JP6316802B2 - エクストリームｐｃｒ - Google Patents

Description

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において広く使用されている技術である。その名称は、その主要な構成要素の１つである、インビトロでの酵素的複製によってＤＮＡ断片を増幅するのに使用されるＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＰＣＲが進行するにつれて、生成したＤＮＡ（アンプリコン）はそれ自身、複製のためのテンプレートとして使用される。それにより連鎖反応が始まり、ＤＮＡテンプレートが指数関数的に増幅する。ＰＣＲを用いれば、ＤＮＡ断片の単一のコピーまたは少数のコピーを数桁を越えて増幅して、数百万またはそれより多くのＤＮＡ断片のコピーを生成することが可能になる。ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および一対のプライマーを用いる。

ＰＣＲは概念的には３つの反応に分けられ、各反応は通常、それぞれ３つの温度で所定期間起こると考えられる。このようなＰＣＲの「平衡パラダイム」は、サイクルごとに３つの温度で３つの期間にわたり起こる３つの反応（変性、アニーリング、および伸長）によって容易に理解される。しかし、この平衡パラダイムは、物理学的な実態とはあまりよく合致しない。即時の温度変化が起こらない、すなわちサンプルの温度を変化させるには時間がかかる。さらに、個々の反応速度が温度に応じて変動し、一度プライマーのアニーリングが起これば、それに続いてポリメラーゼ伸長が即座に起こる。特に迅速ＰＣＲ（ｒａｐｉｄ ＰＣＲ）の場合、反応速度と温度が常に変化するという動力学的パラダイムがより正確である。生成物が変性しプライマーがアニールしさえすれば、ＰＣＲ中に温度を一定に保つことは必ずしも必要ではない。ＰＣＲの動力学的パラダイムのもとでは、生成物の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長は、一時的に重複し、それらの速度は温度に応じて連続的に変動する場合がある。平衡パラダイムのもとでは、サイクルは、それぞれ所定期間保持される３つの温度によって定義されるが、それに対して動力学的パラダイムは、遷移速度と標的温度を必要とする。図１５ａ〜１５ｂに、平衡パラダイムと動力学的パラダイムの例示的な時間／温度プロファイルを示す。しかし、これらの温度プロファイルは単に例示的なものであって、いくつかのＰＣＲの実行においては、必要な温度が２つだけになるようにアニーリング工程と伸長工程とが一緒になっていることが理解される。

パラダイムが正しいか間違っているかということではなく、これらは有用性の点で異なっている。平衡パラダイムは理解が簡単であり、工学的な見方および機器製造に向いている。動力学的パラダイムは、生化学、迅速サイクルＰＣＲ、および融解曲線分析により大きく関連する。

１９８０年代後半にＰＣＲが最初に広まったとき、そのプロセスは遅かった。典型的なプロトコールは、変性は９４℃で１分、アニーリングは５５℃で２分、および伸長は７２℃で３分であった。温度間の遷移時間が含まれる場合、８分のサイクルが典型的であり、その結果、３０サイクルが完了するのに４時間を要した。サイクル時間の２５パーセントが温度遷移に費やされていた。サイクル速度が増加するにつれて、温度遷移に費やされる時間の比率も増加することから、動力学的パラダイムがますます重要となっていった。迅速サイクルＰＣＲ中、通常、温度は変化している。短い生成物（＜１００ｂｐ）の迅速サイクルＰＣＲの場合、時間の１００％が温度遷移に費やされる場合があり、保持時間は必要ではない。より長い生成物の迅速サイクルＰＣＲの場合、温度を最適な伸長温度で保持することを含む場合がある。

用語「迅速ＰＣＲ」は、相対的な場合と曖昧な場合のそれぞれの意味がある。１時間のＰＣＲは、４時間と比べれば迅速であるが、１５分と比べると遅い。さらに、より高いテンプレート濃度で開始したり、またはより少ないサイクルを使用したりすれば、ＰＣＲプロトコールをより短くできる。より具体的な尺度は、各サイクルに必要な時間である。したがって、１９９４年に、「迅速サイクルＰＣＲ」（または「迅速サイクリング」）は、１０〜３０分で完了する３０サイクルと定義され（１）、この場合、それぞれのサイクルは２０〜６０秒になる。これらの各段階間で温度に傾斜をつけるのに時間を要するため、この各サイクルの実際の時間は、多くの場合、変性、アニーリング、および伸長に関してプログラムされた時間の合計よりも長い。１９９０年代初頭における初期の研究で、温度制御にキャピラリーチューブと熱風を使用した迅速サイクリングの実行可能性が確立された。長年かけて、システムはより速くなり、変性、アニーリング、および伸長の動力学的な必要条件がより明確になってきた。

初期の迅速システムの１つにおいて、チャンバー内には、ヘアドライヤーからの加熱要素およびファン、熱電対、ならびにキャピラリーチューブ中のＰＣＲサンプルが同梱されていた（２）。ファンは、熱電対およびキャピラリーを通過する加熱空気の迅速フローを生じさせた。熱電対の熱的応答をサンプルと合致させることにより、温度が変化している間でさえも熱電対の温度を厳密にサンプルの温度に合わせて変化させた。空気の熱伝導率は低いが、キャピラリーによって晒された大きい表面積に対して空気を迅速に移動させることは、変性、アニーリング、および伸長温度間でサンプルをサイクリングさせるのに十分であった。電子制御器により温度をモニターし、加熱要素への出力を調節することにより求められるタイミングとサイクル数が達成された。冷却するために、制御器によりソレノイドを活性化することにより、入口を外気に向かって開いて、別の方法で閉じたチャンバーに冷却空気を導入した。

キャピラリー／空気システムを使用すれば、温度を迅速に変化させることができる。低熱質量チャンバー、循環空気、およびガラスキャピラリー中のサンプルを使用して、わずか１０分のＰＣＲ（各２０秒の３０サイクル）の後に、５００ｂｐより大きいＰＣＲ生成物をエチジウムブロマイドで染色したゲルで可視化した（３）。生成物の収量は、伸長時間とポリメラーゼ濃度の影響を受けた。３０秒サイクル時間（伸長は、７０℃から８０℃の間で約１０秒）の場合、ポリメラーゼ濃度を反応液１０μｌあたり０．１ユニットから０．８ユニットに増加させるにつれてバンドの強度も増加した。ポリメラーゼのユニットの定義は紛らわしいことがあることが知られている。天然型Ｔａｑポリメラーゼの場合、０．４Ｕ／１０μｌは、典型的な迅速サイクリング条件下では約１．５ｎＭである（５０）。

迅速プロトコールで使用される変性温度およびアニーリング温度における保持時間は、瞬時または「０」秒である。すなわち、温度−時間プロファイルは、変性およびアニーリングの際の温度の急激な上昇は示すが最高温度および最低温度の保持は示さない。変性およびアニーリングは、極めて急速に起こる場合がある。

迅速かつ正確な温度制御は、ＰＣＲに必要な温度および時間の分析的研究を可能にする。例示的なヒトゲノムＤＮＡの５３６ｂｐのフラグメント（β−グロビン）の場合、９１℃から９７℃の間の変性温度が、１秒未満から１６秒までの変性時間と同等に有効であった。しかし、実際には１６秒よりも長い変性時間は生成物の収量を減少させることが見出された。プライマーのアニーリングにかかる時間が制限される限りは、５０〜６０℃のアニーリング温度で特異的生成物が優れた収量で得られた。すなわち、変性からアニーリングへの迅速な冷却と１秒未満のアニーリング時間によって最良の特異性が得られた。７５〜７９℃の伸長温度で収量は最大になり、最大約４０秒の伸長時間で増加した。

この初期の研究の結論は以下の通りである。１）ＰＣＲ生成物の変性は極めて迅速であるため、変性温度を保持する必要はない、２）プライマーのアニーリングは極めて急速に起こる場合があるため、アニーリング温度の保持は必要ではない場合がある、および３）必要な伸長時間は、ＰＣＲ生成物の長さとポリメラーゼ濃度によって決まる。また迅速サイクルＰＣＲは、温度を正確に制御しさえすれば、より速いだけでなく、特異性および収量に関してもより優れている（４、５）。ＰＣＲの速度は、利用され得る生化学によって制限されないが、サンプルの温度を厳密にまたは迅速に制御しない機器によっては制限される。

しかし、現行の実験室用ＰＣＲ機器の多くは、瞬時の変性時間およびアニーリング時間に関する性能はあまり高くなく、多くは「０」秒の保持期間のプログラミングすら不可能である。コニカルチューブの壁を介して熱が移動することによる時間遅延、低い表面積対体積の比率、および大きいサンプルの加熱のために、ほとんどの機器は、サンプルが確実に望ましい温度に達するようにするために変性時間およびアニーリング時間の延長に頼らざるを得ない。これらの時間遅延により、時間経過に対する正確な温度が不確定になる。その結果、市販品における再現性は悪く、市販品間でのばらつきが大きい（６）。多くの機器は、温度遷移中に著しい温度の変動を示す（７、８）。温度のアンダーシュートおよび／またはオーバーシュートは、試みられたサンプル体積に依存するソフトウェアでの予測ではほとんど解決しない慢性的な問題である。このような難点は、経時的に変化する場合がある機器の熱的性質によってさらに悪化する。

時間が経って、「薄壁」管における漸進的な改善、サンプル間のより高い伝導熱分布、低熱質量のブロック、および他の「速い」改変により、従来のヒートブロック機器はより速くなりつつある。それにもかかわらず、これらのシステムにとって、６０秒未満でサイクルを完了させる程度に迅速にサイクリングすることはめったにない。ほんの少数のヒートブロックシステムが６０秒未満のサイクルを達成できるが、通常は制限された温度範囲での２温度サイクリングに限定される。サンプル容器を平板化すれば、抵抗加熱と空気冷却によって（９）、または一定温度に維持された加熱ゾーン間をフレキシブルなチューブでサンプルを移動させることによって迅速サイクリングを達成できる（米国特許第６，７０６，６１７号）。

ＰＣＲ用の空気／キャピラリーシステムの商業用バージョンは１９９１年から利用でき（１）、リアルタイムＰＣＲ用のものは１９９６年から利用できるようになった（１０、１１）。他の機器の迅速サイクリング性能は、初めて２０〜６０秒のサイクルを実証した空気／キャピラリーの標準品と比較されることが多い。不思議なことに、長年にわたりキャピラリー／空気システムをより遅く運用する傾向があるが、おそらくこれは、多くの使用者による「０」秒の変性時間およびアニーリング時間への不信感を反映しているのであろう。また熱で活性化される酵素は長い活性化期間も必要とすることから、「速い」活性化酵素が使用されたとしても運転時間も二倍になることが多い。迅速サイクリングからの別の妥協点は、プラスチックキャピラリーの使用である。これらのキャピラリーは機器と熱的に適合していないため、標的温度に達するまで変性およびアニーリング時の２０秒の保持が必要になることが多い（１２）。

マイクロシステムにおいて、ＰＣＲのサイクル時間をさらに減少させるいくつかの進歩が起こっており、この場合、処理される体積は当然ながら小さい（１３、１４）。しかし、高い表面積対体積比を有するサンプルチャンバーを用いたとしても、加熱要素が高い熱質量を有し、チャンバーの外部にある場合、サイクルは長くなる場合がある（１５）。サンプル近傍で薄膜の抵抗加熱器と温度センサーを用いることにより、１０〜３０分の増幅が達成できる（１６、１７）。

低熱質量システムの冷却は、通常、受動的な熱拡散および／または強制空気によってなされるが、いくつかの興味深い加熱方法が開発されている。赤外線放射は、温度のモニタリングのための較正された赤外線高温測定（１９）を用いて加熱に使用できる（１８）。あるいは、ガラスキャピラリー上の薄い金属膜が、迅速サイクリングのための抵抗加熱要素と温度センサーの両方として役立つ場合がある（２０）。最後に、電解質の抵抗によるＰＣＲ溶液の直接のジュール加熱と温度モニタリングが考えられ、キャピラリーで実施もされている（２１）。上記の方法はいずれも、固定されたサンプルに熱を移動させたり、固定されたサンプルから熱を移動させたりするものである。

静止サンプルへの熱伝達、および静止サンプルからの熱伝達の代わりに、異なる温度の槽へ、または固定された温度ゾーンを有するチャネルを介してサンプルを物理的に移動させてもよい。ＰＣＲの流体がチャネル内で変性温度、アニーリング温度、および伸長温度で維持された様々なセグメントを通過するマイクロ流体工学的な方法が普及するようになってきた。連続流型ＰＣＲは、３つの温度ゾーンを行き来する蛇行チャネル内（２２）で、さらに半径が徐々に増加または減少する３つの温度セクターを通過するループ内で実証されている（２３）。蛇行レイアウトを有する改変型は、ＰＣＲの動力学的パラダイムにより厳密に適合させるために、等温ゾーンの代わりに固定された熱勾配を使用している（２４）。ＰＣＲに必要なマイクロチャネルの長さを制限するために、いくつかのシステムは、二方向性の圧力駆動のフロー（２５）、空気力学（２６）、または動電学的な力（２７）によって温度ゾーン間で前後にサンプルを往復させる。直線的なサンプル往復の代わりに、単一の円形のチャネルを、強磁性流体として（２８）、または対流によって（２９）駆動するサンプルの動きと共に使用できる。連続流方式を包含するマイクロシステムＰＣＲの考えられる利点の１つは、サイクル速度である。

