JP7397882B2 - 二重特異性抗体及びその調製方法、使用 - Google Patents

二重特異性抗体及びその調製方法、使用 Download PDF

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Description

関係出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２日に中国専利局に提出された、出願番号２０１９１０５９１１１０．２であり、名称が「二重特異性抗体及びその調製方法、使用」である中国出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容が、参照により本明細書に取り込まれる。
本開示は、抗体及びその調製方法、使用に関し、具体的に、二重特異性抗体及びその調製方法、使用に関する。
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２などのＢ細胞の表面の特異性抗原は、Ｂ細胞関連疾患の潜在的な治療標的であり、その中で、ＣＤ２０タンパク質は、Ｂリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５またはＢ１とも称され、ヒトＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされた、分子量が３５ｋＤ程度の４回膜貫通型の高疎水性を有する非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、プレＢ細胞および成熟したＢ細胞の表面に特異性発現しているが、造血幹細胞、前駆細胞、形質細胞及びその他の正常な体細胞に発現していないものである。ＣＤ２０は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）などのＢ細胞リンパ腫の細胞の表面にも同時に発現している。ＣＤ２０には既知の天然のリガンドがない。しかし、研究により以下のことを発見した。ＣＤ２０は、カルシウムイオンチャネル活性があり、細胞内のカルシウムイオン濃度を調節することによって細胞周期を調節し、Ｂ細胞の活性化であるＧ０期からＧ１期への分化・成長過程に特別な役割を果たすとともに、Ｓ期から有糸分裂へ細胞周期を調節し、細胞のアポトーシスを誘導することもできる。
ＣＤ２０は、様々なＢ細胞関連リンパ腫細胞の表面に特異的に発現され、プレＢ細胞とその他の体細胞では発現せず、且つ脱落や分泌しにくく、抗体と結合した後にエンドサイトーシスが起こらないので、Ｂ細胞関連疾患の治療に対して利用可能性を有する理想的なターゲットである。現在、ＣＤ２０に対する様々なモノクローナル抗体類治療薬がすでに市販され、その作用機序によりＩ型とＩＩ型に分けられる。Ｉ型抗体は、主に補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）により機能しており、ＩＩ型は、主にプログラム細胞死（ＰＣＤ）及びＡＤＣＣにより機能している。ヒトマウスキメラ抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、商品名：Ｒｉｔｕｘｉａｎ）は、第１の世代のＣＤ２０抗体（Ｉ型）であり、１９９７年にＮＨＬの治療薬としてＦＤＡにより承認され、その後、関節リウマチ、ＣＬＬなどの疾患の治療薬としても承認された。完全ヒトモノクローナル抗体オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、商品名：Ａｒｚｅｒｒａ）は、第２の世代のＣＤ２０抗体（Ｉ型）であり、リツキシマブと比べて、ＣＤ２０に対する親和性が高く、細胞試験でＣＤＣ応答も強く、ＡＤＣＣ応答がリツキシマブに似ており、２００９年にフルダラビンまたはアレムツズマブに効果のないＣＬＬの治療薬としてＦＤＡにより迅速に承認され、その後、治療濾胞性リンパ腫、視神経脊髄炎、びまん性と再発性多発性硬化症などの疾患の治療薬として承認された。ヒト化モノクローナル抗体オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ、商品名：Ｇａｚｙｖａ）は、第３の世代のＣＤ２０抗体（ＩＩ型）であり、糖鎖修飾により、ＮＫ細胞、巨噬細胞及び樹突状細胞に対する抗体の親和性を高めるため、リツキシマブよりもＡＤＣＣ応答が強く、また、好中球によって引き起こされるエンドサイトーシス及び細胞死を介して、Ｂ細胞のアポトーシスをより効果的に誘導することができる。２０１３年に、クロラムブシルと組み合わせて過去未治療のＣＬＬの治療薬としてＦＤＡにより承認された。
ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体薬は、従来の化学療法と比べて、より優れた臨床的利点を示しているが、多くの場合には化学薬品と組み合わせる必要があり、すべての患者がＣＤ２０抗体療法に反応できるわけではないものである。これは、ＣＤ２０モノクローナル抗体の有効性が腫瘍細胞におけるＣＤ２０の発現レベルに関連しており、ＣＬＬ細胞などの一部のタイプのＣＤ２０は、他のタイプのＢ細胞腫瘍よりもＣＤ２０の発現レベルが著しく低いため、ＣＤ２０モノクローナル抗体の有効性が制限されるためである。また、モノクローナル抗体は、主に、ＦｃγＲとの結合によって生成されるＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどの作用機序で腫瘍細胞を殺すが、ＦｃγＲは、人類に多型性を持ち、ＦｃγＲのＦｃに対する親和性に大きな差異をもたらし、薬物全体の有効性を減らし、再発や薬剤耐性につながり、一度再発すると治療がさらに難しくなり、予後が極めて悪く、生存期間の中央値はわずか２～８ヶ月である。腫瘍殺傷効果の高いＴ細胞は、ＦｃγＲを持たないため、効果的に活性化することができないので、Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞をより効率的に死滅させたり、２つ以上の抗原ターゲットに結合する多機能抗体を同時に開発したりして、現在の治療状況に合わせるより効果的な抗体医薬の設計が必要となっている。
二重特異性抗体は、２つのエピトープまたは１つの抗原の２つのエピトープに同時に結合できるため、相乗効果によってより高い効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を達成できる。一部の二重特異性抗体は、エフェクター細胞（Ｔ細胞など）を標的標的に動員し、Ｔ細胞を活性化することで標的細胞を直接殺すことができる。現在、二重特異性抗体は、安全性と有効性が大幅に向上し、腫瘍や自己免疫疾患の治療に広く用いられ、腫瘍免疫療法の研究開発のホットスポットとなり、幅広い応用が期待されている。悪性腫瘍治療の実用化においては、通常、二重特異性抗体は、腫瘍細胞表面抗原と免疫細胞表面抗原に同時に結合し、自身の免疫系を活性化して腫瘍細胞を死滅させる。
ＣＤ３は、ホモロガスまたはヘテロ二量体のタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の重要な構成要素である。その細胞内領域には、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が含まれている。ＩＴＡＭは、リン酸化されると、キナーゼＺＡＰ７０に結合するので、Ｔ細胞活性化シグナルを下流に伝達する。ＣＤ３を標的とする抗体は、Ｔ細胞の表面にＣＤ３を蓄積することよってＴ細胞を活性化することができる。このプロセスは、ＭＨＣ抗原ペプチドのＴＣＲ認識プロセスを模倣している。ＣＤ３耐性と腫瘍特異的抗原耐性を持つ二重特異性抗体は、Ｔ細胞と腫瘍細胞に同時に結合し、Ｔ細胞を活性化・誘導してグランザイムやパーフォリンなどを分泌させ、腫瘍細胞を死滅させる。例えば、ＣＤ２０分子とＣＤ３分子に同時に結合する二重特異性抗体は、ＣＤ２０タンパク質を発現する腫瘍細胞にＴ細胞を動員し、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞を殺して排除することができる。
ほとんどの初期の二重特異性抗体は、精製されたモノクローナル抗体の化学的架橋、または２つの異なるモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞の融合によって生成される。しかし、これらの方法で製造された製品には、安定性が低く、収量が低く、抗体修飾が不適切であり、免疫原性、製造・精製が難しいなどの多くの問題がある。近年の遺伝子工学技術の進歩に伴い、遺伝子工学技術により多くのＢｓＡｂが作製されており、現在６０種類以上のバイスペシフィック抗体が存在し、主に、Ｆｃを含まない二重特異性抗体と、Ｆｃ領域が含まれる二重特異性抗体との２種類に分けられる。ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂｓ、Ｂｉ－ＮａｎｏｂｏｄｙなどのＦｃを含まない二重特異性抗体は、分子量が小さく、原核細胞で発現可能であり、生産の複雑さを軽減し、組織や腫瘍細胞を容易に通過してターゲット到達することができるが、Ｆｃ関連の生物学的機能を媒介できず、半減期が短く、インビボで素早く排出されてしまう。抗体に非天然のペプチド鎖連結断片や付加構造を導入すると、相対分子量や物理化学的性質が天然の型ＩｇＧ抗体とは大きく異なり、多量体を形成しやすく、免疫原性をもたらす。Ｆｃを含む二重特異性抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介し、血中での抗体の半減期（ＦｃＲｎ媒介）、安定性および溶解性を増加させる。さらに、それは、プロテインＡ（プロテインＡ）とプロテインＧ（プロテインＧ）の結合領域でもあり、下流の製品の精製を容易にさせる。このタイプの二重特異性抗体技術には、ＴｒｉｏＭａｂ、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＤｕｏＢｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ＢＥＡＴなどが含まれる。
本開示は、例えば、先行技術の上記の欠点を解消し、腫瘍細胞のＴ細胞特異的死滅を媒介できる、ＣＤ２０とＣＤ３を標的とする安定かつ効率的な二重特異性抗体を提供することを目的とする。
第１の態様において、本開示は、ＣＤ２０に結合可能なドメイン、ＣＤ３に結合可能なドメインおよびヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体を提供する。ＣＤ２０に結合可能なドメインおよびＣＤ３に結合可能なドメインは、それぞれ独立してＦａｂ領域、ＳｃＦｖ領域、またはｓＤａｂ領域から選択される。
最も理想的な二重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体の自然な構造を維持するものである。これは、抗体の調製プロセスに、重鎖と軽鎖の不一致の問題を解消する必要がある。本開示は、抗体の構造および機能に影響を与えることなく、抗体のＦｃおよび重鎖－軽鎖界面における少数のアミノ酸を変化させ、少数の部位変異を導入することにより、この人工的に改変されたペアリング法を用いて、白血球分化抗原２０（ＣＤ２０）と白血球分化抗原３（ＣＤ３）を同時に標的とする。従来のモノクローナル抗体と比べて、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体は、以下の利点を有する。（１）ＣＤ４＋和ＣＤ８＋を活性化するＴ細胞は、ＣＤ２０発現レベルが非常に低い腫瘍細胞を含むＣＤ２０陽性の腫瘍細胞を特異的に殺す。（２）非常に低い投与量でも、非常に効果的な腫瘍傷害効果を得られる。（３）低レベルのサイトカイン放出を引き起こすことができ、より安全である。（４）構造が天然のＩｇＧ抗体と類似しており、モノクローナル抗体と類似の安定性、半減期、物理的および化学的特性を有する。当該二重特異性抗体は、疾患の治療や診断などさまざまな応用分野で使用できる。
