JP6567494B2 - ４’−チオ−修飾ヌクレオチドを有するリボ核酸及び関連方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国特許出願第６１／７８５，０９８号の、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その全体が、本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明は、４’−チオ−修飾ヌクレオチド残基を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、これらのｍＲＮＡを含む組成物、及びそれを作製し、使用する方法に関する。

メッセンジャーＲＮＡを使用する遺伝子治療は、様々な疾病の治療のためのアプローチとして提案されている。宿主内でのタンパク質産生の手段としての、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の導入の概念は、以前に報告されている。Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．７１：４８４−４８９（２００９）、Ｄｅｂｕｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．１４８：３３４−３４３（２０１０）。しかしながら、インビボでのタンパク質産生のためのｍＲＮＡの投与の成功は、典型的にｍＲＮＡがパッケージ化されている（例えば、ポリマーまたは脂質担体と複合したｍＲＮＡなど）ことを必要とした。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０６８１０号及び同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号を参照されたい。パッケージ化されていない（裸の）ｍＲＮＡの投与は、より安定かつ有益な治療もたらすために、化学修飾されたヌクレオチドがｍＲＮＡ内に組み込まれることを必要とした。例えば、Ｍ．Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１５４−１５９（２０１１）、Ｋ．Ｋａｒｉｋｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１６（１１）：１８３３−１８４０（２００８）を参照されたい。
インビボで産生され得る治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの投与は、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの投与、及び治療用タンパク質の直接投与に対する有意な利点を提供し得る。しかしながら、治療用タンパク質をコードする治療用ｍＲＮＡの開発は医学治療における有望な前進を表す一方で、そのような治療の有用性は、ｍＲＮＡ、特に全長タンパク質をコードするｍＲＮＡのインビボでの不良な安定性によって依然として限定され得る。
特に、遺伝子置換治療において使用されるｍＲＮＡの不良な安定性は、コードされた治療用タンパク質のインビボでの不十分な、またはより最適でない産生をもたらし得る。治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡの投与後、ｍＲＮＡは、例えば、１つ以上のヌクレアーゼへのインビボでの暴露時に、分解を受け得る。リボヌクレアーゼ（例えば、エンドリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡのより小さい成分への分解を触媒することができ、これによりｍＲＮＡに治療用タンパク質を産生することをできなくする、ヌクレアーゼ酵素の分類を表す。したがって、ヌクレアーゼ酵素（例えば、リボヌクレアーゼ）は、例えば、合成で、または組み換えで調製されたｍＲＮＡの循環半減期を短くすることができる。核酸分解による分解後、ｍＲＮＡは翻訳されないため、意図された治療用利益を発揮することが阻止され、これはｍＲＮＡ遺伝子治療の有効性を有意に低減し得る。

国際公開第２０１１／０６８１０号 国際公開第２０１２／１７０９３０号

Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．７１：４８４−４８９（２００９） Ｄｅｂｕｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．１４８：３３４−３４３（２０１０） Ｍ．Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１５４−１５９（２０１１） Ｋ．Ｋａｒｉｋｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１６（１１）：１８３３−１８４０（２００８）

本発明は、より安定、堅固、かつ持続したインビボでのタンパク質産生のための、改良された修飾ｍＲＮＡを提供する。本発明は、一部には、治療用タンパク質をインビボで産生するために使用されるｍＲＮＡの安定性が、リボース部分内の４’酸素が硫黄によって置換される修飾リボヌクレオチドを組み込むことによって、更に改良され得るという認識に基づく。リボヌクレオチドのリボース部分内の４’酸素の硫黄での置換は、Ｓ．Ｈｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐ．３：２０９−２１０（２００３））及びＭ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３７：１３５３−１３６２（２００９））によって以前に報告されているが、両方の報告が、ＲＮＡ干渉のための、最大１５残基長の４’−チオ残基を含有するＲＮＡの短い合成断片を含み、４’−チオ−修飾ヌクレオチドを含む１９〜２１残基長の短いＲＮＡもまた、ＲＮＡ干渉（Ｄａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：１６２４−１６３４（２００６））及びアプタマーの発現（最大５９残基長；Ｈｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３２：３８１５−３８２５（２００４）、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．３３：２９４２−２９５１（２００５）、Ｍｉｎａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６：９４５０−９４５６（２００８））が報告されている。しかしながら、これらの報告は、従来技術において試験されるあらゆる干渉ＲＮＡまたはアプタマーよりも、ずっと長い長さを一般的に有し、均一に二本鎖の状態では存在せず、大きな非螺旋及び／または単鎖の成分を有する立体構造の形をとり得る、全長ｍＲＮＡ（つまり、全長機能性治療用タンパク質をコードし、１つ以上の非コード領域を任意で含有するｍＲＮＡ）への４’−チオリボヌクレオチドの組み込みの効果について、予測的ではない。より重要なことに、本発明の前に、４’−チオ−修飾ヌクレオチドを組み込むｍＲＮＡが、インビボでのタンパク質産生のための使用に成功し得るのかどうかは不明であった。実施例を含めて本明細書に記載されるように、本発明者らは、１つ以上の４’−チオ−修飾ヌクレオチド（例えば、４’−チオ−ＡＴＰ、４’−チオ−ＵＴＰ、４’−チオ−ＧＴＰ、及び／または４’−チオ−ＣＴＰ）を組み込む全長ｍＲＮＡの合成に成功した。ｍＲＮＡの長さに対する懸念にも関わらず、本発明者らは、最大１００％の４’−チオ−ＡＴＰ、１００％の４’−チオ−ＵＴＰ、１００％の４’−チオ−ＧＴＰ、及び／または１００％の４’−チオ−ＣＴＰを組み込む全長ｍＲＮＡを合成することができた。実施例に示すように、そのような修飾ｍＲＮＡは無修飾ｍＲＮＡよりも安定し、驚くべきことに、そのような広範な修飾は修飾ｍＲＮＡがインビボで効果的に翻訳される能力に影響を与えないようである。

したがって、本発明は、例えば、ｍＲＮＡの安定性、免疫原性、及び翻訳効率に対するより良い制御を可能にするｍＲＮＡ、ならびにこれらのｍＲＮＡ及び任意で担体を含む組成物、ならびにこれらのｍＲＮＡ及び組成物を使用して、疾病及び／または障害の治療のための治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発する方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有するｍＲＮＡ分子であって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む、ｍＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド残基を含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、１００％のヌクレオチド残基を含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の４’−チオ−ＡＴＰを含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の４’−チオ−ＵＴＰを含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の４’−チオ−ＧＴＰを含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の４’−チオ−ＣＴＰを含有する。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、本明細書に記載される様々な４’−チオ−修飾ＮＴＰの組み合わせを含有する。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、非コード領域を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、ポリ−Ａ及び／またはポリ−Ｕテールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基を更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基は、５−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び２−チオ−ウリジンのうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基は、４’−チオ−フラノース環を組み込む。いくつかの実施形態において、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の非標準ヌクレオチド残基は、４’−チオ−フラノース環を組み込む。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも６０残基長である。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５００、約１，０００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００、約４，０００、約４，５００、または約５，０００残基長である。

本発明の更なる実施形態は、コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含む組成物であって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環及び担体を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡであって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環及び担体を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含み、ｍＲＮＡが、少なくとも６０残基長である、ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子であって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含み、ポリマーに基づく担体または脂質ナノ粒子と複合した、ｍＲＮＡ分子を含む。

本発明は、コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子であって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む、ｍＲＮＡ分子、またはそのようなｍＲＮＡ及び担体を含む組成物を対象に投与することを含む、治療用タンパク質をインビボで産生する方法を更に提供する。本発明はまた、コード領域及び任意で非コード領域を有する少なくとも１つのｍＲＮＡ分子であって、ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む、ｍＲＮＡ分子、またはそのようなｍＲＮＡ及び担体を含む組成物を投与することを含む、治療用タンパク質を必要とする対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法において投与されるｍＲＮＡは、少なくとも６０残基長である。本明細書に記載される様々な修飾ｍＲＮＡは、治療用タンパク質の産生のために、または様々な疾病、障害、または状態の治療のために使用され得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される修飾ｍＲＮＡを使用してタンパク質を産生する方法を提供する。そのようなタンパク質産生の方法は、インビトロの無細胞系、インビトロの細胞に基づく系、またはインビボの系において使用され得る。様々な実施形態において、適したｍＲＮＡは、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態において、適したｍＲＮＡは、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、最大約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド残基（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、及び／または非標準ＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）テールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも６０残基長である。

いくつかの実施形態において、本発明は、治療用タンパク質をインビボで産生することができる薬物の製造のための、提供されるｍＲＮＡ分子の使用を提供する。

いくつかの他の実施形態において、本発明は、提供されるｍＲＮＡを作製する方法を提供する。いくつかの他の実施形態において、本発明は、提供されるｍＲＮＡのインビトロでの合成のための方法を提供する。いくつかの他の実施形態において、本発明は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、最大約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド残基（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、及び／または非標準ＮＴＰ）を含有する、提供されるｍＲＮＡを作製する（例えば、インビトロで合成する）方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５００、約１，０００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００、約４，０００、約４，５００、または約５，０００残基長の、提供されるｍＲＮＡを作製する（例えば、インビトロで合成する）ための方法を提供する。

本発明の追加の目的及び利点は、一部は以下の記載において説明され、及び一部は記載から明らかになる、または本発明の実践によって学ばれるであろう。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせの手段によって認識され、達成されるであろう。

前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載の両方は、例示的かつ説明的であるのみであって、主張される本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの実施形態を図示し、記載と共に、本発明の原理を更に説明する役割を果たす。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有するｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡが、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む少なくとも１つのヌクレオチド残基を含む、前記ｍＲＮＡ分子。
（項目２）
前記アデノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも１％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目３）
前記グアノシン残基のうちの少なくとも１％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１または項目２に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目４）
前記ウリジン残基のうちの少なくとも１％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１〜３のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目５）
前記シチジン残基のうちの少なくとも１％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１〜４のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目６）
前記ヌクレオチド残基のうちの１０％未満が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目７）
前記残基のうちの少なくとも５０％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目８）
前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも９９％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、項目１〜５または７のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目９）
前記非コード領域がポリＡテールを含み、前記ポリＡテールが４’−チオ−アデノシン残基を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１０）
前記ポリＡテールが、少なくとも約９０ヌクレオチド残基長である、項目９に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１１）
前記ポリＡテールが、少なくとも約５００ヌクレオチド残基長である、項目９または項目１０に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１２）
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基を更に含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１３）
前記非標準ヌクレオチド残基が、５−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び２−チオ−ウリジンのうちの１つ以上から選択される、項目１２に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１４）
前記１つ以上の非標準ヌクレオシド残基が、４’−チオ−フラノースを含むように更に修飾される、項目１３に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１５）
前記分子が、少なくとも２００個のヌクレオチド残基を含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１６）
前記分子が、少なくとも５０００個のヌクレオチド残基を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１７）
前記コード領域が、治療用タンパク質をコードする、項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１８）
前記治療用タンパク質が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、インスリン、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、及びアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、１，４−アルファ−グルカン分枝酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ＧＬＵＴ−２、ＵＤＰグリコーゲンシンターゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート硫酸シルファターゼ、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコースアミダーゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ペチルマロニル（ｐｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ）−ＣｏＡムターゼ、尿酸オキシダーゼ、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、及び酸性アルファ−グルコシダーゼから選択される、項目１７に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
（項目１９）
項目１〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのｍＲＮＡ分子及び担体を含む、組成物。
（項目２０）
前記担体が、脂質を含む、項目１９に記載の前記組成物。
（項目２１）
前記ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子内に被包される、項目２０に記載の前記組成物。
（項目２２）
前記担体が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイ１−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタン酸）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、シス、またはトランスＨＧＴ５００１、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉＮ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＣ１２−２００から選択される１つ以上の陽イオン性脂質を含む脂質ナノ粒子である、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目２３）
前記脂質ナノ粒子が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、及びコレステロールから選択される１つ以上のヘルパー脂質を含む、項目２１または項目２２に記載の前記組成物。
（項目２４）
前記脂質ナノ粒子が、ペグ化脂質を含む、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目２５）
前記脂質ナノ粒子が、１つ以上の陽イオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びペグ化脂質を含む、項目２１に記載の前記組成物。
（項目２６）
前記担体が、ポリマーを含む、項目１９に記載の前記組成物。
（項目２７）
前記ポリマーが、ポリエチレンイミンである、項目２６に記載の前記組成物。
（項目２８）
項目１〜１８のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ、または項目１９〜２７のいずれか一項に記載の前記組成物を対象に投与することを含む、タンパク質をインビボで産生する方法。
（項目２９）
治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発することができる薬物の前記製造のための、項目１〜１８のいずれか一項の記載のｍＲＮＡ分子の使用。

