JP6286536B2

JP6286536B2 - 新規オキサゾリジノン抗菌化合物

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Publication number: JP6286536B2
Application number: JP2016526946A
Authority: JP
Inventors: ラグーミトラアッラ; アジェイクマールデュビー; シュリーニバスレディマレパリ; ラーマクリシュナレディポンギラティ
Original assignee: Lee Pharma Ltd
Current assignee: Lee Pharma Ltd
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2018-02-28
Anticipated expiration: 2034-07-28
Also published as: JP2016535039A; CN105705147A; US20160272597A1; ES2699001T3; EP3065740A1; EP3065740A4; US9573910B2; WO2015068173A1; CN105705147B; EP3065740B1

Description

相互参照
本出願は、インド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びインド特許出願第２２５４／ＣＨＥ／２０１４号の優先権を主張するものである。両方とも、本ＰＣＴ出願において本明細書に組み込まれている。

本発明は、新規オキサゾリジノン化合物に関する。より詳細には、本発明は、インド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びそれに対応するＰＣＴ／ＩＮ２０１４／００００１８号に開示された式Ｉの新規［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］化合物に関する。本化合物は、多剤耐性Ｓ．マルトフィリア（S. Maltophilia）病原菌並びに多数のグラム陽性及びグラム陰性病原菌に対して効果的な、広範に及ぶ抗微生物剤である。本化合物は、既知の広く使用されているオキサゾリジノン誘導体のうちのいくつかを含む多数の抗生物質に耐性を持つに至ったＳ．マルトフィリアに対して、優れた生物学的活性を示した。

ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas Maltophilia）は、一般的にＳ．マルトフィリアとして知られ、好気性、グラム陰性、新興多剤耐性の、世界的規模でみられる日和見病原菌である。院内及び市中感染によるＳ．マルトフィリア感染症の発生率の増加は、この病原性微生物が、著しい致死／症例比を伴うこと、及び菌血症患者の１４〜６９％に及ぶ粗死亡率を伴う重大な院内病原菌として出現したことから、免疫低下者にとって、特に懸念される。

Ｓ．マルトフィリアは、ＴＭＰ−ＳＭＸ、β−ラクタム抗生物質、マクロライド、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、カルバペネム、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ポリミキシン、セフェピム、チカルシリンクラブラン酸塩（ticarcillin-clavulanate）、セフタジジム及びピペラシリン・タゾバクタムを含む数多くの抗生物質に対する耐性を示す。

したがって、Ｓ．マルトフィリアは、多剤耐性病原菌として世界中で出現しており、重篤な呼吸器感染、血流及び尿路感染を引き起こす可能性がある。この広く知られている病原菌によって引き起こされる一般的な感染症の一部には、肺炎、血流感染症、皮膚感染症、手術部位感染、尿路感染、心内膜炎髄膜炎、腹腔内感染症、合併性疾患（co-morbid illness）、眼内炎及び嚢胞性線維症（主に膵臓、呼吸器系及び汗腺に影響する外分泌腺の遺伝性代謝障害）が含まれる。

ある研究によると、Ｓ．マルトフィリアの薬剤耐性は、米国及び欧州各国において１０％〜１５％の率で増大しており、治療選択肢が限られている中で、Ｓ．マルトフィリア感染症の治療を著しく困難なものにしている。

式Ｉの新規化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］は、参照により本明細書に組み込まれている本出願人のインド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びそれに対応するＰＣＴ／ＩＮ２０１４／００００１８号に開示された。本化合物は、バクテロイド、クロストリジア種（clostridia species）などの嫌気性生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（mycobacterium avium）などの抗酸菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ，methicillin resistant Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ，Staphylococcus epidermitis）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ，penicillin-resistant Streptococcus pneunoniae）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ，vancomycin-resistant enterococci）を含む多剤耐性グラム陽性細菌を含めた、いくつかのヒト及び動物病原菌に対する強力な抗微生物活性を有することが知られているオキサゾリジノン系の薬剤に属する。

オキサゾリジノン系の抗菌薬は、細菌タンパク質合成を阻害する特有の機序を有する。リネゾリドは、強力な抗菌活性を有する薬剤のうち最も重要なオキサゾリジノン系の１つであり、多くの重要な耐性病原菌に対して潜在的な抗菌活性を有する、臨床使用で承認された最初のオキサゾリジノンであった。しかしながら、Ｓ．マルトフィリアは、リネゾリドに対しても同様に耐性を示したことから、発明者らは、Ｓ．マルトフィリア及び他の多剤耐性病原菌に対して効果的であると思われる新たな抗菌化合物の開発を目指した。

発明者らは、インド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びそれに対応するＰＣＴ／ＩＮ２０１４／００００１８号に開示された式Ｉの新規化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］を開発した。化合物Ｉに関するさらなる抗微生物研究において、本化合物が多剤耐性Ｓ．マルトフィリア病原菌によって引き起こされる感染症の治療並びに広範に及ぶグラム陽性及びグラム陰性病原菌に対抗する非常に大きな可能性を示したこと、また、本化合物に関して実施された単回投与急性毒性試験において有望な結果を示したことが観察された。本化合物は、既知の広く使用されているオキサゾリジノン誘導体のうちのいくつかを含む多数の抗生物質に耐性を持つに至ったＳ．マルトフィリアに対して、優れた生物学的活性を示した。

本発明の主な目的は、多剤耐性Ｓ．マルトフィリア感染症の治療のための抗生物質治療を提供することである。

本発明の別の目的は、多剤耐性Ｓ．マルトフィリア及び他の薬剤耐性病原菌によって引き起こされる感染症の治療のための新規抗菌薬を提供することである。

本発明の別の目的は、多剤耐性Ｓ．マルトフィリア並びに他のグラム陽性及びグラム陰性病原菌によって引き起こされる感染症の治療のための新規の広範に及ぶオキサゾリジノン誘導体を提供することである。

本発明の別の目的は、新規抗菌化合物及びその薬学的に許容される塩を提供することである。

本発明のさらなる目的は、ヒト及び動物使用のための新規抗菌薬の医薬組成物を提供することである。

式Ｉの新規オキサゾリジノン化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］は、参照により本明細書に組み込まれている、本出願人のインド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びそれに対応するＰＣＴ／ＩＮ２０１４／００００１８号に開示された。

式Ｉの化合物は、以下の^１Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、質量及びＩＲスペクトルデータにより特徴付けられる。

