担体、正電荷担体、リポソーム、タンパク質担体、ポリマー、ナノ粒子、ナノ乳剤、脂質、およびリポイドからなる群から選択される１つまたは複数の担体とを含む。一実施形態において、この組成物は、診断的適用、または治療的適用のためのものである。

本発明の医薬組成物および製剤は、ＲＮＡ成分を除いて、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡに対して開発された医薬組成物および製剤と同じであるか、同様であってもよい（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７年；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００７年）。医薬組成物および製剤中のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡは、本情報の二重鎖ＲＮＡ分子によって置換することができる。医薬組成物および製剤は、さらに改変することによって、本情報の二重鎖ＲＮＡ分子に適応させることもできる。

開示された二重鎖ＲＮＡ分子の「薬学的に許容される塩」または「塩」は、イオン結合を含む開示された二重鎖ＲＮＡ分子の生成物であり、一般に、開示された二重鎖ＲＮＡ分子を、対象に投与するのに適した酸または塩基と反応させることによって生成される。薬学的に許容される塩として、それだけに限らないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、および酒石酸塩を含めた酸付加塩；Ｎａ、Ｋ、Ｌｉなどのアルカリ金属陽イオン、ＭｇまたはＣａなどのアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩を挙げることができる。

「医薬組成物」は、対象への投与に適した形態での、開示された二重鎖ＲＮＡ分子を含む製剤である。一実施形態において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルを含めた様々な形態のいずれかである。単位用量の組成物中の活性成分（例えば、開示された二重鎖ＲＮＡ分子またはその塩の製剤）の量は、有効量であり、関与する特定の治療によって変化する。当業者は、患者の年齢および状態に応じて、投与量に対して日常の変更を行うことが時折必要であることを理解するであろう。投与量は、投与経路にも依存する。様々な経路は、経口、肺性、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内などを含めて企図されている。本発明の二重鎖ＲＮＡ分子の局所または経皮投与のための剤形として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション剤、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。一実施形態において、活性な二重鎖ＲＮＡ分子は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされる任意の保存剤、緩衝液、または噴霧剤と混合される。

本発明は、必要としている対象に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む治療方法を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、ｉｖ、ｓｃ、局所、ｐｏ、およびｉｐからなる群から選択される経路を介して投与される。別の実施形態において、有効量は、１日あたり１ｎｇ〜１ｇ、１日あたり１００ｎｇ〜１ｇ、または１日あたり１μｇ〜１ｍｇである。

本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体と組み合わせた、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子を含む医薬製剤も提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合性である、任意の、およびすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることが意図されている。適当な担体は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ．に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。そのような担体または希釈剤の例として、それだけに限らないが、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび固定油などの非水性のビヒクルも使用することができる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および作用剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒質または作用剤が、活性な二重鎖ＲＮＡ分子と不適合である場合を除いて、組成物中でのこれらの使用は企図されている。追加の活性な二重鎖ＲＮＡ分子も、組成物中に組み込むことができる。

製剤のための方法は、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４２６２（ＷＯ０３／０１１２２４）、米国特許出願公開第２００３／００９１６３９号、および米国特許出願公開第２００４／００７１７７５号に開示されており、そのそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。

本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、治療有効量（例えば、腫瘍増殖の阻害、腫瘍細胞の死滅、細胞増殖性障害の治療または予防などによる所望の治療効果を実現するのに十分な有効なレベル）の本発明の二重鎖ＲＮＡ分子（活性成分として）を、従来の手順によって標準的な医薬担体または希釈剤と組み合わせることによって（すなわち、本発明の医薬組成物を製造することによって）調製された適当な剤形で投与される。これらの手順は、所望の製剤を得るために、適切な場合、成分の混合、顆粒化、および圧縮または溶解を伴う場合がある。別の実施形態において、治療有効量の本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、標準的な医薬担体または希釈剤を含まない適当な剤形で投与される。

薬学的に許容される担体として、固体担体、例えば、ラクトース、テラアルバ、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。例示的な液体担体として、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、水などが挙げられる。同様に、担体または希釈剤として、当技術分野で既知の時間遅延物質、例えば、単独の、またはワックスを含むモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどを挙げることができる。他の充填剤、賦形剤、香味剤、および当技術分野で既知のものなどの他の添加剤も、本発明による医薬組成物中に含めることができる。

本発明の活性な二重鎖ＲＮＡ分子を含む医薬組成物は、一般に既知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、湿式混合、乳化、カプセル封入、エントラッピング、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、活性な二重鎖ＲＮＡ分子の薬学的に使用することができる製剤への加工を促進する賦形剤および／または助剤を含む、１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して、従来の様式で製剤化することができる。もちろん、適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。

本発明の二重鎖ＲＮＡ分子または医薬組成物は、化学療法剤治療に対して現在使用されている、多くの周知の方法で対象に投与することができる。例えば、癌の治療のために、本発明の二重鎖ＲＮＡ分子は、腫瘍中に直接注射し、血流もしくは体腔中に注射し、または経口服用し、またはパッチを用いて皮膚を介して適用することができる。乾癬状態の治療については、全身投与（例えば、経口投与）、または皮膚の患部への局所投与は、好適な投与経路である。選択される用量は、有効な治療となるのに十分であるが、容認できない副作用を生じるほど高くあるべきでない。患者の病状（例えば、癌、乾癬など）および健康は、治療の間、および治療後の妥当な期間密接にモニターされるべきである。

