JP6796332B2 - 細胞培養器、細胞構造体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、特に、微小サイズの細胞構造体を大量に簡便に作製することが可能な細胞培養器に関する。

生物学の分野における重要な実験技術として、１９００年頃に開発された細胞培養技術がある。開発当初は、培地成分の最適化等細胞を馴化することに注力されるに留まり、単層培養や浮遊培養の技術が中心に検討されてきた。

近年、単層培養系の細胞と生体内組織の細胞との間で、種々の性質、刺激応答性、細胞機能等が異なることが明らかになり、単層構造を形成させる単層培養よりも、生体内の組織構造に近い３Ｄ構造を形成させる３Ｄ培養、特に、スフェロイド培養の需要が拡大している。

古典的には、タンパク質系のゾル中に細胞を浮遊させ、この細胞浮遊液を何らかのトリッガー（熱、光、化学架橋剤等）でゲル化させることによって形成させた３Ｄゲル中に細胞を包埋させる技術、多孔質のスキャホールド中に細胞を生着させる技術、ＮＩＰＡＭを固定化した培養皿を用いて細胞シートの積層体を調製する技術等が盛んに開発されてきた。

近年では、住友ベークライト社のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ等の、非接着性の丸底面へ細胞を沈降させる手法；ＪＳＲ社のＮａｎｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ、日立製作所のＮａｎｏ Ｐｉｌｌａｒ Ｐｌａｔｅ等の、レーザー加工により平滑面を規則正しい凹凸面にすることによって培養面に接着した細胞の遊走性を高め、これにより、培養面において細胞の自己組織化を誘導する手法；クラレ社のＥｌｐｌａｓｉａ、イワキ社のＥＺＳＰＨＥＲＥ等の、直径１００〜５００μｍ、深さ５００μｍ程度の無数の穴が配設された培養皿を用いて、各穴の底面へ各穴に播種した細胞を沈降させる手法等が開発されている。

Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４２４，Ｐ８７０−８７２，２１ Ａｕｇｕｓｔ，２００３．

しかしながら、３Ｄ構造を有するスフェロイド等の細胞構造体を多数調製する場合、上記従来の細胞培養器では、多数の微小サイズ（例えば、１００μｍ×２００μｍ）のウェルに細胞を播種しなければならず、培養操作が簡便ではなかった。

そこで、本発明は、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）の細胞構造体（例えば、スフェロイド）を大量に簡便に作製することが可能な細胞培養器を提供することを目的とする。

本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の細胞培養器は、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域を複数有し、前記第一被覆領域の表面ゼータ電位が、０〜５０ｍＶであり、前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であり、前記各第一被覆領域の面積が、０．１〜３０ｍｍ ^２ であり、
前記第一被覆領域間の距離が、０．１〜１０ｍｍである、ことを特徴とする。
ここで、本発明の細胞培養器は、前記第一被覆領域に対する水の接触角が、５０〜９０°であることが好ましい。
また、本発明の細胞培養器では、前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記第一被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー；Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー；２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物；からなる群から選択される少なくとも１種の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記アニオン性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有するビニル誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器では、前記カチオン性モノマーは、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
更に、本発明の細胞培養器は、前記第一被覆領域に、細胞接着性物質で更に被覆された第二被覆領域を有し、該第二被覆領域は前記第一被覆領域の内側にあるものとしてもよい。
更に、本発明の細胞培養器は、前記細胞接着性物質は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
本発明の細胞構造体の製造方法は、本発明の細胞培養器の前記培養面に細胞を播種し、播種した細胞を培地中で培養し、培地交換を行い、前記培養面に接着した細胞をさらに培養し、細胞構造体を得ることを特徴とする。
また、本発明の細胞構造体の製造方法では、細胞構造体のサイズが５０〜１，５００μｍ径であることが好ましい。

本発明によれば、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）の細胞構造体（例えば、スフェロイド）を大量に簡便に作製することが可能な細胞培養器を提供することができる。

本発明の実施形態の細胞培養器の一例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例の概略と共に示す図である。 試験４で作製した本発明の実施例の細胞培養器を培養面側からみた図である。 本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、培地交換から、０時間後（培地交換直後）２時間後、３時間後、４時間後の様子を示す図である。 本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、培地交換から５時間後、６時間後、８時間後、１２時間後の様子を示す図である。 本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、塊状の細胞構造体が自発的に第一被覆領域から剥離し、浮遊した後、細胞培養器を適当に転倒・混和させることによって浮遊物を人為的に細胞培養器の中央部に集めて、細胞構造体同士を接触させてから、０時間後、５時間後、８時間後、１２時間後の様子を示す図である。 本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、塊状の細胞構造体が自発的に第一被覆領域から剥離し、浮遊した後、細胞培養器を適当に転倒・混和させることによって浮遊物を人為的に細胞培養器の中央部に集めて、細胞構造体同士を接触させてから、１７時間後、２２時間後、２５時間後、３４時間後の様子を示す図である。 （ａ）は、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から０時間後（培地交換直後）の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図であり、（ｂ）は、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から２１時間後の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。 本発明の実施形態の細胞培養器の別の例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の別の例の概略と共に示す図である。 本発明の実施例の細胞培養器の第一及び第二被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から０時間後（培地交換直後）の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真である。 図９に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に１０ｃｍ／秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）〜（ｄ）は、揺動開始から、０秒後、０．５秒後、１．０秒後、１．５秒後の様子を示す図である。 図９に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に１０ｃｍ／秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）〜（ｄ）は、揺動開始から、２．０秒後、２．５秒後、３．０秒後、３．５秒後の様子を示す図である。 本発明の実施形態の細胞培養器の別の例を用いた本発明の実施形態の細胞構造体培養槽の概要を示す図である。（ａ）は、細胞構造体培養槽の斜視図を示す図であり、（ｂ）は、細胞構造体培養槽の断面図を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明の細胞培養器の実施形態について詳細に例示説明する。