図面は、例示の目的であるのみであって、限定の目的ではない。

例示的な４’−チオＲＮＡ塩基、４’−チオ−アデノシン、４’−チオ−グアノシン、４’−チオ−シチジン、４’−チオ−ウリジン、４’−チオ−５−メチル−シチジン、４’−チオ−プソイドウリジン、及び４’−チオ−２−チオウリジンの分子構造を示す。 修飾及び無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの遺伝子導入後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でのＦＦＬルシフェラーゼ産生からのルシフェラーゼ検出を示す。 修飾及び無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの安定性研究の結果を示す。 修飾及び無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの投与後の、マウス肝臓内でのＦＦＬルシフェラーゼ産生からのルシフェラーゼ検出を示す。

本明細書で使用する場合、「ｍＲＮＡ」という用語は、コード領域及び任意で非コード領域を含む、修飾及び／または無修飾ＲＮＡに言及するために使用される。「コード領域」という用語は、アミノ酸の鎖、すなわち、ペプチド結合によって結合した２つ以上のアミノ酸に翻訳され得るｍＲＮＡの一部または領域に言及する。アミノ酸の鎖はまた、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）に折り畳まれ得るペプチドまたはポリペプチドとも称され得る。「非コード領域」という用語は、典型的に翻訳されないｍＲＮＡの一部または領域に言及する。非コード領域は、典型的に、ポリ（Ａ）またはポリ（Ｕ）テールを含むが、これに限定されない、５’非翻訳領域及び／または３’非翻訳領域を含む。

「非標準核酸塩基」は、天然塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）以外の塩基部分である。Ｔの類似体はまた、一般的にＵの類似体でもあり、その逆もまた同様であるという例外はあるものの、非標準核酸塩基は、核酸二重螺旋（ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鋳型の転写中に形成されるものなどの局所ＲＮＡ−ＤＮＡ螺旋を含む）内のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによる組み込みの、核酸二重螺旋及び遺伝子座内のその塩基対合特性が、既に列記した５つの核酸塩基のうちの１つに最も類似する際の、特定の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）の類似体である。「ヌクレオシド」、「塩基」、「ヌクレオチド」、または「残基」を含むが、これに限定されない用語と併せて使用される「非標準」という用語は、「核酸塩基」と併せて使用される場合と同一の様式で解釈されるべきである。

本明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」という用語は、対象に投与される場合、対象の健康及び健全性に対して有益な効果を提供する任意のタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、対象におけるそのタンパク質の欠乏、欠如、または異常発現は、疾病または状態を生じさせる。「治療用タンパク質」はまた、所望の治療的効果を達成するために、対象において通常は存在しない、または通常は十分な量で存在しないタンパク質にも言及し得る。

「ヘルパー脂質」という用語は、本明細書で使用する場合、コレステロールを含む任意の中性または双性イオン脂質材料に言及する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ヘルパー脂質は、脂質二重層／ナノ粒子内に安定性、強剛性、及び／または流動性を追加し得る。

本発明のｍＲＮＡは、メッセンジャーリボ核酸分子へと置換して、対象に投与される際のその生物学的特性を向上させるために、ヌクレオチド残基のリボース部分内の４’酸素が硫黄で置換される特定の化学修飾された塩基を用いる。本発明のｍＲＮＡへの組み込みのための例示的４’−チオ修飾ヌクレオチド残基を、図１に描写する（チオ−置換フラノース環を含有する修飾ヌクレオチド残基を示す）。いくつかの実施形態において、フラノース環の４’−チオ修飾は、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、及び／またはヒト血清中の他のＲＮＡ分解酵素に対する改良された抵抗性を提供する。そのような安定性は、増大したＲＮＡ半減期を提供し得る。したがって、例えば、フラノース環内に４’−チオ修飾を有するｍＲＮＡまたはそのようなｍＲＮＡを含む組成物の投与は、改良された生物学的特性、例えば、それが今度はインビボでの増大したタンパク質産生に寄与する増大した半減期を有するｍＲＮＡの細胞取り込みをもたらす。

特定の実施形態において、ＲＮＡ内のアデノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも１％は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ｍＲＮＡ内のアデノシンのうちの約１〜５％、５〜１５％、１５〜３０％、３０〜５０％、５０〜７５％、７５〜９０％、９０〜９９％、または９９〜１００％は、４’−チオ−アデノシンであり得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のアデノシン残基のうちの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％は、４’−チオ−アデノシンである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のアデノシン残基のうちの約１００％は、４’−チオ−アデノシンである。

特定の実施形態において、ＲＮＡ内のグアノシンヌクレオチド残基のうちの少なくとも１％は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ｍＲＮＡ内のグアノシンのうちの約１〜５％、５〜１５％、１５〜３０％、３０〜５０％、５０〜７５％、７５〜９０％、９０〜９９％、または９９〜１００％は、４’−チオ−グアノシンであり得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のグアノシン残基のうちの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％は、４’−チオ−グアノシンである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のグアノシン残基のうちの約１００％は、４’−チオ−グアノシンである。

特定の実施形態において、ＲＮＡ内のウリジンヌクレオチド残基のうちの少なくとも１％は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ｍＲＮＡのウリジンのうちの約１〜５％、５〜１５％、１５〜３０％、３０〜５０％、５０〜７５％、７５〜９０％、９０〜９９％、または９９〜１００％は、４’−チオ−ウリジンであり得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のウリジン残基のうちの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％は、４’−チオ−ウリジンである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のウリジン残基のうちの約１００％は、４’−チオ−ウリジンである。

特定の実施形態において、ＲＮＡ内のシチジンヌクレオチド残基のうちの少なくとも１％は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ｍＲＮＡ内のシチジンのうちの約１〜５％、５〜１５％、１５〜３０％、３０〜５０％、５０〜７５％、７５〜９０％、９０〜９９％、または９９〜１００％は、４’−チオ−シチジンであり得る。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のシチジン残基のうちの少なくとも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％は、４’−チオ−シチジンである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ内のシチジン残基のうちの約１００％は、４’−チオ−シチジンである。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡ内の各４’−チオ−修飾ヌクレオチドは、４’−チオ−ウリジンである。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡ内の各４’−チオ−修飾ヌクレオチドは、４’−チオ−シチジンである。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡ内の各４’−チオ−修飾ヌクレオチドは、独立して４’−チオ−ウリジンまたは４’−チオ−シチジンである。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上の４’−チオ−ウリジンまたは４’−チオ−シチジンを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの４’−チオ−アデノシン残基を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの４’−チオ−グアノシン残基を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの４’−チオ−グアノシンまたは４’−チオ−アデノシン残基を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上の４’−チオ−グアノシンまたは４’−チオ−アデノシン残基を含む。

特定の実施形態において、１つの塩基型（例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン）の、フラノース環内に４’−チオ修飾を有するヌクレオチド残基の画分は、他の塩基型の修飾ヌクレオチド残基の画分とは独立して変化する。

特定の実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの１０％未満は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ヌクレオチド残基のうちの約１〜５％、５〜１０％、３〜５％、１〜３％、０．１〜１％、または０．０１〜０．１％は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。

他の実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの１０％超は、フラノース環内に４’−チオ修飾を有する。例えば、ヌクレオチド残基のうちの約１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、または４５〜５０％は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの５０％超は、フラノース環内に４’−チオＲＮＡ修飾を有する。例えば、ヌクレオチド残基のうちの約５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％、９５〜９７％、９７〜９８％、９８〜９９％、９９〜９９．９％、または９９．９〜１００％は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む。

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド残基のうちの少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む。いくつかの実施形態において、約１００％のヌクレオチド残基は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込み得る。

本発明のｍＲＮＡ内のコード領域及び非コード領域は、配列の非近接領域を包含し得る。任意の非コード領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテール、及び／または５’キャップ構造のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、非コード領域を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、ポリＡテールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ配列、３’−ＵＴＲ配列、及びポリＡテールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ配列、コード領域、３’−ＵＴＲ配列、及びポリＡテールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ配列、５’キャップ、３’−ＵＴＲ配列、及びポリＡテールを含む。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ配列、５’キャップ、コード領域、３’−ＵＴＲ配列、及びポリＡテールを含む。

特定の実施形態において、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテールは、４’−チオ−置換フラノース環を組み込むヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態において、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテール、あるいは非コード領域の他の成分のみが、フラノース環内に４’−チオ置換を有するヌクレオチド残基を組み込む一方で、ｍＲＮＡ分子内のヌクレオチド残基の残部は、４’−チオ−フラノース修飾を含有しない。いくつかの実施形態において、コード領域は、４’−チオ−置換フラノース環を組み込むヌクレオチド残基を含む。特定の実施形態において、コード領域及び非コード領域の両方（存在する場合）は、フラノース環内に４’−チオ置換を有するヌクレオチド残基を組み込む。特定の実施形態において、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテールの長さは、変化し得る。例えば、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテールの長さは、少なくとも約５０、７０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、またはポリ−Ｃテールの長さは、約９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００ヌクレオチド長未満であり得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、４’−チオ−置換フラノース環に加えて、他の修飾を含み得る。例えば、分子は、非標準核酸塩基を組み込み得る。特定の実施形態は、５−メチル−シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン（「ψＵ」）、２−チオ−ウリジン（「２ｓＵ」）、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンシトシン、及びこれらの修飾の組み合わせなどのヌクレオチド残基修飾、ならびに他のヌクレオチド残基修飾を含み得る。特定の実施形態は、フラノース環またはヌクレオチド残基の他の部分、例えば、核酸塩基に対する追加の修飾を更に含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、４’−チオ置換フラノース環は、例えば、プソイドウリジン、２−チオウリジン、及び５−メチルシチジンなどの無修飾塩基または修飾塩基内に含まれ得る。特定の実施形態において、これらの修飾のいずれも、ヌクレオチド残基の０〜１００％で、例えば、０％超、１％超、１０％超、５０％超、９０％超、または９５％超、あるいは個別または組み合わせでのヌクレオチド残基の１００％で存在し得る。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基は、５−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び２−チオ−ウリジンのうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、５−メチル−シチジン内に少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基は、４’−チオ−フラノース環を組み込む。いくつかの実施形態において、最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の非標準ヌクレオチド残基は、４’−チオ−フラノース環を組み込む。

追加の修飾は、例えば、糖修飾または糖置換（例えば、２‘−Ｏ−アルキル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの１つ以上）を含み得る。糖修飾が２‘−Ｏ−アルキル修飾である実施形態において、そのような修飾は、２‘−デオキシ−２‘−フルオロ修飾、２‘−Ｏ−メチル修飾、２‘−Ｏ−メトキシエチル修飾、及び２‘−デオキシ修飾を含み得るが、これに限定されない。