ＩＲスペクトルデータ
３３３５、３０８５、２９８４、２９００、２７４３、２６９７、１７３６、１６７１、１６０９、１５９７、１５４２、１５１２、１４７４、１４２０、１３６９、１３４８、１３１８、１２８５、１２３１、１１４２、１１１４、１０８３。（図１に示す通り）
（Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３：δ２．０１（ｓ，３Ｈ）、３．０６（ｔ，４Ｈ）、３．６０〜３．７８（ｍ，４Ｈ）、３．８５〜３．８６（ｔ，２Ｈ）、４．０３（ｔ，２Ｈ）、４．７８（ｍ，１Ｈ）、６．１２（ｓ，１Ｈ）、６．８２〜６．８５（ｍ，１Ｈ）、６．９８〜７．０３（ｑ，１Ｈ）、７．３２〜７．３４（ｄｄ，１Ｈ）（図２に示す通り）
^１３Ｃ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３：２２．７、４１．７、４７．７、５０．５、６６．６、７１．８、１０９．６、１１１．９、１１６．２、１３４．３、１３９．９、１４０．０、１５０．８、１５３．２、１５４．６、１７１．２。（図３に示す通り）
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８．３７（Ｍ＋１）（図４に示す通り）

式Ｉの化合物はさらに、８．８９８、１３．０５、１３．７９９、１５．８４９、１８．８１７、１９．１３８、１９．４５４、２０．１９３、２１．３９５、２１．６８６、２２．２８９、２２．８３３、２３．５０４、２６．１３３及び３２．４４８°２θのＸＲＤスペクトルにより特徴付けられる（図５に示す通り）。

化合物Ｉは、
ａ）式II

の３，４−ジフルオロニトロベンゼン化合物を還元して、式III

の３，４−ジフルオロ−アニリン化合物を得るステップ；
ｂ）化合物IIIを（Ｒ）エピクロロヒドリンと反応させて、式IV

の（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オール化合物を得るステップ；
ｃ）式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オール化合物をフタルイミドカリウムとカップリングさせて、式Ｖ

の（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を得るステップ；
ｄ）ＣＤＩを用い、式Ｖの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を環化させて、式VI

の（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を得るステップ；
ｅ）ヒドラジン水和物と反応させることにより、化合物VIのフタルイミド環を開環して、式VII

の（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オン化合物を得るステップ；
ｆ）無水酢酸を用い化合物VIIをアシル化して、対応する式VIII

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｇ）ニトロ化試薬（硝酸及び硫酸）を用い化合物VIIIをニトロ化して、式IX

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｈ）（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物IXをモルホリンと反応させて、式Ｘ

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｉ）式Ｘの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を還元して、式XI

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ；
ｊ）（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（化合物XI）を脱アミノ化して、式Ｉ

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ
を含む方法により調製される。

化合物Ｉの抗菌活性を確かめるために、詳細な抗微生物研究を実施し、その有効範囲並びに静菌性及び殺菌性活性を研究した。

化合物Ｉの生物活性試験をＩＩＣＴ（INDIAN INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY）ハイデラバードで実施したところ、薬剤耐性Ｓ．マルトフィリア病原菌に限らず、Ｍ．ルテウス（M. luteus）、Ｂ．ステアロテルモフィルス（B. sterothemophilus）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｋ．ニューモニエ（K. pneumonia）、緑膿菌（P. aeruginosa）、大腸菌（E. coli）、Ｐ．ブルガリス（P. vulgaris）、チフス菌（S. typhi）、枯草菌（B. subtilis）、Ｓ．ミュータンス（S. mutans）、Ｂ．スファエリクス（B. sphaericus）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、リジニバチルス（Lysinobacillus）、Ｂ．セレウス（B. cereus）、Ｂ．メガテリウム（B. megatherium）、Ｐ．ミラビリス（P. mirabilis）、Ｓ．パラチフス（S. paratyphi）などの他のグラム陽性及びグラム陰性病原菌に対する有望な結果が得られた。

以下のパラメータに関して、ステノトロホモナス・マルトフィリアに対する化合物Ｉの抗菌性評価を行った。
ａ．様々な濃度での寒天プレートアッセイ（１０、５０、１００、１５０μｇ）
ｂ．ＭＩＣ研究
１．様々な濃度による（１０００〜５μｇ／ｍｌ１０通りまでの様々な濃度）
２．様々な期間（４〜３２時間８通りの時間間隔）
ｃ．生物の生存性に関する作用様式
１．濃度による及びインキュベーション時間に基づく殺菌性／静菌性
２．コロニー計数／色素に基づく評価
ｄ．感受性試験（様々な性質の４０種を超える抗生物質の評価）
ｅ．他の感染性細菌による抗菌能研究（antibacterial potential studies）（２０種までの様々な株）

化合物Ｉの抗菌活性から以下のことが判明した。
− 化合物Ｉは、Ｓ．マルトフィリアに対して作用するが、リネゾリド及びバンコマイシンは阻害性がない。
− 濃度に基づく阻害活性は、Ｓ．マルトフィリアに対して認められた。
− ＭＩＣ研究により、５００μｇ／ｍｌ以上が、Ｓ．マルトフィリアの完全阻害（殺菌性）に有効であることが示唆された。
− ５００μｇ未満の濃度で、２４時間まで静菌性作用が持続する。
− Ｓ．マルトフィリアの抗生物質感受性プロファイルを探った。
− 化合物Ｉは、キサントモナス科（Xanthomonadaceae）（Ｓ．マルトフィリア及びシュードモナス種（Pseudomonas sp.））並びにバチルス（バチルス・セレウス（Bacillus cereus））属のうちのいくつかの種に対して有効である。

検査室での分析（lab analysis）の間、１０μｇレベルでの化合物ＩがＳ．マルトフィリアの増殖阻害に効果的であることが見出された。また、化合物Ｉの濃度の増加により、増殖阻害の範囲が拡大するという結果となった。しかし、寒天プレートアッセイ上の化合物Ｉの濃度の増加に伴う比例的な増殖阻害範囲は認められなかった。

低用量の化合物ＩがＳ．マルトフィリアの増殖を阻害するのに十分であることが観察された。一方、化合物Ｉの濃度と比例関係にない阻害範囲が観察されたことは興味深い事実である。これは、実験の間、薬剤及び微生物の相互作用に影響を及ぼす寒天中の化合物Ｉの物質輸送（mass transfer）に起因している可能性がある。物質輸送の影響を低減し、化合物Ｉと微生物株の接触を改善するための代替法の１つは、固体バリアを除去すること、又は液体希釈法（broth dilution method）による培地中の化合物の拡散を増加させることであった。