いくつかのマイクロシステムはそれでもなお６０秒より長いサイクルを必要とするが、多くは、迅速サイクルＰＣＲの２０〜６０秒のサイクル範囲で稼働する（１３、３０）。赤外線加熱の場合、１６〜３７秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（１８、１９）。金属でコーティングされたキャピラリーは、４０秒のＰＣＲサイクルを達成しており（２０）、一方で直接の電解質加熱は、２１秒のサイクルで増幅した（２０）。閉ループ対流型ＰＣＲの場合、２４〜４２秒の範囲の最小のサイクル時間が報告されている（２９、３１）。いくつかのグループは、ＰＣＲサイクル時間を、１９９０年に最初に実証された迅速サイクルＰＣＲの元の定義よりも速い２０秒未満に短くすることに注目してきた。静止サンプルの薄膜抵抗加熱は、２５μｌのサンプルではサイクル時間を１７秒に短くし（３２）、１００ｎｌのサンプルでは８．５秒に短くした（１７）。連続流システムは、熱勾配ＰＣＲ（２４）とサンプル往復（２６）を用いて１２〜１４秒のサイクルを達成したが、強磁性流体ループにより９秒のサイクルでのＰＣＲが成功したことが主張されている（２８）。ガラス基板およびプラスチック基板による連続流システムは、様々なサイズのＰＣＲ生成物で６．９秒（２２）および５．２秒（２３）のサイクル時間を達成している。アルミニウム基板を介した交互の熱水および冷水の伝導により、油の下で１μｌの液滴を５．２５秒のサイクルで増幅した（３３）。同様に、多孔質の銅ブロックを介した水の伝導により、５μｌのサンプルを４．６秒のサイクルで増幅した（３４）。蒸気圧によって増大した１μｌの反応プラグの連続流デバイスは、３秒のサイクルを達成した（３５）。加えて、ペルチエ素子の間に挟まれたガリウムにキャピラリーを浸漬することによって、キャピラリー中で大腸菌のＳｔｘバクテリオファージの８５ｂｐのフラグメントを２．７秒のサイクルで増幅することを主張する報告がなされている（３６）。あるいは、加圧した熱いガスおよび冷たいガスでサイクリングしたキャピラリーでのＰＣＲ増幅により、２．６秒のサイクルが達成された（４８）。

表１に、最初に「迅速ＰＣＲ」を定義した２０秒のサイクルより短い時間にＰＣＲサイクル時間を最小化するための研究を要約する。過去２０年にわたり、サイクル速度をさらに向上させた新しいプロトタイプ機器が開発されてきた。しかし、実用的なＰＣＲ性能（効率および収量）が不十分であることが多い。一般的な原則として、サイクルが短くなればなるほど、ＰＣＲの成功に求められることは、より高い開始濃度で使用される標的（細菌、ファージ、多コピープラスミド、またはさらにはＰＣＲ生成物）の複雑度がどれだけ低いかに関わってくる（例えば、初発サンプルとして５ｎｇのアンプリコンが使用された米国特許第６，２１０，８８２号を参照）。実際に、表１で列挙した研究のうち、２０秒未満のサイクルで例えばヒトＤＮＡなどの複雑な真核ＤＮＡを使用したものは皆無である。成功が求められる前にほとんど増幅しなくてもいいように、初発のテンプレート分子のコピー数が極めて高いことが多い（例えば、１μｌあたり１８０，０００，０００のλファージのコピー）。さらに、多くの研究において、特に高いテンプレート濃度を用いた環境での肯定的な結果の有効性に関して、テンプレート非含有対照がないことが疑問視されることもない。ある機器に注目した報告は、熱的サイクリングデバイスの設計およびモデリングについて広範に調べており、最後の短時間ＰＣＲの実証では、高濃度の複雑度が低い標的を使用している。ＰＣＲサンプル非存在下でのモデリングおよび測定に基づいて、加熱速度および冷却速度（最大１７５℃／秒）が報告されている（１７）。

サイクル時間を短くする方法の１つは、温度サイクリングの必要条件を簡易化するためにＰＣＲプロトコールにバリエーションを導入することである。より長いプライマーはより高いＴｍを有するため、アニーリング温度が高くなる場合がある。生成物の長さとそのＴｍを制限することによって、生成物のＴｍをわずかに超えた温度まで変性温度を低くできる。より高いアニーリング温度とより低い変性温度とを組み合わせることにより、増幅の成功に必要な温度範囲を減少させる。また３工程サイクリング（変性、アニーリング、および伸長）を２工程（変性および併合されたアニール／伸長工程）に減らすことも、温度サイクリングの必要条件を簡易化する。温度範囲の減少と２工程サイクリングはいずれも、表１に記載された２０秒未満のサイクル時間を用いた研究において典型的である。しかし、併合されたアニール／伸長工程が、７０℃よりも低い温度から、ポリメラーゼが最も活性化する最適な８０℃までの温度で行われる場合、２工程サイクリングはポリメラーゼ伸長速度を遅くする場合がある。ポリメラーゼ伸長速度は、約７０〜８０℃までの温度では対数線形を示し、６０〜１２０ｂｐ／秒の最大値が報告されている（５０）。

プロトコールのバリエーションを用いたとしても、サイクル時間が２０秒未満である場合、対照反応と比較して、増幅効率および収量は不十分であることが多い（２２、２３）。これらのより速いＰＣＲに向けられた努力は工学面に偏りすぎているようであり、生化学面はほとんど注目されていない。サイクル時間が２０秒から２秒に短くなるにつれて、ＰＣＲ収量は減少し、最終的には収量ゼロになるが、これは、単純な標的を高コピー数で用いた場合でさえもロバスト性が欠如することを反映している。

表１で開示された様々な参考文献に記載の機器は、反応条件が合えば極めて速いＰＣＲに適している場合がある。本明細書において開示されたように、プライマー、ポリメラーゼ、およびＭｇ＋＋の濃度を高めることに注目することにより、反応ロバスト性と収量を保持しつつ「エクストリームＰＣＲ（ｅｘｔｒｅｍｅ ＰＣＲ）」（２０秒未満のサイクル（１０分未満で３０サイクル）のＰＣＲ）が実現化される。

本発明の一態様において、増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法が提供され、本方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、該プライマーがそれぞれ、少なくとも２μＭの濃度で提供される工程と、エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが１サイクルあたり２０秒未満で完了する工程とを含む。

本発明の他の態様において、増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法が提供され、該方法は、熱安定性ポリメラーゼおよび標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーを生体サンプルに添加する工程であって、該ポリメラーゼとプライマーの比率は、（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、該ポリメラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである工程と、エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが２０秒未満で完了する工程とを含む。

本発明のさらに他の態様において、ＰＣＲを行うためのデバイスが提供され、該デバイスは、ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、サンプルを加熱する手段と、サンプルを冷却する手段と、サンプルを加熱する手段およびサンプルを冷却する手段にサンプル容器を繰り返し晒して、サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で熱的にサイクリングするための制御手段とを含む。

さらなる一実施形態において、標的核酸でＰＣＲを行うためのキットが提供され、該キットは、ｄＮＴＰと、少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含む。

以下に記載された、現在認識される本発明を実行するにあたり最良の形態を例示した好ましい実施形態の詳細な説明を考察すれば、本発明の追加の特徴が当業者に明らかになるであろう。

エクストリームＰＣＲを行うための略図である。 水槽中の１つのサンプルチューブをモニタリングするためのリアルタイム機能を有するエクストリームＰＣＲを行うための例示的なデバイスを示す図である。 ３温度サイクリングを用いた例示的なエクストリームＰＣＲを行うためのデバイスを示す図である。 温度参照キャピラリーを共に示した図１ｂにおけるデバイスの光学素子の拡大図である。 図１ｂのサンプルホルダーの位置（点線）にサンプル温度（直線）を重ね合わせたグラフである。 図１ｂに示したデバイスを使用したエクストリームＰＣＲの温度を示したグラフである。 図２ｂとの比較のために示された回転式のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用した迅速サイクルＰＣＲの温度を示したグラフである。 図２ｂの温度プロファイルを使用して増幅した、エクストリームＰＣＲ生成物（点線）および迅速サイクルＰＣＲ生成物（二点鎖線）の微分融解曲線をエクストリームサイクリングの陰性対照（直線）および迅速サイクリングの陰性対照（一点鎖線）と共に示すグラフである。 図３ａの同じサンプルの２％ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロースゲルの写真であり、レーン１および８はサイズマーカーであり、レーン２および３は３０秒のエクストリームＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン４は３０秒のエクストリームＰＣＲのテンプレート非含有対照であり、レーン５および６は１２分のＰＣＲの結果得られた生成物であり、レーン７は１２分のＰＣＲのテンプレート非含有対照である。 図３ａおよび３ｂで示されたのと同じ生成物を増幅したエクストリームＰＣＲの温度の軌跡（点線）を、同じ反応のリアルタイムモニタリング（直線）と共に示すグラフである。 温度制御により伸長速度を増加させたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。 図１ｂのサンプルホルダーの位置（直線）にサンプル温度（点線）を重ね合わせた、図４ａの部分拡大図である。 ＩＲＬ１０ＲＢの５８ｂｐのアンプリコンの負の微分融解曲線（−ｄＦ／ｄＴ）を示すグラフであり、ＡＡ（直線）、ＡＧ（一点鎖線）、およびＧＧ（点線）の遺伝子型が示される。 エクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。 図５ａで使用されたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。 図５ａからの４μＭのＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（ＫＴ ＰＯＬ）生成物の負の微分融解曲線を示すグラフである。 図５ａに基づき１０μＭのプライマー濃度で様々なポリメラーゼ濃度を使用したエクストリームＰＣＲの結果を示すアガロースゲルの写真である。 １９ゲージのステンレス鋼チューブ中で行われたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。 図６ａのエクストリーム温度サイクルによって生産されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。 長い（１秒の）併合されたアニール／伸長工程を用いたエクストリームＰＣＲの温度の軌跡を示すグラフである。 １０２ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。 １秒の併合されたアニール／伸長工程を使用して２２６ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。 ４秒の併合されたアニール／伸長工程を使用して４２８ｂｐの生成物を増幅するのに使用されるエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示すグラフである。 図８ａから得られたリアルタイムの結果と、２秒のアニール／伸長工程を使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。 図８ｂから得られたリアルタイムの結果と、５秒のアニール／伸長工程を使用した類似の温度の軌跡を示すグラフであり、それぞれテンプレート非含有対照を包含する。 異なる開始濃度でのＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントの増幅曲線を示すグラフである。 図９ａからのデータのＣｑ対ｌｏｇ_１０（最初のテンプレートのコピー数）のプロットである。反応は５連で行われた。 ＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントの増幅が示されていることを除いては図９ａ〜９ｂと同様のグラフである。 ３００ｂｐの生成物にエクストリームＰＣＲを使用して（２０サイクル、１サイクルあたり４．９秒）、ポリメラーゼ濃度対プライマー濃度対ＰＣＲ生成物濃度をプロットした３次元グラフである。 ＫＡＰＡ２Ｇ ＦＡＳＴポリメラーゼおよび１〜５秒の伸長時間を使用した５００ｂｐの合成テンプレートのＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 数種のＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ濃度およびＫＡＰＡ２Ｇ ＦＡＳＴポリメラーゼに関する伸長した長さ対最小の伸長時間のプロットである。 １００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 ２００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 ３００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 ４００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 ５００ｂｐのサイズを有する生成物のＰＣＲ増幅に関する蛍光対サイクル数のプロットである。 様々なマグネシウム濃度を使用したエクストリームＰＣＲの３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。 図１２ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。 ５ｍＭのＭｇ^＋＋と共に様々なサイクル時間を使用した３５サイクル後における、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。サイクル時間は、０．３２秒（直線）、０．４２秒（二点鎖線）、０．５２秒（一点鎖線）、および０．６２秒（点線）であった。サイクル時間には、６０°の槽中での０．１〜０．４秒の保持時間が包含される。 図１３ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。 ３種の異なる機器：（１）エクストリームＰＣＲ、（２）ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、および（３）ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）で増幅した場合の、ＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントの負の微分融解曲線を示すグラフである。 図１４ａの負の微分融解曲線で示されたＰＣＲ生成物のゲルの写真である。 ＰＣＲの平衡パラダイム（図１５ａ）および動力学的パラダイム（図１５ｂ）に関する例示的なプロファイルを示すグラフである。黒く塗り潰された部分は、熱的サイクリング中の核酸の変性を示し、斜線部分はアニーリングを示し、白一色の部分は伸長を示す。

本明細書で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味し、状況が不適切でない限り複数形を包含するものと定義される。範囲は、本明細書では、「およその」１つの特定の値から、および／または「およその」別の特定の値までと表される場合がある。用語「約」は、本明細書では、およそ、ほぼ、だいたい、または概ねを意味するものとして使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、「約」は、明示された数値よりも上および下に境界を広げることによりその範囲を修正する。一般的に、用語「約」は、本明細書では、述べられている値よりも５％の偏差で上および下に数値を修正するために使用される。このような範囲が示される場合、他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、接頭語「約」の使用によって値が近似値として示される場合、特定の値により他の実施形態が形成されるものと理解されよう。さらに、それぞれの範囲の端点は、他方の端点と関連して、かつ他方の端点とは独立してどちらも有意であることが理解されよう。