本発明の様々な特徴をさらに例示するために、いくつかの実施例を以下に示す。これらの実施例は、本発明を実施するのに有用な方法も例示する。これらの実施例は、特許請求する本発明を制限しない。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は真核生物における遺伝子特異的サイレンシングの触媒機構であり、生物学および医学に関して深い意味がある（Ｆｉｒｅら、１９９８年）、１２。ＲＮＡｉは、３’突出を有する１９〜２１塩基対（ｂｐ）の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＩＳＣに進入しＲＮＡｉを媒介することが知られている最小ＲＮＡ二重鎖（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｆｉｒｅら、１９９８年；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年）を組み込む際に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される（Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００年、ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＴｕｓｃｈｌ、２００４年；Ｒａｎａ、２００７年）。ＲＩＳＣ酵素複合体の天然基質として、ｓｉＲＮＡをその様々な前駆体のＤｉｃｅｒ触媒的プロセシングによって化学的に合成または作製することができる（ＤｏｎｚｅおよびＰｉｃａｒｄ、２００２年；Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００年；Ｋｉｍら、２００５年；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、２００２年）。遺伝子サイレンシングに広く使用されているが、ｓｉＲＮＡは遺伝子サイレンシングにおいて哺乳動物細胞中の多数の遺伝子に対してサイレンシング効力が低く能力は限られている（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；Ｉｏｒｎｓら、２００７年）。ここで本発明者らは、哺乳動物細胞中の有効なＲＮＡｉメディエーターに関する構造的足場の要件を調べる。本発明者らが驚いたことに、本発明者らは、二重アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの非対称性ＲＮＡ二重鎖は、哺乳動物細胞中の強力で有効な遺伝子サイレンシングを媒介することを発見した。３’および５’アンチセンス突出を有する１４〜１５ｂｐの二重鎖ＲＮＡによって構造的に特徴付けられる非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）を、ｓｉＲＮＡより高い効率でＲＩＳＣに組み込んだ。ａｉＲＮＡは、哺乳動物細胞においてｍＲＮＡの配列特異的切断および標的遺伝子サイレンシングを引き起こした。β−カテニンのｍＲＮＡの同一配列を標的化したとき、ａｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子サイレンシングの媒介において、ｓｉＲＮＡより有効（ほぼ１００％）、強力（ピコＭ）、急激な発生（２４時間以内）および持続的（１週間まで）であった。これらの結果は、ａｉＲＮＡが、ＲＩＳＣに組み込まれた最小ＲＮＡ二重鎖足場であって、かつ哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡより良い効率で遺伝子をサイレンシングする非ｓｉＲＮＡ型のＲＮＡｉメディエーターであることを示唆する。したがって、ａｉＲＮＡは広範囲のＲＮＡｉの適用例に有意な可能性を有し得る。

方法および材料
細胞培養および試薬
Ｈｅｌａ、ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、およびＨ１２９９細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣから得て、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。この試験中に記載する小ＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ、Ｑｉａｇｅｎ、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ技術（表２）によって合成され、製造者の説明書に従いアニーリングした（図３ａ）。ヒトＡｇｏ２を標的とするｓｉＲＮＡ、およびＤｉｃｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）は１００ｎＭで使用した。ＲＮＡのトランスフェクションは示した濃度でＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して実施した。ヒトＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ）は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。血清中安定性は、示した時間量のａｉＲＮＡ二重鎖またはｓｉＲＮＡ二重鎖を１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベーション、次に非変性ＴＢＥ−アクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって決定した。

ノーザンブロット分析。

β−カテニンのレベルを決定するために、様々な時間時点でｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡトランスフェクトＨｅｌａ細胞からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。２０μｇの全細胞ＲＮＡを変性アガロースゲルのそれぞれのレーンに載せた。電気泳動後、ＲＮＡはＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、ＵＶ架橋させ、３０分間８０℃で焼いた。β−カテニンおよびアクチンｍＲＮＡを検出するプローブを、β−カテニンｃＤＮＡ断片（１〜５６８ｎｔ）およびアクチンｃＤＮＡ断片（１〜５００ｎｔ）から、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩランダムプライマー標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して調製した。小ＲＮＡのＲＩＳＣローディングを分析するために、ｐＣＭＶ−Ａｇｏ２を用いたトランスフェクション後４８時間でｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。細胞は示した時間時点で溶かし、Ａｇｏ２抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ抽出によって複合体から単離し、１５％ＴＢＥ−尿素ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に載せた。電気泳動後、ＲＮＡはＨｙｂｏｎｄ−ＸＬナイロン膜に移した。ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡプローブキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して５’^３２Ｐ標識ＲＮＡプローブを作製した。アンチセンスプローブ（５’−ＧＵＡＧＣＵＧＡＵＡＵＵＧＡＵＧＧＡＣＵＵ−３’（配列番号７１））。センスプローブ（５’−ＵＣＣＡＵＣＡＡＵＡＵＣＡＧＣ−３’（配列番号７２））
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｇｏ２−ＲＩＳＣローディング。

ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡセンスおよびアンチセンス鎖を、Ｔ４キナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して^３２Ｐ末端標識した。末端標識ＲＮＡはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによって精製し、ＥｔＯＨで沈殿させ、水中に再懸濁した。次いで標識ＲＮＡを、記載したようにｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡアンチセンス鎖とアニーリングさせた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解物用に、Ｈｅｌａ細胞をヒトＡｇｏ２発現ベクターで２４時間トランスフェクトし、Ｓ１０溶解物をほぼ記載したように生成した（Ｄｉｇｎａｍら、１９８３年）。５’センス鎖またはアンチセンス鎖標識二重鎖ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを、次いでＡｇｏ２−Ｓ１０溶解物に加えた。３７℃で５分間のインキュベーション後、Ａｇｏ２を記載したように免疫沈降させ、Ａｇｏ２結合（ペレット）と非Ａｇｏ２結合（上清）画分を２０％ＴＢＥ−アクリルアミドゲル上で分離し、ゲルをフィルムに感光させてセンス鎖−Ａｇｏ２結合を検出した。ａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの競合実験用に、１００倍までの非放射能のａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを使用して、^３２Ｐ標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと競合させＲＩＳＣをローディングした。簡単に言うと、Ｓ１０溶解物を記載したようにＡｇｏ２発現ベクターでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から生成した。次いで標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをＳ１０溶解物に加え、次いで直後に非標識ａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを加えた。反応物は５分間３７℃でインキュベートし、上に記載したように処理した。

ｑＲＴ−ＰＣＲ
示したａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後に示した時間時点で採取した。ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬで単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬および示したｍＲＮＡ用のプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。データは対照トランスフェクト細胞に対して表し、それぞれの試料はアクチンｍＲＮＡレベルに正規化する。図１４ｄ中の実験用に、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏ１部位でのｐｃＤＮＡ３．１^＋またはｐｃＤＮＡ３．１⁻のいずれかへのＳｔａｔ３ｃ ＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）のクローニングによってＳｔａｔ３構築物を作製した。次いでＳｔａｔ３順方向または逆方向発現ベクターを、２４時間ａｉＳｔａｔ３またはｓｉＳｔａｔ３を用いてＨｅｌａ細胞にコトランスフェクトした。次いで細胞を採取し、ＴＲＩＺＯＬによってＲＮＡを単離し、ＴａｑＭａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬およびＳｔａｔ３またはアクチン用のプライマープローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ワンステップ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＳｔａｔ３順方向（５’−ＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７３））およびＳｔａｔ３逆方向（５’−ＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＧ−３’（配列番号７４））プライマーおよびアクチン順方向（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号７５））およびアクチン逆方向（５’−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号７６））プライマーを使用して同じＲＮＡ試料で実施した。

ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して調製し、ｃＤＮＡはランダムプライマーおよびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。ＰＣＲはＰｆｘポリメラーゼを使用して２０サイクルで実施した。プライマー：アクチン−１、５’ＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号７５）；アクチン−２、５’−ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号７６）；β−カテニン−１、５’−ＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号７７）；β−カテニン−２、５’−ＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号７８）。

ウエスタンブロット
細胞を氷冷リン酸塩緩衝化食塩水で二回洗浄し、溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＮａＦ、２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、および１０μｇ／ｍｌのそれぞれのペプスタチン、リューペプチン、およびアプロチニン）中で溶解した。２０μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。β−カテニン、Ｎｂｓ１、サバイビン、ｐ２１、Ｒｓｋ１、ｋ−Ｒａｓ、Ｓｔａｔ３、ＰＣＮＡ、ＮＱＯ１、アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＥＦ２、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｍＴＯＲ、ＰＴＥＮ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｇｏ２（Ｗａｋｏ）、Ｄｉｃｅｒ（Ｎｏｖｕｓ）、およびＰａｒｐ１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する一次抗体をこの試験中で使用した。抗原−抗体複合体は増強化学発光（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって目に見える状態にした。

５’−ＲＡＣＥ分析
非サイレンシングａｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡで処理したＨｅｌａ細胞由来の全ＲＮＡ（５μｇ）を、任意の事前処理なしでＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’（配列番号７９））と連結させた。連結ＲＮＡはランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写した。切断産物を検出するために、ＲＮＡアダプターと相補的なプライマー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’ネステッドプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号８０））およびβ−カテニン特異的プライマー（ＧＳＰ：５’−ＣＧＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号８１））を使用してＰＣＲを実施した。増幅断片は１．４％アガロースゲルで分けて、１−ｋｂのＰｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分子量を決めた。特異的切断部位をＤＮＡ配列決定によってさらに確認した。

インターフェロン応答の検出。

図１５ａ中の実験用に、ＰＢＭＣを１００ｎＭのβ−カテニンｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡと直接インキュベートした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して１６時間で精製し、インターフェロン応答遺伝子の発現のレベルは、製造者（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって記載されたようにＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図１５ｂ中の実験用に、Ｈｅｌａ細胞をモックトランスフェクトしたかまたは２４時間１００ｎＭの示したａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して精製し、インターフェロン応答遺伝子の発現のレベルはＲＴ−ＰＣＲによって決定した。マイクロアレイ分析用に、Ｈｅｌａ細胞を１００ｎＭのａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。全てのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬを使用して２４時間で精製し、ＲＮＡは製造者のプロトコル（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｎｃ．）に従いヒトゲノムＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）とのハイブリダイゼーションに使用した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１処理細胞由来のＲＮＡを対照として使用した。転写産物の発現値を計算するために、マイクロアレイＳｕｉｔｅ５．０をクオンタイル正規化で使用し、存在すると言われる（Ｐ）十分なハイブリダイゼーションシグナルを有する転写産物をこの試験中で使用した。

ａｉＲＮＡ配列およびｓｉＲＮＡ配列
ａｉＲＮＡ二重鎖およびｓｉＲＮＡ二重鎖の配列および構造を表２中に挙げる。点突然変異の位置をｋ−Ｒａｓ ａｉＲＮＡにおいて枠で囲む。

寿命評価
それぞれの動物の健康状態の毎日の検査も実施した。体重を３日毎に調べた。食餌および水は動物飼育施設の手順に従い毎日供給した。２０％を超える死亡率およびまたは２０％を超える正味体重の減少をもたらした治療は毒性であると考えた。結果は平均腫瘍体積（ｍｍ^３）±ＳＥとして表す。０．０５未満のＰ値は統計上関連があると考える。

動物飼育
オスまたはメスの無胸腺ヌードマウス４〜５週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ．）を、試験開始前に少なくとも１週間動物飼育施設に順応させた。使用した全ての実験手順はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ＳｏｃｉｅｔｙおよびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓによって概説されたガイドラインと一致し、これらはＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．によっても承認された。動物は制御温度（６８°Ｆ〜７２°Ｆ）、光（１２時間明−暗サイクル）、および湿度（４５〜５５％）を有する室内で、木材チップを敷き詰めたケージにおいて４群で飼育した。実験中、動物は水および食餌に自由にアクセスさせた。

（実施例１．）
非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こす。

ｓｉＲＮＡの構造的足場は、ＲＩＳＣ中に組込みＲＮＡｉを媒介するのに必要な形状であると考えられる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｒａｎａ、２００７年；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年）。しかしながら、ＲＩＳＣの組込みおよび遺伝子サイレンシングに関するＲＮＡ二重鎖足場の要件についてはほとんど知られていない。有効なＲＮＡｉメディエーターおよびＲＩＳＣ基質に関する構造的足場の要件を調べるために、本発明者らは最初に、ｓｉＲＮＡより短いＲＮＡ二重鎖が遺伝子サイレンシングを媒介することができたかどうか決定した。二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの長さは、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）媒介非特異的インターフェロン応答の活性化、合成コストの増大、および送達問題における、その傾向の重要な決定因子である（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｓｌｅｄｚら、２００３年）。本発明者らは、異なる哺乳動物の遺伝子を標的化する２ヌクレオチド３’突出または平滑末端を有する１２〜２１ｂｐの範囲に一連の短いｄｓＲＮＡを設計した。長さが１９ｂｐ未満に低減した後に遺伝子サイレンシングは検出せず（データ示さず）、これはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの細胞溶解物における以前の報告（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ）、および１９〜２１ｂｐがＲＮＡｉを媒介する最も短いｓｉＲＮＡ二重鎖であるという概念と一致する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｃ；Ｒａｎａ、２００７年；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年）。