化合物Ｉの抗微生物能を把握するために、グラム陽性及びグラム陰性のものからなる２０種の様々な細菌株を使用して、リネゾリド及びバンコマイシンに対する相対的な微生物増殖阻害範囲を評価する最初の検査室での実験を計画した。比較のためのバンコマイシンの選択は、バンコマイシンがグラム陽性細菌感染症を治療するために一般に使用されている代替的な抗生物質であるという事実に基づいた。試験したすべての微生物株の中でも、Ｓ．マルトフィリア、Ｐ．エルジノーサ（P.aeruginosa）、さらにはＢ．セレウスの株のうちの１つが、バンコマイシン又はリネゾリドではなく、化合物Ｉに対する抗菌活性を示した。このことから、化合物Ｉが上記の生物に関係する感染症をより効果的に制御する潜在的薬剤候補となり得るが示唆された。さらに検査室での分析から、化合物Ｉがキサントモナス科（Ｓ．マルトフィリア及びシュードモナス種）並びにバチルス（バチルス・セレウス）属のうちのいくつかの種に対して有効であることも確立された。

式Ｉのオキサゾリジノン化合物のＩＰスペクトルデータの図である。式Ｉのオキサゾリジノン化合物のＨ−ＮＭＲスペクトルデータの図である。式Ｉのオキサゾリジノン化合物の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータの図である。式Ｉのオキサゾリジノン化合物のＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）スペクトルデータの図である。式Ｉのオキサゾリジノン化合物のＸＲＤデータの図である。式Ｉのオキサゾリジノン化合物の寒天プレートアッセイの写真である。化合物Ｉに対するＳ．マルトフィリアの阻害範囲を示す寒天プレートの写真である。１２時間の試験管希釈法（tube dilution method）による化合物ＩのＭＩＣの写真である。Ｓ．マルトフィリアに対する化合物Ｉの殺菌性／静菌性の色素ベース評価の写真である。市販の抗生物質でのＳ．マルトフィリアの抗微生物プロファイルを示す寒天プレートの写真である。

本発明の詳細な実施形態を以下に開示する。但し、開示される実施形態が本発明の単なる例示にすぎず、様々な形態で具現化され得ることを理解されたい。本発明の範囲は、開示される実施形態に限定されることなく、本明細書で使用される用語及び語句は、限定であることを意図したものでなく、むしろ本発明に関する理解しやすい説明を与えるものである。本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲により明確に定められる。

式Ｉの新規オキサゾリジノン化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］は、参照により本明細書に組み込まれている、インド特許出願第５０６３／ＣＨＥ／２０１３号及びそれに対応するＰＣＴ／ＩＮ２０１４／００００１８号に開示された。

式Ｉの新規オキサゾリジノン化合物の合成方法を、以下のスキーム−Ｉで説明する：

新規オキサゾリジノン化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］（式Ｉ）の合成方法は以下のステップを含む：
ａ）式II

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ。

上記の方法の各ステップはさらに、以下本明細書で詳述する。

ステップａ：３，４−ジフルオロニトロベンゼンを還元して、３，４−ジフルオロ−アニリンを得るステップ
式Ｉの３，４−ジフルオロニトロベンゼンをオートクレーブ内で水素ガスを加えながらｐｄ／Ｃで還元し、３〜４時間反応を維持する。反応終了後、ろ過及び蒸留して、式IIIの化合物を得る。

ステップｂ：３，４−ジフルオロ−アニリンを（Ｒ）エピクロロヒドリンと反応させて、式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オールを得るステップ
本ステップは、５０℃〜５５℃で５．０〜６．０時間加熱しながら、３，４−ジフルオロ−アニリンを（Ｒ）エピクロロヒドリンと反応させ、反応終了後、真空下で蒸留し、式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オールを得ることを伴う。

ステップｃ：式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オールをフタルイミドカリウムとカップリングさせて、式Ｖの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオンを得るステップ
本ステップにおいて、式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オールを、ＤＭＦ中で１４０〜１５０℃で５．０〜６．０時間フタルイミドカリウムで処理する。その後、冷却し、ろ過し、水とメタノールとの混合物で洗浄し、式Ｖの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオンを得る。

ステップｄ：ＣＤＩを用い、式Ｖの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオンを環化させて、式VIの（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオンを得るステップ
本ステップにおいて、ＣＤＩを用い、酢酸エチル中の（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（式Ｖ）を環化させ、３．０〜４．０時間室温で撹拌する。反応終了後、酢酸エチルで洗浄し、次いで水で洗浄することにより、式VIの（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオンを得る。

ステップｅ：ヒドラジン水和物と反応させることにより、（Ｓ）−２−（（３−（３，４ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオンのフタルイミド環を開環して、式VIIの（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オンを得るステップ
本ステップは、室温で、メタノールと水との中での（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオンとヒドラジン水和物との反応、さらには６５〜７０℃まで加熱し、同温度で２．０〜３．０時間撹拌することを伴う。反応終了後、ジクロロメタンでの抽出、蒸留を経て、式VIIの（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オンを得る。

ステップｆ：無水酢酸を用い、式VIIの（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オンをアシル化して、対応する式VIIIの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ
本ステップにおいて、式VIIの（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オンを、２５〜３０℃でジクロロメタン中で無水酢酸と反応させ、３．０〜４．０時間撹拌する。反応終了後、有機層を蒸留し、水で洗浄して、式VIIIの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得る。

ステップｇ：ニトロ化試薬（硝酸及び硫酸）を用い（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドをニトロ化して、式IXの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ
本ステップは、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを、ジクロロメタン中の硫酸及び硝酸溶液に加え、０〜５℃で３０分間撹拌し、３．０〜４．０時間撹拌することを伴う。その後、温度を上げ、有機層を分離し、ジクロロメタンで抽出して、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得る。

ステップｈ：（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドをモルホリンと反応させて、式Ｘの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ
本ステップにおいて、イソプロピルアルコール中の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドの溶液に、モルホリンを加えて、７０〜７５℃で１．０〜２．０時間撹拌する。その後、水を加え、水を用いて分離及び洗浄し、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得る。

ステップｉ：式Ｘの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５イル）メチル）アセトアミドを還元して、式XIの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ
本ステップにおいて、メタノール中、Ｐｄ／Ｃで、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを還元し、５．０〜６．０Ｋｇ／Ｃｍ^２の水素ガスで３．０〜４．０時間、３５〜４０℃で維持する。反応終了後、触媒をろ過し、溶媒を完全に留去して、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５イル）メチル）アセトアミドを得る。