図１に、本発明の実施形態の細胞培養器の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例の概略と共に示す。

本発明の実施形態の細胞培養器（以下、「本実施形態の細胞培養器」ともいう。）は、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域を複数有するものである。

細胞培養器としては、市販のプレート、ディッシュ、フラスコ、ガラス板、シリコンシート等が挙げられる。

ここで、本実施形態の細胞培養器では、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域の表面ゼータ電位が、０〜５０ｍＶである。表面ゼータ電位を０ｍＶ以上とすれば、負に帯電する細胞を接着させることができ、また、５０ｍＶ以下とすれば、細胞毒性を軽減することができる。
上記と同様の理由から、表面ゼータ電位は、好適には０〜３５ｍＶであり、更に好適には１０〜２５ｍＶである。

この細胞培養器によれば、一般的な３７℃のインキュベーター中で細胞を培養して、組織を形成させた後、トリプシン処理等の細胞剥離操作を行うことなく、例えば、細胞シート状の構造を有する細胞を回収することができる。

更に、上記特定の範囲の表面ゼータ電位を有する、本発明の実施形態の細胞培養器によれば、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体（スフェロイド）を簡便に形成させることができる。
これは、上記特定の範囲の表面ゼータ電位とすることによって、細胞培養器の培養面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができるものと推測される。

上記の細胞構造体を形成する現象の再現性は極めて高く、細胞培養器によれば、均質な細胞構造体を多数作製することが可能となる。

従来の細胞培養器を用いて作製された細胞の塊は、細胞非接着性の培養面に接着できない細胞が寄せ集められたものに過ぎないため、細胞の塊を構成する細胞のバイアビリティが低いという問題があった。
一方、本発明の実施形態の細胞培養器で作製された細胞構造体（スフェロイド）は、培養面上に速やかに接着し、増殖しながら伸展するという経過を経たうえで形成されるものであるため、細胞間に産生された細胞外マトリックスが豊富に存在する。そのため、細胞構造体自体のバイアビリティ（活性）が極めて高い。

そして、この細胞培養器によれば、細胞構造体のサイズは、実験者が目的に応じて適宜定めることができ、サイズに分布を持たせることも、サイズを均一にすることも可能となる。
細胞構造体のサイズは、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）とすることができ、５０〜１，５００μｍ径としてよく、５０〜２００μｍ径であることが好ましい。

また、この細胞培養器では、平板な培養面において細胞構造体を作製することが可能であるため、細胞培養器を用いて作製した細胞構造体に対してアッセイを行う場合に、この培養器を直接的に顕微鏡により観察することも可能となる。

更に、この細胞培養器によれば、細胞が細胞培養器の培養面と壁との境界である培養面の外縁に接着させないことも可能となり、サイズの均質性を長時間維持することができる。

また、本発明の実施形態の細胞培養器では、本発明の効果を高める観点から、第一被覆領域に対する水の接触角が、５０〜９０°であることが好ましく、６０〜８０°であることが更に好ましく、６２〜７８°であることが特に好ましい。
なお、第一被覆領域に対する水の接触角とは、第一被覆領域内の任意の数点において、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠して、測定される接触角の平均値を指す。

上記の通り、第一被覆領域は、細胞表面との間の相互作用を高めて、細胞の第一被覆領域に対する接着性を高める観点から、所定程度以上の疎水性を有する領域であることが好ましい。

そして、細胞培養器では、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を被覆する前における細胞培養器の培養面が、細胞非接着性であることが好ましい。
なお、「細胞非接着性」とは、付着細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞等）が、通常の培養条件下で、接着しない又は接着しにくい性質をいう。
かかる構成によれば、培養面のうちの第一被覆領域以外の非被覆領域に、播種された細胞が接着することを抑制することができる。接着しなかった細胞は、培地交換等の簡便な操作により、細胞培養器から除去することができ、これらの細胞によるアポトーシスやヒートショックプロテインの産生等の、接着した細胞の生育に対する悪い影響を抑制することが可能となる。また、細胞培養器の培養面を細胞非接着性とすれば、各第一被覆領域に播種された細胞が、接触することがなく、別々に細胞構造体を作製することが可能になる。

細胞培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン、ポリブテン、ポリエチレン、ポリカーボネート等が挙げられ、精密な成形加工が容易であり、種々の滅菌法を適用することが可能であり、透明性があるため顕微鏡観察に向いているという観点から、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。

詳細には、上記ポリスチレン等の材質の細胞培養器は、未処理の場合、表面のゼータ電位がマイナスの比較的大きな値となり、負電荷を帯びる細胞表面と培養面とが静電的に反発する。そのため、この場合、細胞の接着には不利となる。なお、ポリスチレン表面に接着してゼータ電位をプラス側に変化させ得るタンパク質を含む培地を用いたとしても、表面のゼータ電位はマイナスのままかゼロ付近にとどまることが多い。
ここで、上記ポリスチレン等の材質の細胞培養器に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を被覆すると、ポリマー又はポリマー組成物の厚み（すなわち、被覆前の培養面からの距離）の二乗の分だけポリスチレン等の材質の表面のゼータ電位が減衰され、被覆後の培養面の表面のゼータ電位がよりプラス側に振れることとなる。そのため、被覆処理の場合、細胞の接着に有利となる。