単語「または」は、本明細書で使用される場合、具体的に列挙されたもののうちいずれか１つのものを意味し、さらにその列挙されたもののいずれかの組み合わせも包含する。

「サンプル」は、動物；動物からの組織または臓器；細胞（対象内の細胞、対象から直接採取した細胞、または培養物中で維持された細胞もしくは培養細胞株からの細胞のいずれか）；細胞溶解産物（または溶解産物画分）または細胞抽出物；細胞、細胞材料、またはウイルス材料から誘導された１種または複数の分子（例えばポリペプチドまたは核酸）を含有する溶液；または本明細書で説明されているようなアッセイされる天然に存在する核酸もしくは天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味する。またサンプルは、細胞、細胞成分、または核酸を含有する任意の体液または排出物（例えば、これらに限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁など）であってもよい。

語句「核酸」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する、または合成のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを指し、これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスかどうかにかかわらず、ワトソン−クリック塩基対形成によって相補的核酸にハイブリダイズ可能なものである。また本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ、ｄＵＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ）、およびヌクレオシド間の非ホスホジエステル結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を包含していてもよい。特に、核酸としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」は、相補配列を含有する第二のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（「標的」）と塩基対を形成できる限定された配列の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。その結果得られたハイブリッドの安定性は、長さ、ＧＣ含量、最隣接のスタッキングエネルギー、および発生する塩基対形成の程度によって決まる。塩基対形成の程度は、例えばプローブと標的分子との相補性の程度などのパラメーター、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度の影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、例えば温度、塩濃度、および例えばホルムアミドなどの有機分子の濃度といったパラメーターの影響を受け、当業者に公知の方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法で、放射性標識、蛍光標識、または非放射性標識のいずれかによって検出できるように標識されていてもよい。ｄｓＤＮＡ結合色素（二本鎖ＤＮＡに結合すると、一本鎖ＤＮＡに結合するかまたは溶液中で遊離状態である場合よりも強い蛍光を発する色素）を使用して、ｄｓＤＮＡを検出することができる。「プライマー」は、ポリメラーゼによって伸長するように特異的に構成されるが、それに対して「プローブ」または「オリゴヌクレオチド」は、そのように構成されていてもよいし、または構成されなくてもよいことが理解されている。

「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高いストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸（例えばサンプル核酸）を認識し物理的に相互作用して（すなわち塩基対を形成して）、他の核酸とは実質的に塩基対を形成しないことを意味する。

「高いストリンジェンシー条件」は、６５℃の温度で、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）を含有する緩衝液中で、または４２℃の温度で、４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で、長さが少なくとも４０ヌクレオチドのＤＮＡプローブを使用した結果起こるハイブリダイゼーションと同等のハイブリダイゼーションが起こる条件を意味する。例えばＰＣＲ、ノーザン、サザン、またはインサイチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定などの高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションのための他の条件は、分子生物学分野の当業者にとって周知である（４７）。

例示的な実施形態において、２０秒未満のサイクル時間を用いたＰＣＲ、いくつかの実施形態では１０秒未満、５秒未満、２秒未満、１秒未満、および０．５秒未満のサイクル時間を使用したＰＣＲのための方法およびキットが提供される。これらのサイクル時間を用いれば、３０サイクルのＰＣＲは、それぞれ１０分未満、５分未満、２．５分未満、１分未満、３０秒未満、および１５秒未満で完了する。ＰＣＲ速度が速くなればなるほど、プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とが増加することによりＰＣＲ効率および収量が維持される。

ＰＣＲの３要素反応（プライマーのアニーリング、ポリメラーゼ伸長、およびテンプレート変性）のどれが不十分になっても、ＰＣＲの効率および収量が制限される場合がある。例えば、プライマーがテンプレートの９５％にしかアニールしない場合、たとえそのテンプレートの１００％が変性してプライマーが結合したテンプレートの１００％が伸長して全長生成物になったとしても、ＰＣＲ効率が９５％よりも大きくなることはできない。同様に、伸長効率がわずか９５％である場合も、可能な最大のＰＣＲ効率は９５％でしかない。ＰＣＲ生成物濃度をサイクルごとに２倍にするためには、全ての要素が、１００％の達成率を得なければならない。以降の段落で、変性、アニーリング、および伸長を順次考察する。

遅いＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）、迅速ＰＣＲ（２０〜６０秒のサイクル）、およびエクストリームＰＣＲ（２０秒未満のサイクル）の温度サイクリングにおいて、ＰＣＲの失敗に関する一般的な原因は、不十分な変性である。目標は、各サイクルでの変性を完全に行い、プライマーのアニーリングで定量的なテンプレートが利用できるようにすることである。ＰＣＲ前の最初のテンプレートの変性、特にゲノムＤＮＡの変性は通常、ＰＣＲ中の増幅生成物の変性よりもより厳しい条件を必要とする。元の迅速サイクルＰＣＲの最適化（４）は、テンプレートを沸騰させた後に行われているが、これは、最初のゲノムＤＮＡを確実に変性させる優れた方法である。不完全な最初の変性は、高いＴｍを有する標的、特に高い安定性のフランキング領域を有する標的の場合に起こる場合がある（３７）。そのために、特に、変性中のわずかな温度差がＰＣＲ効率に影響を与える場合、例えばゲノムの挿入または欠失に関して、定量的ＰＣＲの性能が損なわれる場合がある（３７〜３９）。先に行われた沸騰または制限消化（３７）が望ましくなく、より高い変性温度がポリメラーゼ性能を損なう場合、生成物のＴｍを下げるアジュバントを使用して変性を補助してもよい。

変性のための初期設定の標的温度として９４℃が使用されることが多いが、それが最適であることはめったにない。ＰＣＲ生成物は、主にＧＣ含量と長さに応じて４０℃より高い温度範囲で融解する（４３）。ＰＣＲ生成物が、より低い変性温度が使用できるように十分低い温度で融解する場合、低い変性標的温度は、速度の利点と特異性の利点の両方を有する。変性温度が低ければ低いほど、サンプルはより速く変性温度に到達でき、より速くＰＣＲを行うことができる。より高い変性温度で発生し得る生成物は二本鎖のままであり、プライマーのアニーリングに利用できないと予想されるため、これらの発生し得る全ての生成物を排除することによりさらに特異性が高められる。高いＴｍの生成物を増幅するために、標的温度を９４℃より高くする必要がある場合がある。しかし、現行の熱安定性ポリメラーゼのほとんどは９７℃より高温で変性し始め、ＰＣＲ溶液は標高に応じて９５℃から１００℃の間で沸騰する場合があるため、温度を高める余地がさほどない。１価の塩およびＭｇ^＋＋濃度を低くすると、生成物のＴｍが下がる。同様に、ｄＵＴＰおよび／または７−デアザ−ｄＧＴＰを取り込むことによっても生成物のＴｍは下がるが、ポリメラーゼ伸長速度を減少させる場合がある。ほとんどの独自のＰＣＲの「エンハンサー」は、生成物のＴｍを下げて高いＴｍの生成物の変性（および増幅）を可能にする単純な有機物質である。これらのなかでも最も一般的に普及しているものは、ＤＭＳＯ、ベタイン、グリセロール、エチレングリコール、およびホルムアミドである。Ｔｍを下げることに加えて、これらの添加剤のうちいくつかは、ＰＣＲ混合物の沸点も上昇させる（特に高い標高で有用である）。エンハンサー濃度が増加するにつれ、生成物のＴｍは下がるが、ポリメラーゼ阻害が増加する場合がある。

しかし、エクストリームサイクリング条件下であっても変性が律速である必要はない。なぜなら、温度が生成物のＴｍからわずかしか上回っていなくても、ＤＮＡの巻き戻しが最初に極めて速く起こる（１０〜１００ミリ秒）ためである。変性は、増幅生成物のＴｍよりも測定が困難な２〜３℃高い温度で迅速に起こるが、アンプリコンの完全な変性はおそらく０．１秒未満で起こる。複数のドメインで生成物が融解する場合、標的の変性温度は、最も高い融解ドメインよりも２〜３℃高いと予想される。サンプルがこの温度に到達する限りは、長い生成物であったとしても変性は極めて速い。キャピラリーおよび水槽を使用すれば（４０）、２０ｋＢを超えるＰＣＲ生成物の完全な変性が１秒未満で起こる（５２）。生成物のＴｍおよび融解ドメインは、例示的には、ＤＮＡ色素および高解像度融解を用いて実験的に決定される（４１）。Ｔｍの推測はソフトウェアでの予測により達成できるが（４２）、その精度は限定的である。さらに、観察されたＴｍは、例えば塩濃度および任意の色素やアジュバントの存在などの局所的な反応条件に強く依存する。したがって、観察されたＴｍは通常、より反応条件に適合されている。

効率への影響がなければ、変性への接近速度は、可能な限り速くてもよく、例えば図２ａおよび図６ａで示されるように２００〜４００℃／秒であってもよい。これらの速度では、変性温度に到達するのに約０．１〜０．２秒しか要さない。しかし、標的温度に接近するときのより遅い速度は、標的温度を上回る危険を減少させ、起こり得るポリメラーゼの不活性化または溶液の沸騰を回避する。より遅い接近温度を達成する例示的な方法の１つは、標的温度よりも５〜１０℃高い温度の高温槽にサンプルを浸すことである。標的と槽温度との温度差により指数関数的な接近曲線が定められ、差が小さくなるにつれてこの接近曲線は自動的に遅くなる。温度を連続的にモニタリングすることによって、変性の目標が達成されたら次の相（アニーリングまで冷却すること）が始動する。まとめると、ＰＣＲにおける完全な生成物の変性は、生成物の最も高い融解ドメイン温度よりも２〜３℃高い温度で０．２秒未満を必要とし、可能な限り迅速に、例示的には４０〜４００℃／秒で変性温度に接近し得る。変性は最初に起こるため、その速度は生成物の濃度にのみ依存し、効率（または変性される生成物のパーセンテージ）は生成物の濃度とは無関係である。

低品質のＰＣＲでは、不完全なかつ／または間違ったプライマーのアニーリングが生じる場合がある。全てのテンプレート部位にプライマーが結合しない場合に、効率が低くなる。さらに、望ましくない部位でプライマー結合が起こる場合、別の生成物が生産される場合がある。目標は、実質的に、各サイクルで望ましい部位でのみ完全なプライマーのアニーリングを達成し、ポリメラーゼ伸長のために定量的なプライマーが結合したテンプレートを提供することである。

２０〜６０秒のサイクルを用いた迅速ＰＣＲプロトコールは、５００ｎＭのプライマーのＴｍよりも５℃低い温度で１秒未満のアニーリング時間を提唱している（５２）。２０秒未満のサイクルを試みた機器の場合のプライマー濃度は、それぞれ２００〜１，０００ｎＭの範囲である（表１）。これらの濃度は、長いアニーリング時間が使用される従来のＰＣＲ（６０秒未満のサイクル）で使用される濃度に類似している。プライマー濃度を低くすることは、特異性を向上させるために使用されることが多く、プライマー濃度を増加させることは、非特異的増幅に関する懸念のために考慮されることはまれである。しかし、迅速サイクリングを用いる場合、特異性の向上はより短いアニーリング時間に起因している（５）。この傾向が継続すれば、エクストリームＰＣＲの極めて短いアニーリング時間は、高いプライマー濃度を容認するものと想像できる。アニーリングを促進するために、２０〜６０秒のサイクルの場合、プライマーのＴｍよりも５℃低いアニーリング温度が推奨される。Ｔｍは、増幅で使用されるのと同じ緩衝液条件下で飽和させたＤＮＡ色素およびオリゴヌクレオチドを使用した融解分析によって最もよく実験的に測定される。プライマーを、ダングリング末端（ｄａｎｇｌｉｎｇ ｅｎｄ）として５’−伸長部分を有するその相補標的と組み合わせることにより、そのテンプレートにアニールしたプライマーの安定性を最適に概算し、融解分析が行われる。