ステップｊ：（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを脱アミノ化して、所望の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ
本ステップは、（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドに濃縮ＨＣｌを添加し、温度０〜５℃で反応塊を維持し、その後、亜硝酸ナトリウム水溶液を加え、撹拌することを伴う。反応終了後、１０℃未満で次亜リン酸（Ｈ_３ＰＯ_２）を加え、反応塊の温度を３０〜３５℃まで上げる。反応終了後、ジクロロメタンを加えて、ジクロロメタンを用いて抽出し、所望の新規（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得る。

式Ｉの新規オキサゾリジノン誘導体化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］を調製するための上述の方法をさらに、以下に与える実施例により説明する。
［実施例］

式IVの（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オールの調製
２００．０ｇの３，４−ジフルオロニトロベンゼン、６００．０ｍｌのトルエン及び１２．０ｇのｐｄ／Ｃを、２５℃〜３５℃でオートクレーブ中に取る。水素ガス２．０〜６．０Ｋｇ／Ｃｍ^２を加え、３〜４時間、２５℃〜３５℃で反応を維持し、ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認する。反応後、反応塊を装填せず、ハイフローベッドを通してろ過し、トルエン（２００．０ｍｌ）で洗浄する。ろ液を取り除き、５０℃未満真空下で蒸留する。得られた３，４−ジフルオロアニリン粗重量１５２．０ｇ、収率：９３．８％、ＨＰＬＣによる純度：９５．８５％。

前ステップの３，４−ジフルオロアニリン１４０．０ｇ、１２０．４ｇの（Ｒ）−エピクロロヒドリンをきれいな丸底フラスコに入れ、５０℃〜５５℃までゆっくり加熱し、５．０〜６．０時間、５０℃〜５５℃で反応塊を維持し、ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認する。反応終了（compiles）後、５０℃未満で真空下、低蒸留器で蒸留して、式IIIの粗化合物（１７０．０ｇ、収率：７１．０％、純度：７３．２９％）を得る。

（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（式Ｖ）の調製
１５６．０ｇのフタルイミドカリウム及び１７０．０ｍｌのＤＭＦを用いて５．０〜６．０時間１４０〜１５０℃で処理し、実施例１から得られた粗生成物。ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認した。反応塊を室温まで冷却し、８５０．０ｍｌの水及び２５５．０ｍｌのメタノールを加えて、１．０〜２．０時間室温で撹拌した。ろ過した固形物（the filtered the solids）を、水及びメタノールの混合物（１７０．０ｍｌ）で洗浄し、固形物を乾燥させた。得られた固形物重量２０６．０ｇ、ＨＰＬＣによる純度：６３．１％。

（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン（式VI）の調製
４１０．０ｇの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン（式Ｖ）、８２０．０ｍｌの酢酸エチル及び２１０．０ｇのＣＤＩを丸底フラスコに入れた。３．０〜４．０時間室温で撹拌した。ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認した。反応終了後固形物をろ過し、２０５．０ｍｌの酢酸エチルで洗浄した。その後、ウェットケーキ及び１８００．０ｍｌの水を丸底フラスコに入れた。１．０〜２．０時間４０〜４５℃で撹拌し、固形物をろ過し、４１０．０ｍｌの水で洗浄した。ウェットケーキを乾燥させ、（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオンを得た。重量：２７２．０ｇ、収率：５７．９％、ＨＰＬＣによる純度：９４．２２％。

（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（式VIII）の調製
３７０．０ｇの（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン、３７０．０ｍｌのメタノール及び１４８０．０ｍｌの水、２１６．５ｇのヒドラジン水和物を室温で丸底フラスコに入れた。反応塊を６５〜７０℃までゆっくり加熱し、同温度で２．０〜３．０時間撹拌した。ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認した。反応終了後、反応塊を室温まで冷却し、ジクロロメタンで生成物を抽出した。有機層を完全に蒸留し（distilled off）、式VIIの粗生成物（２０８．０ｇ）を得た。

上記の得られた粗生成物に３７０．０ｍｌのジクロロメタンを加え、２５〜３０℃で上記反応塊に１４７．５ｇの無水酢酸をゆっくり加え、３．０〜４．０時間撹拌し、ＴＬＣにより反応塊を調べて、反応終了を確認した。反応終了後、反応塊を水で洗浄した。有機層を完全に蒸留（distilled off）し、得られた粗生成物塊を得て、撹拌下、この塊に３７０．０ｍｌの水を加えて、１時間維持し、固形物をろ過し、水で洗浄した。乾燥させて、式VIIIの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド、重量：２３０．０ｇ、収率：８１．６％、ＨＰＬＣによる純度：９５．５４％を得た。

（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（式Ｘ）の調製
３２０．３ｇの硫酸を丸底フラスコに入れた。０〜５℃まで冷却し、０〜５℃で８８．７ｇの硝酸をゆっくり加え、３０分間撹拌し、８５０．０ｍｌのジクロロメタンを加えた。その後、１７０．０ｇの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを０〜５℃でロット単位で加え、０〜５℃で３０分間撹拌し、反応塊の温度を室温まで上げた。３．０〜４．０時間撹拌し、ＴＬＣを調べて、反応終了を確認した。反応終了後、反応物を８５０．０ｍｌの冷却水中でクエンチし、有機層を分離した。ジクロロメタンで水性層を抽出した。合わせた有機層から溶媒を留去した。式IXの粗化合物（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド。（１８２．０ｇ）

こうして得られた粗生成物に、１８２．０ｍｌのイソプロピルアルコールを加え、これに１２２．４ｇのモルホリンをゆっくり加え、１．０〜２．０時間、７０〜７５℃で撹拌した。ＴＬＣを調べて、反応終了を確認した。終了後、３４０．０ｍｌの水を反応塊に加え、その後、室温まで冷却した。こうして分離された材料をろ過し、１７０．０ｍｌの水で洗浄した。乾燥させて、式Ｘの得られた生成物（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド、重量：１８９．０ｇ、収率：７８．６８％、ＨＰＬＣによる純度：９１．１２％を得た。

（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（式XI）の調製
１００．０ｇの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド、１５００．０ｍｌのメタノール及び１０．０ｇのＰｄ／Ｃを、オートクレーブ内で水素付加にかける。５．０〜６．０Ｋｇ／Ｃｍ^２の水素ガスで、３．０〜４．０時間３５〜４０℃で維持する。ＴＬＣにより反応終了を確認する。反応終了後、触媒をろ過し、溶媒を完全に留去した。得られた式XIの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド、重量：８０．０ｇ、収率：８６．９％、ＨＰＬＣによる純度：９６．３２％。