次に本発明者らは、突出の非対称性構造を有する非ｓｉＲＮＡ足場のＲＮＡ二重鎖が、遺伝子サイレンシングを媒介することができるかどうか試験した。ｓｉＲＮＡ二重鎖は対称センス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。３’突出を含有する二重鎖ｓｉＲＮＡ構造はＲＩＳＣ複合体中への取り込みに必要とされるが、センス鎖のＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）媒介切断後、アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡの切断を誘導する（Ｈａｍｍｏｎｄら、２００１年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年；Ｔａｂａｒａら、１９９９年）。本発明者らは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端に突出を有する様々な長さの非対称性ＲＮＡ二重鎖を作製しようと努めた。

表３中に示す配列を有するオリゴを、アニーリング後２０％ポリアクリルアミドゲルによって確認した。図３Ａ中に示すように、それぞれのレーンには以下のように載せた：レーン１、２１ｎｔ／２１ｎｔ；レーン２、１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン３、１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン４、１３ｎｔ／１３ｎｔ；レーン５、１３ｎｔ／２１ｎｔ；レーン６、１４ｎｔ／１４ｎｔ；レーン７、１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ；レーン８、１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ；レーン９、１５ｎｔ／１５ｎｔ；レーン１０、１５ｎｔ／２１ｎｔ。

ＨｅＬａ細胞を２００，０００細胞／ウエルで６ウエル培養プレートに平板培養した。図３Ｂ中に示すように、２４時間後、それらをスクランブルｓｉＲＮＡ（レーン１）、Ｅ２Ｆ１標的化２１−ｂｐ ｓｉＲＮＡ（レーン２、特異性の対照として）またはβ−カテニン標的化２１−ｂｐ ｓｉＲＮＡ（レーン３、陽性対照として）、または異なる長さの混合物：１２ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン４）；１２ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン５）；１３ｎｔ／２１ｎｔ（レーン６）；１４ｎｔ（ａ）／２１ｎｔ（レーン７）；１４ｎｔ（ｂ）／２１ｎｔ（レーン８）；１５ｎｔ／２１ｎｔ（レーン９）の同じ濃度のａｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間で採取した。β−カテニンの発現はウエスタンブロットによって決定した。Ｅ２Ｆ１およびアクチンは対照として使用した。これらの結果は、非対称性干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は哺乳動物細胞において遺伝子特異的サイレンシングを引き起こすことを実証する。

ａｉＲＮＡの機能において重要なａｉＲＮＡの構造特徴を決定するために、本発明者らは、コア１５／２１二重アンチセンス突出構造の修飾に基づいて、複数のａｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを作製した（表４）。表４中に要約したａｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の長さ、センスおよびアンチセンス突出の程度、およびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドだけには限られないが、これらを含めた修飾を含有していた。

親１５／２１ａｉＲＮＡ構造に対する修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の改変によって行った（表４）。修飾ａｉＲＮＡ二重鎖を、５０ｎＭで４８時間Ｈｅｌａ細胞にトランスフェクトした。β−カテニンおよびアクチンに関するウエスタンブロットを使用して、親１５／２１ａｉＲＮＡと従来のｓｉＲＮＡ構造と比較した遺伝子サイレンシングの程度を調べた。二重センス鎖突出を含有するａｉＲＮＡ修飾体も試験した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なる長さのアンチセンス鎖と対形成する２１塩基のセンス鎖を含有する。さらに、本発明者らは、ＤＮＡ塩基で修飾したａｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの活性も調べた。ＤＮＡ置換はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方で行った（表３）。試験したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか中に１つまたは複数のＤＮＡ置換を含有しており、または示した長さのＤＮＡセンス鎖と対形成する２１塩基のアンチセンスＲＮＡを含有していた。これらの様々なａｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの結果は図４および５中に示した。

まとめると、これらのデータはａｉＲＮＡ機能に対する構造的手掛かりを与える。

センス鎖に関して、本発明者らのデータは、１５塩基の長さは十分働き、一方１４塩基と１９塩基の間の長さは依然機能的であることを示す。アンチセンス突出の法則に見合うという条件で、センス鎖はアンチセンス鎖の任意の部分に適合し得る。センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかにおけるＤＮＡと１つのＲＮＡ塩基の交換は許容され、活性の増大をさらにもたらす可能性がある。

アンチセンス鎖の長さに関しては、２１塩基の長さは十分働き、１９〜２２塩基は活性を保持し、および長さが１９塩基未満に低減するまたは２２塩基を超えて増大するとき、活性は低下する。アンチセンス鎖の３’末端は１〜５塩基の突出を必要とし、２〜３塩基の突出が好ましく、平滑末端は活性の低下を示す。標的ＲＮＡ配列と対形成する塩基が好ましく、３塩基までのＤＮＡ塩基の交換が同時の５’ＤＮＡ塩基の交換なしで許容される。アンチセンス鎖の５’末端は０〜４塩基の突出を好み、活性状態を保つために突出を必要としない。アンチセンス鎖の５’末端は標的ＲＮＡ配列に適合しない２塩基を許容することができ、３塩基までのＤＮＡ塩基の交換を同時の３’ＤＮＡ塩基の交換なしで許容することができる。

ミスマッチまたは化学的に修飾した塩基に関して、本発明者らは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか中のミスマッチと１つまたは複数の化学的に修飾した塩基の両方が、ａｉＲＮＡ構造によって許容されることを発見している。

表４中、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃはヌクレオチドを表し、一方ａ、ｔ、ｇ、ｃはデオキシヌクレオチドを表す。