特定の実施形態において、ｍＲＮＡのうちの０〜１００％は、単鎖であり得る。特定の実施形態において、ＲＮＡのうちの０〜１００％は、非螺旋立体構造の形をとり得る。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約１００％が４’−チオ−ウリジンで置換される、ｍＲＮＡを含む。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約１００％が４’−チオ−ウリジンで置換され、シチジン残基の約１００％が５−メチル−シチジンで置換される、ｍＲＮＡを含む。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約１００％が４’−チオ−プソイドウリジンで置換される、ｍＲＮＡを含む。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ウリジン残基の約１００％が４’−チオ−プソイドウリジンで置換され、シチジン残基の約１００％が５−メチル−シチジンで置換される、ｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、有益な生物学的効果を提供し、これは、例えば、対応する天然ｍＲＮＡと比較して、増大した安定性、改良されたタンパク質産生率、及び／またはより高いタンパク質収率を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、対応する天然ｍＲＮＡ（すなわち、修飾を有さない対応するｍＲＮＡ）と比較して、インビボで投与される際、増大した安定性（例えば、より長い血清半減期）を有する。

本発明のｍＲＮＡは、対象への投与時にｍＲＮＡ転写物から翻訳される治療用タンパク質の量の増大を、修飾を有さない対応するｍＲＮＡと比較して、少なくとも約２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３６％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、７５０％、８００％、９００％、または１，０００％、もたらす程度まで、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）分解に対してより抵抗性であり得る。

特定の実施形態において、本発明の組成物内の修飾ｍＲＮＡ分子の長さは、少なくとも２００ヌクレオチド残基長である。例えば、ｍＲＮＡは、少なくとも約２００、３００、４００、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチド残基長であり得る。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも６０残基長である。いくつかの実施形態において、提供されるｍＲＮＡは、少なくとも約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、または約７０００残基長である。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡによってコードされた治療用タンパク質は、そのタンパク質の欠乏、欠如、または異常発現が、疾病及び／または状態を生じさせる、任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、酵素であり得る。他の実施形態において、治療用タンパク質は、所望の治療的効果を達成するために、対象において通常存在しない、または通常は十分な量で存在しないものである。

例えば、適した治療用タンパク質の非限定的な選択は、エリスロポエチン、インスリン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、インスリン、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、１，４−アルファ−グルカン分枝酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ＧＬＵＴ−２、ＵＤＰグリコーゲンシンターゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート硫酸シルファターゼ（ｓｉｌｆａｔａｓｅ）、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコースアミダーゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、例えば、第ＶＩＩＩ因子、及び第ＩＸ因子などの凝血因子、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、尿酸オキシダーゼ、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、ならびに酸性アルファ−グルコシダーゼを含む。

特定の実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、裸の、またはパッケージ化されていないｍＲＮＡとして投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物内のｍＲＮＡの投与は、適した担体の包含によって促進され得る。特定の実施形態において、担体は、１つ以上のｍＲＮＡを有する標的細胞の遺伝子導入を促進する、その能力に基づいて選択される。

本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、ｍＲＮＡを含む、生物学的活性剤の投与に関する使用を一般的に意図される、あらゆる標準的な医薬担体、媒介物、希釈剤、賦形剤、及び同様物を含む。本明細書に記載される組成物、及び特に担体は、多様なサイズのｍＲＮＡをそれらの標的細胞または組織に送達する、及び／または安定化することができる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、大きなｍＲＮＡ（例えば、少なくとも５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、またはそれ以上のｍＲＮＡ、あるいは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、または７，０００残基長のｍＲＮＡ）を送達することができる担体を含む。本発明に従うｍＲＮＡは、あらゆる様々な既知の方法に従って合成され得る。例えば、本発明に従うｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、所望の量（複数可）の４’−チオ−修飾標準及び／または非標準リボヌクレオチド（例えば、１つ以上の所望の４’−チオ−ＮＴＰ（複数可））を含むリボヌクレオチドトリリン酸の貯蔵所であるプロモーターを含有する、線状または環状ＤＮＡ鋳型で典型的に実行され、ＤＴＴ及びマグネシウムイオン、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害剤を含み得る緩衝系である無修飾リボヌクレオチドトリリン酸と任意で混合される。正確な条件は、特定の用途に従って変化するであろう。４’−チオ−修飾標準及び／または非標準リボヌクレオチドが、任意の長さの全長ｍＲＮＡに効果的に組み込まれ得ることが観察される。

いくつかの実施形態において、本発明に従うｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡ鋳型は、インビトロで転写される。適したＤＮＡ鋳型は、インビトロでの転写のために、プロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーターを典型的に有し、対象のタンパク質及び終了信号をコードするための所望のヌクレオチド配列が続く。典型的に、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ−末端（５’）の端部への「キャップ」の添加、及びＣ−末端（３’）の端部への「テール」の添加を含む。キャップの存在は、ヌクレアーゼに対して、ほとんどの真核生物細胞に見られる抵抗性を提供する上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。

したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従うｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的に以下のように添加される。まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、末端リン酸基のうちの１つを５’ヌクレオチドから除去し、２つの末端リン酸を残す。その後、グアニリルトランスフェラーゼによってグアノシントリリン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸に添加し、５’５’５トリリン酸連鎖を産生する。その後、メチルトランスフェラーゼによってグアニンの７−窒素をメチル化する。キャップ構造の例は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含むが、これに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明に従うｍＲＮＡは、３’テール構造を含む。適した３’テール構造は、ポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、及び／またはポリ−Ｃテールを含むが、これに限定されない。例示的な適したポリ−Ａ、ポリ−Ｕ、及びポリ−Ｃテールは、上記に記載される。ポリ−Ｕまたはポリ−Ｃテールは、ポリＡテールに添加されても、ポリＡテールを置換してもよい。

いくつかの実施形態において、本発明に従うｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチド長（例えば、約５０〜４００ヌクレオチド長、約５０〜３００ヌクレオチド長、約５０〜２００ヌクレオチド長、または約５０〜１００ヌクレオチド長）の間であり得る。

本発明の特定の実施形態において、担体は、標的細胞、組織、または器官へのｍＲＮＡの送達を最適化するように選択及び／または調製され得る。例えば、標的細胞が肺細胞である場合、担体の特性（例えば、サイズ、電荷及び／またはｐＨ）は、そのような担体を標的細胞または器官に効果的に送達し、免疫クリアランスを低減し、及び／またはその標的器官内での維持を促進するように最適化され得る。あるいは、標的組織が中枢神経系である場合、（例えば、標的脳領域（複数可）または脊髄組織へのｍＲＮＡポリヌクレオチドの送達を促進するための）担体の選択及び調製は、血液脳関門の透過及びその内部での維持、及び／またはそのような担体をそのような標的組織に直接送達する代替手段の使用を考慮しなくてはならない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、局所組織または器官から、そのような組成物が１つ以上の末梢標的器官または組織に投与される場所への、外因性ポリヌクレオチドの転移を促進する薬剤と組み合わせられ得る。

特定の実施形態において、本発明の組成物内で用いられる担体は、ｍＲＮＡの標的細胞及び組織への転移を促進するためのリポソーム小胞、または他の手段を含み得る。適した担体は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成誘導エキソソームの両方、天然、合成、及び半合成ラメラ体、ナノ微粒子、カルシウム蛍光体−ケイ酸ナノ微粒子、ゾルゲル、カルシウムリン酸ナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、ナノ結晶性微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンに基づく送達系、ミセル、乳剤、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、カルシウムリン酸ヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他のベクトル性タグなどのポリマーに基づく担体を含むが、これに限定されない。バイオナノカプセル及び他のウイルス性キャプシドタンパク質アセンブリの適した担体としての使用もまた、企図される。（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（９）：８８７−９５（２００８））。

本発明の特定の実施形態において、担体は、単体で、または他の担体との組み合わせで、ポリマーを担体として使用して製剤化される。適したポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコライドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ペグ化プロタミン、ＰＬＬ、ペグ化ＰＬＬ、及び分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を含むが、これに限定されない、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリマーは、１つ以上の多ドメインブロックポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリマーまたはポリマー（複数）の乾燥粉末製剤を含み得る。

ポリヌクレオチドの標的細胞への送達を促進するためのリポソーム担体の使用もまた、本発明によって企図される。リポソーム（例えば、リポソーム脂質ナノ粒子）は、研究、工業、及び医薬における様々な用途において、特に診断用または治療用化合物の担体としてのインビボでのそれらの使用のために、一般的に有用であり（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１（１９９８）、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５１：６９１−７４３（１９９９））、通常、１つ以上の二重層の膜によって外部培地から隔絶された内部水間隙を有する微視的な小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって典型的に形成される。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマー及び界面活性物質（例えば、ポリメロソーム、ニオソームなど）によっても形成され得る。

特定の実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、脂質ナノ粒子と複合して、標的細胞への送達を促進する。適した脂質の例は、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）を含む。特定の実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子及び組成物は、様々な核酸に基づく材料を被包するように設計された、１つ以上の陽イオン性脂質、ヘルパー脂質、及びペグ化脂質を用いる多様な比率の多成分性脂質混合物と組み合わせられ得る。

陽イオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ジアルキルアミノに基づく、イミダゾールに基づく、グアニジウムに基づく、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタン酸）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＨＧＴ４００３（その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１２／１７０８８９）、ＩＣＥ（その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／０６８８１０、）、ＨＧＴ５０００（その教示の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されるものなどのアミノアルコール脂質様物、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１０７：２７６−２８７（２００５））、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０））、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７：１８６４−１８６９（２０１０））を含み得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、陽イオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２：

である。

適したヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、及びコレステロールを含むが、これに限定されない。

ナノ粒子製剤における使用のためのペグ化脂質は、Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）で脂質に共有的に結合した、最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ−ＤＳＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びＰＥＧ−セラミドを含むが、これに限定されない。

特定の実施形態において、脂質ナノ粒子担体は、以下の脂質製剤のうちの１つを含む：
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ＸＴＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ；
ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ；
ＡＬＮＹ−１００、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＳＧ。

特定の実施形態において、これらのｍＲＮＡを含む本発明のｍＲＮＡ及び組成物は、全身的な様式よりもむしろ局所的な様式で、例えば、好適には持続した放出性製剤での、標的組織への直接の医薬組成物の注入によって、投与され得る。局所送達は、標的とされる組織に応じて、様々な方法で形を帯び得る。例えば、本発明のｍＲＮＡ及び組成物を含有するエアロゾルは、吸入され得る（経鼻、気管、または気管支送達のため）。本発明のｍＲＮＡ及び組成物は、例えば、傷害、疾病の顕性化、疼痛の部位に注入され得る。組成物は、経口、気管、または食道適用のためにロゼンジで提供され得る。胃への、または腸内への投与のために、液体、錠剤、またはカプセルの形態で供給され得、直腸または腟適用のために坐薬の形態で供給され得、またはクリーム、液滴の使用によって、または注入によっても、目へさえも送達され得る。

本明細書に企図されるのはまた、本明細書に開示されるリポソームナノ粒子のうちの１つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物、及び例えば、その教示の全体が本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号に開示されるような、そのような凍結乾燥された組成物の使用のための関連方法である。例えば、本発明の凍結乾燥されたｍＲＮＡ及び組成物は、投与前に再構成され得る、またはインビボで再構成され得る。例えば、凍結乾燥されたｍＲＮＡ及び／または組成物は、適切な剤形（例えば、円板、杆体、または膜など皮内剤形）で製剤化され、その剤形が、個体の体液によってインビボで経時的に再水和するように投与され得る。