（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（式Ｉ）の調製
８２．０ｍｌの濃ＨＣｌに、８０．０ｇの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（式XI）をゆっくり加え、反応塊の温度０〜５℃を維持した。この反応塊に、０〜５℃で２３．５ｇの亜硝酸ナトリウム水溶液１２５．０ｍｌを加えて、３０分間撹拌し、ＴＬＣを調べて反応終了を確認した。終了後、１０℃未満で２２．５ｇの次亜リン酸（Ｈ_３ＰＯ_２）を加え、その後、反応塊の温度を３０〜３５℃まで上げ、３０分間撹拌し、ＴＬＣを調べて反応終了を確認した。反応終了後、反応塊を０〜５℃まで冷却し、４００．０ｍｌのジクロロメタンを加え、４８％の腐食性の苛性アルカリ溶液（caustic lye）を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整した。有機層を分離し、ジクロロメタンを用いて水性層を抽出した。合わせた有機層を蒸留し（distilled off）、粗生成物を得た。その後、この粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、さらにメタノールで再結晶し、式Ｉの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド、重量：１０．０ｇ、収率：１３．０％、ＨＰＬＣによる純度：９９．５％を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ^１３−ＮＭＲ、質量、ＩＲスペクトルデータにより構造を確認した。

式Ｉの化合物の構造的解明は、以下に述べるように^１Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、質量、ＩＲスペクトルデータなどにより確かめる。

ＩＲスペクトルデータ：
３３３５、３０８５、２９８４、２９００、２７４３、２６９７、１７３６、１６７１、１６０９、１５９７、１５４２、１５１２、１４７４、１４２０、１３６９、１３４８、１３１８、１２８５、１２３１、１１４２、１１１４、１０８３。（図Ｉ）
（Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３：δ２．０１（ｓ，３Ｈ）、３．０６（ｔ，４Ｈ）、３．６０〜３．７８（ｍ，４Ｈ）、３．８５〜３．８６（ｔ，２Ｈ）、４．０３（ｔ，２Ｈ）、４．７８（ｍ，１Ｈ）、６．１２（ｓ，１Ｈ）、６．８２〜６．８５（ｍ，１Ｈ）、６．９８〜７．０３（ｑ，１Ｈ）、７．３２〜７．３４（ｄｄ，１Ｈ）（図II）
^１３Ｃ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３：２２．７、４１．７、４７．７、５０．５、６６．６、７１．８、１０９．６、１１１．９、１１６．２、１３４．３、１３９．９、１４０．０、１５０．８、１５３．２、１５４．６、１７１．２。（図III）
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８．３７（Ｍ＋１）；（図IV）

ＸＲＤ分析の方法：
粉末ＸＲＤ作成：ＢｒｕｋｅｒＤ２Ｐｈａｓｅｒ
ＰＭＭＡホルダー及び以下に詳述する走査パラメータを用いて収集したＬＤサンプルデータ：
２θ範囲：３〜４０°
ステップサイズ：０．０１２
ステップの時間：７２秒
ＧｅｎｅｒａｔｏｒＫＶ：３０
ＧｅｎｅｒａｔｏｒｍＡ：１０
検出器：ＬｙｎｘＥｙｅ
スピナ：１５ｒｐｍ
Ｘ線源：ＣｕＫα

抗微生物研究
化合物Ｉの抗菌活性を確かめるために、詳細な抗微生物研究を行い、その有効範囲並びに静菌及び殺菌活性を研究した。

以下のパラメータに関してステノトロホモナス・マルトフィリアに対する化合物Ｉの抗菌性評価を行った。
ｆ．様々な濃度での寒天プレートアッセイ（１０、５０、１００、１５０μｇ）
ｇ．ＭＩＣ研究
１．様々な濃度による（１０００〜５μｇ／ｍｌ１０通りまでの様々な濃度）
２．様々な期間（４〜３２時間８通りの時間間隔）
ｈ．生物の生存性に関係する作用様式
１．濃度による及びインキュベーション時間に基づく殺菌性／静菌性
２．コロニー計数／色素に基づく評価
ｉ．感受性試験（様々な性質の４０種を超える抗生物質の評価）
ｊ．他の感染性細菌による抗菌能研究（２０種までの様々な株）

結果
寒天プレートアッセイ
肺疾患、院内感染、合併性疾患、菌血症、髄膜炎、心内膜炎などの既知の原因微生物株である、ステノトロホモナス・マルトフィリアを使用した化合物Ｉの抗菌性を速やかに評価するために、寒天プレートアッセイを行った。

所与の背景情報を考慮して、寒天プレートを使用したＳ．マルトフィリアに対する化合物Ｉ、バンコマイシン及びリネゾリドの抗菌特性をベースにした初期の寒天プレートを評価し、５０μｇの各化合物をＤＭＳＯ溶液中に溶解させた。必要であれば、Ｓ．マルトフィリアへのＤＭＳＯの影響を排除するため、試験化合物としてＤＭＳＯもまた使用し、表１及び図６にデータを提示する。

上の表から、Ｓ．マルトフィリアの増殖は、化合物Ｉによってのみ阻害され、バンコマイシン及びリネゾリドのいずれによっても阻害されなかったことが明らかであり、化合物Ｉが、保健医療の分野において将来性があることが示唆される。

化合物Ｉ濃度による増殖阻害研究
さらなる研究を開始する前に、化合物Ｉの抗菌効率を理解することが重要である。化合物Ｉの抗菌効率を評価するために、寒天プレートアッセイについて０〜２５０μｇの濃度範囲を使用した。２つのパーセント（two percent）の寒天プレートを用意し、２４時間増殖したＳ．マルトフィリアを寒天プレート上に蔓延させ、４℃でインキュベートした。３０分後、Ｓ．マルトフィリアからなる寒天プレートを室温で無菌環境に移し、滅菌穿孔を使用してウェルを設けた。各ウェルに、ＤＭＳＯ中に溶解した既知の濃度の化合物Ｉを加えた。３７℃で２４時間のインキュベーション後、阻害範囲を測定した。表２及び図７にデータを提示する。

表２及び図７に提示されたデータは、明白に以下のことを示す
ｉ．化合物Ｉは、１０μｇのレベルでＳ．マルトフィリアの増殖阻害に効果的である。
ii．化合物Ｉ濃度を上げた結果、増殖阻害範囲の拡大がもたらされた。
iii．寒天プレートアッセイにおける化合物Ｉ濃度の上昇に伴う比例的な増殖阻害範囲は認められなかった。