本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ２０エピトープおよびＣＤ３エピトープに特異的に結合し、抗原特異性を介してＴ細胞活性化を媒介することができる。二重特異性抗体は、Ｔ細胞を介して腫瘍細胞を特異的に死滅させることができ、ＣＤ２０とＣＤ３を安定的、効率的に標的とする新たな二重特異性抗体（即ち、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ）であり、ヒトおよび霊長類のＣＤ２０とＣＤ３と交差反応できる。
本開示の二重特異性抗体は、３本または４本のポリペプチド鎖からなり、３本鎖構造は重鎖、軽鎖およびｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖を含む。４本鎖構造は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。二重特異性抗体は、ＣＤ２０に特異的に結合する免疫グロブリンドメイン、ＣＤ３に特異的に結合する免疫グロブリンドメイン、ならびにヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。２本の重鎖（または１本の重鎖とｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖）が相互作用し、結合してヘテロ二量体形態を形成し、前記のヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。４本鎖二重特異性抗体では、２本の軽鎖が、それぞれ重鎖の１つに結合してＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂ構造とＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ構造を形成する。なお、本開示に記載のＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂは、インビボでの抗体の半減期および安定性を向上させることができるＦｃ領域を含む。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第１の重鎖と第１の軽鎖とにより形成され、前記第１の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、および／または、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第２の重鎖と第２の軽鎖とにより形成され、前記第２の重鎖の可変領域は、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つのポリペプチド鎖により構成され、各ポリペプチド鎖は、反対の電荷を持つ非対称アミノ酸修飾を含む。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖のＣＨ１部分および第１の軽鎖のＣＬ部分は、いずれも天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基と、非システイン残基を置き換えるシステイン残基とを含む。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、非システイン残基を置き換えるシステイン残基と、第１の軽鎖のＣＬ部分の、非システイン残基を置き換えるシステイン残基とは、ジスルフィド結合を形成している。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２２０Ｓであり、非システイン残基を置き換えるシステイン残基がＬ１２８Ｃである。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の軽鎖のＣＬ部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２１４Ｓであり、非システイン残基を置き換えるシステイン残基がＦ１１８Ｃである。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基を含まず、且つ非システイン残基を置き換えるシステイン残基を含まない。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の重鎖と第２の重鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖のヒンジ領域および前記第２の重鎖のヒンジ領域は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して共有結合している。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖と第２の重鎖は、いずれもＣＨ２ドメインと修飾されたＣＨ３ドメインを含み、前記第１の重鎖のＣＨ２ドメイン、修飾されたＣＨ３ドメインは、前記第２の重鎖のＣＨ２ドメイン、修飾されたＣＨ３ドメインと互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖と第２の重鎖のＣＨ２ドメインのうち、少なくとも１つのＣＨ２ドメインは、１つ、２つまたはそれ以上の変異部位を含む。変異部位は、Ｆｃの受容体ＦｃγＲへの結合を減少させるために使用される。本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、当該変異の組み合わせは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａである。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインと第２の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成するための反対の電荷を持つ非対称アミノ酸修飾を含む。反対の電荷を持つ非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体の形成を促進できる。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインは、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ変異の少なくとも１つを含み、且つ前記第２の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ変異の少なくとも１つを含み、または、前記第１の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインは、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ変異の少なくとも１つを含み、前記第２の重鎖の修飾されたＣＨ３ドメインは、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ変異の少なくとも１つを含む。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖と第２の重鎖は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖と第２の重鎖は、ヒト抗体ＩｇＧ１に由来する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記第１の重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、第１の軽鎖は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖は、配列番号５または配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、または、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域の第２の重鎖は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、前記第１の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖の重鎖の可変領域ＣＤＲ３は、Ｎ１０６Ｔ変異を含み、変異後のＣＤＲ３配列がＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡである。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、またはその可変領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
本開示は、第２の態様において、上記のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を基体に連結してなる発現ベクターを提供する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクターまたは組換え発現ベクターである。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記基本ベクターは、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ １－Ｆｃ２である。
本開示は、第３の態様において、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である。本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。
本開示は、第４の態様において、上記の二重特異性抗体を調製する方法を提供する。該方法は、
請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチドを基本ベクターに連結してなる発現ベクターを構築するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）で構築された発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換し、宿主細胞を培養するステップ（ｂ）と、
二重特異性抗体を分離及び精製するステップ（ｃ）とを含む。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記二重特異性抗体を分離及び精製する方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換法または陰イオン交換法である。
本開示は、第５の態様において、カップリング物質と上記の二重特異性抗体とがカップリングすることにより形成される抗体コンジュゲートを提供する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記カップリング物質は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識体、発光物質、発色物質または酵素である。
本開示は、第６の態様において、上記の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
本開示は、第７の態様において、腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスを治療する医薬品または医薬組成物の調製における上記の二重特異性抗体の使用を提供する。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記腫瘍は、ＣＤ２０発現に関連する悪性腫瘍である。
本開示の二重特異性抗体の１つ以上の実施形態において、前記悪性腫瘍は、急性Ｂリンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫である。
本開示は、第８の態様において、医薬品または医薬組成物における上記の二重特異性抗体の使用を提供する。
本開示は、第９の態様において、腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスの治療における上記の二重特異性抗体の使用を提供する。