変性と対照的に、アニーリング効率はプライマー濃度に依存する。プライマーのアニーリングは、極めて速いサイクル速度で制限的になる場合がある。プライマーのアニーリングは、２番目に起こる反応であり、プライマー濃度と標的濃度の両方に依存する。しかし、多くのＰＣＲにおいて、プライマー濃度は標的濃度よりもかなり高く、実際的にはアニーリングは擬似的に最初に起こり、プライマー濃度にのみ依存する。このケースにおいて、プライマーが結合した生成物の比率（アニーリング効率）は、プライマー濃度にのみ依存して生成物濃度には依存しないことから、より高いプライマー濃度は、より短いアニーリング時間を可能にすると予想される。さらに、理論にとらわれずにいえば、その関係は直線的であると考えられる。アニーリング時間がより短くなればなるほど、ＰＣＲの効率および収量を維持するためにはプライマー濃度の増加が必要になる。例えば、迅速サイクリングは、プライマーのＴｍよりも５℃低い温度で約１〜３秒のアニーリングを可能にする（３）。エクストリームＰＣＲにおいて、このアニーリング時間（Ｔｍ−５℃、またはそれより低い温度で）を１０倍短くする場合、プライマー濃度を１０倍増加させれば類似のプライマー結合効率が期待される。有効なアニーリング時間が次第に短くなるにつれて、プライマー濃度もほぼ同じ倍率で次第に高くなるべきである。典型的な迅速ＰＣＲプロトコールは、５００ｎＭの各プライマーを使用する。エクストリームＰＣＲにおいてアニーリング時間が３倍から４０倍短くなると、同じプライマー結合効率を得るのに必要なプライマー濃度は、各プライマーで１，５００〜２０，０００ｎＭである。これは、プライマーの合計で３，０００〜４０，０００ｎＭと同等であり、表１に記載されたいずれのプライマー濃度よりも高い。これは、先に行われた試みで２０秒未満のサイクリングでの効率が不十分であることの理由の１つは、不十分なプライマー濃度の後に起こる不十分なアニーリング効率であることを示唆している。エクストリームＰＣＲでは、プライマー濃度をそれぞれ１．５〜２０μＭに増加させることにより、０．０５〜０．３秒のアニーリング時間にもかかわらず優れたアニーリング効率を達成している。増加させたプライマー濃度を使用すれば、アニーリング時間の短縮を相殺して同じアニーリング効率を達成することが可能なため、さらにより短いアニーリング時間でさらにより高いプライマー濃度を考慮できる。市販されているほとんどの機器は少なくとも１秒の保持時間を必要とし、わずかな機器が「０」秒の保持時間を許容することが知られているが、わずかな秒の保持時間を許容する市販の機器はない。エクストリームＰＣＲのいくつかの実例について、０．１秒または０．０１秒きざみの保持時間が望ましい場合がある。

効率を犠牲にすることなくアニーリング速度を増加させアニーリング時間を短くする別の方法は、Ｍｇ^＋＋濃度を増加させることである。アニーリング速度は、イオン強度の増加に伴い増加し、プライマーのアニーリングを包含するハイブリダイゼーション速度を増加させるには２価カチオンが特に有効であることが当分野において知られている。

例示的には、アニーリングの標的温度への接近速度は、可能な限り速くてもよい。例えば、２００〜８００℃／秒で（図２ａおよび図６ａ）、０．０５〜０．２秒でアニーリング温度に到達することが可能である。また迅速な冷却も、全長生成物の再ハイブリダイゼーションを最小化する。冷却中に二重鎖増幅生成物が形成される程度になると、プライマーは二重鎖生成物にアニールできないため、ＰＣＲ効率は低下する。これはＰＣＲ初期ではめったに起こらないが、生成物濃度が増加するにつれて、冷却中に二重鎖がますます形成されるようになる。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩを用いた連続的なモニタリングから、このような生成物の再アニーリングが、ＰＣＲがプラトーになる主な原因である場合があることが示唆される（４４）。

ポリメラーゼ伸長も時間を必要とし、伸長時間が短い場合にＰＣＲ効率を限定する場合がある。より長い生成物は、ＰＣＲ中により長い伸長時間を必要とすることが知られており、推定上全ての生成物の伸長を完了させるために、ＰＣＲの最後に数分の最終的な伸長が付け足されることが多い。長い生成物のための通常のアプローチは、伸長にかかる時間を長くすることである。プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長が同じ温度で行われる２工程サイクリングのいくつかのケースと同様に、より低い伸長温度を使用することにより必要な時間がさらに長くなる。

最適なＰＣＲ効率のためには、各サイクルにおけるプライマーが結合したテンプレートの実質的に完全な伸長が必要である。ほとんどのポリメラーゼ伸長速度は、温度に伴い所定の最大値まで増加する。Ｔａｑポリメラーゼの場合、最大値は７５〜８０℃で約１００ヌクレオチド／秒であり、温度が１０℃低下するごとに約４倍減少する（５０）。５３６ｂｐのベータグロビン生成物の場合、迅速サイクルＰＣＲでは７６℃が最適であることが見出された（４）。近年、商業的な要求に応じて、全体のＰＣＲ時間を短くできるより速いポリメラーゼが導入されつつあり、これは、このようなポリメラーゼが、より長い生成物のための伸長保持時間を不要にするかまたは短くできることを示唆している。

より速いポリメラーゼ伸長速度の代替策またはそれを補強する策として、ポリメラーゼ濃度を増加させると必要な伸長時間が短くなることが発見された。５００ｎＭの各プライマーと共に、ＰＣＲにおいて標準的なＴａｑポリメラーゼ濃度（０．０４Ｕ／μｌ）または１．５ｎＭ（４９）を使用すると仮定すれば、各プライマーがテンプレートに結合する場合、一度にテンプレートの０．１５％が伸長する程度のポリメラーゼしか存在していないため、新しいプライマーが結合したテンプレート全てを伸長させるためにはポリメラーゼをそれらに何度も再利用することが必要となる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、プライマーが結合した有効なテンプレートのより多くが一度に伸長され、テンプレート全てを伸長させるのに必要な時間を短くするが、これはおそらく、より速い伸長速度によるのではなく、いずれの時点においてもプライマーが結合したテンプレートのより高い比率を伸長することによるものと予想される。

一次近似によれば、小さいＰＣＲ生成物の場合（１００ｂｐ未満）、必要な重合時間は、酵素の重合速度（それ自身が温度の関数である）およびポリメラーゼ濃度に正比例するようである。また必要な時間は、伸長させようとするテンプレートの長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さ）に反比例する。ポリメラーゼ活性を、ＰＣＲにおいて標準的な活性である０．０４Ｕ／μｌの２０〜３００倍に増加させることにより、２０秒未満のサイクルを用いたエクストリームＰＣＲは、特異的生成物の高い収量を達成できる。すなわち、０．８〜１２Ｕ／μｌ（１〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）の活性は、０．１〜１．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いた２工程のエクストリームＰＣＲを可能にする。これまでに使用された最大のポリメラーゼ活性は、０．５Ｕ／μｌであった（表１）。エクストリームＰＣＲの実例で使用される２工程ＰＣＲの場合、７０〜７５℃での併合されたアニール／伸長工程がより速い重合速度にとって有利である。さらに、２工程ＰＣＲは温度サイクリングを簡易化するため、エクストリームサイクリング（２０秒未満のサイクル）の実例では典型的には２工程ＰＣＲが使用され、迅速なアニーリングと迅速な伸長の両方が、併合されたアニール／伸長工程の間に起こらなければならない。それゆえに、実例では増加させたプライマー濃度と増加させたポリメラーゼ濃度の両方が使用され、その結果として、エクストリーム２温度サイクリング下でロバストなＰＣＲがもたらされる。例示的には、以下に記載される実施例で例示されるように、５０〜７５℃で０．０５〜５．０秒の併合されたアニール／伸長時間を用いる場合、それぞれ１．５〜２０μＭのプライマー濃度と、任意の標準的なポリメラーゼの０．４〜１２Ｕ／μｌのポリメラーゼ濃度（０．５〜１６μＭのＫｌｅｎＴａｑ）とが必要である。アニーリングおよび伸長の両方に対して１つのＰＣＲサイクリングセグメントしかないため、エクストリームＰＣＲ条件は、例示的にはプライマー濃度とポリメラーゼ濃度の両方を増加させることによって両方のプロセスを強化することを必要とする。

また、エクストリーム３温度サイクリングも想定され、その場合、アニーリング工程および伸長工程は異なる温度で別々に維持される。このケースにおいて、アニーリング工程および伸長工程に配分される時間を個々に制御して、具体的な要求に合わせることが可能である。例えば、アニーリング時間のみが短く（０．０５〜０．２秒）伸長時間が比較的長く維持される場合（例示的には１、２、５、１０または１５秒）、効率的なＰＣＲのためにはプライマー濃度だけを増加させればよい。あるいは、伸長時間は短いが（７０〜８０℃の範囲内で１秒未満）、アニーリング時間は長い場合、効率的なＰＣＲを達成するためにはポリメラーゼ濃度だけを増加させればよいと考えられる。効率的なＰＣＲとは、例示的には少なくとも７０％の効率、より例示的には少なくとも８０％の効率、さらには少なくとも９０％もの効率を有するものと理解される。

１００ｂｐよりも長い生成物の場合、エクストリームＰＣＲを使用した効率的な伸長は、高いポリメラーゼ濃度と増加させた伸長時間との組み合わせを必要とする場合がある。ポリメラーゼが過量に存在する場合、例示的には、最小の時間は、塩基の伸長の長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さと定義される）を塩基／秒単位のポリメラーゼ伸長速度で割った値であるはずである。しかし、これまで述べてきたように、ポリメラーゼが飽和しているのは通常、テンプレート濃度がポリメラーゼ濃度よりも大きくなる前、ＰＣＲの開始時のみである。サイクル時間を短くする方法の１つは、ポリメラーゼの最大温度近傍、典型的には７０〜８０℃で、２温度ＰＣＲを使用することである。必要な伸長時間は、リアルタイムＰＣＲを使用して定量サイクル、すなわちＣｑをモニタリングすることによって実験的に決定できる。例えば、７５℃で１００塩基／秒のポリメラーゼ伸長速度では、ポリメラーゼ濃度が過量である場合、２００ｂｐの生成物は、約２秒を要すると予想される。同様に、４００ｂｐの生成物は、これと同じポリメラーゼを使用した場合、その濃度が、伸長されるテンプレートの濃度よりも高い限りは約４秒を要すると予想される。ポリメラーゼが過量ではない場合、より多くのポリメラーゼを添加することによって、より多くのテンプレートが同時に伸長されて、ポリメラーゼ濃度に比例して必要な伸長時間を短くすることが可能になる。

任意のＤＮＡ分析方法の有用性は、どれだけ速く行うことができるか、どれだけ多くの情報が得られるか、およびどの程度難しいかによって決まる。従来のクローニング技術と比較して、ＰＣＲは速くかつ簡単である。迅速サイクルＰＣＲおよびエクストリームＰＣＲは、必要な時間の連続的な短縮に重点を置いている。リアルタイムＰＣＲは、各サイクルでデータを得ることにより情報量を増加させる。ＰＣＲ中またはＰＣＲ後に融解分析を行って、温度を増加させながらＤＮＡハイブリダイゼーションを連続的にモニターできる。

ＰＣＲの平衡パラダイムおよび動力学的パラダイムに戻るって考えると（図１５ａ〜１５ｂ）、１００ｂｐ未満の生成物のエクストリームＰＣＲは、動力学的モデルがよく当てはまることが実証されている。温度は常に変化しており、変性、アニーリング、および伸長の速度は温度依存性であることから、ＰＣＲの適切な評価は、温度全域にわたる各要素の反応速度を統合することでしか得られない。１００ｂｐより大きい生成物の場合、より長い伸長時間を要する場合があり、反応速度論モデルと平衡モデルのどちらの要素でも適切である。

本明細書に記載の少なくとも１つの実施形態に従って反応条件が構成される場合、いくつかの実施形態に関して例示すれば、２秒未満のサイクル時間を用いて、完全な増幅のために１分未満で、極めて速い速度でＰＣＲを行うことができることが発見された。例示的には、このエクストリームＰＣＲに、増加させたポリメラーゼ濃度とプライマー濃度との様々な組み合わせが使用される。いずれの特定の理論にとらわれずにいえば、過剰な濃度のプライマーは、概して完全なプライマーのアニーリングを可能にし、それによってＰＣＲ効率を増加させると考えられる。同様にいずれの特定の理論にとらわれずにいえば、ポリメラーゼ濃度を増加させることによっても、より完全な伸長がもたらされるためにＰＣＲ効率が向上すると考えられる。ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、アニールしたプライマーへの結合が促進され、さらに完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合でも再結合が促進される。以下に記載の実施例で、複雑な真核生物ゲノムＤＮＡを用いて開始した場合でもエクストリームＰＣＲが成功したことを示す。

以下に記載される実施例ではＫｌｅｎＴａｑを使用したが、類似の活性を有する任意の熱安定性ポリメラーゼが、ポリメラーゼ伸長速度を考慮した類似の方式でエクストリームＰＣＲで性能を発揮すると考えられる。本明細書で提示されたように、例示的には酵素の活性化率（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｅ）の差で調節することにより濃度を増加させて使用した場合、エクストリームＰＣＲを可能にすると予想されるポリメラーゼの市販の調製物としては、例えば、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ、Ｋａｐａ２Ｇ ＦＡＳＴ、ＫＯＤ Ｐｈｕｓｉｏｎ、天然のまたはクローニングしたサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ、ＧｏＴａｑ、およびＦａｓｔ Ｓｔａｒｔが挙げられる。