上のデータは、とりわけ、低用量でもＳ．マルトフィリアの増殖を低減するのに十分であるという点が興味深い。一方、化合物Ｉの濃度と比例関係にない阻害範囲が観察されたことは、注目すべき事実である。これは、実験の間、薬剤及び微生物の相互作用に影響を及ぼす寒天中の化合物Ｉの物質輸送に起因している可能性がある。物質輸送の影響を低減し、化合物Ｉと微生物株の接触を改善するための代替法の１つは、固体バリアを除去すること、又は液体希釈法による培地中の化合物の拡散を促進することであった。

ＭＩＣ研究
微生物学において、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ，minimum inhibitory concentration）は、一晩インキュベーションした後の微生物の視認できる増殖を阻害する抗微生物薬の最小濃度である。最小発育阻止濃度は、抗微生物剤に対する微生物の耐性を確認し、さらには、新たな抗微生物剤の活性をモニターする診断的検査において重要である。ＭＩＣは一般に、生物に対する抗微生物剤の活性に関する最も根本的な検査指標とされている。本方法において、拡散に関する上記の問題も除外される。

試験管希釈法による化合物ＩのＭＩＣ
Ｓ．マルトフィリア増殖の阻害に必要な化合物Ｉ濃度のＭＩＣを見出すため、０〜１０００μｇ／ｍｌの範囲で１０通りの異なる濃度（１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２、７．８１、３．９０、０μｇ／ｍｌ）の化合物Ｉを、１０^７個の細胞を含有する１ｍｌの滅菌培地中に補充した。これらの試験管を３７℃でインキュベートした。１２時間後、Ｓ．マルトフィリアの増殖が観察された。図８にデータを提示する。

図８より、０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲の試験したすべての濃度でＳ．マルトフィリアの増殖が認められたことが明らかになったが、増殖の視認性は、化合物Ｉの濃度により変化した。５００及び１０００μｇ／ｍｌの化合物Ｉを補充した試験管においては、増殖は観察されず、Ｓ．マルトフィリアに対する本化合物のＭＩＣが５００μｇであることが示唆された。

各期間でのＭＩＣ
Ｓ．マルトフィリアに対するＬＤ誘導体のＭＩＣは５００μｇ／ｍｌであるが、インキュベーションの時間によって、Ｓ．マルトフィリアの増殖が微生物の代謝性質又は化合物の生理学的特性により異なる可能性がある。これを考慮して、様々な時間間隔で増殖を目視によりモニターした。報告書の最後に補遺としてデータを提示する。図により、４時間のインキュベーションを行っても、様々な濃度で化合物Ｉを補充したいずれの試験管についても増殖が認められなかったことが明らかである。一方、４〜８時間の増加に伴い、Ｓ．マルトフィリアの増殖が、６２．５、３１．２５、１５／６２、７．８１、３．９０及び０の濃度の化合物Ｉを補充した試験管で認めることができた。さらに、インキュベーションの時間を１２時間超に、すなわち１６、２０及び２４時間に増加させた場合、５００及び１０００μｇを補充した試験管を除いたすべての試験管で、Ｓ．マルトフィリアの増殖を視認できた。これは、５００μｇの化合物Ｉが、１２時間、Ｓ．マルトフィリアの増殖を阻害するのに効果的であることを示している。

生物の生存性に関係する作用様式
殺菌性／静菌性
Ｓ．マルトフィリアの殺菌又は増殖の抑止に関係する化合物Ｉの増殖阻害特性を評価するために、インキュベーションの時間との関係で、様々な濃度の化合物Ｉが存在する下での生物の増殖パターンを分析した。結果を表にまとめた。データから、所与のいかなる濃度の化合物Ｉにおいても、インキュベーションが４時間を経過するまで増殖が検出されなかったことが明らかであった。インキュベーション時間を４時間超に増加すると、６２．５、１２５及び２５０μｇ／ｍｌを補充した試験管において１６時間のインキュベーションまで目に見える増殖が観察されなかったが、増殖期間のさらなる延長、すなわち２０時間を超えるとＳ．マルトフィリアの増殖が認められた。これは、生物の増殖が一時的に抑止された後、再び増殖を始める可能性があることを示唆しており、一方で、５００μｇ／ｍｌ以上の濃度の化合物Ｉの補充の場合、Ｓ．マルトフィリアの増殖は１２０時間後であっても観察されなかった。このデータはさらに、化合物Ｉが５００μｇ／ｍｌで使用された場合、Ｓ．マルトフィリアを根絶するのに効果的であることを裏付ける。さらに、データは、５００μｇ／ｍｌ以上の濃度で、化合物Ｉが殺菌的に作用し、５００μｇ／ｍｌ未満では静菌的に作用し得ることを示唆する。

色素に基づく分析
化合物Ｉの抗菌性はさらに、色素間相互作用法（dye interactive method）により確認された。図９は、化合物Ｉの存在下でのＳ．マルトフィリアの生存性を示す。図９から、様々な濃度の化合物Ｉの存在下で増殖したＳ．マルトフィリア培養物に対してメチレンブルーを補充すると、５００及び１０００μｇ／ｍｌを補充した培養物に青色が認められ、残りの培養物は青色を示さなかったことが明らかとなった。色の変化又は青色の消失に関する基本的な原理は、還元性の環境に関係している。メチレンブルー溶液は、酸化性の環境では青色であるが、還元剤に曝されると無色に変化する。いかなる生命体の増殖も、代謝として知られる広範な化学反応に関係しており、この反応は基本的に酸化還元反応で特徴付けられ、いくつかの還元補助因子（reducing cofactor）が、活発に増殖している細胞内に常に存在している。それ故、このような還元性の環境（生命体）にメチレンブルーを曝すと、色素が直ちに還元され、その色を失う。２５０μｇ／ｍｌまでの濃度の化合物Ｉを補充されたＳ．マルトフィリア培養試験管においてメチレンブルーの色が消失したことから、これは、５００μｇ／ｍｌ以上の化合物Ｉの濃度がＳ．マルトフィリアの増殖にとって有害であることを示す。

様々な抗生物質についてのＳ．マルトフィリアの感受性試験プロファイル（図１０）

他の感染性細菌についての抗菌能研究（２０種までの株）
化合物Ｉの抗菌性を把握するため、グラム陽性及びグラム陰性からなる２０の異なる細菌株を使用して、リネゾリド及びバンコマイシンに対する相対的な微生物株増殖阻害範囲を評価する最初の実験を計画した。比較のためのバンコマイシンの選択は、それがグラム陽性細菌感染症を治療するために一般的に使用されている代替の抗生物質であるという事実に基づいていた。結果を表５に報告する。