なお、一般的な細胞培養用のプレートは、ポリスチレン等のプラスチックでできているが、表面処理（例えば、プラズマ処理）が施されており、培養面に細胞が接着しやすくなっている。

細胞培養器では、各第一被覆領域の面積が、０．１〜３０ｍｍ^２であることが好ましい。上記範囲とすれば、目的の微小サイズのスフェロイドが得られやすい。

細胞培養器では、第一被覆領域間の距離が、０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。
なお、「第一被覆領域間の距離」とは、第一被覆領域間の培養面上における最短距離をいう。
０．１ｍｍ以上とすれば、隣接する第一被覆領域間で、それぞれの領域に播種された細胞どうしが接着してしまうことを抑制することができる。１０ｍｍ以下とすれば、大量の細胞構造体（スフェロイド等）を効率良い作製することができる。

本発明の実施形態の細胞培養器では、該細胞培養器の培養面の第一被覆領域が、単位面積当たりに有する、温度応答性ポリマーの量が、５．０〜５０ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、１５〜４０ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体を形成させやすくするという効果が得られやすい。

本実施形態の細胞培養器が有する第一被覆領域の数は、実験者の目的に応じて適宜定められてよく、２以上としてよく、１０以上としてよく、１，０００以上としてよい。

細胞培養器では、第一被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状であることが好ましい。曲率半径としては、０．１〜５０ｍｍであることが好ましく、１〜１０ｍｍであることが更に好ましい。
円形の第一被覆領域の直径としては、１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましく、３０μｍ〜１５００μｍであることが更に好ましい。
これらの形状は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

細胞培養器では、温度応答性ポリマーは、水溶液の状態からの沈殿、溶液の塗布及び溶媒の乾燥、放射線照射、低温プラズマ照射、コロナ放電、グロー放電、紫外線、ラジカル発生剤を使用したグラフト重合等の手法により細胞培養器の培養面に被覆されていてよい。

細胞培養器の培養面を温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆する方法、及び第一被覆領域となる複数の培養面上における位置に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置する方法については後述する。

本実施形態の細胞培養器は、前述の第一被覆領域のみを有し、後述の第二被覆領域を有しないものとしてもよく、この場合、細胞培養器は、細胞培養用プレート（例えば、３５ｍｍディッシュ等）をベースとして作製されてよく、例えば、再生医療の分野において好適に用いることができる。
一方、本実施形態の細胞培養器は、前述の第一被覆領域の内側に後述の第二被覆領域を有するものとしてもよく、この場合、細胞培養器は、マイクロプレート（例えば、９６穴プレート等）をベースとして作製されてよく、例えば、創薬の分野（特に、薬剤スクリーニング）において好適に用いることができる。

また、本実施形態の細胞培養器は、細胞接着性物質で更に被覆された第二被覆領域を有し、該第二被覆領域は第一被覆領域の内側にあるものとしてもよい。

細胞接着性物質としては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ペプチド、カチオン性ポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。
ペプチドとしては、分子内にアルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を少なくとも１組含むもの、アルギニンを８分子以上連続した配列を含むもの、リジンが１０分子以上連続した配列を含むもの等が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、アミノスチレン等が挙げられる。
これらの中でも、細胞接着性が高い、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンが好ましい。
また、上記列挙の細胞接着性物質を含む試薬も好適に用いることができ、かかる試薬としては、当業者に周知の、ヒト、ウシ、イヌ、ブタ、魚類の血清、無血清培地等が挙げられる。

第二被覆領域を有する細胞培養器によれば、形成した細胞構造体の一部が第二被覆領域に接着したままとなり、細胞構造体を細胞培養器の各第一被覆領域の位置に固定することが可能となる。
また、本発明における第一被覆領域も第二被覆領域も、無色透明で、肉厚は、極めて薄く、平滑であるため、当該両領域を透過する光は、屈折、反射、吸収されることがほとんどなく、細胞培養器をそのまま測定（光学測定等）に適用することが可能となる。

播種される細胞は、細胞培養器の培養面の面積に対する個数が少な過ぎる（細胞播種密度が小さ過ぎる）と、アポトーシスしてしまうという性質があり、生きた細胞を得るために満たすべき最小限の細胞播種密度が存在する。
従来公知の複数のウェルを備える細胞培養器を用いて細胞培養を行う場合、ウェルのサイズに応じて播種すべき細胞の数が定まってしまう。
そして、播種すべき細胞数に伴って、１個１個の細胞に対する必要栄養量や細胞全体を物理的に浸漬することが可能な体積等を考慮して、細胞構造体を培養するために必要な培養スケールが定まり、培養に要する培地の量、更には、試験に用いる薬剤の量も定まることとなる。
昨今のｉＰＳ細胞実験等の効果な実験を小スケールで行いたいという欲求は当該技術分野において高まっており、現在のところ国際規格品の中で最小サイズである３８４ウェルの細胞培養器を用いた場合であっても、実験コストが十分に低減されないこともある。
ここで、本実施形態の第二被覆領域を有する細胞培養器によれば、多数の細胞構造体（スフェロイド）を、それぞれを隔壁等により独立した空間に隔離することなく、同じ空間に共存させることが可能となる。このため、細胞構造体を分化させるのに用いられる分化誘導因子や、スクリーニングされる薬剤等を培地に含め、この培地を多数の細胞構造体が共存する系に一度に加える（必要に応じて、適宜攪拌する）だけで、全ての細胞構造体を同じ条件下におくことができる。また、細胞構造体が分泌する生理活性物質も、系中に均一に拡散させることができる。