特定の実施形態において、本発明のｍＲＮＡまたは組成物を投与することを含む、対象を治療する方法もまた、企図される。例えば、本発明の特定の実施形態は、特定のタンパク質の産生、及び／または特定のタンパク質の利用が不十分な、または易感染性である状態を治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、標的細胞内の１つ以上のｍＲＮＡの翻訳効率を調節する（例えば、増大する、改良する、または他の方法で向上させる）方法を提供する。本明細書で使用する場合、「翻訳効率」という語句は、ｍＲＮＡが翻訳され、コードされた治療用タンパク質が産生される程度に言及する。

特定の実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子、またはそのようなｍＲＮＡを含む組成物は、患者に投与される。

いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子、またはそのようなｍＲＮＡを含む組成物は、インビトロまたはインビボ系におけるタンパク質産生のために使用される。適したインビトロ系私のは、インビトロの無細胞系またはインビトロの細胞に基づく系である。適したインビボ系は、非ヒト動物（例えば、ラット、マウス、豚、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、非ヒト霊長類など）、またはヒトなどの、任意の生きている生物であり得る。

以下の特定の実施例は、図示的なもののみとして解釈されるべきであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。更なる精錬なく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその最大限まで利用し得ると考えられる。

実施例１：４’−チオ−置換フラノース環を組み込むｍＲＮＡの合成及び発現
タンパク質をコードするｍＲＮＡを合成する。ｍＲＮＡは、少なくとも１つの４’−チオ−置換フラノース環を含有する。ｍＲＮＡは、医薬組成物に製剤化され、対象に投与される。ｍＲＮＡは、より長い半減期を呈し、４’−チオ−置換フラノース環を含有しない対照ｍＲＮＡよりも多い量の、ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の合成もたらし得る。

Ｉ．製剤の実験的詳細：
Ｉ−Ａ．メッセンジャーＲＮＡ材料
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）を、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって合成し、ゲル電気泳動によって決定される、５’キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８６：１２３９−１２４９（２００５））及び約２００ヌクレオチド長の３’ポリ（Ａ）テールの添加を続ける。各ｍＲＮＡ産生物中に存在する５’及び３’非翻訳領を、それぞれＸ及びＹとして表し、述べるように定義した（下記参照）。

ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（配列番号１）：Ｘ_１ＡＵＧＧＧＧＧＵＧＣＡＣＧＡＡＵＧＵＣＣＵＧＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＵＵＣＵＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＵＣＡＵＣＵＧＵＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＵＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＡＣＣＵＣＵＵＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＡＧＣＵＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＵＣＵＡＵＧＣＣＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＧＵＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＵＡＧＡＡＧＵＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＵＧＵＵＧＧＵＣＡＡＣＵＣＵＵＣＣＣＡＧＣＣＧＵＧＧＧＡＧＣＣＣＣＵＧＣＡＧＣＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＵＵＣＧＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＧＧＧＣＵＣＵＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＣＵＣＣＡＣＵＣＣＧＡＡＣＡＡＵＣＡＣＵＧＣＵＧＡＣＡＣＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＣＧＡＧＵＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＵＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＵＧＡＹ_１

ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡ（配列番号２）：Ｘ_１ＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＵＧＣＧＣＧＣＵＵＧＣＧＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＣＧＵＵＵＣＣＵＧＧＧＡＣＡＵＣＣＣＵＧＧＧＧＣＵＡＧＡＧＣＡＣＵＧＧＡＣＡＡＵＧＧＡＵＵＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＵＡＣＣＡＵＧＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＧＧＧＡＧＣＧＣＵＵＣＡＵＧＵＧＣＡＡＣＣＵＵＧＡＣＵＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＵＵＣＣＵＧＣＡＵＣＡＧＵＧＡＧＡＡＧＣＵＣＵＵＣＡＵＧＧＡＧＡＵＧＧＣＡＧＡＧＣＵＣＡＵＧＧＵＣＵＣＡＧＡＡＧＧＣＵＧＧＡＡＧＧＡＵＧＣＡＧＧＵＵＡＵＧＡＧＵＡＣＣＵＣＵＧＣＡＵＵＧＡＵＧＡＣＵＧＵＵＧＧＡＵＧＧＣＵＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＵＵＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＵＣＡＧＣＧＣＵＵＵＣＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＵＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＣＵＡＡＵＵＡＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＡＵＵＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＵＧＧＡＡＡＵＡＡＡＡＣＣＵＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＵＵＵＧＧＡＵＡＣＵＡＣＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＣＣＣＡＧＡＣＣＵＵＵＧＣＵＧＡＣＵＧＧＧＧＡＧＵＡＧＡＵＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＧＡＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＧＵＧＡＣＡＧＵＵＵＧＧＡＡＡＡＵＵＵＧＧＣＡＧＡＵＧＧＵＵＡＵＡＡＧＣＡＣＡＵＧＵＣＣＵＵＧＧＣＣＣＵＧＡＡＵＡＧＧＡＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＵＵＧＵＧＵＡＣＵＣＣＵＧＵＧＡＧＵＧＧＣＣＵＣＵＵＵＡＵＡＵＧＵＧＧＣＣＣＵＵＵＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＵＵＡＵＡＣＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＣＡＧＵＡＣＵＧＣＡＡＵＣＡＣＵＧＧＣＧＡＡＡＵＵＵＵＧＣＵＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＧＵＡＵＡＡＡＧＡＧＵＡＵＣＵＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＵＵＵＵＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＵＵＧＵＵＧＡＵＧＵＵＧＣＵＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧＧＵＵＧＧＡＡＵＧＡＣＣＣＡＧＡＵＡＵＧＵＵＡＧＵＧＡＵＵＧＧＣＡＡＣＵＵＵＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＣＡＡＧＵＡＡＣＵＣＡＧＡＵＧＧＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＵＧＣＵＣＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＧＵＣＵＡＡＵＧＡＣＣＵＣＣＧＡＣＡＣＡＵＣＡＧＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＵＣＵＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＡＡＧＧＡＣＧＵＡＡＵＵＧＣＣＡＵＣＡＡＵＣＡＧＧＡＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＧＧＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＧＧＧＣＵＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＣＧＣＵＣＵＵＡＵＡＣＣＡＵＣＧＣＡＧＵＵＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＵＡＡＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＣＣＵＧＣＵＵＣＡＵＣＡＣＡＣＡＧＣＵＣＣＵＣＣＣＵＧＵＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＵＵＣＵＡＵＧＡＡＵＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＧＵＵＡＡＧＡＡＧＵＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＡＧＡＡＡＡＵＡＣＡＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＡＡＡＡＧＡＣＵＵＡＣＵＵＵＡＡＹ_１

コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（配列番号３）：Ｘ_２ＡＵＧＧＡＡＧＡＵＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＡＣＣＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＣＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＧＣＣＵＵＵＡＣＣＧＡＣＧＣＡＣＡＵＡＵＣＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＵＡＣＣＵＡＣＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＣＧＧＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＵＧＧＧＣＵＧＡＡＵＡＣＡＡＡＣＣＡＵＣＧＧＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＵＡＧＣＵＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＣＧＵＧＵＵＧＧＧＵＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＵＧＣＡＡＡＡＧＡＵＣＣＵＣＡＡＣＧＵＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＵＡＣＣＧＡＵＣＡＵＡＣＡＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＵＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＡＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＵＧＡＣＵＵＣＣＣＡＵＵＵＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＵＡＧＵＧＧＣＡＧＵＡＣＣＧＧＡＵＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＣＣＣＵＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＵＵＧＵＧＵＣＣＧＡＵＵＣＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＣＣＵＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＧＣＵＧＧＧＣＵＡＣＵＵＧＡＵＣＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＣＧＵＧＣＵＣＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＡＵＵＣＵＵＧＣＧＣＡＧＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＧＡＵＵＣＡＡＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＣＡＣＵＡＵＵＵＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＡＡＧＣＡＡＣＵＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＧＧＵＧＡＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＵＵＣＣＡＣＣＵＡＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＡＧＵＡＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＣＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＵＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＵＡＡＧＡＣＡＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＡＵＧＡＵＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＡＣＧＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＵＧＧＡＧＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＵＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＵＧＧＵＧＵＵＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＵＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＵＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＵＣＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＹ_２

Ｘ_１（５’非翻訳配列）（配列番号４）：ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ

Ｘ_２（５’非翻訳配列）（配列番号５）：
ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ

Ｙ_１（３’非翻訳配列）（配列番号６）：
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣ

Ｙ_２（３’非翻訳配列）（配列番号７）：
ＵＵＵＧＡＡＵＵ

Ｉ−ｂ．製剤プロトコル
プロトコルＡ：Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈する。別個に、ＧＬＡ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、振盪して、２０％エタノール中に最終懸濁液を生じさせる。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管する。最終濃度＝０．８５ｍｇ／ｍＬのＧＬＡ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ平均＝８１．２ｎｍ（偏差（５０）＝６３．２ｎｍ；偏差（９０）＝１０４ｎｍ）。

プロトコルＢ：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈する。別個に、ＥＰＯ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、振盪して、２０％エタノール中に最終懸濁液を生じさせる。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．３５ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ平均＝７５．９ｎｍ（偏差（５０）＝５７．３ｎｍ；偏差（９０）＝９２．１ｎｍ）。

プロトコルＣ：２．０ｍｇ／ｍＬの水性溶液ＰＥＩ（分枝状、２５ｋＤａ）の一定分量を、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの水性溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）と混合する。結果として生じる複合した混合物を、上下に数回ピペッティングし、注入前に２０分間放置する。最終濃度＝０．６０ｍｇ／ｍＬのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ平均＝７５．９ｎｍ（偏差（５０）＝５７．３ｎｍ；偏差（９０）＝９２．１ｎｍ）。

ＩＩ．修飾メッセンジャーＲＮＡ対無修飾ｍＲＮＡの分析：
ＩＩ−ａ．メッセンジャーＲＮＡ構築物内の修飾塩基の定量化
４’−チオＮＴＰ修飾メッセンジャーＲＮＡを、リボヌクレアーゼＩまたはヌクレアーゼＰ１に様々な期間にわたって供し、十分に分解させる。完了時、結果として生じる一リン酸ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで更に分解して、それぞれのヌクレオシドを提供する。ヌクレオシド混合物を、効率的な酵素除去のためにＡｍｉｃｏｎスピンカラム（３０，０００ＭＷＣＯ）に適用する。結果として生じるヌクレオシド溶液を、ＨＰＬＣによって分析し、それぞれの無修飾ヌクレオシドとのピーク面積比較によって定量化する。

ＩＩ−ｂ．４’−チオＮＴＰ修飾メッセンジャーＲＮＡ構築物の安定性
４’−チオＮＴＰ修飾メッセンジャーＲＮＡを、リボヌクレアーゼＩまたはヌクレアーゼＰ１に様々な期間にわたって供し、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を評価する。同様に、４’−チオＮＴＰ修飾メッセンジャーＲＮＡを、血清（ヌクレアーゼを含有）で様々な期間にわたって処理し、ヌクレアーゼ分解を評価した。指定の時点で、ヌクレアーゼ反応物を阻害剤で急冷し、結果として生じる溶液を、効率的な酵素除去のためにＡｍｉｃｏｎスピンカラム（３０，０００ＭＷＣＯ）に適用する。完了時、残余分をアガロースゲルに適用し、ｍＲＮＡ構築物の生存率（サイズ、分解産生物など）について分析する。同一の実験を無修飾ｍＲＮＡ上に実行し、直接比較及び推測が導かれ得る。