試験を行った様々な微生物株すべての中でも、Ｓ．マルトフィリア、Ｐ．エルジノーサ、及びＢ．セレウスの株のうちの１つが化合物Ｉに対する抗菌活性を示したが、バンコマイシン及びリネゾリドに対しては示さなかったことから、化合物Ｉが上記の生物に関係した感染症をより効果的に制御するための潜在的な薬剤候補となる可能性があることが示唆された。

結論
化合物Ｉの抗微生物活性の要約を以下に示す：
− 化合物ＩはＳ．マルトフィリアに対して作用するが、これは、増殖を阻害できなかったリネゾリド及びバンコマイシンなどの他の抗生物質と対照的である。
− 濃度に基づく抗微生物活性試験により、化合物Ｉが１０μｇのレベルでＳ．マルトフィリアの増殖阻害に効果的であることが示された。
− ＭＩＣ研究により、５００μｇ／ｍｌ以上の化合物ＩがＳ．マルトフィリアの完全な阻害に効果的であることが示唆された。
− ５００μｇの化合物Ｉは、１２時間Ｓ．マルトフィリアの増殖を阻害するのに効果的である。
− 化合物Ｉは、５００μｇ／ｍｌ以上の濃度で殺菌的に作用し、５００μｇ／ｍｌ未満で静菌的に作用し得る。
− Ｓ．マルトフィリアの抗生物質感受性プロファイルを探った。
− 化合物Ｉは、キサントモナス科（Ｓ．マルトフィリア及びシュードモナス種属）並びにバチルス（バチルス・セレウス）属のうちのいくつかの種に対して有効である。

医薬品・化粧品法（Drugs & Cosmetic Act and Rules）のプロトコールスケジュールに従って、ＵＳＦＤＡが承認したTeena Laboratories社（ハイデラバード）でのウィスターラットを使用した化合物Ｉの単回投与急性毒性の予備試験を実施した。単回投与急性毒性の結果は以下の通りである：
− すべての動物において、治療と関連がある食物摂取：体重及び臨床徴候に対する、治療に関係する影響は観察されなかった。
− 単回用量毒性研究において、媒体対照群、低用量、中等度用量及び高用量群の動物において、通常より早い死（pre-terminal deaths）は観察されなかった。
− ３つの用量レベルにおいてすべての動物群における血液学的パラメータは、対照動物と比較して正常範囲であることが分かった。
− ３つの用量レベルにおいてすべての動物群における生化学的パラメータは、対照動物と比較して正常範囲であることが分かった。
− 研究により、動物研究における実験条件下の推奨臨床投与計画での投与試験項目に関して、化合物Ｉが３つの異なる用量レベルにおいて臨床的、行動学的、身体的、生理学的、生化学的、血液学的パラメータに何ら重大な変化をもたらさなかったことが確立された。

したがって、ウィスターラットでの単回投与毒性研究において、低用量、中等度用量及び高用量、すなわち４５．０ｍｇ／ｋｇ、２２５．０ｍｇ／ｋｇ及び４５０ｍｇ／ｋｇによる１回の化合物Ｉ試験項目の投与後、死亡がみられず、ウィスターラットにおける実験条件下での身体的及び生理学的パラメータに重大な変化が起きなかったことが示された。

したがって、本発明は、多剤耐性Ｓ．マルトフィリア病原菌並びに多数のグラム陽性及びグラム陰性病原菌に対する潜在的抗菌薬剤として、治療用の新規オキサゾリジノン化合物Ｉを提供する。

化合物Ｉはさらに、医薬組成物及び医薬品での使用のための薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物及び他の薬学的に好適な誘導体に変換され得る。一部の実施形態では、化合物Ｉのエナンチオマーもまた、当業界において好適に使用されるために調製され得る。

薬学的に許容される塩には、無機又は有機塩基及び無機又は有機酸から調製される塩が含まれる。

無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム（luminium）、アンモニウム、カルシウム、銅、三価鉄（ferric）、二価鉄（ferrous）、リチウム、マグネシウム、マンガン塩（manganic salts）、マンガンの（manganous）、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。固形の塩は、２以上の結晶構造で存在し得、また水和物の形態でもあり得る。無毒性有機塩基から誘導される塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルエチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの一級、二級及び三級アミンの塩、天然由来の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂が含まれる。

本発明の化合物が塩基性である場合、塩は、無機及び有機酸を含む薬学的に許容される無毒性酸から調製され得る。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸（camphorsulfonic）、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。

式Ｉの化合物の医薬組成物は、化合物又はその薬学的に許容される塩を、本目的のために従来使用されている固体若しくは液体の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される補助剤及び賦形剤と組み合わせることによって調製することができる。

医薬組成物は、散剤、錠剤、水和性顆粒剤（dispersible granules）、カプセル剤、カシェ剤及び坐剤など、固体又は液体の形態であってもよい。固体担体は、希釈剤、香味料、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤及び被包剤としても機能し得る少なくとも１種の物質とすることができる。不活性固体担体には、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース系材料、低融点ワックス（low melting wax）、ココアバターなどが含まれる。液体医薬組成物は、溶液、懸濁液及び乳濁液であってもよい。例えば、好適な従来の着色剤、香味料、安定剤及び増粘剤を含有していてもよい、水及び水−プロピレングリコール並びに水−ポリエチレングリコール系に溶解した本発明の化合物の溶液が提供され得る。

好ましくは、医薬組成物は、有効量の活性成分（式Ｉの化合物）を含有する単位剤形で提供されてもよい。

活性成分（式Ｉの化合物）の量は、特定の用途、特定の化合物の効力、医薬組成物及び単位剤形中の所望の濃度に応じて変更又は調整することができる。一般に、活性成分の量は、組成物の０．１重量％〜９９重量％の間の任意の適切な値であってもよい。

治療用途において、化合物又は医薬組成物は、抗菌的に有効となる活性成分の血中濃度を達成及び維持するように、経口、非経口及び／又は局所的に投与することができる。一般に、このような活性成分の抗菌的に有効な投与量は、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。但し、投与量は、患者における必要性、治療対象の細菌感染の重症度、及び使用される特定の化合物に応じて、変わり得る。また、速やかに所望の血中レベルを達成するために、初回投与量を上記の上限レベルを超えて増量する場合もあり、又は初回投与量を至適未満とする場合もあり、治療の経過中に、特定の状況に応じて１日の投与量を漸増する場合もあることが理解されるべきである。所望であれば、１日の投与量を複数回の投与、例えば、１日につき２〜４回に分割してもよい。