（実施例２．）
ａｉＲＮＡによって誘発される遺伝子サイレンシングのメカニズム。

ａｉＲＮＡによって誘導される遺伝子ノックダウンのメカニズムを調べるために、本発明者らは最初に、ａｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングが翻訳レベルまたはｍＲＮＡレベルで起こるかどうか決定した。１０ｎＭの１５ｂｐ ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−カテニンのノーザンブロット分析は、ａｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルを２４時間以内に９５％を超えて低下させ、かつその低下は４日を超えて続いたことを示し（図６ａ）、ａｉＲＮＡがｍＲＮＡレベルで遺伝子サイレンシングを媒介することを示唆した。ａｉＲＮＡによって誘導されるβ−カテニンｍＲＮＡの低減は、ｓｉＲＮＡによる誘導より実質的により迅速、有効および持続的であった（図６ａ）。本発明者らはさらに、１５ｂｐ ａｉＲＮＡがβ−カテニンｍＲＮＡの部位特異的切断を触媒したかどうか決定した。１５ｂｐ ａｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞から単離した全てのＲＮＡを、ｃＤＮＡ末端（５’−ＲＡＣＥ）の迅速な増幅およびβ−カテニンｍＲＮＡ切断断片の存在に関するＰＣＲによって調べた（図６ｂ）。本発明者らは、ａｉＲＮＡトランスフェクション後４および８時間でβ−カテニン切断断片を検出した（図６ｃ）。配列分析は、ａｉＲＮＡアンチセンス鎖の５’末端に対してａｉＲＮＡ標的配列内、塩基１０と塩基１１の間で切断が起こっていたことを示した（図６ｄ）。スクランブルａｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後、このような切断断片は観察しなかった（図６ｃ）。これらの結果は、ａｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの配列特異的切断によって、強力かつ有効な遺伝子サイレンシングを誘導したことを実証する。

次に本発明者らは、非対称性ａｉＲＮＡの新規の足場をＲＩＳＣ中に取り込ませることが可能であるかどうか決定した。複合体の触媒単位としてのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）とのＲＩＳＣ酵素複合体によってＲＮＡｉが触媒される（Ｌｉｕら、２００４年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年）。ａｉＲＮＡがＡｇｏ／ＲＩＳＣ複合体中に取り込まれるかどうか決定するために、本発明者らは、細胞をａｉＲＮＡでトランスフェクトした後、ｍｙｃタグ化Ａｇｏ１（Ｓｉｏｌａｓら、２００５年）を発現する細胞由来のｍｙｃタグ化ヒトＡｇｏ１を免疫沈降させた。ＲＩＳＣ複合体と結合した小ＲＮＡは、Ａｇｏ免疫沈降物のノーザンブロッティングによって検出した。ノーザンブロット分析は、ａｉＲＮＡは高い効率でＲＩＳＣ複合体に進入することを明らかにした（図６ｅ）。これらのデータは、非対称性ａｉＲＮＡの新規の足場を効率良くＲＩＳＣ中に取り込ませることが可能であることを示唆する。

ａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡより効率良く遺伝子サイレンシングを誘導したので、本発明者らは、ａｉＲＮＡがｓｉＲＮＡより効率良くＲＩＳＣ複合体を生成することができるかどうか試験した。図６ｅ中に示すように、ａｉＲＮＡ−Ａｇｏ２／ＲＩＳＣ複合体がｓｉＲＮＡ−Ａｇｏ２／ＲＩＳＣ複合体より速くより効率良く形成され、対応するｓｉＲＮＡより多くのａｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体中に含有されていた（図６ｅおよび図７Ａ）。注目すべきことに、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡによる二次構造の形成と一致する典型的なパターン（２１）を示した（図６ｅおよび図７）。対照的に、ａｉＲＮＡは１つのバンドを示し、短い長さのａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡで起こる二次構造形成を低減または除去する可能性があることが示唆された。

さらに、ａｉＲＮＡの非対称性構造はアンチセンス鎖を有する活性ＲＩＳＣの形成を容易にし、センス鎖で形成される無効なＲＩＳＣを低減する可能性がある（Ｒｅｆ．１６）。本発明者らのデータは、図７Ｂ中に示すようにこれは真実であり、センス鎖はＲＩＳＣ複合体において検出することができないことを証明した。図８Ａも、ａｉＲＮＡのアンチセンス鎖はＡｇｏ２と強く結合するが、センス鎖はしないことを実証する。対照的に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の両方がＡｇｏ２と結合する。これらのデータは、ａｉＲＮＡが細胞中でのＲＩＳＣの形成においてｓｉＲＮＡより高い効率を有することを示唆し、これがａｉＲＮＡの優れた遺伝子サイレンシング効率の根底にある可能性がある。

さらに、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、機能的であるために切断されることが必要であることが示されている。したがって本発明者らは、同じ要件がａｉＲＮＡに当てはまるかどうか試験した。それを実施するために、ａｉＲＮＡセンス鎖の位置８または９におけるヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルで修飾してそれを切断不能にした。本発明者らの結果は、切断不能なセンス鎖を有するａｉＲＮＡは依然機能的であることを示し（図８Ｂ）、それらのメカニズムの点でａｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと全く異なることを実証する。

さらに本発明者らは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡに関する何らかの異なるローディングポケットが存在するかどうか調べた。本発明者らは非放射能のａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用して、ＲＩＳＣ複合体に関して放射標識ｓｉＲＮＡまたはａｉＲＮＡと競合させた（図９）。驚くことに、これらの結果は、非放射能のａｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体に関してｓｉＲＮＡと競合しないこと（図９Ｂ）、および非放射能のｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ複合体に関してａｉＲＮＡと競合しないこと（図９Ｃ）も示す。これらのデータは、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡをＲＩＳＣ複合体の異なるポケットに充填することが可能であることを示す。

まとめると、前述のデータは、ａｉＲＮＡはＲＩＳＣ中に組み込まれる第１の非ｓｉＲＮＡ足場を示し、ＲＩＳＣと相互作用する新規な構造足場を与えることを示唆する。ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのＲＩＳＣローディングの差は、図１０中に示す本発明者らのモデル中で例示する。簡単に言うと、非対称性の性質のために、アンチセンス鎖のみが選択されてＲＩＳＣ複合体中に存在し、鎖選択において１００％の効率をもたらす。対照的に、ｓｉＲＮＡは構造上対称性である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖の両方が、選択されてＲＩＳＣ複合体中に存在する可能性を有し、したがってｓｉＲＮＡは無効な鎖選択を有し、同時にセンス鎖ＲＩＳＣ複合体のために非特異的遺伝子サイレンシングを引き起こす可能性がある。

（実施例３．）
ａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡより迅速、強力、有効、および持続的な遺伝子サイレンシングを媒介する。