２秒のサイクル時間を可能にする現行の市販のＰＣＲ機器はないため、システム４を組み立てて、エクストリームＰＣＲの構想の証明試験を行った。しかし、システム４は例示的なものであり、迅速に熱サイクリング可能な他のシステムも本開示の範囲内であることが理解される。図１ａで示されるように、９５．５℃（本発明の実施例が行われた場所であるユタ州ソルトレイクシティでの沸騰水の温度）の高温の水槽１０、および３０〜６０℃の低温の水槽１４を使用して、サンプル容器２０中に入れられた１〜５μｌのサンプルの温度を変化させる。例示的な水槽１０、１４は４．５クォートのステンレス鋼製ドレッシング用ジャー（Ｌａｂ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｕｐｐｌｙ、番号４１６３４）であるが、いくつかの実施例では５００ｍｌのガラスビーカーを使用して、磁気撹拌しながら電気ホットプレート１２、１６（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｓｏｔｅｍｐデジタルホットプレート（番号１１−３００−４９ＳＨＰ）で加熱が行われる。しかし、他の実施形態が、サンプルを加熱したり冷却したりするのに使用され得ることが理解される。図１ａに示される実施形態において、サンプル容器２０は、ガラス／プラスチック複合材の反応チューブ（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、番号１７２０、内径０．８ｍｍおよび外径１．０ｍｍ）である。しかし、他の実施例では、サンプル容器２０として、皮下注射針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、番号３０５１８７、内径０．０４２インチ、外径０．０７５インチ）と、ステンレス鋼管材料で構成されＢｉｏＦｉｒｅチューブのプラスチックの頂上部に適合させたステンレス鋼／プラスチック複合材の反応チューブ（Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ、内径０．０４２インチ／外径０．０７５インチ、内径０．０３５インチ／外径０．０４２インチ、または内径０．０２６５インチ／外径０．０３５インチ）とを使用した。その他のサンプル容器も本発明の範囲内であるが、大きい表面積対体積比を有し、速い熱伝達速度を有するサンプル容器が望ましい。所定の実施形態に関して、金属管材料の開放端をガス炎を使用して赤色から白色に加熱し、万力で圧縮することによって密封した。リアルタイムＰＣＲの場合、光学的に透明であるか、または光学的に透明な部分を有するチューブが望ましい。短時間の遠心分離によりサンプルを各チューブの底部に沈降させた。

サンプル容器２０は、アーム２１によりステッピングモーターのシャフト２６に取り付けられたチューブホルダー２２によって保持される。反応溶液が６．５〜７．５ｃｍの半径で保持されるように２〜５個のサンプル容器２０を保持するためのチューブホルダー２２を、黒いデルリン（Ｄｅｌｒｉｎ）プラスチックから機械製作した（図１ａでは１つのサンプル容器２０のみを図示したが、このようなサンプル容器２０の列が存在してもよい）。図１ａでは図示されていないが、熱電対（Ｏｍｅｇａ ｔｙｐｅ Ｔ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ細線熱電対、番号５ＳＲＴＣ−ＴＴ−Ｔ−４０−３６、３６インチのリード線、０．００３インチの直径、テフロン^{（登録商標）}製絶縁材を有する）を使用して、温度を測定できる。図１ｂと類似したチューブホルダーおよびアームを示す図１ｄを参照すれば（同様の数値は類似の構成要素を示す）、２つのサンプル容器を保持するように設計されたチューブホルダー２２２が存在しており、チューブホルダー２２２における一方の場所は熱電対２２８によって占められている。本明細書で説明される実施形態のいずれにおいても、図１ｄで示されるように、任意の数のサンプル容器２０または２２０を熱電対と共に使用してもよいし、熱電対熱電対なしで使用してもよいことが理解される。熱電対による増幅および線状化は、Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＡＤ５９５チップ（示さず）を用いて行われる。まず、Ｔ型電圧＝（ＡＤ５９５の出力／２４７．３）−１１μＶに従って、ＡＤ５９５の出力から熱電対の電圧を計算した。次いで、Ｔ型熱電対の電圧／温度相関に関するアメリカ国立標準技術研究所の係数を使用して熱電対の電圧を温度に変換した。アナログシグナルをデジタル化し（ＰＣＩｅ−６３６３収集ボード）、ＣＰＵ４０にインストールされたＬａｂＶｉｅｗソフトウェア（バージョン２０１０、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で処理し、ユーザーインターフェース４２に表示した。例示的には、ステッパーの動きを８７〜９２℃および６０〜７５℃で動的に引き起こすか、またはコンピューターで制御された期間にわたり各水槽中にステッパーを保持してもよい。典型的には３０〜５０サイクルが行われる。

チューブホルダー２２中の全てのサンプル容器２０が水槽１０と水槽１４との間を素早く移動して、サンプルが入っている各サンプル容器２０の一部が完全に浸されるように、ステッピングモーター２４（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、番号ＨＴ２３−４０１、３Ｖ、３Ａ）が水槽１０と水槽１４との間に配置される。ステッピングモーター２４は、例示的には４ＳＸ−４１１ｎｕＤｒｉｖｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、示さず）で作動し、ＰＣＩ−７３４４運動制御器とＣＰＵ４０にインストールされたＮＩ−Ｍｏｔｉｏｎソフトウェア（バージョン８．２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とで制御される。ステッピングモーター２４は、水槽１０と水槽１４との間を約０．１秒で回転する。図２ａは、９０℃および５０℃でステッパーの動きが引き起こされた運転に関して、サンプル容器２０の位置の軌跡（点線）の上にサンプルの温度の軌跡（直線）を重ねて示す。図２からわかるように、５０℃よりも低い温度にいくつかのオーバーシュートがあるが、これは水槽１４からサンプル容器２０に移動させるのに必要な時間によるものと推定される。したがって、上記で論じられたように、いくらかより高い温度でステッピングモーター２４を始動させることが望ましい場合がある。以下の実施例において、示された温度は、到達したサンプルの温度であって、トリガー温度ではない。図２ａから計算された最大の加熱速度は３８５℃／秒であり、最大の冷却速度は３３３℃／秒である。例示的には、エクストリームＰＣＲは、少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で行ってもよい。他の実施形態において、傾斜速度は、３００℃／秒であってもよいし、またはそれよりも大きくてもよい。

いくつかの実施例では、システム４はまた、リアルタイムモニタリングのために構成される。図１ａで示されるように、リアルタイムモニタリングの場合、サンプル容器２０がステッピングモーター２４により高温の水槽１０から低温の水槽に移動したとき、このモニタリング位置を保ちながら、または保たずにサンプル容器２０が光ファイバーチップ５０を通過するように、光学素子ブロック２５の光ファイバーチップ５０がサンプル容器２０上に取り付けられる。この例示的な実施形態において、光ファイバーチップは、水槽の上の空気中に提供される。熱的サイクリングデバイス４をＣＰＵ４０によって制御してユーザーインターフェース４２に表示してもよい。

図１ｂは、図１ａに類似した実施形態を示す。ホットプレート２１２および２１６は、高温の水槽２１０および低温の水槽２１４の温度を制御するために備えられている。ステッピングモーター２２４は、例示的にはアルミニウムで作製されたアーム２２１とチューブホルダー２２２を動かしてサンプル容器２２０と熱電対２２８（図１ｄに示される）を動かすために備えられている。しかし、この実施形態において、ブロック２５４を配置させることにより、光ファイバーケーブル２５２のチップ２５０は水槽２１４中に保持される。光ファイバーケーブル２５２は、ポート２４８を介して水槽２１４に入り、光学素子ブロック２２５にシグナルを与える。熱的サイクリングデバイス２０４をＣＰＵ２４０によって制御してユーザーインターフェース２４２に表示してもよい。

Ｏｃｅａｎ ＯｐｔｉｃｓのＬＬＳ−４５５ＬＥＤ光源２５６からの光を、光ファイバーケーブル２５２（Ｏｃｅａｎ ＯｐｔｉｃｓのＰ６００−２−ＵＶ−ＶＩＳ、ファイバーコア直径６００μｍ）によって４４０＋／−２０ｎｍの励起干渉フィルター、ビーム分割のための４５８ｎｍのダイクロイックフィルターおよび４９０＋／−５ｎｍの放出フィルター（全てＳｅｍｒｏｃｋより、示さず）を備えたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｐｔｉｃｓの光学素子ブロック２５８に導いた。より低温の水槽中に配置されたきに、１つのサンプルのキャピラリーからおよそ１〜２ｍｍの距離で一列に置かれた別の光ファイバーケーブル（示さず）を用いて、キャピラリーの落射蛍光照明が達成された。放出検出は、ＨａｍａｍａｔｓｕのＰＭＴ６２を用いて行われた。

図１ｃは、３温度ＰＣＲのための例示的なシステム３０４を示す。９５．５℃の高温の水槽３１０、３０〜６０℃の低温の水槽３１４、および７０〜８０℃の中程度の温度の水槽３１３を使用して、サンプル容器３２０中に入れられている１〜５μｌのサンプルの温度を変化させ、磁気撹拌しながら３つの電気ホットプレート３１２、３１６、および３１８で加熱する。サンプル容器３２０は、アーム３２１でステッピングモーター３２４に取り付けられたチューブホルダー３２２によって保持される。また熱電対３２８も、チューブホルダー３２２によって保持される。ステッピングモーター３２４が回転するときに、アーム３２１を持ち上げることができる。光ファイバーチップ３５０は、例示的には、中程度の温度の水槽３１３中に提供されるが、図１ａの場合のように空気中に置かれていてもよいことが理解される。この例示的な実施形態の構成のために、３つの水槽３１０、３１３、および３１４を互いに等距離で設けることは不可能であった。したがって、サンプルの冷却は高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間でなされることが望ましく、それに対してサンプルの加熱は、サンプルがその他の水槽間を移動することによってなされるために、高温の水槽３１０と低温の水槽３１４との間に最も大きいスペースを設けた。しかし、この構成は単なる例示であり、他の構成も本開示の本質の範囲内であることが理解される。２つのステッピングモーターが同時に使用されるために（一方はキャピラリーを水から持ち上げるためであり、もう一方は水槽間を移動させるためである）、それぞれの角運動を最小化することにより、槽間の運動時間を短くできる。２つの水槽によるシステムでは、槽間でサンプルを移動させるのに必要なステッパーの角運動は、２７０度よりも大きい。しかし、３つの水槽によるシステムでは、サンプルを持ち上げるステッピングモーターは４５度未満で横断する必要があり、一方でサンプルを水槽間で移動させるステッパーは、わずか９０度またはそれ未満で移動する必要がある。また水槽は、必要な角運動をさらに制限するために円形のセクター（扇形のくさび）として構成されてもよい。角運動を最小化することにより、水槽間の移動時間が短くなる。１００ミリ秒未満の移動時間、または５０ミリ秒未満もの移動時間が想定される。このシステム３０４の他の構成要素は図１ａ〜ｂに示されるシステム４、２０４と類似しており、図１ｃでは示されていない。

特に他の指定がない限り、５０ｍＭのトリス（２５℃でｐＨ８．３）、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、５００μｇ／ｍｌの非アセチル化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、２％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇの精製ヒトゲノムＤＮＡ、および１×ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）プラス（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する５μｌの反応体積でＰＣＲを行った。プライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は、具体的な実験プロトコールに従って変更した。Ｋｌｅｎｔａｑ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼをＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはワシントン大学（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＷａｙｎｅ Ｂａｒｎｅｓのいずれかから得た。ＫｌｅｎＴａｑの分子量は６２．１ｋＤであり、２８０ｎｍにおける吸光係数は、配列から計算した場合、６９，１３０Ｍ^−１ｃｍ^−１である（米国特許第５，４３６，１４９号）。質量分析法で、優勢な分子量は６２ｋＤであることが確認され、変性ポリアクリルアミドゲルで、主要なバンドは合計で８０％より高い純度を有することが示された。吸光度および純度を使用して濃度を計算したところ、１０％グリセロール中、８０μＭのストックであることが示された。最終的なポリメラーゼ濃度は、典型的には０．２５〜１６μＭであった。１μＭのＫｌｅｎＴａｑは、０．７５Ｕ／μｌに等しく、この場合の１ユニットは、活性化サケ精子ＤＮＡを用いて７２℃で３０分で合成された生成物１０ｎｍｏｌと定義される。ユタ大学のコア施設でプライマーを合成し、脱塩し、濃度をＡ_２６０によって決定した。各プライマーの最終濃度は、典型的には２．５〜２０μＭの間で様々であった。

プライマーＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣ（配列番号１）およびＴＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴ（配列番号２）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントを増幅した。これらのプライマーは変異体ｒｓ番号１８０５１２８（ｃ．２５３Ｇ＞Ａ）を間に挟み、配列：ＣＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＣ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡ（配列番号３）を増幅した。

図３ａには、図１ａに示されるデバイスを使用したエクストリームＰＣＲによって生成したＰＣＲ生成物の融解曲線が示され、この場合、０．６４μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび１０μＭの各プライマーを使用して、図２ｂで示されるように９１℃から５０℃の間で、３５サイクルおよび２８秒の総増幅時間でサイクリングされた。各サイクルは０．８秒を要した。さらに図３ａには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの迅速サイクリングによって生成した同じアンプリコンの融解曲線も示され、この場合、０．０６４μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび０．５μＭの各プライマーを使用して、３５サイクルおよび１２分の総増幅時間で、９０℃から５０℃の間でサイクリングされた（図２ｃ）。各サイクルは１０．３秒を要した。図２ｂおよび２ｃでは時間の尺度が異なるため、図２ｂの全体のエクストリームＰＣＲプロトコールは、それに対応する迅速サイクルの２サイクル未満で完了することに留意されたい。両方の反応により、類似のＴｍを有しゲル電気泳動で強いバンドを示すアンプリコンが生産されたのに対し（図３ｂ）、陰性対照は融解分析またはゲル電気泳動のどちらによっても増幅は示されなかった。この実例において、エクストリームＰＣＲ条件は、ゲルで分析したところ（図３ｂ）、迅速サイクルＰＣＲ条件よりも高い収量を示した。融解曲線におけるＴｍの０．５℃の差は、ポリメラーゼ貯蔵緩衝液中のグリセロール含量から生じる、各反応液におけるグリセロールの量の違いに起因すると考えられる（ＰＣＲにおけるグリセロールの最終濃度は、エクストリーム条件下では１．３％であり、迅速条件下では０．１％であった）。また、図３ｂからも、アンプリコンのサイズが類似しており、予測通りであったことが確認される。加えて、ポリメラーゼ濃度とプライマー濃度とが高いにもかかわらず、反応は特異的のようであり、非特異的生成物は認められなかった。しかし、高解像度融解分析では３種の遺伝子型を区別することはできなかった。プライマーの総濃度に対するポリメラーゼの化学量論的なパーセンテージは、エクストリームＰＣＲの場合は３％であり、迅速サイクルＰＣＲの場合は６．４％であった。