式Ｉの化合物はまた、非経口的、すなわち、注射により、例えば静脈内注射により、又は他の非経口的投与経路により投与されてもよい。非経口投与用の医薬組成物は、一般に、式Ｉによる薬学的に許容される量の化合物を、薬学的に許容される液体担体中に溶解した可溶性塩として含有し、これらの薬学的に許容される液体担体は、例えば、注射用水、及び好適に緩衝されて約３．５〜７のｐＨを有する等張液を与える緩衝液などである。好適な緩衝剤は、代表的な緩衝剤をほんの一例として、例えば、オルトリン酸三ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ（＋）−リジン及びＬ（＋）−アルギニンが挙げられる。式Ｉによる化合物は一般に、約１ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌの範囲の溶液で、薬学的に許容される注射可能な濃度をもたらすのに十分な量の担体中に溶解する。結果として得られる液体医薬組成物は、上述の抗菌的に有効な投与量を得るように投与される。本発明による式Ｉの化合物は、有利には、固体及び液体の剤形で経口投与される。

局所治療として、有効量の式Ｉは、患者の皮膚の治療領域に塗布することができる薬学的に許容されるゲル又はクリーム媒体に混合されてもよい。このようなクリーム及びゲルは当技術分野でよく知られており、浸透賦活薬を含むことができる。

Claims

式Ｉ

のオキサゾリジノン抗菌化合物［（Ｓ）−Ｎ−［［３−［４−フルオロ−３−モルホリノフェニル］−２−オキソオキサゾリジン−５−イル］メチル］アセトアミド］、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、又は水和物。
３３３５ｃｍ^−１、３０８５ｃｍ^−１、２９８４ｃｍ^−１、２９００ｃｍ^−１、２７４３ｃｍ^−１、２６９７ｃｍ^−１、１７３６ｃｍ^−１、１６７１ｃｍ^−１、１６０９ｃｍ^−１、１５９７ｃｍ^−１、１５４２ｃｍ^−１、１５１２ｃｍ^−１、１４７４ｃｍ^−１、１４２０ｃｍ^−１、１３６９ｃｍ^−１、１３４８ｃｍ^−１、１３１８ｃｍ^−１、１２８５ｃｍ^−１、１２３１ｃｍ^−１、１１４２ｃｍ^−１、１１１４ｃｍ^−１、１０８３ｃｍ^−１のＩＲスペクトルデータを有する、請求項１に記載のオキサゾリジノン化合物。
δ２．０１（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ、３．０６（ｔ，４Ｈ）ｐｐｍ、３．６０〜３．７８（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ、３．８５〜３．８６（ｔ，２Ｈ）ｐｐｍ、４．０３（ｔ，２Ｈ）ｐｐｍ、４．７８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ、６．１２（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ、６．８２〜６．８５（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ、６．９８〜７．０３（ｑ，１Ｈ）ｐｐｍ、７．３２〜７．３４（ｄｄ，１Ｈ）ｐｐｍのＨ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３を有する、請求項１に記載のオキサゾリジノン化合物。
２２．７ｐｐｍ、４１．７ｐｐｍ、４７．７ｐｐｍ、５０．５ｐｐｍ、６６．６ｐｐｍ、７１．８ｐｐｍ、１０９．６ｐｐｍ、１１１．９ｐｐｍ、１１６．２ｐｐｍ、１３４．３ｐｐｍ、１３９．９ｐｐｍ、１４０．０ｐｐｍ、１５０．８ｐｐｍ、１５３．２ｐｐｍ、１５４．６ｐｐｍ、１７１．２ｐｐｍの^１３Ｃ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３を有する、請求項１に記載のオキサゾリジノン化合物。
３３８．３７（Ｍ＋１）のＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）を有する、請求項１に記載のオキサゾリジノン化合物。
８．８９８、１３．０５、１３．７９９、１５．８４９、１８．８１７、１９．１３８、１９．４５４、２０．１９３、２１．３９５、２１．６８６、２２．２８９、２２．８３３、２３．５０４、２６．１３３及び３２．４４８°２θに主ピークを有するＸＲＤスペクトルを有する、請求項１に記載のオキサゾリジノン化合物。
式Ｉ

のオキサゾリジノン化合物（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを調製するための方法であって、
ａ）式II

の３，４−ジフルオロニトロベンゼン化合物を還元して、式III

の３，４−ジフルオロ−アニリン化合物を得るステップ；
ｂ）化合物IIIを（Ｒ）エピクロロヒドリンと反応させて、式IV

の（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オール化合物を得るステップ；
ｃ）式IVの前記（Ｒ）−１−クロロ−３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）プロパン−２−オール化合物をフタルイミドカリウムとカップリングさせて、式Ｖ

の（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を得るステップ；
ｄ）ＣＤＩを用い、式Ｖの（Ｒ）−２−（３−（（３，４−ジフルオロフェニル）アミノ）−２−ヒドロキシルプロピル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を環化させて、式VI

の（Ｓ）−２−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）イソインドリン−１，３−ジオン化合物を得るステップ；
ｅ）ヒドラジン水和物と反応させることにより、化合物VIのフタルイミド環を開環して、式VII

の（Ｓ）−５−（アミノメチル）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）オキサゾリジン−２−オン化合物を得るステップ；
ｆ）無水酢酸を用い化合物VIIをアシル化して、対応する式VIII

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｇ）ニトロ化試薬である硝酸及び硫酸を用い化合物VIIIをニトロ化して、式IX

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｈ）（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４，５−ジフルオロ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物IXをモルホリンと反応させて、式Ｘ

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ；
ｉ）式Ｘの（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−５−モルホリノ−２−ニトロフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を還元して、式XI

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミドを得るステップ；
ｊ）（Ｓ）−Ｎ−（（３−（２−アミノ−４−フルオロ−５−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド（化合物XI）を脱アミノ化して、式Ｉ

の（Ｓ）−Ｎ−（（３−（４−フルオロ−３−モルホリノフェニル）−２−オキソオキサゾリジン−５−イル）メチル）アセトアミド化合物を得るステップ
を含む、前記方法。
鏡像異性的に純粋な、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
薬学的に許容される担体、及び請求項１〜６のいずれかに記載のオキサゾリジノン化合物Ｉ又はその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
式Ｉの化合物を、組成物の０．１重量％〜９９重量％の量で含む、請求項９に記載の医薬組成物。
請求項１０に記載の医薬組成物を含む製剤。
１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で式Ｉの化合物を含む、請求項１１に記載の製剤。