遺伝子サイレンシングの性質においてｓｉＲＮＡとａｉＲＮＡを比較するために、本発明者らは最初に、遺伝子サイレンシングに最適なａｉＲＮＡ構造を決定した。

ｓｉＲＮＡ二重鎖は、対称性のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。３’突出を含有する二重鎖ｓｉＲＮＡ構造は、センス鎖のＡｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）媒介切断後に、ＲＩＳＣ複合体中への組込みに必要とされる一方で、アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡの切断を誘導する（Ｈａｍｍｏｎｄら、２００１年；Ｍａｔｒａｎｇａら、２００５年；Ｔａｂａｒａら、１９９９年）。本発明者らは、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端に突出を有する様々な長さの非対称性ＲＮＡ二重鎖を作製しようと努めた。本発明者らは、３’および５’アンチセンス突出を有する１２〜１５ｂｐの一組のこのような非対称性ＲＮＡ二重鎖を設計して、β−カテニン（図１１Ａ）、癌細胞および幹細胞に関係する内因性遺伝子（Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００６年）を標的化した。標準構造の最適ｓｉＲＮＡを設計して、ＲＮＡｉを誘発するためにβ−カテニンを標的化した（Ｘｉａｎｇら、２００６年）。β−カテニンに対する全てのａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによって標的化した同じ配列内に設計した（図１１Ａ）。これらの結果は、最適な遺伝子サイレンシングは１５ｂｐのａｉＲＮＡで得たことを示した（図１１Ｂ）。したがって、本発明者らは１５ｂｐのａｉＲＮＡを使用して、後の実験中で２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖と比較した。

本発明者らが驚いたことに、本発明者らは、ａｉＲＮＡは、非標的対照遺伝子アクチンを維持しながら、β−カテニンタンパク質の強力かつ非常に有効な低減を誘導したことを発見した（図１１Ｃ）。

次に本発明者らは、β−カテニンを標的化するａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの発生を調べた。使用したａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの配列は図１１Ａ中に示す。図１２中に示すように、ａｉＲＮＡにはより迅速な発生（図１２ＣおよびＤ）、およびより良い効力（図１２ＢおよびＤ）もある。

本発明者らは、様々な標的および複数のヒト細胞系に対する、ａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの影響も比較した。複数のａｉＲＮＡを設計して、低い効率でｓｉＲＮＡによって標的化した同じ配列で、Ｓｔａｔ３（図１３ｂ）、ＮＱＯ１（図１２ｄ）、延長因子２（ＥＦ２）（図１３ｃ）、Ｎｂｓ１（図１４ｂ）、サバイビン（図１４ｂ）、Ｐａｒｐ１（図１４ｂ）、ｐ２１（図１４ｂ）、Ｒｓｋ１（図１４ｃ）、ＰＣＮＡ（図１４ｃ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（図１４ｃ）、ｍＴＯＲ（図１４ｃ）、およびＰＴＥＮ（図１４ｃ）、およびβ−カテニン（図１３ａ）を含めた異なる機能範囲の遺伝子を標的化した（Ｒｏｇｏｆｆら、２００４年）。図１３および１４中に示すように、ａｉＲＮＡはＳｔａｔ３、β−カテニン、Ｒｓｋ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、Ｎｂｓ１、ｍＴＯＲ、およびＥＦ２を抑制する際にｓｉＲＮＡより有効であり、ＮＱＯ１、ＰＣＮＡ、サバイビン、ＰＴＥＮ、Ｐａｒｐ１、およびｐ２１をサイレンシングする際にｓｉＲＮＡと同程度有効である。標的配列はｓｉＲＮＡの最適化に基づいて選択したので、ａｉＲＮＡの効力および効能を、ａｉＲＮＡ用に最適化した部位を標的化することによってさらに増大することが可能であると考えられる。さらに、本発明者らのデータは、Ｈｅｌａ（図１３ａ）、Ｈ１２９９（図１４ａ、左図）およびＤｌｄ１（図１４ａ、右図）を含めた複数の細胞系において、ａｉＲＮＡはｂ−カテニンに対してｓｉＲＮＡより有効であることも示す。

まとめると、これらのデータは、ａｉＲＮＡは、哺乳動物細胞中で遺伝子サイレンシングを媒介する際にｓｉＲＮＡより有効、強力、発生が迅速、および持続的であることを実証する。

（実施例４．）
ａｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性
次に本発明者らは、ａｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングの特異性を調べた。本発明者らは最初に、野生型ｋ−Ｒａｓ対立遺伝子を標的化するａｉＲＮＡを分析した。ＤＬＤ１細胞は野生型ｋ−Ｒａｓを含有し、一方ＳＷ４８０細胞は１つの塩基対置換を有する突然変異体ｋ−Ｒａｓを含有する（図１４ｄ）。野生型ｋ−Ｒａｓを標的化するａｉＲＮＡでのＤＬＤ１細胞のトランスフェクションは有効なサイレンシングを示したが、ＳＷ４８０細胞において突然変異体ｋ−Ｒａｓのサイレンシングは観察しなかった。これらのデータは、ａｉＲＮＡが対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを媒介することを実証する。

インターフェロン様応答の活性化は、遺伝子サイレンシングの主な非特異的メカニズムである。遺伝子サイレンシングにｓｉＲＮＡを使用する主な理由は、３０ｂｐより短いｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞中でインターフェロン様応答を活性化する低い能力を有することである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１年；ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＴｕｓｃｈｌ、２００４年；Ｓｌｅｄｚら、２００３年）。本発明者らは、ａｉＲＮＡが哺乳動物細胞中でインターフェロン様応答を活性化する何らかの兆候を示したかどうか試験した。β−カテニンに対するａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＰＢＭＣ細胞およびＥＦ２またはサバイビンに対するａｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞から回収したＲＮＡを、インターフェロン誘導性遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲによって分析した。本発明者らは、ａｉＲＮＡトランスフェクションは、試験した任意のインターフェロン誘導性遺伝子のＲＴ−ＰＣＲにより如何なる増大も示さず、一方標的化ｍＲＮＡのレベルは対照トランスフェクト細胞に比べ低減したことを発見した（図１５ａおよびｂ）。マイクロアレイ分析も実施して、ａｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡによって誘導された既知のインターフェロン応答関連遺伝子の発現の変化を比較した。図１５ｃ中に示すように、ｓｉＲＮＡと比較してａｉＲＮＡに関するはるかに少ない変化を観察した。