細胞培養器では、各第二被覆領域の面積が、０．００１〜１０ｍｍ^２であることが好ましい。上記範囲とすれば、前述の通り第一被覆領域による、目的の微小サイズのスフェロイドを形成する効果と、前述の第二被覆領域による、細胞構造体を細胞培養器に固定する効果とを、バランスよく得ることができる。

細胞培養器では、第二被覆領域が、単位面積当たりに有する、細胞接着性物質の量が、１．０〜１，０００ｎｇ／ｍｍ^２であることが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、細胞構造体の形成と細胞構造体の固定とを、効率的に行うことができる。

第一被覆領域の内側に設ける第二被覆領域の数は、実験者の目的に応じて適宜定められてよく、各第一被覆領域に、１つとしてよく、２以上の複数としてもよい。

細胞培養器では、第二被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状であることが好ましい。曲率半径としては、０．１〜５０ｍｍであることが好ましく、１〜１０ｍｍであることが更に好ましい。
円形の第二被覆領域の直径としては、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましく、
１０〜１，０００μｍであることが更に好ましい。
これらの形状は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

以下、本発明の実施形態の細胞培養器の第一被覆領域に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物について詳述する。

本発明の実施形態の細胞培養器に用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含む温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本発明の実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。

２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。

重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。

次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。

なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。

混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。

なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。

ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）及び塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル数）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。

溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。

数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。

この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。

この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。

（温度応答性ポリマー）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。

ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。

Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。

カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。

ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。

ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水、等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。

次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。

この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。

この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。

そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。

この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。

紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ^２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。

温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。

この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。

上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。

なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。

更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。

（温度応答性ポリマー）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。

例えば、特許文献１に記載の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡはポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記特許文献１の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。

一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。

上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。

特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。

また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。

更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。

（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。

Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。

また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。

以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。

（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する（（２）トリスは任意選択的に含む。）。

（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。

この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。

ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。

また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。

上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。

上記（３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピン等の人工核酸等が挙げられる。
特に、ＤＮＡとしては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞を分化細胞、特に、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、血管内皮細胞、に分化誘導できるＤＮＡが好ましい。

また、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。

（３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸等のジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。

なお、上記（３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。

ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。

上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。

また、上記割合（（２）／（１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。

上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。

ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。

Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。

上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。

上記温度応答性ポリマー又は上記温度応答性ポリマー組成物は、加熱乾燥、凍結乾燥、減圧蒸留等により水分を除去して、メタノール、エタノール等のアルコール、ケトン、エステル等の有機溶媒に溶解してもよい。これらの中でも、表面張力と沸点が低く速やかな乾燥が可能であり、温度応答性ポリマーをより均一に被覆できる観点から、メタノールに溶解させることが好ましい。また、有機溶媒に溶解する場合には、更に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等の非イオン性でかつ親水性である親水性分子を加えてもよい。

（細胞培養器の製造方法）
図１に、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の一例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例の概略と共に示す。
本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例は、第一被覆領域のみを有し、第二被覆領域を有しないものである。
本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例では、まず、細胞培養器を準備する（図１（ｉ）参照）。
なお、図１に示す例では、細胞培養器の培養面を、細胞非接着性としている。

次いで、細胞培養器の培養面上の複数の箇所に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を配置（スポット）する（図１（ｉｉ）参照）。
ここで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置（スポット）手法としては、例えば、８連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。
また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を水溶液の状態で使用する場合には、その曇点以下の温度まで冷却して用いてよい。
図１に示す例では、４箇所に、温度応答性ポリマーの水溶液を塗布している。

前述の通り、被覆手法としては、水溶液の状態からの沈殿、塗布した水溶液又は有機溶媒溶液からの溶媒の除去（乾燥）、放射線照射、低温プラズマ照射、コロナ放電、グロー放電、紫外線、ラジカル発生剤を使用したグラフト重合等の手法が挙げられる。
この製造方法の一例では、温度応答性ポリマーを細胞培養器の培養面に（相互作用、非共有結合、共有結合等を介して、）結合させる（図１（ｉｉｉ）参照）。
図１に示す例では、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させている。
ここで、塗布量としては、０．００５〜２００μＬとしてよく、好適には、１〜５０μＬである。

図１に、本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の概略と共に示す。

本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の一例では、細胞を播種する（図１（ｉｖ）参照）。ここでは、細胞培養器に培地を加え、その後、細胞を懸濁させた培地を加えてよい。
播種される細胞の密度が、１，５００個／ｍｍ^２以下（培養面の面積が２００ｍｍ^２である２４ウェル細胞培養プレートに１．０ｍＬの細胞浮遊液を加えることにより播種する場合、３．０×１０^５個／ｍＬ以下）であることが好ましい。なお、播種される細胞は、生きた細胞とする。
上記細胞密度とすれば、第一被覆領域に接着した細胞が、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を形成しやすい。
この細胞培養方法の一例は、血管内皮細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞等間葉系の細胞に対して、特に好適に適用することができる。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。

続いて、この細胞培養方法の一例では、播種された細胞を培養する（図１（ｖ）参照）。培養条件は、使用する細胞に応じて適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。
このとき、図１（ｖ）に示す通り、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しない。

ここで、この細胞培養方法の一例では、培地交換を行う（図１（ｖｉ）参照）。
このとき、図１（ｖｉ）に示す通り、培養面に接着しなかった細胞が細胞培養器から除去される。

この細胞培養方法の一例では、第一被覆領域に接着した細胞を更に培養する（図１（ｖｉｉ）参照）。培養条件は、使用する細胞に応じて適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気等としてよい。
このとき、特定の範囲の表面ゼータ電位を有する第一被覆領域において、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を簡便に形成させることができる。