従来技術と比べて、本開示は、以下の有益な効果を有する。
（１）本開示に記載の前記ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ分子は、天然のＩｇＧ抗体の構造あるいは天然のＩｇＧ抗体に近い構造を維持し、モノクローナル抗体と似ている安定性および理化学的性質を有する。
（２）本開示は、二重特異性抗体の構築に関し、重鎖と軽鎖の少数のアミノ酸を変異させ、２つのポリペプチド鎖が反対の電荷を持ち、重鎖ヘテロ二量体の形成を促進し、非天然のジスルフィド結合を導入することで軽鎖のミスマッチを解消する。この方法は、突然変異がほとんどなく、Ｆｃ領域の機能にほとんど影響を与えず、真核細胞におけるタンパク質の発現と収量に影響を与えない。
（３）モノクローナル抗体と比べて、本開示に記載の前記ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ分子は、腫瘍細胞の表面抗原に結合することができるとともに、Ｔ細胞の表面ＣＤ３分子にも結合することができる。さらに、ＴＣＲの抗原特異的活性化に依存しているので、標的腫瘍殺傷を増加させることができる。したがって、少量の抗体で腫瘍細胞を顕著に殺す役割を果たすことができる。
（４）ＢｉＴＥなどの小分子二重特異性抗体と比べて、本開示の前記ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ分子は、抗体のＦｃ領域を含むので、抗体の半減期と安定性を向上させるとともに、既存のモノクローナル抗体の精製技術を利用でき、二重特異性抗体の製造プロセスが簡素化される。
（５）ＣＤ２０を標的としたキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ－Ｔ）と比べて、本開示は、外因性ウイルス、インビトロＴ細胞培養及び再注入などの操作を含まず、副作用がより少なく、より安全であり、より制御可能である。
（６）本開示は、ＣＤ３類二重特異性抗体分子の安全性を改善するためのＣＤ３親和性弱体化の改変に関する。
本開示の前記ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ構造の一例の模式図である。 プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂを示す。そのうち、図２Ａは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１プロテインＡワンステップ精製後の非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル図であり、図２Ｂは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２プロテインＡワンステップ精製後の非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル図であり、図２Ｃは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ（３本鎖二重特異性抗体、ａｎｔｉ－ＣＤ２０ドメインがｓｃＦｖであり、ａｎｔｉ－ＣＤ３ドメインがＦａｂである）プロテインＡワンステップ精製後の非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ゲル図である。 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）方法によって精製されたＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１Ａ２８０紫外線吸収ピークを示す図である。プロテインＡ精製後のサンプル（図２Ａ）を陽イオン交換カラムにローディングし、ＮａＣｌ勾配によって溶出し、紫外光の２８０ｎｍでの吸収値を検出することにより溶出したタンパク質を採取した。ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１はＣＥＸを介して１つのメイン溶出ピーク（ピークＤ）と４つの小さな二次溶出ピークを形成した。 二重抗体精製の溶出曲線である。（Ａ）濃度が１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ精製サンプル（図２Ａ）１ｍＬを取り、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりタンパク質ワンステップ精製後サンプルの凝集体含有量を分析する。該図はＡ２８０紫外線吸収ピークを示す図である。（Ｂ）濃度が１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ精製サンプル（図２Ｃ、ｌａｎｅ１）１ｍＬを取り、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりタンパク質ワンステップ精製後サンプルの量体含有量を分析する。該図はＡ２８０紫外線吸収ピークを示す図である。 ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体の抗原ＣＤ３に対する結合能を検出する結果の図である。そのうち、図５Ａは、ＥＬＩＳＡによるＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１とＶ２とのＣＤ３抗原分子への親和性の比較、ＣＤ３抗原に結合するＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１のＥＣ５０濃度が０．８１７８μｇ／ｍＬであり、ＣＤ３抗原に結合するＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２のＥＣ５０濃度が２．０９７μｇ／ｍｌである。図５Ｂは、３本鎖二重特異性抗体のＣＤ３抗原分子への結合能力を示す。そのうち、１は、４本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したＥＣ５０濃度が４．９μｇ／ｍｌである。２は、３本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがｓｃＦｖであり、ＣＤ３に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したＥＣ５０濃度が４．９μｇ／ｍｌである。３は、３本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したドメインｓｃＦｖであり、ＣＤ３に結合したＥＣ５０濃度が０．６μｇ／ｍｌである。 ＦＡＣＳにより検出されたＣＤ２０発現陽性細胞（Ｒａｊｉ細胞）へのＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１とＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２の結合を示す図である。 ＡＤＣＣ細胞傷害実験を示す図である。図７Ａと図７Ｂは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１とＶ２を介した標的細胞（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞）へのＡＤＣＣ活性を検出するための図であり、Ｖ１とＶ２は、ＣＤ２０の発現が高い腫瘍細胞に対して傷害効果が顕著であり、ＥＣ５０濃度がいずれも０．２ｎｇ／ｍｌである。図７Ｃは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ３本鎖二重特異性抗体を介した標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）への傷害活性を検出するための図であり、そのうち、１は、３本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがｓｃＦｖであり、ＣＤ３に結合したドメインがＦａｂである。２は、３本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したドメインｓｃＦｖである。３は、４本鎖二重特異性抗体であり、ＣＤ２０に結合したドメインがＦａｂであり、ＣＤ３に結合したドメインがＦａｂである。 タンパク質の熱安定性試験を示す図であり、タンパク質サンプルを３７℃と４０℃で異なる期間（０日間、１日間、４日間、７日間）置いた場合のタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の図である。 ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂサイトカイン放出試験の結果を示す図である。 ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂを介したマウスにおける抗腫瘍活性の検出結果を示す図である。
以下、本開示の目的、技術案および利点をよりよく説明するために、添付の図面および具体的な実施形態を参照しながらさらに説明する。さらに、本開示をよりよく理解させるために、以下、関連用語の定義および説明を提供する。
ＢｓＡｂ：二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）
ＨＣ：重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）
ＬＣ：軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
ＶＨ：重鎖の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）
ＶＬ：軽鎖の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
ＣＨ：重鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）
ＣＬ：軽鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）
ＣＤＲ：抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）
ｓｃＦｖ：１本鎖の可変領域抗体フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーティング、即ち、フローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）
ＥＣ５０：５０％効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
特に断らない限り、本開示において使用される関連用語は、当該技術分野において一般的に理解される用語と同じ意味を有する。本開示に記載の前記分子クローニング、細胞培養、タンパク質精製、免疫学的実験、微生物学、動物モデルなどの試験の操作ステップは、当分野で広く使用されている一般的なステップである。特に断らない限り、本開示における単数形の用語の意味が複数の意味を含み、複数の意味が単数形の意味を含む。特に断らない限り、本開示に記載のヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端の方向に左から右に並べて表記する。特に断らない限り、本開示に記載のアミノ酸配列は、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）の方向に左から右に並べて表記する。本開示で言及されるアミノ酸の３文字の略語およびヌクレオチドの１文字の略称は、当分野で一般的に受け入れられるものであり、アミノ酸の１文字の略称は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ 生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されるものである。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する２０種類のアミノ酸のうちの１つ、または、特定の定義された場所に存在する可能性のある非天然類似体である。本開示に記載の「アミノ酸の変異」という用語は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、欠失および修飾、ならびにアミノ酸の置換、挿入、欠失および修飾の任意の組み合わせを指す。本発明の好ましいアミノ酸修飾は置換である。本開示において「アミノ酸の置換」または「置換」という用語は、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指す。例えば、置換Ｃ２２０Ｓとは、ポリペプチドの２２０位のアミノシステインがアミノ酸セリンで置換されたバリアントポリペプチドを指す。アミノ酸の変異は、分子クローニングまたは化学方法によって達成することができ、分子クローニング法は、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発、全遺伝子合成などを含む。