さらに、前述のように、センス鎖−ＲＩＳＣ複合体は非特異的遺伝子サイレンシングを引き起こし得る。センス鎖−ＲＩＳＣ複合体によって媒介される非特異的遺伝子サイレンシングにおいてａｉＲＮＡとｓｉＲＮＡを比較するために、細胞はａｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡおよびＳｔａｔ３（センスＲＮＡ）を発現するプラスミドまたはアンチセンスＳｔａｔ３（アンチセンスＲＮＡ）を発現するプラスミドのいずれかとコトランスフェクトした。細胞を採取し、トランスフェクション後２４時間でＲＮＡを回収し、Ｓｔａｔ３センスまたはアンチセンスＲＮＡの相対的レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって決定した（挿入図）。結果は、ａｉＲＮＡはアンチセンスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡに対して影響がなく、一方ｓｉＲＮＡは影響があることを示す（図１５ｄ）。この結果は、ａｉＲＮＡは、センス鎖−ＲＩＳＣ複合体によって媒介される望ましくない非特異的遺伝子サイレンシングを完全に無効することを実証する。

要約すると、本発明者らは、ａｉＲＮＡが新規なクラスの遺伝子サイレンシングインデューサーであること、ＲＩＳＣ基質およびＲＮＡｉメディエーターの非ｓｉＲＮＡ型および最小構造足場を示した（図１５ｆ）。本発明者らのデータは、ａｉＲＮＡがＲＩＳＣ、細胞のＲＮＡｉ機構中で働くことを示唆する。ＲＩＳＣ中への組込み後、ａｉＲＮＡはａｉＲＮＡアンチセンス鎖の５’末端に対して塩基１０と塩基１１の間のｍＲＮＡの配列特異的切断を媒介する。非対称構造のａｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡより効率良くＲＩＳＣと相互作用することができる。高いＲＩＳＣ結合効率と一致して、ａｉＲＮＡは、本発明者らの実験中で試験した遺伝子に対する遺伝子特異的サイレンシングを媒介する際にｓｉＲＮＡより強力、有効、発生が迅速、および持続的である。以前の実験は有効なＲＩＳＣ形成を容易にする際のＤｉｃｅｒの役割を示しているが、本発明者らのデータは、ａｉＲＮＡはＤｉｃｅｒ媒介プロセシングとは無関係に高い効率で活性ＲＩＳＣ複合体を生成することができることを示唆する。

この新規なＲＮＡ二重鎖足場の重要な特徴は、３’および５’末端のアンチセンス突出である。１２〜１５ｂｐのａｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導することが知られている最も短いＲＮＡ二重鎖である。長いｄｓＲＮＡはＣ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて強力な遺伝子サイレンシングを誘発したが、哺乳動物細胞における遺伝子特異的サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ二重鎖を使用するまで可能ではなかった。Ｄｉｃｅｒ消化によって画定するｓｉＲＮＡ足場は、１９〜２１ｂｐの鎖の長さ部分および３’突出中の対称性によって特徴付けられ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１年）、これはＲＮＡｉを媒介するためのＲＩＳＣ中への組込みに必要な構造であると考えられている。したがって、ＲＮＡｉインデューサーの最適化努力は、ｓｉＲＮＡより常に大きいｓｉＲＮＡ前駆体に焦点を当てている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、２００４年；ＺｈａｎｇおよびＦａｒｗｅｌｌ、２００７年）。本発明者らのデータは、ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを媒介するためのＲＩＳＣ中への組込みに必要な足場ではないことを示唆する。異なる長さのａｉＲＮＡは一連の遺伝子サイレンシング効力およびＲＩＳＣ組込み効率を示し、ＲＩＳＣの組込みおよび活性化のメカニズムを理解するまたとない機会を与える。ＲＩＳＣの組込みおよびＲＮＡｉの誘導におけるａｉＲＮＡの構造−活性関係をさらに理解するために研究が必要とされ、これは標的配列の選択、長さ、構造、化学組成、および様々なＲＮＡｉ用途の変更に関してａｉＲＮＡを最適化するための合理的根拠を確立するのを手助けするはずである。

（実施例５．）
ａｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏにおいてｓｉＲＮＡより有効である
ａｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であるかどうか調べるため、およびそれをｓｉＲＮＡと比較するため、本発明者らは、ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの影響を試験した。

ヒト結腸癌は、米国では癌による死亡原因の第２位である。Ｗｎｔβ−カテニンシグナル伝達経路は厳重に制御されており、発生、組織の恒常性、および再生において重要な機能を有する。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の規制解除は様々なヒトの癌において頻繁に見られる。８０パーセントの結腸直腸癌のみが、腫瘍抑制遺伝子大腸腺腫性ポリポーシスの不活性化、またはプロト発癌遺伝子β−カテニンの突然変異のいずれかによって、この経路の活性化を明らかにする。

Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、異なる組織の癌の発症と進行の両方に重要であることが分かっている。したがって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の標的化阻害は、様々な起源の癌の治療用の合理的で有望な新しい手法である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明者らは、リボザイム標的化によって、ヒト結腸癌ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニン発現の低減および関連する細胞死の誘導を実証しており、β−カテニン発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでは腫瘍増殖に対して律速的であることを示す。

ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞をメスの無胸腺ヌードマウスに皮下接種し（８×１０^６個の細胞／マウス）、放置して触診可能な腫瘍を形成した。この試験では、腫瘍が約１２０ｍｍ^３に達したときに投薬を開始した。動物は、毎日０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合化β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合化β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合化無関連ｓｉＲＮＡで静脈内（ｉｖ）治療した。動物にはｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照を合計１０用量投与した。腫瘍は治療全体で測定した。図１６中に示すように、０．６ｎｍｏｌ ｍｇ／ｋｇでの単剤治療としてｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡを用いた静脈内治療は、腫瘍増殖を有意に阻害した。ｓｉＲＮＡのＴ／Ｃ％値は、０．０２８６のｐ値で４８．８％であると計算した。しかしながら、β−カテニン特異的ａｉＲＮＡを用いた治療は、腫瘍増殖のはるかに一層大幅な低減をもたらした。Ｔ／Ｃ％値は、０．００２４のｐ値で９．９％であると計算した。ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照の静脈内投与が原因の体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、β−カテニンの標的化によるＰＥＩ複合体形成を介したａｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ全身施用は、結腸癌を有する患者の治療用途の、非常に有効、特異的および安全な作用物質を開発するための手段を与えることを示唆する。