ＩＩ−ｃ．タンパク質産生に対する４’−チオＮＴＰ修飾メッセンジャーＲＮＡの効果
インビトロでの研究：４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ及び無修飾ｍＲＮＡのインビトロでの遺伝子導入を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して実行する。１マイクログラムの各ｍＲＮＡ構築物の遺伝子導入を、別個のウェル内でリポフェクタミンを使用して実行する。選択時点（例えば、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間など）で細胞を収集し、それぞれのタンパク質産生を分析する。ＦＦＬ ｍＲＮＡにおいて、生物発光アッセイによって、細胞可溶化液をルシフェラーゼ産生について分析する。ＥＰＯ及びＧＬＡ ｍＲＮＡ研究において、細胞上清を取得し、ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、ＥＰＯ及びＧＬＡタンパク質についてそれぞれ分析する。無修飾対４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡの経時的なタンパク質産生の比較が、行われ得る。

インビボでの研究：経時的なタンパク質産生の比較を、野生型マウス（ＣＤ−１）への４’チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ被包ナノ粒子（脂質またはポリマー）の注入、対同一の様式で送達される無修飾ｍＲＮＡによって行う。選択時点（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間など）で血清及び器官を採取し、それぞれのタンパク質レベルを監視する。ＦＦＬ ｍＲＮＡにおいて、生物発光アッセイによって、肝臓ホモジネートをルシフェラーゼ産生について分析する。ＥＰＯ及びＧＬＡｍＲＮＡ研究において、マウス血清を取得し、ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、ＥＰＯ及びＧＬＡタンパク質についてそれぞれ分析する。無修飾対４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡの経時的なタンパク質産生の比較を行う。

同様に、被包されていない（裸の）４’チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ及び無修飾ｍＲＮＡを、静脈内、皮下、または気管内投与のいずれかによって注入し、安定性及びタンパク質産生の差を評価するために、上記に記載されるような同一の分析が、実行され得る。

ＩＩＩ．投与された裸の修飾ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ負荷ナノ粒子によって産生されるＦＦＬ、ＥＰＯ、及びＧＬＡタンパク質の分析：
ＩＩＩ−ａ．注入プロトコル
全ての研究は、各実験の開始時点で生後約６〜８週間の雄のＣＤ−１マウスを使用して実行する。試料を、３０〜２００マイクログラムの等価全用量の被包されていない、または被包されたＦＦＬ、ＥＰＯ、またはＧＬＡ ｍＲＮＡ（修飾または無修飾）の単一ボーラス尾静脈注入によって導入する。指定された時点でマウスを屠殺し、生理食塩水で灌流する。

ＩＩＩ−ｂ．分析のための器官組織の単離
各マウスの肝臓及び脾臓を収集し、３つの部分に配分し、分析のために、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保管するか、またはスナップ冷凍し、−８０℃で保管するかのいずれかにする。

ＩＩＩ−ｃ．分析のための血清の単離
全ての動物を、ＣＯ_２窒息によって用量投与（±５％）の４８時間後に安楽死させ、開胸及び末端心臓血液採取を続ける。安楽死させた動物への心臓穿刺によって、血清分離チューブ内に全血（最大取得可能容積）を採取し、室温で少なくとも３０分間凝血させ、２２℃±５℃で、９３００ｇで１０分間遠心分離し、その後血清を抽出する。中間血液採取のために、顔面静脈穿刺または尾切除によって約４０〜５０μＬの全血を採取する。未処理の動物から採取した試料を、研究動物との比較のための基線ＧＬＡレベルとして使用する。

ＩＩＩ−ｄ．酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析
ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ：ＥＰＯタンパク質の定量化を、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃Ｄｅｐ−００）について報告される手順に従って実行する。用いられ得る陽性対照は、超高純度、及び組織培養等級の組み換えヒトエリスロポエチンタンパク質（それぞれ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２８６−ＥＰ及び２８７−ＴＣ）からなる。指定された時点で血液試料を採取し、上記に記載するように処理する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置上吸収（４５０ｎｍ）によって、検出を監視する。

ＧＬＡ ＥＬＩＳＡ：ヒツジ抗ＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標）Ｇ−１８８ＩｇＧを捕捉抗体として、ウサギ抗ＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標）ＴＫ−８８ＩｇＧを二次（検出）抗体として用いて、標準ＥＬＩＳＡ手順に従った（Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性化のために使用する。２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して、反応物を２０分後に急冷する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置上吸収（４５０ｎｍ）によって、検出を監視する。未処理のマウス血清及びヒトＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標）タンパク質を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用する。

ＩＩＩ−ｅ．生物発光分析
ルシフェラーゼアッセイ：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（品目＃Ｅ１５００）を使用して、生物発光アッセイを行う。１０ｍＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に添加することによって、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを調製し、ボルテックスによって混合する。約２０ｕＬのホモジネート試料を、９６ウェルの平板上に充填し、各試料に対して２０ｕＬの平板制御を続ける。別個に１２０ｕＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（上記に記載するように調製）を９６ウェルの平底平板の各ウェルに添加する。その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置を使用して、各平板を適切なチャンバーに挿入し、発光を測定（相対光単位（ＲＬＵ）で測定）する。

実施例２．４’−チオ修飾を有するｍＲＮＡの送達及び発現のための例示的リポソーム製剤
本実施例は、４’−チオ修飾ｍＲＮＡのインビボでの効果的な送達及び発現のための、例示的リポソーム製剤を提供する。

脂質材料
本明細書に記載される製剤は、様々な核酸に基づく材料を被包するように設計された、１つ以上の陽イオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非陽イオン性脂質及び／またはコレステロールに基づく脂質）、ならびにペグ化脂質を用いる、多様な比率の多成分性脂質混合物を含む。陽イオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６），Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＭＣ３、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＩＣＥ、ジアルキルアミノに基づくもの、イミダゾールに基づくもの、グアニジウムに基づくものなどを含み得る（が、排他的ではない）。ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロールなどを含み得る（が、排他的ではない）。ペグ化脂質は、Ｃ_６〜Ｃ_２０の長さのアルキル鎖（複数可）で脂質に共有的に結合した、最大５ｋＤａの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る（が、排他的ではない）。

ポリマー材料
本明細書に記載される更なる製剤は、分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２５ｋＤａ）（Ｓｉｇｍａ＃４０８７２７）、プロタミン、ペグ化プロタミン、ＰＬＬ、ペグ化ＰＬＬなどを含み得る（が、排他的ではない）、様々な帯電したポリマー材料を含む。

ｍＲＮＡ材料
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）を、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって合成し、ゲル電気泳動によって決定される、５’キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００５，８６，１２３９−１２４９）及び約２００ヌクレオチド長の３’ポリ（Ａ）テールの添加を続けた。各ｍＲＮＡ産生物中に存在する５’及び３’非翻訳領域を、それぞれＸ及びＹとして表し、述べるように定義した（下記参照）。

ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、及びコドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）の例示的なｍＲＮＡ配列を、配列番号１、２、及び３にそれぞれ描写する。例示的な５’及び３’ＵＴＲ配列を、配列番号４、５、６、及び７に記載する。

例示的な製剤プロトコル
Ａ．Ｃ１２−２００及びＧＬＡ
Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別個に、ＧＬＡ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、振盪して、２０％エタノール中に最終懸濁液を生じさせた。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝０．８５ｍｇ／ｍＬのＧＬＡ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ_平均＝８１．２ｎｍ（偏差_（５０）＝６３．２ｎｍ；偏差_（９０）＝１０４ｎｍ）。

Ｂ．ＤＯＤＡＰ及びＥＰＯ
ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール性溶液の一定分量を、混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別個に、ＥＰＯ ｍＲＮＡの水性緩衝液（１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製した。脂質溶液を、水性ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入し、振盪して、２０％エタノール中に最終懸濁液を生じさせた。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．３５ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ_平均＝７５．９ｎｍ（偏差_（５０）＝５７．３ｎｍ；偏差_（９０）＝９２．１ｎｍ）。

Ｃ．ＰＥＩ及びＣＦＴＲ
２．０ｍｇ／ｍＬの水性溶液ＰＥＩ（分枝状、２５ｋＤａ）の一定分量を、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの水性溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。結果として生じる複合した混合物を、上下に数回ピペッティングし、注入前に２０分間放置した。最終濃度＝０．６０ｍｇ／ｍＬのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（被包）。Ｚ_平均＝７５．９ｎｍ（偏差_（５０）＝５７．３ｎｍ；偏差_（９０）＝９２．１ｎｍ）。

実施例３：修飾ｍＲＮＡ対無修飾ｍＲＮＡのインビボでの安定性及びタンパク質産生の分析
本実施例は、修飾ｍＲＮＡの安定性、及び様々な標的組織におけるインビボでのタンパク質の発現を分析するための例示的な方法を図示する。

ｍＲＮＡ構築物内の修飾塩基の定量化
４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡを、リボヌクレアーゼＩまたはヌクレアーゼＰ１に様々な期間にわたって供し、十分に分解させた。完了時、結果として生じる一リン酸ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで更に分解して、それぞれのヌクレオシドを提供した。ヌクレオシド混合物を、効率的な酵素除去のためにＡｍｉｃｏｎスピンカラム（３０，０００ＭＷＣＯ）に適用した。結果として生じるヌクレオシド溶液を、ＨＰＬＣによって分析し、それぞれの無修飾ヌクレオシドとのピーク面積比較によって定量化した。

４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ構築物の安定性
４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡを、リボヌクレアーゼＩまたはヌクレアーゼＰ１に様々な期間にわたって供し、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を評価した。指定の時点で、ヌクレアーゼ反応物を阻害剤で急冷し、結果として生じる溶液を、効率的な酵素除去のためにＡｍｉｃｏｎスピンカラム（３０，０００ＭＷＣＯ）に適用した。完了時、残余分をアガロースゲルに適用し、ｍＲＮＡ構築物の生存率（サイズ、分解産生物など）について分析した。同一の実験を無修飾ｍＲＮＡ上に実行し、直接比較及び推測を導いた。

タンパク質産生に対する４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡの効果

インビトロでの研究：
４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ及び無修飾ｍＲＮＡのインビトロでの遺伝子導入を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して実行した。１マイクログラムの各ｍＲＮＡ構築物の遺伝子導入を、別個のウェル内でリポフェクタミンを使用して実行した。選択時点（例えば、４時間、８時間、３２時間、４８時間、５６時間、８０時間など）で細胞を収集し、それぞれのタンパク質産生を分析した。ＦＦＬ ｍＲＮＡにおいて、生物発光アッセイによって、細胞可溶化液をルシフェラーゼ産生について分析した。ＥＰＯ及びＧＬＡ ｍＲＮＡ研究において、細胞上清を取得し、ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、ＥＰＯ及びＧＬＡタンパク質についてそれぞれ分析した。無修飾対４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡの経時的なタンパク質産生の比較を行った。例示的な結果を、図２に示す。

インビボでの研究：
経時的なタンパク質産生の比較を、野生型マウス（ＣＤ−１）への４’チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ被包ナノ粒子（脂質またはポリマー）の注入、対同一の様式で送達される無修飾ｍＲＮＡによって行った。選択時点（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間など）で血清及び器官を採取し、それぞれのタンパク質レベルを監視した。ＦＦＬ ｍＲＮＡにおいて、生物発光アッセイによって、肝臓ホモジネートをルシフェラーゼ産生について分析した。ＥＰＯ及びＧＬＡ ｍＲＮＡ研究において、マウス血清を取得し、ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、ＥＰＯ及びＧＬＡタンパク質についてそれぞれ分析した。無修飾対４’−チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡの経時的なタンパク質産生の比較を行った。

同様に、被包されていない（裸の）４’チオＮＴＰ修飾ｍＲＮＡ及び無修飾ｍＲＮＡを、静脈内、皮下、または気管内投与のいずれかによって注入し、安定性及びタンパク質産生における差を評価するために、上記に記載されるような同一の分析を実行した。