上記の通り形成した細胞構造体は、その後、自発的に第一被覆領域から剥離し、細胞培養器の培養面上を移動するようになる（図１（ｖｉｉｉ）参照）。

更に、培養面上を移動する複数の細胞構造体は、接触し合うことによって、互いに接着し、より大きな細胞構造体を形成する（図１（ｉｘ）参照）。ここでは、細胞培養器を適宜転倒・混和させることによって、複数の細胞構造体の接触を促してもよい。

図８に、本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の別の例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の別の例の概略と共に示す。
本発明の実施形態の細胞培養器の別の例は、第一被覆領域の内側に第二被覆領域を備えるものである。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例における、細胞培養器の準備（図８（ｉ）参照）、細胞培養器の培養面への温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置（図８（ｉｉ）参照）、温度応答性ポリマーの細胞培養器の培養面への結合（図８（ｉｉｉ）参照）については、前述の本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の場合と同様としてよい。

次いで、この製造方法の別の例では、第一被覆領域上に、細胞接着性物質を配置（スポット）する（図８（ｉｖ）参照）。
ここで、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物の配置（スポット）手法としては、例えば、８連マイクロピペッターによる手技、溶液を定量吐出するスポッター印刷法、回転スクリーンドラム印刷法等が挙げられる。
図８に示す例では、４箇所の第一被覆領域において、それぞれ１箇所に、細胞接着性物質の水溶液を塗布している。
ここで、塗布量としては、０．０１〜１００μＬとしてよく、好適には、０．１〜１０μＬである。

続いて、この製造方法の別の例では、図１に示す例のように、塗布した細胞接着性物質の水溶液を乾燥させる。

図８に、本発明の実施形態の細胞培養器を用いた細胞培養方法の別の例の概略を、本発明の実施形態の細胞培養器の別の例の概略、及び本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例の概略と共に示す。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例における、細胞の播種（図８（ｖｉ）参照）、播種された細胞の培養（図８（ｖｉｉ）参照）、培地交換（図８（ｖｉｉｉ）参照）、第一及び第二被覆領域に接着した細胞の更なる培養（図８（ｉｘ）参照）については、前述の本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例の場合と同様としてよい。

前述の通り、形成した細胞構造体は、第二被覆領域に位置する細胞構造体の一部で、細胞培養器にアンカリングされる。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の一例により製造される、第一被覆領域のみを有し、第二被覆領域を有しない細胞培養器は、再生医療、薬物送達（ＤＤＳ）の分野において、好適に用いることができる。
具体的には、再生医療では再生を望む部位における細胞ソース、ＤＤＳではサイトカインの分泌体といった用途が考えられる。

本発明の実施形態の細胞培養器の製造方法の別の例により製造される、第一被覆領域の内側に第二被覆領域を有する細胞培養器は、創薬の分野において、好適に用いることができる。
具体的には、高価なｉＰＳ細胞を用いた小スケールでの薬剤スクリーニングといった用途が考えられる。

図１２に、本発明の実施形態の細胞培養器の別の例を用いた本発明の実施形態の細胞構造体培養槽の概要を示す。図１２（ａ）に、細胞構造体培養槽の斜視図を示し、図１２（ｂ）に、細胞構造体培養槽の断面図を示す。

本発明の実施形態の細胞構造体培養槽は、図１２に示すように、容器内に、第一被覆領域の内側に第二被覆領域を備える箇所を複数有する培養シートが複数層積層されているものである。
本発明の実施形態の細胞構造体培養槽は、細胞構造体を活性の高い状態で培養し、細胞構造体に所望の物質や生物材料（例えば、成長因子、ペプチド、糖、タンパク質、サイトカイン、その他生理活性物質、エクソソーム、マイクロＲＮＡ等）を産生させ、かかる物質や生物材料を得るために、好適に用いられる。

従来の培養槽を用いた方法では、細胞塊を含む培地を容器内で撹拌しながら浮遊分散させて、細胞塊が産生する抗凝固剤（ｔ−ＰＡ等）等を得ている。しかし、接着性細胞の場合であっても、細胞を接着させることなく浮遊させているため、細胞の活性が低く、所望の物質の産生効率が低いものとなっていた。かかる問題を解決する改良方法として、細胞をビーズに接着させて、ビーズを含む培地を撹拌しながら分散する方法が検討されている。しかしながら、この方法も、培養スケールが比較的大きくなり、また、細胞が細菌に感染するリスクが高いという問題があり、ビーズに均質に効率良く細胞を接着させること自体も困難であった。
本発明の実施形態の細胞構造体培養槽によれば、接着性細胞の場合であっても、細胞を培養面に接着させた状態で培養することが可能となり、且つ、培地の撹拌を要することがないために容器内の空間を有効に利用しつつ、細胞の細菌への感染リスクも低減することが可能となる。

細胞構造体培養槽における培養シートの詳細については、前述の本発明の実施形態の細胞培養器の別の例において記載した通りとしてよい。
ここで、培養シートには、細胞構造体をアンカリングさせる上記箇所が、シートの縦方向及び横方向に行列をなすことが、培養環境を均一にする観点から、好ましい。

また、細胞構造体培養槽においては、培養シートどうしの間に培地が通過できる程度の間隔が設けられている。かかる間隔は、例えば、培養シートの表面及び／又は裏面に、細胞構造体の径よりも大きな高さを有する突起部を適宜設け、突起部の先端で当該培養シートに隣接する培養シートを支えることによって、設けてよい。