１μＭのポリメラーゼ、１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用して、４５ｂｐのＫＣＮＥ１の反応をリアルタイムでモニタリングした。図１ａのデバイスを使用して、２つの水槽間の空気中のサンプルを各サイクルでモニターした。密封されたチャンバーの空気の温度を７０℃に保持し、各サイクル０．２秒でサンプルを調査した。温度参照キャピラリーで測定しながら、サンプルを図３ｃで示されるように６０℃から９０℃の間でサイクリングした。位置決めと測定の時間が追加されたために、サイクル時間が０．８秒から１．１２秒に増加した。したがって、５０サイクルは５６秒で完了した。約３０サイクルでの、すなわち約３４秒後の蛍光の増加から、増幅が認められた（図３ｃ）。測定のためにサンプルが空気中にあり、ポリメラーゼの伸長速度が制限される間も、温度はほぼ６０℃に保たれた。

図３ｃで観察されるように、この反応は、約２５サイクルの定量サイクル（Ｃｑ）を有するが、少なくとも５０サイクルまではプラトーにはならないようである。またこの反応は６４サイクル後に停止したため、アンプリコンの量が増加し続け、かなり後にならないとプラトーに達しない場合もある。理論にとらわれずにいえば、プライマー濃度を増加させることにより、収量を向上させ、さらに、プラトーを例示的にはＣｑ後に２０サイクル、より例示的にはＣｑ後に２５サイクルまたはそれより多くのサイクル遅延させることができると考えられる。

この実施例では、インターロイキン１０ベータ受容体中のＡ＞Ｇ変異体（ｒｓ番号２８３４１６７）を間に挟む５８ｂｐのフラグメントを、プライマーＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣ（配列番号４）およびＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴ（配列番号５）を用いて増幅し、以下のアンプリコン：ＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＣ（配列番号６）を生成した。実施例１で説明したようにして、図１ａに示される機器を使用してエクストリームＰＣＲを行った。１μＭのポリメラーゼ、１０μＭの各プライマー、および１．３％グリセロールを使用した（全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは５％）。ポリメラーゼがより高い伸長速度を有する場合、ポリメラーゼ伸長のために温度を７０〜８０℃に増加させるために、様々な位置決定プロトコールを使用した。アニーリング温度に達した後、モニターするために空気中で即座に位置決定する代わりに、伸長温度に達するまでサンプルを高温の水槽に移した。次いでサンプルを高温の水槽の真上の空気中に配置させて、図４ａおよび４ｂに示した温度サイクルを生じさせることにより、７０℃から７７℃の間の最適な温度でより速いポリメラーゼ伸長を可能にした。３種の異なる遺伝子型をそれぞれ、０．９７秒のサイクルを使用して３９サイクルを３８秒で完了させるエクストリームＰＣＲによって増幅した。エクストリームＰＣＲの後、ＬＣ２４キャピラリーが適合するように改変されたＨＲ−１機器で各遺伝子型の高解像度融解曲線を得た。図４ｃから明らかなように、３種の遺伝子型全てが予想通りに増幅され、区別された。

実施例１における反応混合物はエクストリームＰＣＲおよび迅速サイクルＰＣＲの両方で同じであるが、見たところ図３ａで観察されるＴｍのシフトの原因と思われるポリメラーゼおよびプライマーの量、ならびにグリセロール濃度のわずかな差が認められた。この実施例およびこの先全ての実施例において、グリセロール濃度は、必要に応じてその濃度を均一化することにより２％に保持された。エクストリームＰＣＲの場合、１μＭのポリメラーゼおよび１０μＭの各プライマーを使用し、迅速サイクルＰＣＲの場合、０．０６４μＭのポリメラーゼおよび０．５μＭの各プライマーを使用した。上記で論じられたように、より速いアニーリング時間は、プライマー特異性の向上をもたらすと考えられる。この特異性の向上に伴い、増加させたプライマー濃度を使用してもよく、それにより、プライマーの結合が促進されてアニーリング時間が短くなると考えられる。同様に、増加させたポリメラーゼ濃度によりアニールしたプライマーへの結合も促進されて、完全な伸長の前にポリメラーゼが離れた場合に、不完全なアンプリコンへの再結合も促進される。加えて、ポリメラーゼ濃度が高ければ高いほど、ＰＣＲの後半でさえもより大量のプライマーが結合したテンプレートが一度に伸長でき、１つのポリメラーゼが伸長させなければならないテンプレート数が少なくなるため、全体の伸長時間が短くなる。

図５ａに、様々なポリメラーゼ濃度およびプライマー濃度を用いたエクストリームＰＣＲサイクリングの結果を要約する。この実施例において、インターロイキン１０ベータ受容体の４９ｂｐのフラグメントを、プライマーＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号７）およびＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号８）、ならびに３ｍＭのＭｇＣｌ_２を用いて増幅して、ＧＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡ（配列番号９）を生成した。各エクストリームＰＣＲ反応で、図１ｂに示されるデバイスを、リアルタイムでモニタリングせずに使用した。図５ｂで示されるように、２６秒より少し短い総反応時間（０．７３秒のサイクル）で、９０℃から６３℃の間で３５サイクルで温度をサイクリングした。図５ａで示されるようにポリメラーゼおよびプライマーの量を変更したこと以外は、実施例１で論じられた通りの反応条件を用いた。図５ａの縦軸は、ＨＲ−１機器で正規化しないで得られた融解曲線の負の微分プロットのピークとして数値化したものである。０．５μＭのポリメラーゼでは、いずれのレベルのプライマー濃度でも実質的に増幅は観察されなかった。しかし、１．０μＭのポリメラーゼでは、５μＭおよびそれを超えるプライマー濃度で認識できるレベルの増幅が観察された。ポリメラーゼレベルが増加するにつれて、アンプリコンの量も最大約４μＭのレベルまで増加する。８μＭのポリメラーゼでは、アンプリコンの量はプライマー濃度に応じてプラトーになるかまたは低下し、より低いプライマー濃度では１６μＭで有意な低下がみられた。これらの４９ｂｐの生成物の場合のエクストリーム温度サイクリング条件下では、ポリメラーゼの好ましい濃度範囲は、プライマー濃度に応じて、約１μＭから８μＭの間であり、より具体的には２μＭから８μＭの間であると考えられる。

同様に、２．５μＭのプライマー濃度ではほとんど増幅が観察されなかった。しかし、５μＭのプライマーでは、２〜８μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度を用いたところ増幅が成功し、増幅は濃度の増加に伴い向上し続けた。約１０〜２０μＭのプライマー濃度を用いたところ優れた増幅が達成された。図５ｃは、４μＭのＫｌｅｎＴａｑで様々なプライマー濃度を用いた場合の融解曲線を示し、一方で図５ｄは、プライマー濃度を１０μＭに保持しながらポリメラーゼ濃度を変更したときの生成物のサイズを実証している。高濃度のポリメラーゼおよびプライマーにもかかわらず、非特異的増幅は観察されていない。

理論にとらわれずにいえば、酵素の量もプライマーの量も閾値を超えているのであれば、酵素の量とプライマーの量との比率が、エクストリームＰＣＲサイクリングにとって重要であると考えられる。上記の量は、各プライマーをベースにして示されることに留意されたい。ポリメラーゼが二重鎖になったプライマーのそれぞれに結合することを考えれば、プライマーの総濃度が最も重要である場合がある。ＫｌｅｎＴａｑの場合、好適な比率は０．０３〜０．４（プライマーの総濃度に対して３〜４０％の酵素）であり、例示的には最小で約０．５μＭのＫｌｅｎＴａｑ濃度であり、より例示的には、エクストリームＰＣＲの場合、約１．０μＭである。プライマーは、等モル量で提供されてもよいし、または非対称ＰＣＲの場合のように一方が過量に提供されてもよい。最適なポリメラーゼ：プライマーのパーセンテージはまた、温度サイクリング条件と生成物のサイズにも依存し得る。例えば、標準的な（遅い）温度サイクリングは、かなり低いプライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージを使用することが多く、典型的には、１．５ｎＭ（０．０４Ｕ／μｌ）のポリメラーゼ（４９）および０．１５％のパーセンテージの１，０００ｎＭのプライマーの総濃度が使用され、これは、エクストリームＰＣＲに関して有効であると見出されたパーセンテージよりも１０倍以上低い。

熱の移動とサイクル速度を増加させるために、１９ゲージの鋼の皮下注射針で８μＭのポリメラーゼおよび２０μＭの各プライマーを用いて、実施例３におけるのと同じＰＣＲ標的を増幅した。全プライマーに対するポリメラーゼのパーセンテージは２０％であった。図１ｂの機器で増幅を行ったところ、各０．４６秒で３５サイクル（図６ａ）、９１℃から５９〜６３℃の間のサイクリングを使用して、１６秒で増幅が完了した。サイクリング中の最大の加熱速度は４０７℃／秒であり、最大の冷却速度は８１５℃／秒であったことから、保持を行わずに４００℃／秒より速い傾斜速度でＰＣＲを実行できることが実証された。４％ＮｕＳｉｅｖｅの３：１アガロースゲルでの生成物分析により、正しいサイズの強い特異的なバンドが現れた（図６ｂ）。テンプレート非含有対照は、４９ｂｐで生成物を示さなかったが、陽性サンプルに類似した顕著な量のプライマーバンドを示した。

プライマーＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴ（配列番号１０）およびＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡ（配列番号１１）、ならびにリアルタイム要素を用いない図１ｂの機器を使用して、ＮＱＯ１遺伝子の１０２ｂｐのフラグメントを増幅した。ポリメラーゼ濃度を０．２５から４μＭの間で変更し、各プライマー濃度を０．５から８μＭの間で変更した。併合されたアニール／伸長期での伸長がポリメラーゼにとってより最適な温度で起こるように、より高温で（低出力で７０秒）アニールするようにプライマーを設計した。これらの温度でのより速い重合速度は、より長い生成物の増幅を可能にすると期待された。より低温の水槽を７２℃に制御して、アニール／伸長期の終了を温度ではなく時間（１秒）で誘発した。３０サイクルの間の７２℃から９０℃の間のサイクリングには、１．９３秒のサイクルを使用したところ５８秒を要した（図７ａ）。図７ａで観察されるように、サンプルの温度は、空気を通って高温の水槽まで移動する間にアニール／伸長温度から約３℃低くなる。図７ｂは、図５ａに示されるように融解曲線を定量することによって得られた増幅した生成物の量を示す。融解曲線分析では、８４℃のＴｍを有する唯一の生成物が示された。０．２５μＭのポリメラーゼまたは１μＭの各プライマーでは極めてわずかな生成物しか観察されなかった。２μＭの各プライマーでもある程度の増幅は起こり、最良の増幅は２〜４μＭのポリメラーゼおよび８μＭの各プライマーで起こる。２〜４μＭのプライマー濃度では、ポリメラーゼ濃度が増加するにつれて収量は減少するが、これは８μＭのプライマー濃度では観察されなかった。熱的サイクリングおよび標的長さが実施例３とは異なるが、プライマーの総濃度に対するポリメラーゼ濃度が、３．１から５０％のときに最良の増幅が起こる。

図１ｂに示される機器をリアルタイムモニタリングしながら使用して、ＢＢＳ２遺伝子の１３５ｂｐおよび３３７ｂｐのフラグメントをエクストリームＰＣＲにより増幅した。エクストリームＰＣＲに対する生成物の長さの影響と、様々なプライマーの起こり得る交絡的影響の調整を研究するために、まず共通の５’末端伸長部分を有するプライマーを使用してゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅した。１３５ｂｐのフラグメントの場合、プライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号１２）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ（配列番号１３）であった。３３７ｂｐのフラグメントの場合、プライマーは、ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴ（配列番号１４）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧ（配列番号１５）であった。ゲノムＤＮＡからの標準的なＰＣＲ増幅の後に、プライマーおよびｄＮＴＰをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＣＡ）によって分解し、続いてＱｕｉｃｋＳｔｅｐ（商標）２ＰＣＲ精製キット（カタログ番号３３６１７、Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用してＰＣＲ生成物を精製した。ＰＣＲ生成物をおよそ１００万倍に希釈し、標準的なリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｑを等しくすることにより等しい濃度に調節し、２５サイクルのＣｑ（反応液１０μｌあたりおよそ１０，０００コピー）を達成した。