「タンパク質」、「ペプチド鎖」、「ポリペプチド鎖」という用語は、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合した分子を指し、天然のタンパク質、人工タンパク質、タンパク質断片、突然変異タンパク質、融合タンパク質などが含まれる。
「ドメイン」という用語は、生体高分子において独立した機能を有する特定の構造領域である。ドメインは、独立した三次構造を有し、その機能が生体高分子の他の部分に依存していない。本開示におけるドメインは、重鎖の可変領域ＶＨドメイン、軽鎖の可変領域ＶＬドメインなどのタンパク質における領域を指し、ドメインの組み合わせにより大きなドメインを形成できる。
「ＣＤ３」という用語は、Ｔ細胞の表面に発現するＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）の構成成分である分化のクラスター－３タンパク質を指す。それは、ＣＤ３δ（ヒトＣＤ３δＵｎｉＰｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ．Ｐ０４２３）、ＣＤ３ε（ヒトＣＤ３εＵｎｉＰｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ．Ｐ０７７６６）、ＣＤ３γ（ヒトＣＤ３γＵｎｉＰｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ．Ｐ０９６９３）及びＣＤ３ζ（ヒトＣＤ３ζＵｎｉＰｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ．Ｐ２０９６３）の４本のペプチド鎖から構成されるホモロガスまたはヘテロ二量体である。「カニクイザルＣＤ３」、「マウスＣＤ３」のように明示的に指定されない限り、本開示で言及される「ＣＤ３」はヒトＣＤ３である。
本開示に記載の前記「ＣＤ３に結合するポリペプチド鎖」または「ＣＤ３に結合する抗体」には、ＣＤ３単鎖ユニットに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、ならびにＣＤ３ホモダイマーまたはヘテロダイマーに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントが含まれる。本開示に記載の前記ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ＣＤ３タンパク質分子に結合することができるし、細胞の表面上に発現されるＣＤ３にも結合することができる。
「ＣＤ２０」という用語は、ヒトＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードおよび発現されるＢリンパ球制限分化抗原（ヒトＣＤ２０ＵｎｉＰｒｏｔ Ｅｎｔｒｙ Ｎｏ．Ｐ１１８３６）を指し、細胞によって自然に発現されるか、トランスフェクトされた外来遺伝子によって発現されるヒトＣＤ２０タンパク質のバリアント、サブタイプ、および他の種からの相同タンパク質（カニクイザルＣＤ２０タンパク質など）を含む。
「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原認識部位を含み、抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子を指す。ここで、「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ハプテン、または上記の物質の組み合わせなどの、体内で免疫応答を誘導し、抗体に特異的に結合する物質を指す。抗体と抗原の結合は、両者の相互作用によって媒介されるものであり、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、疎水性結合などを含む。抗原の表面にある抗体と結合する領域が、「抗原決定基」または「エピトープ」と称され、一般に各抗原には複数の決定基が存在している。本開示で言及される「抗体」は、望ましい生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、少なくとも２つの異なるエピトープ結合ドメインを含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、翻訳後修飾抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、抗体エピトープを含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含むその他の修飾免疫グロブリン分子を含んでよい。具体的には、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子が含まれる。
天然のヒト抗体の軽鎖は、２つのジスルフィド結合を介して重鎖に共有結合され、重鎖間で形成されたジスルフィド結合によって重鎖－軽鎖二量体が形成され、Ｙの文字に類似した抗体分子が形成される。異なるタイプのヒト抗体の重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。Ｙの文字の両アームと胴体の間の領域がヒンジ領域であり、ある程度の柔軟性がある。各抗体ポリペプチド鎖は、可変領域と定常領域を含み、空間的な折り畳みによって異なるドメイン単位を形成する。各軽鎖は、アミノ末端の可変領域ドメインＶＬとカルボキシ末端の定常領域ドメインＣＬから構成される。各重鎖は、アミノ末端可変領域ドメインＶＨと、それに続く３つまたは４つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）から構成される。
抗体の可変領域は、重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合領域であり、ＶＨとＶＬの構造は類似しており、重鎖と軽鎖の可変領域は、それぞれ３つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）およびＣＤＲに隣接する４つのフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）で構成される。フレームワーク領域は、ＣＤＲをサポートし、ＣＤＲ間の空間関係を限定する。可変領域のＣＤＲはシーケンス内で非常に可変であるため、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ）とも称され、ＣＤＲは、特定の環構造を形成し、抗原認識に直接関与している。可変領域ドメインには、ＨＶＲの３つのセグメントが含まれており、ＶＨ上のＨＶＲのそれぞれは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３であり、ＶＬ上のＨＶＲのそれぞれは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３である。重鎖または軽鎖のＣＤＲは、アミノ末端からそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と表記される。重鎖と軽鎖の可変領域は、非共有結合で結合しており、重鎖の３つのＣＤＲと軽鎖の３つのＣＤＲにより抗原認識部位を構成している。アミノ酸残基のこの部分は、抗原結合に関与する抗体の本体であり、抗原を認識する抗体の特異性を構成する。
「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ領域」、「Ｆａｂ断片」または「Ｆａｂ分子」という用語は、抗原結合フラグメントであり、免疫グロブリン重鎖のＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＶＬドメイン、ＣＬドメインを含み、重鎖の第１の定常領域ドメインＣＨ１は、軽鎖の定常領域ドメインＣＬと結合し、重鎖の可変領域ドメインＶＨは、軽鎖の可変領域ドメインＶＬと結合する。
「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ分子」という用語は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、サイトカイン放出などを引き起こし得る抗体のエフェクター領域である。天然の抗体Ｆｃは、通常、２つまたは３つの免疫グロブリン定常領域ドメインを含む２つの同一のタンパク質フラグメントを組み合わせて構成されている。本開示に記載の前記Ｆｃは、天然型Ｆｃおよび変異型Ｆｃを含む。Ｆｃ領域の境界は変化する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃ２２またはＰ２３０からそのカルボキシ末端までの残基を含むと定義される。実験条件下で、免疫グロブリンモノマーのパパイン消化によって生成されるフラグメントは、それぞれＦａｂとＦｃである。抗体の「ヒンジ」または「ヒンジ領域」という用語は、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＨ２）間のアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを指す。
本開示に記載の前記二重特異性抗体に含まれるＦｃは、ヒト免疫グロブリンＦｃである。通常、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域のポリペプチド配列は、野生型ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に由来する。野生型ヒト免疫グロブリンＦｃは、人類に遍在するアミノ酸配列を指し、特定の個体のＦｃ領域の異なる位置における多型も含まれている。本開示に記載の前記ヒト免疫グロブリンＦｃは、野生型ヒト免疫グロブリンＦｃの個別のアミノ酸に行われる変更を含み、例えば、重鎖ヘテロダイマーを形成するために、Ｆｃ領域の界面アミノ酸の一部を変更する。
特に明記しない限り、本開示に記載の前記抗体可変領域のアミノ酸番号付けは、１９９１年にＫａｂａｔらによって記載されたコードスキーム、すなわち「Ｋａｂａｔインデックス」または「Ｋａｂａｔ番号付け」を使用する。特に明記しない限り、本開示に記載の前記抗体定常領域のアミノ酸番号付けはＥＵインデックスを使用する。
「抗原結合位点」という用語は、抗原結合分子と直接相互作用する１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）で構成され、天然の免疫グロブリン分子は、通常２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、通常１つの抗原結合部位を含む。
「Ｔ細胞活性化」という用語は、Ｔリンパ球、特に傷害性Ｔリンパ球の増値、分化、サイトカインの放出、キラーエフェクター分子の分泌、細胞傷害などを含む１つ以上の免疫応答を指す。
「ＥＣ５０」即ち５０％効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は、最大効果の５０％に相当する抗体濃度を指す。