実施例４．裸の修飾ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ負荷ナノ粒子の投与後の、ＦＦＬ、ＥＰＯ、及びＧＬＡタンパク質産生の分析
本実施例は、裸の、修飾された、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ負荷ナノ粒子のいずれかの投与後の、例示的なタンパク質産生を分析するためのプロトコルを記載し、無修飾ｍＲＮＡと比較した、４’−チオ修飾ｍＲＮＡに関するｍＲＮＡ安定性及びタンパク質産生を実証する。

全ての研究は、各実験の開始時点で生後約６〜８週間の雄のＣＤ−１マウスを使用して実行した。３０〜２００マイクログラムの等価全用量の、被包されていない、または被包されたＦＦＬ、ＥＰＯ、またはＧＬＡ ｍＲＮＡ（修飾または無修飾）の単一ボーラス尾静脈注入によって試料を導入した。指定された時点でマウスを屠殺し、生理食塩水で灌流した。

各マウスの肝臓及び脾臓を収集し、３つの部分に配分し、分析のために、１０％の中性緩衝ホルマリン中で保管するか、またはスナップ冷凍し、−８０℃で保管するかのいずれかにした。

全ての動物を、ＣＯ_２窒息によって用量投与（±５％）の４８時間後に安楽死させ、開胸及び末端心臓血液採取を続けた。安楽死させた動物から血清分離チューブ内に、全血（最大取得可能容積）を心臓穿刺によって採取し、室温で少なくとも３０分間凝血させ、２２℃±５℃で、９３００ｇで１０分間遠心分離し、その後血清を抽出した。中間血液採取のために、顔面静脈穿刺または尾切除によって約４０〜５０μＬの全血を採取した。未処理の動物から採取した試料を、研究動物との比較のための基線ＧＬＡレベルとして使用した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析
ＥＰＯタンパク質の定量化を、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃Ｄｅｐ−００）について報告される手順に従って実行した。用いた陽性対照は、超高純度、及び組織培養等級の組み換えヒトエリスロポエチンタンパク質（それぞれ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２８６−ＥＰ及び２８７−ＴＣ）からなった。指定された時点で血液試料を採取し、上記に記載するように処理した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置上の吸収（４５０ｎｍ）によって、検出を監視した。

ＧＬＡタンパク質の分析のために、ヒツジ抗Ｒｅｐｌａｇａｌ Ｇ−１８８ＩｇＧを捕捉抗体として、ウサギ抗Ｒｅｐｌａｇａｌ ＩｇＧを二次（検出）抗体として用いて、標準的なＥＬＩＳＡ手順に従った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性化のために使用した。２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して、反応物を２０分後に急冷した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置上の吸収（４５０ｎｍ）によって、検出を監視した。未処理のマウス血清及びヒトＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）タンパク質を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。

生物発光分析
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（品目＃Ｅ１５００）を使用して、生物発光アッセイを行った。１０ｍＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に添加することによって、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを調製し、ボルテックスによって混合した。２０ｕＬのホモジネート試料を、９６ウェルの平板上に充填し、各試料に対して２０ｕＬの平板制御を続けた。別個に１２０ｕＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（上記に記載するように調製）を９６ウェルの平底平板の各ウェルに充填した。その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置を使用して、各平板を適切なチャンバーに挿入し、発光を測定（相対光単位（ＲＬＵ）で測定）した。

例示的な結果
４’−チオ修飾または無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの遺伝子導入によるＦＦＬタンパク質の産生を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で試験した。図２は、遺伝子導入の４時間、８時間、３２時間、５６時間、８０時間後に取得した加重相対蛍光単位（ＲＬＵ）スコアを表す。それぞれの時点で、２５％の４’−チオウリジン（２５％の４’−Ｓ−Ｕ）または１００％の４’−チオウリジン（１００％の４’−Ｓ−Ｕ）ＦＦＬ ｍＲＮＡのいずれかで遺伝子導入した細胞は、ＳＮＩＭ（登録商標）ＦＦＬまたは市販のＦＦＬのいずれかで遺伝子導入した細胞よりも高い加重ＲＬＵスコアを有した。

４’−チオ修飾及び無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの経時的な安定性もまた、試験した。３マイクログラムのｍＲＮＡを、マウス血清に暴露し、１時間にわたって監視した。図３に見られるように、ＳＮＩＭ（登録商標）ＦＦＬ及び市販のＦＦＬ ｍＲＮＡと比較して、４’−チオ修飾ｍＲＮＡ、特に１００％の４’−チオウリジン（１００％の４’−Ｓ−Ｕ）ＦＦＬ ｍＲＮＡは、経時的により安定しているようである。

４’−チオ修飾または無修飾ＦＦＬ ｍＲＮＡの遺伝子導入によるＦＦＬタンパク質の産生を、野生型マウスにおいて試験した。１．０ｍｇ／ｋｇ用量のＣ１２−２００負荷脂質ナノ粒子を、静脈内に投与し、動物を屠殺し、上記に記載されるように、分析のためにそれらの肝臓を除去した。図４は、投与の６時間後に取得した、ＲＬＵ／ｍｇ全タンパク質スコアを表す。２５％の４’−チオウリジン（２５％の４’−Ｓ−Ｕ）及び１００％の４’−チオウリジン（１００％の４’−Ｓ−Ｕ）で処理したマウスからの肝臓は、無修飾ｍＲＮＡで処理したマウスからの肝臓よりも高いＲＬＵ／ｍｇスコアを有した。

とりわけ、本明細書に記載される例示的な結果は、４’−チオ−修飾ヌクレオチドを含む、提供されるｍＲＮＡが、合成に成功し得ること、増大した安定性を有すること、及び細胞内でタンパク質を産生するための使用に成功し得ることを実証した。

実施例５．４’−チオ−修飾ヌクレオチドの例示的な合成
合成手順：

中間体の調製：

２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトンの合成

Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，１７９０−１８００

アセトン（２．７９Ｌ）中、Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトン（２７０．０ｇ、１．８２３ｍｏｌ）及び硫酸（１８．０ｇ、０．１８２ｍｏｌ、０．１当量）の溶液を、室温で３日間撹拌した。固体炭酸水素ナトリウム（約４５０ｇ）の添加によって、反応混合物を急冷し、濾過し、濾液を蒸発させた。残部を、酢酸エチルと水との間で分割した。酢酸エチルで水性層を抽出した。組み合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、所望の産生物を白色固体（３１８．８ｇ、９３％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．８３（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．７７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４〜４．６２（ｍ、１Ｈ）、３．９９（ｄｄｄ，Ｊ＝２．３、５．５、及び１２．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝２．３、５．５、及び１２．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．６７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．４６（ｓ、３Ｈ）、１．３７（ｓ、３Ｈ）。

５−Ｏ−メタンスルホニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトンの合成

Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２００６，４８７−４９２

塩化メタンスルホニル（１１６．０ｇ、１．０１４ｍｏｌ、１．２当量）を、０℃でジクロロメタン（２．４３Ｌ）中、２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトン（１５９．０ｇ、０．８４５ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１２８．０ｇ、１．２６７ｍｏｌ）の溶液に滴加した。反応混合物を、室温で１時間撹拌し、その後ジクロロメタンで希釈し、水、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液、及び鹹水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、５−Ｏ−メタンスルホニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトンを橙色の油（２３１．０ｇ、約１００％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．８２〜４．７７（ｍ、３Ｈ）、４．４９〜４．４１（ｍ、２Ｈ）、３．０４（ｓ、３Ｈ）、１．４７（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）。

２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトンの合成

Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２００６，４８７−４９２

水（１．１Ｌ）中、水酸化カリウム（１３７．０ｇ、２．４５ｍｏｌ）を、５−Ｏ−メタンスルホニル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボン酸−１，４−ラクトン（２２５．０ｇ、０．８５ｍｏｌ）に添加し、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、２ＭのＨＣｌ水溶液（ｐＨメーターを使用）でｐＨ３に酸性化し、その後蒸発させた。残部を加熱して、アセトン中に逆流させ、アセトンをデカントした（×３）。組み合わせた抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトンを淡黄色固体（１１５．４ｇ、７３％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．８９〜４．８４（ｍ、２Ｈ）、４．６３〜４．５９（ｍ、１Ｈ）、４．０８〜３．９１（ｍ、２Ｈ）、１．４６（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）。

５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトンの合成

Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，１７９０−１８００

ジクロロメタン（８５．０ｍＬ）中、２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトン（５．０ｇ、０．０２７ｍｏｌ）の溶液に、イミダゾール（２．２ｇ、３２ｍｍｏｌ）に続けてｔｅｒｔ−塩化ブチルジメチルルシリル（ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｌｓｉｌｙｌ）（４．４ｇ、２９ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液、鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトンを淡黄色の油（７．３ｇ、８９％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．７９（ｓ、２Ｈ）、４．５４〜４．４９（ｍ、１Ｈ）、４．００〜３．８６（ｍ、２Ｈ）、１．４５（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、０．０８（ｓ、６Ｈ）。

５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキシトールの合成

Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，１７９０−１８００

テトラヒドロフラン（６３ｍＬ）及びメタノール（１３ｍＬ）中、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキソン酸−１，４−ラクトン（７．２ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（１．４ｇ、０．０３６ｍｏｌ、１．５当量）を室温で一部ずつ添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、その後減圧下で濃縮させた。残部を、酢酸エチルと１Ｍクエン酸水溶液との間で分割した。有機層を１Ｍクエン酸水溶液、鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させて、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキシトールを、静置時に結晶化する無色の油（６．３ｇ、８６％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．２６〜４．２０（ｍ、２Ｈ）、３．８４〜３．５９（ｍ、５Ｈ）、１．５１（ｓ、３Ｈ）、１．３７（ｓ、３Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、０．０７（ｓ、６Ｈ）。

５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１，４−ジ−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−リキシトールの合成

Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，１７９０−１８００

塩化メタンスルホニル（１５．２ｍＬ、０．１９６ｍｏｌ、１０当量）を、１０℃未満でピリジン（１５．８ｍＬ、０．１９６ｍｏｌ、１０当量）に滴加した。ジクロロメタン（１６ｍＬ）中、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｌ−リキシトール（６ｇ、０．０１９６ｍｏｌ）の溶液を、１０℃未満で滴加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。冷却浴を交換し、氷の添加によって塩化メタンスルホニルの過剰量を加水分解した。その後、反応混合物に水（３００ｍＬ）を注ぎ、Ｅｔ_２Ｏ（３×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層を１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液及び鹹水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、減圧下で濃縮させた。フラッシュクロマトグラフィーによって、１：６の酢酸エチル／ヘプタンを有するシリカゲル上で粗産生物を精製して、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１，４−ジ−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−リキシトールを黄色の油（８ｇ、９１％）として生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．７６〜４．６９（ｍ、１Ｈ）、４．４６〜４．３４（ｍ、４Ｈ）、３．９５（ｄｄ，Ｊ＝５．５及び１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２（ｄｄ，Ｊ＝６．０及び１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．１１（ｓ、３Ｈ）、３．０７（ｓ、３Ｈ）、１．５１（ｓ、３Ｈ）、１．３７（ｓ、３Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、０．０９（ｓ、６Ｈ）。

ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メトキシ）ジメチルシランの合成

ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）中、５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−１，４−ジ−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−リキシトール（２５．１ｇ、０．０５６ｍｏｌ）の溶液に、Ｎａ_２Ｓ．９Ｈ_２Ｏ（１６．１ｇ、０．０６７ｍｏｌ、１．２当量）を添加し、反応混合物を８０℃で３時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、水と酢酸エチルとの間で分割した。層を分離させ、水性層を酢酸エチルで抽出した。組み合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによって、酢酸エチル／ヘプタン（１０：１）を有するシリカゲル上で粗産生物を精製して、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メトキシ）−ジメチル−シラン（１０．３ｇ、６０％）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ４．８９（ｄｔ，Ｊ＝１．４及び４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．７９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．０及び１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．６０（ｄｄ，Ｊ＝６．４及び１０．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．３３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．０及び１２．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．８５（ｄｄ，Ｊ＝０．９及び１２．８Ｈｚ、１Ｈ）、１．５２（ｓ、３Ｈ）、１．３２（ｓ、３Ｈ）、０．８９（ｓ、９Ｈ）、０．０６（ｓ、６Ｈ）。

（３ａＳ，４Ｒ，５Ｒ，６ａＲ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール５−酸化物の合成

ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中、約７０％のｍ−クロロ過安息香酸（１６ｇ、６６ｍｍｏｌ）の溶液を、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄した後、組み合わせた濾液を、−７８℃でジクロロメタン（４００ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル（（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）メトキシ）ジメチルシラン（２０ｇ、６６ｍｍｏｌ）の溶液に滴加した。−７８℃で１時間撹拌した後、反応物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で急冷し、ジクロロメタンで希釈した。層を分離させ、有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。取得した残部を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル／ジクロロメタン：ジエチルエーテル（３０：１）によって精製して、（３ａＳ，４Ｒ，５Ｓ，６ａＲ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール５−酸化物（８．８ｇ、４２％）及び（３ａＳ，４Ｒ，５Ｒ，６ａＲ）−４−（（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラ−ヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール５−酸化物（７．３ｇ、３５％）を生じさせた。

ヌクレオシド中間体の合成：

１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン

１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンの合成

トルエン（６２ｍＬ）中、ウラシルの懸濁液（１４０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（３．５ｍＬ、２．５３ｇ、２５ｍｍｏｌ）及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（９．０１ｍＬ、１１，１ｇ、５０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、ジクロロメタン（３４ｍＬ）を二相性混合物に添加して、溶液を生じさせた。その後これを、ジクロロメタン（３４ｍＬ）中、（３ａＳ，４Ｒ，５Ｒ，６ａＲ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール５−酸化物（２．０ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）の溶液に滴加し、その後トリエチルアミン（３．５ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で９０分間撹拌した後、反応物を氷で急冷し、その後酢酸エチルで希釈した。層を分離させ、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し（×２）、その後鹹水で洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、減圧下での濃縮によって粗産生物を生じさせ、これをフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ジクロロメタン１：５）によって精製して、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（１．５５ｇ、６０％）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．４３（ｓ、１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．１２（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．７４（ｄｄ，Ｊ＝１．９及び７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７１（ｍ、２Ｈ）、３．８９（ｍ、２Ｈ）、３．７４（ｍ、１Ｈ）、１．６０（ｓ、３Ｈ）、１．３２（ｓ、３Ｈ）、０．９２（ｓ、９Ｈ）、０，１１（ｓ、３Ｈ）、０．１０（ｓ、３Ｈ）。

１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンの合成

テトラヒドロフラン（８５ｍＬ）中、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−テトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（３．７０ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下、氷浴内で冷却した。テトラヒドロフラン（１０．７ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）中、１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウムの溶液を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。粗産生物を濾過によって採取し、テトラヒドロフランで洗浄し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；メタノール：ジクロロメタン１：３０）によって精製して、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（２．３０ｇ、８６％）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．９７（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．７６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．９３（ｓ、１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．９１（ｓ、２Ｈ）、３．９６（ｄｄ，Ｊ＝４．６及び１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．８９（ｄｄ，Ｊ＝４．６及び１１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．６４（ｂｒｓ、１Ｈ）、１．５９（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）。

４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オン

以下に類似するが、シトシンをチミンと交換した手順を使用して、４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラ−ヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（１３．１）を合成し得る。

１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンの合成

トルエン（１１２ｍＬ）中、チミン（２．６０ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（４．１７ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（１８．３ｇ、８２．５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、ジクロロメタン（３４ｍＬ）を二相性混合物に添加して、溶液を生じさせた。その後これを、ジクロロメタン（５６ｍＬ）中、（３ａＳ，４Ｒ，５Ｒ，６ａＲ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール５−酸化物（３．３０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の溶液に滴加し、その後トリエチルアミン（４．１７ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で６０分間撹拌した後、反応物を氷で急冷し、その後酢酸エチルで希釈した。層を分離させ、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し（×２）、その後鹹水で洗浄した。硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、減圧下での濃縮によって粗産生物を生じさせ、これをフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘプタン０〜５０％）によって精製して、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン− ２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（２．９ｇ、６６％）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．４３（ｓ、１Ｈ）、７．４６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．０７（ｄ，Ｊ＝３２Ｈｚ、１Ｈ）、５．７２（ｍ、２Ｈ）、３．８７（ｍ、２Ｈ）、３．７１（ｍ、１Ｈ）、１．９３（ｓ、３Ｈ）、１．５９（ｓ、３Ｈ）、１．３２（ｓ、３Ｈ）、０．９２（ｓ、９Ｈ）、０．１０（ｓ、３Ｈ）、０．０９（ｓ、３Ｈ）。

４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オンの合成

アセトニトリル（１４０ｍＬ）中、１，２，４−トリアゾール（６．５５ｇ、９４．８ｍｍｏｌ）の懸濁液を、氷バッチ内で０℃まで冷却した。オキシ塩化リン（２．５３ｍＬ、２７．１ｍｍｏｌ）、続けてトリエチルアミン（１８．９ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）を、滴加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後アセトニトリル（２５ｍＬ）中、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（２．９ｇ、６．７７ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。反応物を、室温まで温め、１５０分間撹拌し、その後酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム溶液との間で分割した。有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。取得した残部を、オートクレーブ内でジオキサン（６２ｍＬ）中に溶解させた。水酸化アンモニウム（６２ｍＬ）を添加し、容器を密封し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルと水との間で分割した。有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル：メタノール：酢酸エチル１：１０）による精製によって、アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オン（２．６０ｇ、９０％）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．７４（ｂｒｓ、２Ｈ）、７．４９（ｓ、１Ｈ）、６．００（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．８２（ｄｄ，Ｊ＝２．３及び５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄｄ，Ｊ＝３．２及び５．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９１（ｄｄ，Ｊ＝５．５及び１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８１（ｄｄ，Ｊ＝６．４及び１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｍ、１Ｈ）、１．９１（ｓ、３Ｈ）、１．５６（ｓ、３Ｈ）、１．２７（ｓ、３Ｈ）０．８９（ｓ、９Ｈ）、０．０７（ｓ、３Ｈ）、０．０６（ｓ、３Ｈ）。

４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オンの合成

テトラヒドロフラン（１．４ｍＬ）中、４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オン（５００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下、氷浴内で冷却した。テトラヒドロフラン（１．４ｍＬ、１．９０ｍｍｏｌ）中、１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウムの溶液を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。粗産生物を濾過によって採取し、テトラヒドロフランで洗浄し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル；メタノール：酢酸エチル１：１０）によって精製して、４−アミノ−１−（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルテトラヒドロチエノ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−５−メチルピリミジン−２（１Ｈ）−オン（４３６ｍｇ、量）を生じさせた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ７．６４（ｓ、１Ｈ）、７．３８（ｂｒｓ、１Ｈ）、６．８５（ｂｒｓ、１Ｈ）、５．９７（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．８８（ｄｄ，Ｊ＝２．８及び５．３５Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０（ｄｄ，Ｊ＝３．２及び５．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．５４（ｍ、１Ｈ）、３．４７（ｔｄ，Ｊ＝２．８及び６．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．８０（ｓ、３Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．２１（ｓ、３Ｈ）。

ヌクレオチド標的の合成：
一般的な計画

ヌクレオシド５’−トリリン酸の合成を上記に示す。ヌクレオシドＡを、ジメチルホルムアミド中、イミダゾールＨＣｌ／イミダゾールの存在下で、ホスホラミダイト試薬と反応させ、Ｈ_２Ｏ_２との亜リン酸の後続する酸化を続けて、良好な収率（シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製後、典型的には６０〜８３％の収率）でＢを生じさせる。Ｈ_２Ｏ／ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸での処理による保護基の開裂によって、一リン酸Ｃを、典型的には定量的収率で生じさせる。最終的に、Ｂｏｇａｃｈｅｖ（Ｂｏｇａｃｈｅｖ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ａｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｒｕｓｓ．Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２２，５９９−６０４）によって開発された方法を使用して、トリリン酸Ｄを取得する。

一般的な実験的手順：

Ｂの合成

ジメチルホルムアミド（Ａの３ｍＬ／ｍｍｏｌ）中、Ａ（１当量）、イミダゾールＨＣｌ（１．５当量）、及びイミダゾール（１当量）の溶液に、アルゴン下、室温でジ−ｔｅｒｔ−ブチルジイソプロピルホスホラミダイト（１．５当量）を滴加する。開始材料の完全な消費が観察されるまで、反応混合物を撹拌する（ＬＣ−ＭＳまたはＴＬＣ）（典型的には３０〜９０分間）。その後、反応混合物を氷水浴内で冷却し、液滴で、３５％のＨ_２Ｏ_２（２．６当量）で処理する。反応混合物を、室温まで温め、完全な反応が観察されるまで撹拌する（ＬＣ−ＭＳまたはＴＬＣ）。その後それを氷水浴内で冷却し、チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で慎重に急冷する。産生物を、酢酸エチルで抽出する。有機層を鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮させる。適切な溶離液（一般的にはメタノール／ジクロロメタン）での、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製によって、Ｂを、典型的には６０〜８５％の収率で生じさせる。

Ｃの合成

ジクロロメタン（Ｂの２ｍＬ／ｍｍｏｌ）、水（Ｂの３ｍＬ／ｍｍｏｌ）、及びトリフルオロ酢酸（Ｂの３ｍＬ／ｍｍｏｌ）中、Ｂ（１当量）の混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮（水浴、５０℃未満）して、Ｃを、典型的には定量的な収率で生じさせる。

Ｄの合成

アセトニトリル（無水トリフルオロ酢酸の０．３ｍＬ／ｍｍｏｌ）中、無水トリフルオロ酢酸（５当量）の冷却した溶液（氷水浴）を、アルゴン下でアセトニトリル（Ｃの４ｍＬ／ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１当量）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（４当量）中、Ｃ（１当量）の冷却した懸濁液に滴加する。その後、反応物を室温まで温め、室温で３０分間撹拌し、揮発物を減圧下で除去する。

結果として生じるシロップを、アセトニトリル（Ｃの４ｍＬ／ｍｍｏｌ）中に溶解させ、氷水浴内で冷却し、１−メチルイミダゾール（３当量）及びトリエチルアミン（５当量）をアルゴン下で添加する。反応混合物を１５分間撹拌し、その後室温まで温める。

アセトニトリル（ピロリン酸の１ｍＬ／ｍｍｏｌ）中、トリス（テトラブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．５当量）の溶液を、アルゴン下、室温で滴加し、混合物を室温で４５分間撹拌する。その後、反応物を脱イオン水（Ｃの約１０〜１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）で急冷し、１時間撹拌する。混合物をクロロホルム（３×１０ｍＬ）で洗浄し、組み合わせた有機層を一度脱イオン水（５ｍＬ）で逆抽出する。組み合わせた水性層を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを充填したカラム上に直接充填し、０．０１Ｍ〜０．５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液の勾配で溶出させる。産生物を含有する画分を組み合わせ、凍結乾燥させる。結果として生じるヌクレオシドトリリン酸トリエチルアミン塩を、脱イオン水中で溶解させ、その後Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ８イオン交換カラムに供する。ＵＶ活性を示す画分を組み合わせ、凍結乾燥によって水を除去して、ヌクレオシド５’−トリリン酸をそのナトリウム塩として発生させる。