総体積５μｌの増幅したテンプレートの１，０００コピーに、２μＭのポリメラーゼおよび２％グリセロールと共に共通のプライマーＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡ（配列番号１６）およびＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号１７）をそれぞれ２μＭで使用してエクストリームＰＣＲを行った。１３５ｂｐのＢＢＳ２フラグメントからは２２６ｂｐの生成物が得られ、（プライマーに応じて）１７６塩基または１８５塩基の伸長を必要としたが、３３７ｂｐのＢＢＳ２フラグメントからは４２８ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、３７８塩基または３８７塩基の伸長を必要とした。アガロースゲルで、さらに融解分析によって特異的増幅を検証した。図８ａに、２２６ｂｐの生成物に使用された、７５℃の１秒の併合されたアニール／伸長および８７℃の変性を含むエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で２秒のアニール／伸長期も行った（軌跡示さず）。図８ｃに示されたこれらの増幅に関するリアルタイムＰＣＲの結果から、１秒の伸長を用いた場合、２秒の伸長と比較してＣｑが約５サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。図８ｂに、７５℃の４秒の併合されたアニール／伸長および８７℃の変性を示し、これは、４２８ｂｐの生成物に使用されたエクストリームＰＣＲの温度プロファイルを示す。さらに同じ温度で５秒のアニール／伸長期も行った（軌跡示さず）。図８ｄに示されたこれらの増幅に関するリアルタイムＰＣＲの結果から、４秒の伸長を用いた場合、５秒の伸長と比較してＣｑが約２サイクル高くシフトしたことが明らかになったが、これはおそらく伸長時間が短くなるにつれて効率も減少したことを反映しているものと思われる。

実施例５のＮＱＯ１の１０２ｂｐのフラグメントおよび実施例１のＫＣＮＥ１の４５ｂｐのフラグメントに関して、ヒトゲノムＤＮＡの希釈系列を使用して、ＮＱＯ１には２μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび８μＭの各プライマー、ならびにＫＮＣＥ１には８μＭのＫｌｅｎＴａｑおよび２０μＭの各プライマーを使用して、図１ｂのリアルタイム機器を使用してＰＣＲの定量性能を評価した。図９ａおよび図９ｂでみられるように、少なくとも４０のダイナミックレンジを用いたところ、標準曲線から計算された増幅効率は、ＮＱＯ１では９５．８％であり、ＫＣＮＥ１では９１．７％であった。テンプレート不使用の対照反応では、５０サイクル後に増幅は起こらず、単一コピーの複製物（平均コピー数は、１反応あたり１．５コピー）は、増幅曲線の形状および強度においてより高い濃度と類似していた（図９Ａおよび図９Ｃ）。０．１５コピー／反応の平均コピー数では、二項展開により計算された０．１３コピー／反応の期待値を用いたところ、（ＮＱＯ１の試験とＫＣＮＥ１の試験の両方を合わせた）１７の反応のうち２つの反応が陽性であった。

リアルタイムＰＣＲを使用する際、様々な生成物の長さに応じた伸長時間が必要である（図１０ａ〜ｃ）。様々なプライマーの起こり得る交絡的影響を調整するため、１００〜５００ｂｐの合成テンプレートと共に以下の共通の高いＴｍ（７７℃）を有するプライマーを使用した。
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC（配列番号１８）およびGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号１９）

合成テンプレート配列は以下の通りである。
１００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２０）

２００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATATAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTGGGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２１）

３００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAGTAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTTAGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAATAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２２）

４００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTATGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAAACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTAAGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTACACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２３）

５００ｂｐのテンプレート：
ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACTGAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGCCTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAAACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAAGGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAATAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA（配列番号２４）

まず、中程度の長さの３００ｂｐの生成物に関して、４秒の併合されたアニール／伸長セグメントを１サイクルあたり４．９秒で使用して、プライマーおよびポリメラーゼの最適な濃度を決定した（図１０ａ）。次いで全ての生成物の長さに関して、同一のプライマー濃度（４μＭ）およびポリメラーゼ濃度（２μＭ）を使用して、最小の伸長時間を決定した（図１１ａ〜ｅ）。生成物の長さに応じて、伸長時間が増加すると、さらなる変化が観察されなくなるまでの定量サイクル（Ｃｑ）がわずかに減少したことから、効率的なＰＣＲに必要な最小の伸長時間が示された。例えば、図１０Ｂに、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）ＦＡＳＴポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した５００ｂｐの生成物に関する増幅曲線を示す。ＫＡＰＡ２Ｇ ＦＡＳＴポリメラーゼを使用した場合の最小の伸長時間は３秒であり、これに対してＫｌｅｎＴａｑ１（Ｔａｑポリメラーゼの欠失突然変異体、ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を使用した場合は７秒であった。ポリメラーゼの同一性が一定に維持される場合、より長い生成物はより長い伸長時間を必要とした（図１０ｃ）。ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼの場合、６０ｂｐごとに約１秒を要し、一方でＫＡＰＡ２Ｇ ＦＡＳＴポリメラーゼの場合、１５８ｂｐごとに１秒を要する。これらの２種のポリメラーゼは十分な濃度で市販されているが、その他ほとんどのポリメラーゼはこのような高濃度では市販されていないために、これらのポリメラーゼが選ばれたことに留意されたい。伸長に必要な時間は、伸長させようとする長さに直接的かつ直線的に依存しており、ポリメラーゼ濃度およびポリメラーゼ速度とは反比例することが理解される。これらの３種のパラメーターを関連付ける比例定数（ｋ２）は、以下のように定義することができる。

必要な伸長時間＝ｋ２^＊（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］^＊（ポリメラーゼ速度））

エクストリームＰＣＲ時間は、高いＭｇ^＋＋濃度を用いて短くすることもできる。プライマー：ＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号２５）およびＴＴＧＡＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡ（配列番号２６）を用いてＡＫＡＰ１０の６０ｂｐのフラグメントを増幅し、アンプリコンＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡ（配列番号２７）を生成した。

各反応は、体積１μｌで、３５サイクルを時間ベースで制御して（９４℃の水槽中で０．０７秒、６０℃の水槽中で０．１〜０．４秒）、２〜７ｍＭのＭｇＣｌ_２を使用して行われた。サンプル体積は１μｌであり、５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、２０μＭのプライマー、および８μＭのポリメラーゼを含んでいた。１サイクルあたり０．４２秒のプロトコールを使用したところ、ＭｇＣｌ_２が２〜３ｍＭのときに、融解曲線（図１２ａ）およびゲル（図１２ｂ）で生成物は観察されなかった。４ｍＭで最低限の生成物が存在したが、５〜７ｍＭのＭｇＣｌ_２で増幅した後に大量の生成物が観察された。５ｍＭのＭｇＣｌ_２では、０．３２秒のサイクル時間を用いた場合、融解曲線（図１３ａ）およびゲル（図１３ｂ）で生成物は観察されなかったが、０．４２秒、０．５２秒、および０．６２秒のサイクル時間では大量の生成物が示され、このことは、１５秒（１４．７秒で３５サイクル）で行われたＰＣＲにおいて特異的な高収量の６０ｂｐの生成物が得られることを実証している。したがって、例示的なＭｇ＋＋濃度は、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、またはそれより高く、これらの例示的なＭｇ＋＋濃度は、本明細書で説明される実施形態のいずれかと共に使用できることが理解される。

エクストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼは、より遅いサイクル速度で使用すると有害作用を有する場合がある。それぞれ３２倍または１０６倍遅い迅速サイクルまたはブロックベースの機器では、非特異的生成物が生じた。図１４ａ〜ｂは、実施例９で使用されたＡＫＡＰ１０の６０ｂｐの生成物の増幅を比較した結果を示すが、この場合、増幅は、２０μＭの各プライマー、８μＭのＫｌｅｎＴａｑ、および１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用して、（１）およそ１７秒の総時間をもたらす９４°で０．５秒および６０°で０．２秒の設定時間を用いたエクストリームＰＣＲ、（２）およそ９分の総時間をもたらす９４°で１０秒の最初の変性、続いて０秒で８５°および０秒で６０°のサイクルの設定時間を使用した迅速サイクルＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）、および（３）およそ３０分の総時間をもたらす９４°で１０秒の最初の変性、続いて８５°で０秒および６０°で５秒の温度サイクリングを用いた旧来の（ブロック）温度サイクリング（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６）を４０サイクルで使用して行われた。示されたように、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの迅速サイクリングでさえもかなりの非特異的増幅を生じたが、エクストリームサイクリング条件では単一の融解ピークと、ゲルにおける最小の非特異的増幅が達成された。

また注目すべきことに、エクストリームＰＣＲでは、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度によっても収量が強化される。比較のために定量的ＰＣＲを使用したところ、エクストリームＰＣＲは迅速サイクルＰＣＲと比較して３０倍を超える量の生成物を生産した（データ示さず）。

実施例１〜１０は全て、図１ａ〜１ｄで説明されている１つまたは複数のデバイス、またはこれらの構成にわずかな改変を施したものを使用して行われた。しかし、本明細書で説明される方法および反応は、様々な機器で起こる場合があることが理解される。これらの実施例で使用される水槽およびチューブは、濃度を高めたプライマーおよびポリメラーゼの作用を研究するのに十分な迅速な温度変化をもたらす。しかし、他の実施形態が商業的により好適である場合がある。低容量および高い表面積対体積比のマイクロ流体システムが、エクストリームＰＣＲによく適している場合がある。このようなシステムは、エクストリームＰＣＲで使用される高濃度のプライマーおよびポリメラーゼで求められる迅速な温度変化を可能にする。マイクロ流体システムは、サンプルを変性ゾーン、アニーリングゾーン、および伸長温度ゾーンに繰り返し通す小型化されたチャネルを取り入れたマイクロフローシステム（３５、５３）を包含する。これらのシステムのいくつかは、複雑度がより低い標的で３秒もの速いサイクル時間の有効なＰＣＲであることがすでに実証されている。ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、プライマーはそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供される場合、このようなシステムでより複雑な標的を増幅できることが期待される。また定置式のＰＣＲチップおよびＰＣＲ液滴形成システム（５４）は、１ｎｌまたはそれ未満もの小さい体積が可能であり、さらに極めて迅速なサイクリングを許容するほど十分に低くできることから、プライマーおよびプローブの濃度の増加によって利益を得る場合もある。より遅いサイクル速度でより高いプライマー濃度を用いることに伴う特異性を損なうことなく増加させたプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度を利用できるほど十分速く機器の温度がサイクリングするのであれば、本発明にとって正確な機器は重要ではないことが理解される。

上記の実施例はいずれもＰＣＲを用いたが、ＰＣＲは単なる例示であり、ＰＣＲ以外の核酸増幅方法にも増加したプライマー濃度および酵素濃度とより短い増幅時間との組み合わせが想定されることが理解される。規模を増加させることができる例示的な酵素活性としては、重合（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）、ライゲーション、へリックスの巻き戻し（ヘリカーゼ）、またはエキソヌクレアーゼ活性（５’から３’または３’から５’）、鎖の置換および／もしくは切断、エンドヌクレアーゼ活性、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ消化（ＲＮアーゼＨ）が挙げられる。増幅反応としては、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在増幅（例えば転写ベースの増幅システム、自家持続配列複製法、および核酸配列ベースの増幅など）、鎖置換増幅、全ゲノム増幅、多置換増幅、アンチセンスＲＮＡ増幅、ループ介在増幅、線形結合増幅（ｌｉｎｅａｒ−ｌｉｎｋｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅、分岐増幅（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、等温オリゴヌクレオチド増幅、ヘリカーゼ連鎖反応、および連続侵入シグナル増幅（ｓｅｒｉａｌ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。

一般的には、酵素活性が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比例して変化する。プライマーを包含する反応の場合、プライマー濃度が変化すると、同じ倍率で増幅時間は反比例して変化する。プライマーと酵素の両方が増幅に必要な場合、反応速度を最大化するためには酵素濃度とプライマー濃度の両方を変化させるべきである。増幅サイクルの固有のセグメント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）でプライマーのアニーリングが起こる場合、そのセグメントにおいてプライマーのアニーリングが十分に完了するのに必要な時間は、プライマー濃度と反比例すると予想される。同様に、増幅サイクルの固有のセグメント（例えば、３温度ＰＣＲ中の固有の温度）で酵素活性が必要な場合、そのセグメントにおいて酵素的なプロセスが十分に完了するのに必要な時間は、所定の範囲内で酵素濃度に反比例すると予想される。プライマー濃度または酵素濃度の変更は、それら個々のセグメントに要する時間を変化させるのに使用でき、または同じ条件下で（例えば２温度ＰＣＲにおいて、または等温反応プロセス中に）その両方が起こる場合、１つの反応が反応速度を制限しないように両方の濃度の変更が必要であることが予想される。増幅プロセスをさらに加速するために、Ｍｇ＋＋濃度の増加を酵素濃度およびプライマー濃度の増加と組み合わせて使用してもよい。より高いＭｇ＋＋濃度は、プライマーのアニーリングの速度を増加させ、かつ核酸増幅で使用される多くの酵素反応にかかる時間を短くする。