本明細書で使用される「特異性結合」という用語は、抗体とその標的抗原との間の反応などの、２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。いくつかの実施形態では、特定の抗原に特異的に結合する抗体（または特定の抗原に特異的な抗体）は、抗体の比率が約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれより小さい親和性（ＫＤ）が当該抗原に結合することを指す。本開示のいくつかの実施形態において、「ターゲティング」という用語は、特異的結合を指す。
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するための特異的抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。平衡解離定数が小さいほど、抗体と抗原の結合が強くなり、抗体と抗原の間の親和性が高くなる。通常、抗体は、約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれより小さい解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合している。
「１本鎖の可変領域抗体フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリン重鎖の可変領域ＶＨと軽鎖の可変領域ＶＬの融合タンパク質を指し、Ｎ末端がＶＨでありおよびＮ末端がＶＬである異なる組み合わせを含み、組換えタンパク質を構築するための従来の分子クローニング法によって調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＪＦ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０１２）。
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域の一部または全部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置き換えることによって得られる抗体または抗体フラグメントを指し、ここで、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または反応性を有する非ヒト（マウス、ラット、またはウサギなど）抗体であり得る。さらに、アクセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸残基は、抗体の１つまたは複数の特性をさらに改善または最適化するために、対応する非ヒト抗体アミノ酸残基または他の抗体アミノ酸残基で置き換えることもでき、又は他の抗体のアミノ酸残基で置き換えることができる。
「二重特異性抗体」という用語は、２つの独立した抗原に結合することができるか、または同じ抗原内の異なるエピトープに対して結合特異性を有することができる抗体分子を指す。例えば、いくつかの実施形態において、例えば、二重特異性抗体分子の一方のアームが腫瘍関連抗原に結合し、他方のアームが免疫細胞関連抗原（例えば、ＣＤ３分子）に結合し、このように、腫瘍細胞で細胞性免疫関連メカニズムを活性化および開始することができる。
また、二重特異性抗体は、細胞毒素（例えば、放射性同位元素、ビンカアルカロイド、メトトレキサートなど）、放射性同位元素、蛍光標識体、発光物質、発色物質または酵素にカップリングすることができる。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートを形成するために本開示の抗体または二重特異性抗体にコンジュゲートされる部分は、細胞毒素である。いくつかの実施形態において、前記細胞毒素は、細胞機能を阻害または防止する、および／または細胞破壊を引き起こす物質を指し、小分子細胞毒を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞毒素は、コルヒチン、エムタンシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、ビンデシン、ツブリシンなどから選択される。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートを形成するために本開示の抗体または二重特異性抗体に結合される部分は、放射性同位元素である。いくつかの実施形態において、前記放射性同位元素には、例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕ的放射性同位元素が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートを形成するために本開示の抗体または二重特異性抗体に結合される部分は、蛍光標識体、発光物質および発色物質、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）などから選択される。いくつかの実施形態において、抗体コンジュゲートを形成するために本開示の抗体または二重特異性抗体に結合される部分は、活性フラグメントおよび／またはそれらの変異体を含む、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性毒素などの酵素である。
本開示は、本開示の抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体または抗体コンジュゲート、および任意選択で薬学的に許容されるベクター、界面活性剤および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、本開示の抗体、二重特異性抗体または抗体コンジュゲート以外、１つ以上の追加の治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記追加の治療薬には、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法用の薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌の治療のための他の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
「多重特異性抗体」という用語は、二重特異性、三重特異性、または四特異性抗体を指す。多重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗体のフラグメントで構成されているため、２つ、３つ、または４つの異なる抗原に結合することができる。
本開示に記載の前記二重特異性抗体は、標準的な実験方法を使用して宿主細胞から抽出および精製することができる。例えば、包含抗体Ｆｃ部分的二重特異性抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。精製方法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー、およびタンパク質限外濾過が含まれるが、これらに限定されない。本開示に記載の前記二重特異性抗体の分離・精製方法は、上記の方法の組み合わせを含む。本明細書で使用される「精製」という用語は、細胞、細胞培養物または他の天然成分からの標的成分の分離および／または回収を指す。特に明記しない限り、本開示に記載の前記抗体は、すべて精製された抗体である。使用される「単離抗体」という用語は、構造または抗原特異性の異なる他の分子を実質的に含まない抗体であり、二重特異性抗体分子は、他の抗体分子を実質的に含まない単離された抗体である。
「宿主細胞」という用語は、外因性核酸が導入される細胞およびその子孫を指し、ポリペプチドをコードするヌクレオチドによる形質転換またはトランスフェクションによって外因性ポリペプチドを発現させることができる。本開示に記載の前記的宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ、チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ ２９３、ヒト胎児腎臓２９３）、ＢＨＫ細胞（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ、ベイビーハムスター細胞）、骨髄腫細胞、酵母、昆虫細胞または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの原核細胞を含むが、これらに限定されない。なお、本開示に記載の前記「宿主細胞」は、外因性核酸が導入される細胞を誘導するだけでなく、細胞の子孫も含む。子孫細胞が細胞分裂中に突然変異を受けるので、それらは依然として本開示に記載されている用語の範囲内にある。
本開示は、これらのポリペプチド鎖をコードする核酸配列をさらに含む。抗体を発現させる過程で、核酸配列を適切なベクターに挿入し、ベクターは、プラスミド、ファージ発現ベクター、コスミド、人工染色体、バクテリオファージ、および動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。発現ベクターは、発現を調節するための要素を含み、プロモーター、転写開始配列、エンハンサー、シグナルペプチド配列などを含むが、これらに限定されない。プロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターを含むが、これらに限定されない。当分野で知られている適切な方法を使用して、発現ベクターを宿主細胞に移すことができ、このような方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポソームトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）トランスフェクション法を含むが、これらに限定されない。
実施例１ 発現ベクターの構築
（１）ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂの配列設計
本開示の実施形態における二重特異性抗体は、３本または４本のポリペプチド鎖（図１）を含み、それぞれ、第１の重鎖（その可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する）、第１の軽鎖（その可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する）、第２の重鎖（その可変領域は、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列を有する）、第２の軽鎖（その可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する）及びｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖（配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、あるいはその可変領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する）として名付けられており、一つのＣＤ２０に特異的に結合する免疫グロブリンドメイン、一つのＣＤ３に特異的に結合する免疫グロブリンドメイン、および一つのヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成している。２本の重鎖の相互作用または１本の重鎖とｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖との相互作用は、ヘテロダイマーの形態を構成し、前記のヘテロダイマーＦｃ領域を形成している。
ヒトＣＤ２０の細胞外領域に特異的に結合する二重特異性抗体の可変領域は、ＶＨ１とＶＬ１で構成され（図１）、この配列は、完全ヒトモノクローナル抗体オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（特許番号：ＵＳ２０１４０９３４５４Ａ１）に由来する。