細胞構造体培養槽には、図１２に示すように、容器の側壁に、培地を投入するための投入部と、培地を排出するための排出部とが設けられている。

本発明の実施形態の細胞構造体培養槽を用いた細胞構造体の培養の一例においては、図１２に示すように、培養シートにアンカリングされた細胞構造体を調製した後、投入部から培地を投入し、排出部から培地を排出する。
ここで、排出された培地に、水分蒸発濃縮、凍結乾燥、エタノール沈殿、フェノール処理、抗体固定磁気ビーズ処理、抗体固定蛍光ビーズ処理、ゲル濾過、遠心分離、傾斜比重薬、透析、濾過、電気泳動、酵素処理、液液抽出等の当業者に周知の方法で、所望の物質や生物材料を抽出してよい。
なお、排出された培地は、潅流させてよく、また、任意選択的に、透析してアンモニア等代謝物を除去したり、酸素バブリングをして溶存酸素濃度を高めたりしたうえで、再利用してよい。なお、投入する培地は新たな培地としてもよい。

本発明の実施形態の細胞構造体培養槽は、生体由来系生理活性物質の製造等の用途に好適に用いることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。

（実施例１）
（試験１−１）ポリマーの製造−１
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーの製造（実施例製法１−１）
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。
そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この混合物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて５時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。

ここで、反応物の一部を採取して、ポリマー化したＤＭＡＥＭＡの数平均分子量（Ｍｎ）を測定したところ、９７，００００（分散＝４．１）あった。
数平均分子量が５，０００以上であることを確認した直後に、バイアル瓶に不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、メタクリル酸１．４ｇを加えて、再度磁気撹拌器を用いて撹拌した。なお、ここで加えるメタクリル酸に対しては予め不活性ガスでバブリングを行なった。

この混合物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、１６時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、混合直後に粘性を帯び、１時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。

反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとメタクリル酸とのコポリマーブロックとからなる温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率６０％）。
このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝４５０，００００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２）と決定した（実施例ポリマー１−１）。

実施例ポリマー１−１の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ_２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、実施例ポリマー１に共通する代表的なピークを示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）δ ０．８−１．２（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），１．６−２．０（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２−Ｃ（ＣＨ_３）−），２．２−２．４（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_３）_２），２．５−２．７（ｂｒ，１．９Ｈ，−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２），４．０−４．２（ｂｒ，１．９Ｈ，−Ｏ−ＣＨ_２−）．
ここで、α位に結合したメチル基（δ ０．８−１．２）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合もメタクリル酸ユニットの場合も３個）Ａと、側鎖のエステル結合の酸素に結合しているエチル基（δ ４．０−４．２）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合は２個で、メタクリル酸ユニットの場合は０個）Ｂとから、ＤＭＡＥＭＡの側鎖が有するアミノ基の官能基数と、メタアクリル酸の側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、実施例ポリマー１−１の場合９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。

（試験２）ポリマーの曇点の測定
実施例ポリマー１−１の３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で測定した。
その結果、２０℃〜３０℃では、水溶液は透明であり、吸光度がほぼ０であったが、３１℃付近から水溶液中に白濁が見られるようになり、３２℃で吸光度が急激に上昇した。これにより、上記ポリマーは、約３２℃の曇点を有することを確認した。
なお、実施例ポリマーを３７℃まで昇温させると、ポリマー水溶液は、良好な応答性で、懸濁し、その後、水溶液全体が固化した。この固化物を室温（２５℃）で維持したところ、数十時間の間、固化した状態のままであった。その後、固化物が徐々に溶解して、均質な水溶液に変化した。固化したポリマーは４℃まで冷却すると、速やかに溶解した。そして、上記昇温及び降温の操作を繰り返し行なっても、応答性に変化は生じなかったことから、ポリマーが可逆的に相転移を生じさせることが確認された。

（試験３）ポリマーの凝集体の粒子径測定
実施例ポリマー１−１を２０℃の液体とし、静的光散乱装置（シスメックス社製、型番：ゼーターセイザー・ナノ）を用いて、光散乱により、ポリマー分子の凝集体の粒子径を測定したところ、２５０ｎｍであった。曇点未満の温度である２０℃においても、比較的粒子径の大きい凝集体、すなわち、沈殿しやすく、沈殿後に拡散しにくい凝集体を形成していることが示唆された。実施例ポリマー１は、細胞培養器に容易に被覆することができる可能性が示唆された。

（試験４）細胞培養器（第一被覆領域のみを有する細胞培養器）の製造
細胞培養器として、ポリスチレン製の３５ｍｍ細胞培養プレート（イワキ社製、型番：３０００−０３５−ＭＹＰ、１ウェル当たりの底面積：９ｃｍ^２）を用いた。
培養面を、非イオン性界面活性剤（旭電化社製、プルロニックＦ−６８）でコーティングして、細胞非接着性とした。

次いで、マイクロピペッターを用いて、培養面上の２８箇所に、曇点以下に冷却した温度応答性ポリマーの水溶液（濃度：１５μｇ／ｍＬ）４μＬずつを、それぞれ円形状に塗布した。
１箇所あたりの円形の第一被覆領域の直径は、約２，０００μｍであり、また、第一被覆領域間の距離は、約１，０００μｍであった。
そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した温度応答性ポリマーの水溶液を乾燥させた。
こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域を設けた。