より高いＭｇ＋＋、酵素、およびプライマーの濃度は、より短い増幅時間またはセグメントと共に使用される場合、特に有用である。時間を短くしないでより高い濃度を使用すると、いくつかのケースにおいて、反応の「ストリンジェンシー」が低下するために非特異的な増幅生成物が生じる場合がある。増幅時間またはセグメント時間（秒）を短くすることは、増加した反応物濃度によるストリンジェンシーの損失を埋め合わせるように見えるより高いストリンジェンシーを導入する。逆に言えば、増幅時間またはセグメント時間を増加させることによりこれらのより低い濃度を相殺すれば、反応物濃度を低下させることによって試薬のコストを最小化できる。

ポリメラーゼ濃度を増加させることにより、長時間のＰＣＲ、例示的には標的が５〜５０ｋｂである場合のＰＣＲに必要な時間を短くできる。大きい標的を増幅するには、典型的には１０分〜３０分の伸長期間が使用されるが、これはなぜなら、１）ポリメラーゼが単一の標的の伸長を完了させるため、および２）再利用された酵素が、追加のプライマーが結合したテンプレートを重合させるためにそのような時間が必要になるほど大きい標的が長いためである。ＰＣＲの開始時には、利用可能な酵素のほうがプライマーが結合したテンプレート分子よりも多く存在するため、このようなポリメラーゼの再利用は必要ない。しかし、対数期が終わる前でも、ポリメラーゼ分子の数が限界になることがしばしばあり、酵素の再利用が必要である。ポリメラーゼ濃度を増加させることによって、高いプライマー濃度に起因する収量増加を維持しつつ必要な伸長期間を５分未満まで、場合によっては２分未満まで短くできる。実際の酵素の速度は増加しないが、それほど再利用は必要ではなく、必要な最小の時間は、ほぼ直線的に酵素濃度の影響を受ける。

プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを増加させることによりサイクルシーケンシング時間も短くできる。典型的には、標準的なサイクルシーケンシングにおいて、プライマー濃度は０．１６μＭであり、併合されたアニール／伸長期間は５０〜６０℃で１０分である。プライマー濃度とポリメラーゼ濃度とを１０倍増加させることによって、アニール／伸長に必要な時間をおよそ１０倍短くできる。長いＰＣＲとサイクルシーケンシングの両方において、予想される必要な時間は、ポリメラーゼまたはプライマー濃度のどちらか限定的なほうに反比例する。

エクストリーム温度サイクリングとより高い濃度のプライマー、ポリメラーゼ、および／またはＭｇ＋＋とを組み合わせることによって、大規模並列配列決定のための調製においてプライマーとして使用されるリンカーがライゲーションしたフラグメントのＰＣＲを、現行のものよりもかなり短い時間で完了させることができる。

上記した全ての用途において、より短い増幅時間で反応特異性が維持されるものと予想される。当業者であれば、高いプライマー濃度およびポリメラーゼ濃度は非特異的増幅による問題を引き起こすことを想像するであろうが、全体のサイクル時間および／または個々のセグメント時間を最小化することにより、ＰＣＲの高い特異性および効率がもたらされる。

表２に、エクストリームＰＣＲの具体的な条件を示す。同時に行われた標的のうち３種に関するポリメラーゼおよびプライマー濃度の最適化実験以外の全てのデータが示される。表３に、変数間の定量的な関係が詳述されている。必要なアニーリング時間をプライマー濃度に関連付ける反比例関係はほぼ一定（ｋ１）であり、方程式（必要なアニーリング時間）＝ｋ１／［プライマー］によって定義される。旧来の（標準）ＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲの条件下でこれらの変数の典型的な値の範囲を使用することにより反比例定数の範囲が得られ、その大部分は重複している（旧来のＰＣＲは０．７５〜３０、迅速サイクルＰＣＲは０．２〜１０、およびエクストリームＰＣＲは１〜２０である）。この反比例定数によって、現行のものの範囲から外れる望ましいアニーリング時間は、望ましい時間に必要なプライマー濃度を予測するのに使用できる。例えば、０．０１秒のアニーリング時間で５（秒^＊μＭ）の定数を使用すれば、５００μＭのプライマー濃度の計算が可能である。逆に言えば、０．０１μＭのプライマー濃度が望ましい場合、必要なアニーリング時間は５００秒と予想される。これらの条件は旧来のＰＣＲおよびエクストリームＰＣＲ両方の範囲の外側であるが、これらの条件によりＰＣＲの成功に有用なプライマー濃度とアニーリング時間との関係が予測される。旧来のＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲ全てにおいて適切なｋ１の範囲は、０．５〜２０（秒×μＭ）であり、より好ましくは１〜１０（秒×μＭ）であり、最も好ましくは３〜６（秒×μＭ）である。

また類似の計算を行うことによっても、望ましい伸長時間と、ポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、および増幅させようとする生成物の長さとを関連付けることができる。しかし、長期にわたり様々な実験室で行われてきた旧来のＰＣＲ、迅速サイクルＰＣＲ、およびエクストリームＰＣＲに影響を与える多くの追加の変数（ポリメラーゼ、Ｍｇ＋＋、緩衝液）については、本明細書において変数間の反比例関係を確立するために示されたよく制御されたエクストリームＰＣＲ条件を調べることが最善である場合がある。それにより、エクストリームＰＣＲ条件下でのポリメラーゼ濃度、ポリメラーゼ速度、生成物の長さ、および必要な伸長時間を定量的に表すことができる。定義方程式は、（必要な伸長時間）＝ｋ２（生成物の長さ）／（［ポリメラーゼ］^＊（ポリメラーゼ速度））である。実験的に決定されたｋ２は、上記の方程式において、温度、Ｍｇ^＋＋、ポリメラーゼのタイプ、緩衝液、添加剤、およびｄｓＤＮＡ色素濃度を一定にした条件下での比例定数と定義される。［ポリメラーゼ］および［プライマー］の二次元最適化がなされた３種のエクストリームＰＣＲ標的に関して、プライマー濃度全体にわたり成功した増幅の境界線にある［ポリメラーゼ］を見極めて、他の３つの変数と関連付けることができる。表３で示されるように、これらの３種の異なる標的に関するｋ２値は２未満の倍率で変化していることから、ｋ２は定数であり、他方がわかっているときにある変数を予測するのに使用できると推測される。必要な伸長時間は、伸長の長さ（生成物の長さからプライマーの長さを引いた長さ）に比例し、ポリメラーゼ速度とポリメラーゼ濃度に反比例する。ｋ２は（１／μＭ）の単位で示され、本明細書において使用されるエクストリームＰＣＲ条件にとって最適な値は、０．３〜０．７（１／μＭ）の範囲のうち０．５（１／μＭ）である。ポリメラーゼのタイプ、Ｍｇ＋＋濃度、または異なる緩衝液もしくは色素の状態の点で異なる他の反応条件でも、類似のｋ２値が誘導される場合がある。

サンプル温度を急速に変化させることができるのであればどのような種類の容器でもエクストリームＰＣＲを行うことができる。標準的なチューブおよびキャピラリーに加えて、油のストリーム中に懸濁した水性反応物の微小液滴または薄い２次元ウェーハが、優れた熱的接触をもたらす。エクストリームＰＣＲの速さに必要な温度制御のための優れた方法は、空間的なセグメントを様々な温度で通過するサンプルストリームの連続流ＰＣＲ（液滴として分散する、気泡で分離する、または他の手段で混合を防ぐことのいずれか）である。

参考文献

好ましい実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明したが、以下の特許請求の範囲で記載および定義された本発明の範囲および趣旨内にある変更形態および改変形態が存在する。

Claims (32)

1. 増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
   熱安定性ポリメラーゼおよび前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーを前記生体サンプルに添加する工程であって、前記ポリメラーゼが少なくとも０．５μＭの濃度で提供され、前記プライマーがそれぞれ少なくとも２μＭの濃度で提供される工程と、
   エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが１サイクルあたり１０秒未満のサイクル時間で完了する工程と
   を含む方法。
2. 各サイクルが、１サイクルあたり２秒未満で完了する、請求項１に記載の方法。
3. 傾斜速度が、少なくとも２００℃／秒である、請求項１に記載の方法。
4. 前記傾斜速度が、少なくとも３００℃／秒である、請求項３に記載の方法。
5. 前記傾斜速度が、少なくとも４００℃／秒である、請求項４に記載の方法。
6. プラトーが、Ｃｐの後の少なくとも２０サイクルにある、請求項１に記載の方法。
7. それぞれの前記プライマーの濃度が、２．５μＭより大きい、請求項１に記載の方法。
8. 前記伸長温度とは異なるアニーリング温度をさらに含み、
   前記増幅する工程により１００ｂｐより大きいアンプリコンが生成し、
   前記エクストリーム温度サイクリングプロファイルが、塩基対で表された伸長の長さ（アンプリコンの長さ−プライマーの長さ）を、塩基／秒で表された前記熱安定性ポリメラーゼの伸長速度で割った値にほぼ等しい時間の前記伸長温度での保持を包含する、請求項１のいずれかに記載の方法。
9. 前記増幅する工程が、前記伸長温度と同じかまたはそれよりも低いアニーリング温度をさらに包含し、前記増幅する工程が、前記アニーリング温度での０．０５〜０．９秒間の保持を包含する、請求項１に記載の方法。
10. 前記Ｍｇ^＋＋濃度が、少なくとも４ｍＭである、請求項１に記載の方法。
11. 前記ポリメラーゼおよび前記プライマーの濃度がある倍率で増加し、前記サイクル時間が前記倍率で割られる、請求項１に記載の方法。
12. 前記エクストリーム温度プロファイルが、
    アニーリング時間＝ｋ１／［プライマー］
    （式中、ｋ１は、定数であり、［プライマー］は、各プライマーの濃度である。）
    によって定義されるアニーリング時間を包含する、請求項１に記載の方法。
13. ｋ１が、実験的に決定される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記温度サイクリングプロファイルが、
    伸長時間＝ｋ２（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］^＊（ポリメラーゼ速度））
    （式中、ｋ２は、比例定数であり、［ポリメラーゼ］は、前記ポリメラーゼの前記濃度であり、ポリメラーゼ速度は、ヌクレオチド／秒で表されたポリメラーゼの塩基を取り込む速度である。）
    によって定義される前記伸長温度における時間を包含する、請求項１に記載の方法。
15. ｋ２が、実験的に決定される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記標的核酸が、少なくとも７０％の効率で増幅される、請求項１に記載の方法。
17. 増幅中の生体サンプル中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
    熱安定性ポリメラーゼおよび前記標的核酸配列を増幅するように構成されたプライマーを前記生体サンプルに添加する工程であって、前記ポリメラーゼとプライマーの比率が、（約０．０３〜約０．４のポリメラーゼ）：（プライマーの総濃度）であり、前記ポリメラーゼの濃度が少なくとも０．５μＭである工程と、
    エクストリーム温度サイクリングプロファイルを使用して、複数の増幅サイクルにわたり少なくとも変性温度と伸長温度との間で前記生体サンプルを熱的にサイクリングすることによるポリメラーゼ連鎖反応によって、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、各サイクルが１０秒未満で完了する工程と
    を含む方法。
18. 各サイクルが、５秒未満で完了する、請求項１７に記載の方法。
19. 各サイクルが、２秒未満で完了する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
21. 前記生体サンプルが、真核生物のゲノムＤＮＡを含有する、請求項１７に記載の方法。
22. 前記ポリメラーゼが、少なくとも１．０μＭの濃度で提供されるＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）である、請求項１７に記載の方法。
23. 非特異的増幅が、検出可能なレベル未満である、請求項１７に記載の方法。
24. プライマーの総濃度が、少なくとも５μＭである、請求項１７に記載の方法。
25. ＰＣＲを行うためのデバイスであって、
    ＰＣＲサンプルを保持するためのサンプル容器と、ここで、前記サンプル容器が、標的核酸と、ｄＮＴＰと、少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーとを含み、
    前記サンプルを加熱する手段と、
    前記サンプルを冷却する手段と、
    前記サンプルを加熱する手段および前記サンプルを冷却する手段に前記サンプル容器を繰り返し晒して、前記サンプルを少なくとも２００℃／秒の傾斜速度で熱的にサイクリングする制御手段と
    を含むデバイス。
26. モニタリング位置で前記サンプルを光学的に励起して前記サンプルに蛍光を発生させる手段と、励起された増幅中の前記サンプルの前記蛍光を検出する手段とをさらに含む、請求項２５に記載のデバイス。
27. 前記傾斜速度が、少なくとも３００℃／秒である、請求項２６に記載のデバイス。
28. 前記傾斜速度が、少なくとも４００℃／秒である、請求項２７に記載のデバイス。
29. 前記加熱手段が高温の水槽であり、前記冷却手段が低温の水槽である、請求項２５に記載のデバイス。
30. 前記デバイスが、マイクロ流体システムである、請求項２５に記載のデバイス。
31. 標的核酸に対して、各サイクルが１サイクルあたり１０秒未満のサイクル時間で完了する温度サイクリングプロファイルを使用したＰＣＲを行うためのキットであって、
    ｄＮＴＰと、
    少なくとも０．５μＭの濃度で提供されるポリメラーゼと、
    少なくとも２μＭの濃度でそれぞれ提供される、前記標的核酸を増幅するように構成された一対のプライマーと
    を含む混合物を含むキット。
32. 温度サイクリングプロファイルを使用してＰＣＲを行うための説明書をさらに含み、各サイクルが１サイクルあたり１０秒未満のサイクル時間で完了する、請求項３１に記載のキット。
    

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