ヒトＣＤ３の細胞外領域に特異的に結合する二重特異性抗体の可変領域は、ＶＨ２とＶＬ２で構成され（図１）、この配列は、特許（特許番号：ＣＮ２０１８１０２６３８３２．０）に開示されているマウスモノクローナル抗体のヒト化配列に由来する。
ＣＤＲ領域の脱アミノ化については、抗体の安定性と酸塩基ピークの比率に影響を与え、この開示のＶＨ２のＣＤＲ３には、潜在的な脱アミノ化部位が含まれている（ＶＨ２－ＣＤＲ３の元の配列がＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡである）。いくつかの実施形態において、アミノ酸変異による潜在的な脱アミノ化を排除する。脱アミノ化変異のないＶＨ２－ＣＤＲ３を含むＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂ（ＶＨ２－ＣＤＲ３配列がＨＧＮＦＧＮＴＹＶＳＷＦＡである）をＶ１と名付け、Ｎ１０６Ｔ変異のあるＶＨ２－ＣＤＲ３を含むＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂ（ＶＨ２－ＣＤＲ３配列がＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡ）をＶ２と名付ける。発現および精製後（実施例２と実施例３）、変異体Ｖ１とＶ２のＣＤ３抗原結合能力（実施例４）および腫瘍傷害試験（実施例５）を検証した。
抗体のＦｃ部分は、公開されたＰＣＴ出願であるＷＯ２０１７０３４７７０Ａ１の方法に従って修飾された。一方の重鎖のＦｃ部分には、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋという変異があり、変異はＯＡ（配列番号１）とラベル付けられた。もう一方の重鎖のＦｃ部分には、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄという変異があり、変異は、ＯＢ（配列番号７）とラベル付けられ、これによって、重鎖ヘテロ二量体を形成する。
（２）発現プラスミドの分子クローニング
一般的な分子クローニング法を用いて、第１の重鎖核酸配列および第１の軽鎖核酸配列を人工合成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＪＦ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２０１２）。抗第１の軽鎖は、改変プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９０－２０）にクローン化された。当該プラスミドは、マルチクローニングサイトのＮ末端にヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）シグナルペプチド配列を付加して、ＨＥＫ２９３細胞で抗体を発現および分泌できるように改変されており、ｐＣＤＮＡ３．１－ＣＤ２０－ＬＣとラベル付けられた発現プラスミドが得られた。第１の重鎖重鎖は、プラスミドｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）にクローン化され、ｐＦＵＳＥ－ＣＤ２０－ＨＣ－ＯＢとラベル付けられた発現プラスミドが得られた。
一般的な分子クローニング法を用いて、第２の重鎖核酸配列および第２の軽鎖核酸配列を人工合成した。抗第２の軽鎖は、改変プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ７９０－２０）にクローン化された。当該プラスミドは、マルチクローニングサイトのＮ末端にヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）シグナルペプチド配列を付加して、ＨＥＫ２９３細胞で抗体を発現および分泌できるように改変されており、ｐＣＤＮＡ３．１－ＣＤ３－ＬＣとラベル付けられた発現プラスミドが得られた。第２の重鎖は、プラスミドｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）にクローン化され、ｐＦＵＳＥ－ＣＤ３－ＨＣ－ＯＡおよびｐＦＵＳＥ－ＣＤ３－ＨＣ－ＯＡ－Ｎ１０６Ｔ（ＶＨ２－ＣＤＲ３がＮ１０６Ｔ変異を含む）とラベル付けられた発現プラスミドが得られた。
実施例２ 二重特異性抗体の一過性トランスフェクションと発現
エンドトキシンフリープラスミド大規模抽出キット（Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅ－Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（１００）、ＯＭＥＧＡ社から購入、カタログ番号Ｄ６９２６－０４）を使用して、大規模なプラスミド抽出を行った。その操作は、キットに記載されている手順に従って実行された。ＨＥＫ２９３細胞を細胞密度が２．０～３．０×１０６／ｍＬまで培養し、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。古い培養上清を廃棄し、細胞を新しい培地（ＯＰＭ－２９１ＣＤ０５Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｐｔｉｍａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）で密度が１．０×１０６／ｍＬとなるように細胞を再懸濁した。表１に示すプラスミド組み合わせに従ってコトランスフェクションを行い、トランスフェクトした細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍの培養シェーカーに５～７日間暗所に置き、４日目にフィードを追加した。
Figure 0007397882000001
実施例３ 二重抗体の精製
遠心分離により発現上清を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンで細胞上清をろ過し、バランスの取れたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーフィラー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入、カタログ番号１７－５４３８－０２）を使用して、上清におけるＢｓＡｂタンパク質を捕捉し、非特異的に結合したタンパク質を平衡化バッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗い流した後（約１０カラム容量）、溶出バッファー（１００ｍＭグリシン、ｐＨ ３．０－ｐＨ ３．５）で５～１０カラム容量を溶出し、溶出液を回収し、中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）でｐＨを中性に調整した。溶出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。図２におけるＡと図２におけるＢは、４本鎖二重特異性抗体がプロテインＡによってワンステップで精製された後、Ｖ１とＶ２の両方が高純度に達することができることを示しており、還元電気泳動は、２つの重鎖と２つの軽鎖の比率が１：１：１：１に近いことを示した。図２におけるＣは、３本鎖二重特異性抗体のプロテインＡのワンステップ精製が行われた後、３本鎖二重特異性抗体の純度が非常に高くなったことを示しており、還元電気泳動は、重鎖、軽鎖、およびｓｃＦｖ－Ｆｃ鎖の比率が１：１：１に近いことを示した。
次に、ＡＫＴＡピュア２５Ｌ１タンパク質精製システムを使用して、プロテインＡの溶出後に得られたタンパク質をさらに精製して、溶出したサンプルを、平衡化した陽イオン交換カラムにロード（プレパックカラムＲｅｓｏｕｒｃｅＴＭＳ、１ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－１１７８－０１）し、平衡バッファーＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）でＵＶ吸収線が穏やかになるまで、非特異的に結合したタンパク質を洗い流し、溶出バッファーＢ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ６．０）で１５カラム容量を０％～５０％から直線的に溶出し、溶出ピークを回収した。図３は、溶出曲線を示す。
１ｍＬのプロテインＡ精製サンプル（濃度が１ｍｇ／ｍＬ）を取り、ＡＫＴＡピュア２５Ｌ１タンパク質精製システムの１ｍＬローディングループで平衡化されたモレキュラーシーブプレパックカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ ｉｎｃｒｅａｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９９０９－４４）にサンプルをロードし、平衡バッファー（１×ＰＢＳバッファー：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で１．５カラム容量を溶出し、溶出ピークを回収した。図４は、溶出曲線を示す。ＳＥＣ分析では、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１サンプルがワンステップ精製（プロテインＡ）で精製されると、凝集体が非常に少なくなり、モノマー含有量が９９％を超えていることが示された。
実施例４ 抗体結合の活性検出（ＥＬＩＳＡ）
（１）抗原ＣＤ３に対するＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体の結合能を検出するためのＥＬＩＳＡ
ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂの抗原結合能を検証するために、精製された二重特異性抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって抗原－ＣＤ３結合を検出した。具体的な手順は次のとおりである。
１）本実験で使用したＣＤ３抗原は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入したヒトＣＤ３ｅタンパク質とヒトＣＤ３ｄタンパク質の１：１混合物であった。
２）抗原コーティング
０．１Ｍ重曹緩衝液（ｐＨ ９．５）で抗原を１００ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈した抗原を酵素標識プレートにウェルあたり２００μＬずつ加え、反応ウェルをシーリングフィルムでシールし、４℃で１６時間置いた。プレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した。
３）ブロッキング
脱脂粉乳とＰＢＳバッファーで３％Ｍ－ＰＢＳブロッキング溶液を調製し、各ウェルに３００μＬの３％Ｍ－ＰＢＳを加え、シーリングフィルムで反応ウェルを密閉し、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した。
４）サンプルの追加
二重抗体サンプルをＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、次に４倍勾配希釈で合計８つの濃度にした。希釈したサンプルを１００μＬ／ウェルで加え、抗体濃度ごとに２つの複製ウェルを作成した。反応ウェルをシーリングフィルムでシールし、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した。
５）二次抗体の追加
ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社から購入、カタログ番号ＳＡ００００１－１７）をＰＢＳで１：２０００に希釈した。各ウェルに１００μＬを加え、反応ウェルをシーリングフィルムでシールし、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄した。
６）発色
各ウェルに１００μＬのＴＭＢ発色溶液を加え、室温および暗所で５～１０分間インキュベートした。
７）終了
５０μＬの停止液（１Ｍ ＨＣｌ）を各ウェルに加えて色反応を終了させた。３分後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎＭの各ウェルの反応溶液のＯＤ値を読み取った。