さらに、本発明者らは、ＨＴ２９ヒト結腸癌異種移植モデルにおけるａｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの影響も試験した。ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞をメスの無胸腺ヌードマウスに皮下接種し（６×１０^６個の細胞／マウス）、放置して触診可能な腫瘍を形成した。この試験では、腫瘍が約２００ｍｍ^３に達したときに投薬を開始した。動物は、１日おきに０．６ｎｍｏｌのＰＥＩ複合化β−カテニンｓｉＲＮＡ、ＰＥＩ複合化β−カテニンａｉＲＮＡまたは陰性対照としてＰＥＩ複合化無関連ｓｉＲＮＡで静脈内（ｉｖ）治療した。動物にはｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照を合計８用量投与した。腫瘍は治療全体で測定した。図１７中に示すように、０．６ｎｍｏｌｍｇ／ｋｇでの単剤治療としてｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡを用いた静脈内治療は、腫瘍増殖を有意に阻害した。ｓｉＲＮＡのＴ／Ｃ％値は、０．２１のｐ値で７８％であると計算した。ここでも、β−カテニン特異的ａｉＲＮＡを用いた治療は、腫瘍増殖のはるかに一層大幅な低減をもたらした。Ｔ／Ｃ％値は、０．０１６のｐ値で４１％であると計算した。ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡまたは対照の静脈内投与が原因の体重の有意な変化はなかった。これらのデータは、β−カテニンの標的化によるＰＥＩ複合体形成を介したａｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ全身施用は、結腸癌を有する患者の治療用途の、非常に有効、特異的および安全な作用物質を開発するための手段を与えることを支持する。

まとめると、ａｉＲＮＡは広範囲のＲＮＡｉ用途を有意に改善することができる。ｓｉＲＮＡベースの治療は、限られた効力、送達の難点、インターフェロン様応答および製造コストを含めた課題に対応している（ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７年；Ｉｏｒｎｓら、２００７年；Ｒａｎａ、２００７年）。改善された効力、効能、持続性、および小さなサイズのａｉＲＮＡはこれらの課題を手助けまたは克服することができる。ａｉＲＮＡはより小さく、その送達により少ない物質を必要とし得るからである。したがってａｉＲＮＡは、遺伝子機能試験およびＲＮＡｉベースの治療における広範囲のＲＮＡｉ用途に関する相当な可能性を有する、哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡより良い効力、効能、作用発現、および持続性の、ＲＩＳＣに進入し遺伝子サイレンシングを媒介する新しい小さなＲＮＡ二重鎖となる。

他の実施形態が以下の特許請求の範囲内に存在する。いくつかの実施形態を示し記載してきた一方で、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更形態を作成することができる。

参考文献

Claims (30)

1. ＲＮＡ二重鎖分子であって、
   １９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドからなるアンチセンス鎖であって、
   該アンチセンス鎖は、１〜５ヌクレオチドからなる３’突出と１〜５ヌクレオチドからなる一本鎖の５’突出とを含み、
   該アンチセンス鎖は、該３’突出および二本鎖領域において標的ＲＮＡと相補的であり、
   該アンチセンス鎖の該３’突出は、ＲＮＡヌクレオチドからなる、
   アンチセンス鎖、および
   １４、１５、１６または１７ヌクレオチドからなるセンス鎖であって、
   該センス鎖は、該アンチセンス鎖と相補的であり、
   該センス鎖は、該アンチセンス鎖と、１４、１５、１６または１７塩基対の二本鎖領域を形成する、
   センス鎖
   を含み、該ＲＮＡ二重鎖分子は、該標的ＲＮＡの発現のサイレンシングにおいて、対応する２１マーのｓｉＲＮＡよりも有効であり、該対応する２１マーのｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖の各々において２ヌクレオチドの３’突出を有し、該対応する２１マーのｓｉＲＮＡの標的ＲＮＡと相補的なアンチセンス鎖のヌクレオチドが、該ＲＮＡ二重鎖分子の該標的ＲＮＡと相補的な該アンチセンス鎖のヌクレオチドに実質的に対応する、ＲＮＡ二重鎖分子。
2. 前記二本鎖領域のＧＣ含量が３０％〜７０％である、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
3. 前記アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドからなる、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
4. 前記センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが少なくとも１つの糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、および／または塩基修飾リボヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
5. 前記骨格修飾リボヌクレオチドが、ホスホジエステル結合において修飾を有する、請求項４に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
6. 前記ホスホジエステル結合が、窒素のヘテロ原子または硫黄のヘテロ原子を含むように修飾される、請求項５に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
7. 前記センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、イノシンまたはトリチル化塩基を含む、請求項４に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
8. 前記糖修飾リボヌクレオチドの２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＮにより置換され、各Ｒが独立にＣ_１〜Ｃ_６のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、請求項４に記載の二重鎖ＲＮＡ分子。
9. 前記骨格修飾リボヌクレオチドが、ホスホチオエート基を含有する、請求項４に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
10. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含む組成物。
11. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含むキット。
12. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
13. ウイルスの発現ベクター、または細菌の発現ベクターである、請求項１２に記載の発現ベクター。
14. 請求項１２に記載のベクターを含む単離された細胞。
15. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含む単離された細胞。
16. 哺乳動物の細胞、鳥類の細胞、または細菌の細胞である、請求項１５に記載の細胞。
17. 前記センス鎖が１５ヌクレオチドからなる、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
18. 前記２’−ＯＨ基が２’−Ｏ−メチル基により置換される、請求項８に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
19. 前記５’突出の少なくとも１つのヌクレオチドが、Ａ、ＵまたはｄＴである、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
20. 前記アンチセンス鎖の前記５’突出がＡＡモチーフを含む、請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子。
21. 請求項１０に記載の組成物を含むキット。
22. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含む、疾患または状態を治療するための組成物。
23. 全身投与または局所投与されることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記ＲＮＡ二重鎖分子が、２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む、請求項２２に記載の組成物。
25. 前記ＲＮＡ二重鎖分子が、１５ヌクレオチドのセンス鎖を含む、請求項２２に記載の組成物。
26. 前記ＲＮＡ二重鎖分子が、２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖と１５ヌクレオチドのセンス鎖を含む、請求項２２に記載の組成物。
27. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含む、悪性疾患を治療するための組成物。
28. 前記悪性疾患が癌である、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記悪性疾患が結腸癌である、請求項２７に記載の組成物。
30. 請求項１に記載のＲＮＡ二重鎖分子を含む、眼疾患を治療するための組成物。