図２に、試験４で作製した本発明の実施例の細胞培養器を培養面側からみた図を示す。

（試験５）ゼータ電位の測定
細胞培養プレートの小片に（試験４）の手順と同様の手順に従って設けた第一被覆領域の表面ゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。
具体的には、石英セルの下面に小片の試料を密着させ、セル内部にモニター粒子懸濁液を注入した。ここで、標準のモニター粒子として、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用いた。また、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。そして、ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式を用いて算出した。
非被覆の細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は−６８ｍＶであり、一般的な熱可塑性樹脂の固体表面のゼータ電位として当業者に周知の値であった。
一方、温度応答性ポリマーにより被覆された細胞培養プレートの小片の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。
なお、当業者に周知の通り、現在の技術では、固体表面のゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものであり、また、試料の調製工程においても、コーティング操作自体にバラツキが存在するものであるため、上記ゼータ電位の測定値はある程度の誤差を有し得る。

（試験６）接触角の測定
細胞培養プレートの第一被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。

（試験７）細胞培養
ここで、ＧＦＰでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の間葉系脂肪幹細胞２．５×１０^６個を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６）中に浮遊させ、細胞密度が２．５×１０^６個／プレートとなるように播種した。
この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で３時間培養した。
このとき、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しなかった。
３時間培養後、新たなＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ溶液を用いて培地交換を行った。

図３及び図４に、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
図３（ａ）〜（ｄ）、図４（ａ）〜（ｄ）に、それぞれ、培地交換から、０時間後（培地交換直後）、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、８時間後、１２時間後の様子を示す。

培地交換から０時間後（培地交換直後）には、脂肪幹細胞が第一被覆領域の全面に接着していた（図３（ａ）参照）。
培地交換から２時間後に、接着していた細胞のうち、特に、第一被覆領域の外縁に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた（図３（ｂ）参照）。
培地交換から３時間後〜６時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、第一被覆領域の外縁側から第一被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した（図３（ｃ）、図３（ｄ）、図４（ａ）、図４（ｂ）参照）。
培地交換から８時間後に、遂には、各第一被覆領域における培養から、第一被覆領域の数だけ、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体が形成した（図４（ｃ）参照）。
培地交換から１２時間後、塊状の細胞構造体は、自発的に第一被覆領域から剥離し、細胞培養器の培養面上を移動し始めた。いくつかの細胞構造体は、互いに接着を始めていた（図４（ｄ）参照）。

なお、図７（ａ）に、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から０時間後（培地交換直後）の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。

本実施例では、塊状の細胞構造体を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で更に培養した。
図５及び図６に、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
図５（ａ）〜（ｄ）、図６（ａ）〜（ｄ）に、それぞれ、塊状の細胞構造体が自発的に第一被覆領域から剥離し、浮遊した後、細胞培養器を適当に転倒・混和させることによって浮遊物を人為的に細胞培養器の中央部に集めて、細胞構造体同士を接触させてから、０時間後、５時間後、８時間後、１２時間後、１７時間後、２２時間後、２５時間後、３４時間後の様子を示す。

多数の塊状の細胞構造体は、培養面上を移動し、接触し合うと互いに接着し、より大きな細胞構造体を形成する、という現象を繰り返し、遂には、数個の塊状の細胞構造体となった（図５（ａ）〜（ｄ）、図６（ａ）〜（ｄ）参照）。

なお、図７（ｂ）に、本発明の実施例の細胞培養器の第一被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から２１時間後の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。

（試験８）細胞培養器（第一被覆領域上に第二被覆領域を有する細胞培養器）の製造
前述の（試験４）と同様に、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域を設けた。
次いで、第一被覆領域に、超微量計量ピペッター（ＮＩＣＨＩＲＹＯ社製、デジフィット）を用いて、培養面上の２８箇所に設けられた円形の第一被覆領域に、ヒト血漿由来フィブロネクチン水溶液（ＢＤファルコン社製、濃度：１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号：３３５３６６３）０．２μＬずつを、それぞれ円形状に塗布した。ここで、第一被覆領域の円形と、第二被覆領域の円形とは、同心円状になるようにした。
１箇所あたりの円形の第二被覆領域の直径は、約２５０μｍであった。
そして、クリーンベンチ内にて放置することによって、塗布した細胞接着性物質の水溶液を乾燥させた。
こうして、細胞培養プレートの培養面に温度応答性ポリマーで被覆した第一被覆領域の内側に第二被覆領域を設けた。

（試験９）細胞培養
ここで、前述の（試験４）と同様に、ＧＦＰでタグ付けしたラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞２．５×１０^６個を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９９５−０６５、ＦＣＳ：インビロトジェン社製、ロット番号：９２８６９６）中に浮遊させ、細胞密度が２．５×１０^６個／プレートとなるように播種した。
この播種したラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で３時間培養した。
このとき、播種された細胞のうち、培養面のうちの第一被覆領域に位置する細胞は、第一被覆領域に接着し、一方、播種された細胞のうち、培養面のうちの細胞非接着性である非被覆領域に位置する細胞は、培養面に接着しなかった。
３時間培養後、新たなＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ溶液を用いて培地交換を行った。

本発明の実施例の細胞培養器の第一及び第二被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真は、図３及び図４とほぼ同様となった（図示せず）。
それぞれ、培地交換から、０時間後（培地交換直後）、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、８時間後、１２時間後の様子は、図３及び図４とほぼ同様となった（図示せず）。

培地交換から０時間後（培地交換直後）には、脂肪幹細胞が第一被覆領域の全面に接着していた（図３（ａ）参照）。
培地交換から２時間後に、接着していた細胞のうち、特に、第一被覆領域の外縁に位置する細胞が、自発的に剥離し始めた（図３（ｂ）参照）。
培地交換から３時間後〜６時間後にかけて、細胞の自発的な剥離は、第一被覆領域の外縁側から第一被覆領域の中心側に向かって、徐々に進行した（図３（ｃ）、図３（ｄ）、図４（ａ）、図４（ｂ）参照）。
培地交換から８時間後に、遂には、各第一被覆領域における培養から、第一被覆領域の数だけ、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体が形成した（図４（ｃ）参照）。