８）データ分析
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用したデータ処理を行った後、ｌｏｇ（サンプル濃度）を横軸とし、ＯＤ４５０を縦軸とする曲線を作成し、ＥＣ５０データを取得した。
図５に示すように、ＣＤ３抗原に結合するＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１のＥＣ５０濃度が０．８１７８μｇ／ｍＬであり、ＣＤ３抗原に結合するＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２のＥＣ５０濃度が２．０９７μｇ／ｍｌであり、Ｖ２のＣＤ３抗原への結合力が弱くなり、したがって、Ｎ１０６Ｔの導入によりＣＤ３に対する抗体の親和性が弱くなることを示した。実際の応用で、この機能は、Ｔ細胞の過剰な活性化を回避することに寄与できる。
（２）ＦＡＣＳによる二重抗体サンプルのＣＤ２０陽性細胞との親和性の検出
本開示において、Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ２０発現陽性およびＣＤ３発現陰性細胞（即ち、ＣＤ２０＋／ＣＤ３－）として使用される。Ｒａｊｉ細胞を３７°Ｃ、５％ＣＯ２インキュベーターで培養して、プーリング度が８０％－９０％になるとき細胞を回収した。同時に、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１とＶ２サンプルを２０μｇ／ｍＬに希釈して使用した。細胞を１％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を１×１０７細胞／ｍＬに再懸濁した。１．５ｍＬの遠心チューブを取り、上記の細胞懸濁液１００μＬを各チューブに加え、希釈したサンプル１００μＬを加えた。よく混ぜ、氷上で１時間インキュベートした。遠心分離（４００ｇ、５分）し、上清を捨て、１％ＦＢＳ／ＰＢＳバッファーを１ｍＬ加えて細胞を洗浄し、２回洗浄した。ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１２－４９９８－８２）で細胞を再懸濁し、暗所で氷上で１時間インキュベートした。再度遠心分離（４００ｇ、５分）し、上清を捨て、１ｍＬの１％ＦＢＳ／ＰＢＳバッファーを加えて細胞を洗浄し、２回洗浄した。最後に、細胞を２００μＬの１％ＦＢＳ／ＰＢＳバッファーで再懸濁し、サンプルとＲａｊｉ細胞の結合活性をフローサイトメトリーで検出した。
平均蛍光強度に基づいて、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を使用して、二重抗体サンプルのＲａｊｉ細胞への結合活性を計算および分析した。
図６に示すように、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１およびＶ２は、ＣＤ２０陽性細胞Ｒａｊｉと同じ結合活性を持っている。
実施例５ ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体を介したインビトロ細胞毒性の検出
細胞レベルで腫瘍細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂＶ１およびＶ２の傷害活性をさらに比較するために、本開示は、精製された二重抗体サンプルに対してＡＤＣＣ毒性試験を実施した。
具体的な手順は、次のとおりである。
本開示において、Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ２０陽性腫瘍細胞として使用される。Ｒａｊｉ単細胞の懸濁液を調整した。１０％ＦＢＳを含むフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞密度を０．４０×１０６／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで入れ、２．０×１０４細胞／ウェルにした。この実験では、Ｒａｊｉ細胞数の２０倍のＰＢＭＣ、つまり４．０×１０５細胞／ウェル、１００μＬ／ウェルを加入し、細胞密度を４．０×１０６／ｍＬに調整した。フェノールレッドを含まない１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ １６４０培地で抗体を０．１μｇ／ｍＬに希釈してから、抗体を１：４の比率で希釈し、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、１．５６ｎｇ／ｍＬ、０．３９ｎｇ／ｍＬ、０．１０ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．００６ｎｇ／ｍＬの１０個の濃度の抗体を得た。実験計画によれば、５０μＬ／ウェルの対応する抗体を添加し、添加する必要のないウェルに、１０％ＦＢＳを含む同量のフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地を補充した。細胞と抗体を混合した後、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７°Ｃで一晩インキュベートした。約２０時間後、乳酸脱水素酵素細胞毒性キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅから購入）を用いて細胞の毒性を検出し、さらにＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂの傷害活性を検出した。
計算式
傷害率（％）＝（ＯＤサンプル－Ｓ自発的）／（Ｍａｘ－Ｓ自発的）×１００％
ただし、Ｓ自発的＝ＯＤ自発放出ウェル（標的細胞＋エフェクター細胞）、Ｍａｘ＝ＯＤ最大放出ウェル（標的細胞）。
図７に示すように、精製されたＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１およびＶ２二重特異性抗体は、いずれもＰＢＭＣを効果的に媒介して、ＣＤ２０陽性腫瘍Ｒａｊｉ細胞を殺した。腫瘍細胞は、その傷害能力が顕著であり、ＥＣ５０濃度がそれぞれ０．２１ｎｇ／ｍＬと０．２４ｎｇ／ｍｌである。ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２は、ＣＤ３に対して弱い親和性を示したが、標的細胞Ｒａｊｉの傷害活性には影響しなかった。
実施例６ 抗体安定性実験
プロテインＡで精製したＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂＶ１サンプルを３７°Ｃおよび４０°Ｃに置いた。放置時間は、０ｄ、１ｄ、４ｄ、７ｄを含む。異なる放置時間のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、異なる温度での抗体の分解と安定性を検出した。その結果として、Ｖ１サンプルが３７°Ｃと４０°Ｃで少なくとも７日間安定していることを示した。
実施例７ サイトカイン放出の検出
本開示は、サイトカインの放出に対する二重特異性抗体の効果を決定するために、ＰＢＭＣ細胞を使用した。ＰＢＭＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、各ウェルに２×１０５個の細胞が含まれるように細胞密度を調整し、抗体を１６４０培地で０．２５μｇ／ｍＬに希釈し、勾配で希釈し、上記のウェルにそれぞれ添加した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２培養インキュベーターに４１時間培養した。二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、サンプルにおけるサイトカインの濃度を検出した。具体的な方法は、次のとおりである。ＰＢＭＣ細胞を含む９６ウェルプレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、対応するウェルに８０μＬ／ウェルで加え、反応ウェルをパラフィルムでシールし、室温で１２０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗体を加え、反応ウェルをパラフィルムでシールし、室温で６０分間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ－ストレプトアビジンを加え、反応液をパラフィルムで十分にシールし、室温で１０～２０分間暗所でインキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルの現像剤ＴＭＢ溶液を加え、反応をパラフィルムで十分にシールし、暗所で室温で２０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルの停止液を加え、均一に混合したあとすぐにマイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度値を検出した。実験の結果は、図９Ａ～９Ｂに示される。
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２、ＣＤ３モノクローナル抗体、ＩｇＧおよびさまざまな健康なドナーからのＰＢＭＣを使用して、一晩インキュベートした。上清を取り、上記のＥＬＩＳＡサンドイッチ法実験を行ってサイトカインＩＬ－６およびＩＬ－２の放出を検出し、Ｔ細胞が活性化されてサイトカイン放出を引き起こすかどうかを確認した。実験の結果として、標的細胞（ＰＢＭＣのうちのＢ細胞）の存在下で、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１およびＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ２抗体によって、ＩＬ－２の放出が引き起こされたが（図９Ａ）、ＩＬ－６の放出が引き起こされていなく、放出量は、ＣＤ３モノクローナル抗体よりも低い（図９Ｂ）。Ｖ２によるＩＬ－６の放出量が最も少ない。また、Ｖ２のＣＤ３結合ドメインは、Ｎ１０６Ｔ変異を含み、ＣＤ３に対して低親和性を示す。その結果、本開示のＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ特にＶ２により、比較的低レベルのＴ細胞の活性化のみが引き起こされる。本開示のＣＤ２０×ＣＤ３二重抗体がＣＤ２０陽性のＢ細胞腫瘍を治療するために臨床的に使用される場合、サイトカインストームの発生を減少させることができ、抗体使用の安全性を効果的に改善することができる。
実施例８ マウスにおける抗腫瘍活性の検出
ＣＤ２０×ＣＤ３ＢｓＡｂのｉｎｖｉｖｏ薬力学的評価は、ＣＤ２０の陽性発現を伴う皮下異種移植Ｒａｊｉ細胞腫モデルに基づいて完了した。
動物モデルの構築
対数増殖期のＲａｊｉ細胞を採取し、ＰＢＭＣと混合し、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの背中の皮下に接種し、対照群と治療群にランダムに分けられた。治療は、分けられた群に対して、本開示の二重特異性抗体ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１を、低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇと０．０５ｍｇ／ｍＬ）、中用量（０．１ｍｇ／ｋｇと０．５ｍｇ／ｍＬ）及び高用量（２ｍｇ／ｋｇ）で１日目、３日目、５日目、および８日目に１回投与するように行われた。陰性対照群に対して等量の滅菌生理食塩水を与えた。グループ化（即ち、初回投与前）の際に１回、投与後週に２回、安楽死前に１回、それぞれ腫瘍の長径と短径を測定して記録し、腫瘍体積を計算し、腫瘍体積に基づいて腫瘍成長曲線を描き、グループ間の腫瘍成長曲線の相違を比較した。次の式に従って腫瘍体積を算出した。Ｖ＝１／２×長径×短径２。図１０は、時間の経過に伴う腫瘍体積の曲線を示す。腫瘍体積を週に２回測定し、マウスの体重変化を記録した。実験後、腫瘍を剥がして重さを量った。