（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラ−ヒドロチオフェン−２−イル）メチルトリリン酸ナトリウム塩

ＡのＢへの転換について上記に記載する方法を使用して、１０（９３５ｍｇ、３．１１ｍｍｏｌ）を１４（１．２５ｇ、８１％）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．３８（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．７４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．０５（ｓ、１Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．８５（ｍ、２Ｈ）、４．１９（ｍ、２Ｈ）、３．８３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．５４（ｓ、３Ｈ）、１．４９（ｓ、１８Ｈ）、１．３１（ｓ、３Ｈ）。

ＢのＣへの転換について上記に記載する方法を使用して、１４（１．２５ｇ、２．５８ｍｍｏｌ）を１５（０．９ｇ、量）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ８．１３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄ，Ｊ＝４．１及び６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１１（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８（ｍ、２Ｈ）、３．４３（ｍ、１Ｈ）。

ＣのＤへの転換について上記に記載する方法を使用して、１５（２００ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を４’−チオ−ＵＴＰ（２１５ｍｇ、６２％（４Ｎａ＋塩の場合））に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．８５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３１（ｄｄ，Ｊ＝３．７及び６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｔ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１２（ｍ、１Ｈ）、４．００（ｍ、１Ｈ）、３．４４（ｍ、１Ｈ）。^３１Ｐ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ−８．５７（ｄ）、−１０．９１（ｄ）、−２２．０９（ｔ）。ＨＰＬＣ／ＭＳ：ＲＴ９．６３８分、ｍ／ｚ５０１（Ｍ＋Ｈ）^＋。

（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−５−メチル−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラ−ヒドロチオフェン−２−イル）メチルトリリン酸）ナトリウム塩

ＡのＢへの転換について上記に記載する方法を使用して、１３（４００ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を１６（９１０ｍｇ、６５％）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．１９（ｂｒｓ、２Ｈ）、７．４５（ｓ、１Ｈ）、５．９２（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．９８（ｄｄ，Ｊ＝１．８及び６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．９５（ｄｄ，Ｊ＝２．３及び５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｍ、２Ｈ）、３．８０（ｔｄ，Ｊ＝１．８及び６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．９９（ｓ、３Ｈ）、１．５６（ｓ、３Ｈ）、１．４９（ｓ、９Ｈ）、１．４８（ｓ、９Ｈ）、１．２９（ｓ、３Ｈ）。

ＢのＣへの転換について上記に記載する方法を使用して、１６（１８０ｍｇ、０．９７７ｍｍｏｌ）を１７（３５０ｍｇ、量）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ８．１６（ｓ、１Ｈ）、５．８０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５（ｄｄ，Ｊ＝４．１及び５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１０（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．００（ｍ、２Ｈ）、３．４５（ｍ、１Ｈ）、１．９２（ｓ、３Ｈ）。^３１Ｐ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ０．４１。

ＣのＤへの転換について上記に記載する方法を使用して、１５（３００ｍｇ、０．８４９ｍｍｏｌ）を４’−チオ−５−メチルＣＴＰ（１３６ｍｇ、２８％（４Ｎａ＋塩の場合））に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ７．８４（ｓ、１Ｈ）、５．８５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３（ｍ、２Ｈ）、４．０９（ｍ、１Ｈ）、３．９７（ｍ、１Ｈ）、３．４０（ｍ、１Ｈ）、１．８２（ｓ、３Ｈ）。^３１Ｐ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ−８．９６（ｄ）、−１１．００（ｄ）、−２２．２８（ｔ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ１６５．５２（Ｃｑ）、１５８．０９（Ｃｑ）、１３９．８０（ＣＨ）、１０５．４０（Ｃｑ）、７７．２６（ＣＨ）、７３．２５（ＣＨ）、６６．０６（ＣＨ）、６４．０４（ＣＨ２）、５０．０９（ＣＨ）、１２．３３（ＣＨ３）。ＨＰＬＣ／ＭＳ：ＲＴ１０．２８０分、ｍ／ｚ５１４（Ｍ＋Ｈ）^＋。

先行する４’−チオ−５−メチルＣＴＰの合成に類似するが、１３．１を１３と交換した手順を使用して、４’−チオ−ＣＴＰが作製され得る。

（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−２−イル）メチルトリリン酸ナトリウム塩

ＡのＢへの転換について上記に記載する方法を使用して、１９（５０４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を２０（４４４ｍｇ、５２％）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ８．２４（ｓ、１Ｈ）、８．１９（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．７１（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．０９（ｓ、１Ｈ）、６．２０（ｂｒｓ、２Ｈ）、６．０１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７６（ｍ、１Ｈ）、４．５０（ｍ、１Ｈ）、４．２３（ｍ、２Ｈ）、３．７７（ｍ、１Ｈ）、１．４８（ｓ、１８Ｈ）。

ＢのＣへの転換について上記に記載する方法を使用して、２０（４３０ｍｇ、０．９０４ｍｍｏｌ）を２１（３３０ｍｇ、量）に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ８．６４（ｓ、１Ｈ）、８．２６（ｓ、１Ｈ）、５．８６（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．５４（ｍ、１Ｈ）、４．２６（ｍ、１Ｈ）、４．０６（ｍ、２Ｈ）、３．５４（ｍ、１Ｈ）。

ＣのＤへの転換について上記に記載する方法を使用して、２１（８２ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）を４’−チオ−ＡＴＰ（３６ｍｇ、２６％（４Ｎａ＋塩の場合））に転換した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ８．４９（ｓ、１Ｈ）、８．０３（ｓ、１Ｈ）、５．７６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．５４（ｄｄ，Ｊ＝３．７及び５．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．３５（ｔ，Ｊ＝４．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３（ｍ、２Ｈ）、３．５４（ｄｄ，Ｊ＝４．１及び８．７Ｈｚ、１Ｈ）。^３１Ｐ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）δ−９．０７（ｄ）、−１０．８１（ｄ）、−２２．１５（ｔ）。ＨＰＬＣ／ＭＳ：ＲＴ１０．４６７分、ｍ／ｚ５２４（Ｍ＋Ｈ）^＋。

５−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロチオフェン−２−イル）ピリミジン２，４（１Ｈ，３Ｈ）ジオン（４’−Ｓ−プソイドウリジン）。本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。

（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−５−（２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−２−イル）メチルトリリン酸ナトリウム塩（４’−チオ−ψＵＴＰ）。本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。

（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（４−オキソ−２−チオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）テトラヒドロチオフェン−２−イル）メチルテトラハイドロゲントリリン酸（４’−Ｓ−２−Ｓ−ＵＴＰ）。本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。

（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（２−アミノ−６−オキソ−１Ｈ−プリン−９（６Ｈ）−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロチオフェン−２−イル）メチルテトラハイドロゲントリリン酸（４’−Ｓ−ＧＴＰ）。本化合物は、当業者に既知である手順を使用して、以下の計画に従って作製され得る。
＊＊＊

本明細書は、本明細書中に引用した参考文献の教示に照らして、最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が、本発明によって包含されることを容易に認識する。本開示内に引用した全ての出版物及び特許は、その全体が参照によって組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が本明細書と矛盾する、または不一致である程度まで、本明細書は、任意のそのような材料に取って代わる。本明細書のいかなる参照の引用も、そのような参照が、本発明に対する従来技術であることを認めるものではない。

別段示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書中で使用される、成分、反応条件などの量を表す全ての数は、近似値として理解されるべきであり、本発明によって取得されることが求められる所望の特性に応じて変化し得る。最低限において、及び特許請求の範囲の等価物の原理の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、有効桁数及び通常の丸め技術に照らして解釈されるべきである。本明細書中の異なる量の有効桁を有する一連の数の列挙は、より少ない有効桁を与えられた数が、より多くの有効桁を与えられた数と同一の精度を有することを暗示するものとして解釈されるべきではない。

特許請求の範囲及び／または明細書において「を含む」という用語と併せて使用される際の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つまたは１つ以上」の意味と一致する。本開示は、代替物のみ及び「及び／または」に言及する定義を支持するものの、特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみに言及すること、または代替物が互いに排他的であることが別段明白に示されない限り、「及び／または」を意味するために使用される。

別段示さない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連の全ての要素に言及すると理解されるべきである。当業者は、ほんの通例的な実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する、または等価である任意の方法及び材料が、本発明の実践または試験において使用され得るものの、好適な方法及び材料が、ここで記載される。

本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。更に、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。

本発明の他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示される本発明の実践を考慮することによって、当業者にとって明らかになるであろう。本明細書及び実施例は、例示的のみであると見なされるべきであることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (27)

1. コード領域及び任意で１つ以上の非コード領域を有するｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡのヌクレオチド残基の少なくとも２０％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込み、前記ｍＲＮＡが少なくとも２００個のヌクレオチド残基を含む、前記ｍＲＮＡ分子。
2. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも２５％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
3. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも３０％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
4. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも４０％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
5. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも５０％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
6. 前記ヌクレオチド残基のうちの少なくとも９９％が、４’−チオ−置換フラノース環を組み込む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
7. 前記非コード領域がポリＡテールを含み、前記ポリＡテールが４’−チオ−アデノシン残基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
8. 前記ポリＡテールが、少なくとも約９０ヌクレオチド残基長である、請求項７に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
9. 前記ポリＡテールが、少なくとも約５００ヌクレオチド残基長である、請求項７または請求項８に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
10. 前記ｍＲＮＡ分子が、少なくとも１つの非標準ヌクレオチド残基を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
11. 前記非標準ヌクレオチド残基が、５−メチル−シチジン、プソイドウリジン、及び２−チオ−ウリジンのうちの１つ以上から選択される、請求項１０に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
12. 前記１つ以上の非標準ヌクレオチド残基が、４’−チオ−フラノースを含むように更に修飾される、請求項１１に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
13. 前記分子が、少なくとも５０００個のヌクレオチド残基を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
14. 前記コード領域が、治療用タンパク質をコードする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
15. 前記治療用タンパク質が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、インスリン、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンテターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、及びアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、１，４−アルファ−グルカン分枝酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ＧＬＵＴ−２、ＵＤＰグリコーゲンシンターゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート硫酸シルファターゼ、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコースアミダーゼ、アルファ−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、アポリポタンパク質Ｅ、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、ペチルマロニル（ｐｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌ）−ＣｏＡムターゼ、尿酸オキシダーゼ、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、及び酸性アルファ−グルコシダーゼから選択される、請求項１４に記載の前記ｍＲＮＡ分子。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのｍＲＮＡ分子及び担体を含む、組成物。
17. 前記担体が、脂質を含む、請求項１６に記載の前記組成物。
18. 前記ｍＲＮＡ分子が、脂質ナノ粒子内に被包される、請求項１７に記載の前記組成物。
19. 前記担体が、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイ１−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタン酸）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、シス、またはトランスＨＧＴ５００１、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉＮ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＣ１２−２００から選択される１つ以上の陽イオン性脂質を含む脂質ナノ粒子である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の前記組成物。
20. 前記脂質ナノ粒子が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、及びコレステロールから選択される１つ以上のヘルパー脂質を含む、請求項１８または請求項１９に記載の前記組成物。
21. 前記脂質ナノ粒子が、ペグ化脂質を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の前記組成物。
22. 前記脂質ナノ粒子が、１つ以上の陽イオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、及びペグ化脂質を含む、請求項１８に記載の前記組成物。
23. 前記担体が、ポリマーを含む、請求項１６に記載の前記組成物。
24. 前記ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項２３に記載の前記組成物。
25. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記ｍＲＮＡ分子、または請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の前記組成物を含む、タンパク質をインビボで産生するための組成物。
26. 治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発することができる薬物の製造のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子の使用。
27. 治療用タンパク質のインビボでの発現を誘発するための組成物であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子を含む、組成物。