培地交換から１２時間後、塊状の細胞構造体のうちの大部分は、自発的に第一被覆領域から剥離したが、細胞構造体のうちの第二被覆領域上に位置する部分が、第二被覆領域にアンカリングされ、第一及び第二被覆領域上に留まった（図９参照）。

なお、図９に、本発明の実施例の細胞培養器の第一及び第二被覆領域においてラット皮下脂肪由来の脂肪幹細胞を培養した際の、培地交換から０時間後（培地交換直後）の様子を、実体顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。

本実施例では、塊状の細胞構造体を、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気の細胞培養インキュベーター中で所定時間培養した。

細胞培養器を適当に転倒・混和させても、形成した細胞構造体が細胞培養皿から剥離することはなく、隣接する第一及び第二被覆領域間のそれぞれで形成した細胞構造体は接着することはなかった。
図１０に、図９に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に１０ｃｍ／秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）〜（ｄ）は、揺動開始から、０秒後、０．５秒後、１．０秒後、１．５秒後の様子を示す。
図１１に、図９に示す細胞構造体を、手動で水平方向四方に１０ｃｍ／秒程度の速度で揺らした際の様子を、位相差顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。（ａ）〜（ｄ）は、揺動開始から、２．０秒後、２．５秒後、３．０秒後、３．５秒後の様子を示す。
図１０及び図１１に見られる通り、揺動中、細胞培養皿上の６つの塊状の細胞構造体（図中、培養面の上参照）は、細胞培養皿に関して変位していないのに対して、細胞培養皿上の細胞構造体以外の細胞（図中、培養面の右下参照）は、細胞培養皿に関して変位していることがわかる。

（実施例２〜実施例１１）
更に、下記の表１に記載の通り条件を変えて、実施例１と同様に、試験１〜試験９に記載の操作と同様の操作を行った。

実施例２〜実施例１１において用いた実験材料の詳細を以下に記載する。

−細胞培養器−
・低接着性プレート（３５ｍｍ）：Ｐｒｉｍｅ Ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）（住友ベークライト社）
・ガラスシャーレ（５０ｍｍ）：ＢＲＯＳＩＬ（アズワン社製）
・汎用滅菌（大腸菌用）シャーレ（９０ｍｍ）：ＧＤ９０−１５（アズワン社）

−温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物−
・実施例ポリマー１−２：下記（試験１−２）により調製。
（試験１−２）ポリマーの製造−２
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１００，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。
なお、ポリマーの曇点及び粒子径は、実施例ポリマー１−１の場合と同様であった。
・実施例ポリマー１−３：（試験１−２）において、窒素ガスのパージ時間を１０分間から２０分間に変更した。重合よりも加水分解がより進行してアニオン成分が増えた。
・実施例ポリマー１−４：（試験１−２）において、窒素ガスのパージ時間を１０分間から５分間に変更した。加水分解よりも重合がより進行してカチオン成分が増えた
・実施例ポリマー１−５：（試験１−２）において、ＤＭＡＥＭＡの代わりに、親水性非イオン性モノマーのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）をＤＭＡＥＭＡの３質量％配合したものを用いた。
・実施例ポリマー１−６：（試験１−２）において、ＤＭＡＥＭＡの代わりに、非イオン性モノマーのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）をＤＭＡＥＭＡの５％配合したものを用いた。

−細胞−
・ヒト癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２）：ＣＥＴ社製、ＨＥＰＧ２−５００
・心筋細胞：ビーグル犬由来初代細胞
・軟骨細胞：ビーグル犬由来初代細胞

−細胞接着性物質−
・ラミニン：ニッピ社製
・コラーゲン：新田ゼラチン社製

本発明によれば、微小サイズ（例えば、数百μｍ以下のサイズ）の細胞構造体（例えば、スフェロイド）を大量に簡便に作製することが可能な細胞培養器を提供することができる。

Claims (10)

1. 細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域を複数有し、
   前記第一被覆領域の表面ゼータ電位が、０〜５０ｍＶであり、
   前記細胞培養器の培養面は、細胞非接着性であり、
   前記各第一被覆領域の面積が、０．１〜３０ｍｍ ^２ であり、
   前記第一被覆領域間の距離が、０．１〜１０ｍｍである、
   ことを特徴とする、細胞培養器。
2. 前記第一被覆領域に対する水の接触角が、５０〜９０°である、請求項１に記載の細胞培養器。
3. 前記第一被覆領域の平面視形状が、円形、楕円形、外輪郭線の内側に曲率中心を有する形状からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の細胞培養器。
4. 前記温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー；Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー；２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物；からなる群から選択される少なくとも１種の温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養器。
5. 前記アニオン性モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基からなる群から選択される少なくとも１種の基を有するビニル誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の細胞培養器。
6. 前記カチオン性モノマーは、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４又は５に記載の細胞培養器。
7. 前記第一被覆領域に、細胞接着性物質で更に被覆された第二被覆領域を有し、該第二被覆領域は前記第一被覆領域の内側にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養器。
8. 前記細胞接着性物質は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項７に記載の細胞培養器。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養器の前記培養面に細胞を播種し、播種した細胞を培地中で培養し、培地交換を行い、前記培養面に接着した細胞をさらに培養し、細胞構造体を得ることを特徴とする、細胞構造体の製造方法。
10. 前記細胞構造体のサイズが５０〜１，５００μｍ径である、請求項９に記載の細胞構造体の製造方法。