図１０に示すように、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ Ｖ１（２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）治療群は、治療開始から２１日後に有意な抗腫瘍効果を示した。すべての治療群は、薬物治療による動物の死亡、明らかな薬物毒性、および重度の体重減少がなく、投与期間中の忍容性が良好であった。
上記の実施形態は、本開示の技術案を説明するためのもの過ぎず、本開示の保護範囲を限定するものではない。本開示について、好ましい実施形態を参照しながら詳細に説明したが、当業者は、本開示の技術案の本質および範囲から逸脱しない範囲内で、本開示の技術案を修正または均等に置き換えることができる。
＜付記＞
本発明の態様は以下を含む。
＜項１＞
ＣＤ２０に結合可能なドメイン、ＣＤ３に結合可能なドメイン及びヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、
前記ＣＤ２０に結合可能なドメイン及びＣＤ３に結合可能なドメインは、それぞれ独立してＦａｂ領域、ＳｃＦｖ領域またはｓＤａｂ領域から選択されることを特徴とする二重特異性抗体。
＜項２＞
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の免疫グロブリンＦａｂ領域は、主に互いに結合された第１の重鎖と第１の軽鎖とにより形成され、前記第１の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、
および／または、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、主に互いに結合された第２の重鎖と第２の軽鎖とにより形成され、前記第２の重鎖の可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つのポリペプチド鎖により構成され、各ポリペプチド鎖は、反対の電荷を持つ非対称アミノ酸修飾を含む
ことを特徴とする項１に記載の二重特異性抗体。
＜項３＞
前記第１の重鎖のＣＨ１部分および第１の軽鎖のＣＬ部分は、いずれも天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基と、非天然のシステインを置き換えるシステイン残基を含むことを特徴とする項２に記載の二重特異性抗体。
＜項４＞
前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基と、第１の軽鎖のＣＬ部分の、非天然のシステイン残基を置き換えるシステイン残基とは、ジスルフィド結合を形成していることを特徴とする項３に記載の二重特異性抗体。
＜項５＞
前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２２０Ｓであり、非天然のシステイン残基を置き換えるシステイン残基がＬ１２８Ｃであることを特徴とする項３または項４に記載の二重特異性抗体。
＜項６＞
前記第１の軽鎖のＣＬ部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２１４Ｓであり、非天然のシステイン残基を置き換えるシステイン残基がＦ１１８Ｃであることを特徴とする項３～項５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
＜項７＞
前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基を含まず、且つ非天然のシステイン残基を置き換えるシステイン残基を含まないことを特徴とする項２～項６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
＜項８＞
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の重鎖と第２の重鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成することを特徴とする項２～項７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
＜項９＞
前記第１の重鎖と第２の重鎖は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来することを特徴とする項８に記載の二重特異性抗体。
＜項１０＞
前記第１の重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、第１の軽鎖は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖は、配列番号５または配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする項８に記載の二重特異性抗体。
＜項１１＞
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
又は、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成する
ことを特徴とする項２に記載の二重特異性抗体。
＜項１２＞
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、前記第１の重鎖の可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖の重鎖の可変領域ＣＤＲ３は、Ｎ１０６Ｔ変異を含み、変異後のＣＤＲ３配列がＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡである
ことを特徴とする項１１に記載の二重特異性抗体。
＜項１３＞
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインが第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインがｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含む場合、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の可変領域は、配列番号６または配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、
前記ＣＤ２０に結合可能なドメインがｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、ＣＤ３に結合可能なドメインが第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含む場合、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、またはその可変領域は、配列番号４または配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする項１１に記載の二重特異性抗体。
＜項１４＞
カップリング物質と項１～項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体とがカップリングすることにより形成されることを特徴とする抗体コンジュゲート。
＜項１５＞
前記カップリング物質は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識体、発光物質、発色物質または酵素であることを特徴とする項１４に記載の抗体コンジュゲート。
＜項１６＞
項１～項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
＜項１７＞
腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスを治療する医薬品または医薬組成物の調製における項１～項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
＜項１８＞
前記腫瘍は、ＣＤ２０発現に関連する悪性腫瘍であることを特徴とする項１７に記載の使用。
＜項１９＞
前記悪性腫瘍は、急性Ｂリンパ性白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病またはバーキットリンパ腫であることを特徴とする項１８に記載の使用。
＜項２０＞
項１～項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製するための方法において、項１～項１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチドを基本ベクターに連結してなる発現ベクターを構築するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）で構築された発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換し、宿主細胞を培養するステップ（ｂ）と、
前記二重特異性抗体を分離および精製するステップ（ｃ）と、を含む方法。
＜項２１＞
前記二重特異性抗体を分離および精製するための方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換法または陰イオン交換法である、項２０に記載の方法。
（１）モノクローナル抗体と比べて、本開示に記載の前記ＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ分子は、腫瘍細胞の表面抗原に結合することができるとともに、Ｔ細胞の表面ＣＤ３分子にも結合することができる。さらに、ＴＣＲの抗原特異的活性化に依存しているので、標的腫瘍殺傷を増加させることができる。したがって、少量の抗体で腫瘍細胞を顕著に殺す役割を果たすことができる。
（２）ＢｉＴＥなどの小分子二重特異性抗体と比べて、本開示のＣＤ２０×ＣＤ３ ＢｓＡｂ分子は、抗体のＦｃ領域を含むので、抗体の半減期および安定性を向上させるとともに、既存のモノクローナル抗体精製技術を利用でき、二重特異性抗体の製造プロセスが簡素化される。
（３）ＣＤ２０を標的としたキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ－Ｔ）と比べて、本開示は、外因性ウイルス、インビトロＴ細胞培養および再注入などの操作を含まず、副作用がより小さく、より安全であり、より制御可能である。

Claims (20)

  1. ＣＤ２０に結合可能なドメイン、ＣＤ３に結合可能なドメイン及びヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、
    前記ＣＤ２０に結合可能なドメイン及びＣＤ３に結合可能なドメインは、それぞれ独立してＦａｂ領域、ＳｃＦｖ領域またはｓＤａｂ領域から選択され、
    前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第１の重鎖と第１の軽鎖とにより形成され、前記第１の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、
    前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第２の重鎖と第２の軽鎖とにより形成され、前記第２の重鎖の可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、
    前記ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、２つのポリペプチド鎖により構成され、各ポリペプチド鎖は、反対の電荷を持つ非対称アミノ酸修飾を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体。
  2. 前記第１の重鎖のＣＨ１部分および第１の軽鎖のＣＬ部分は、いずれも天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基と、非システイン残基を置き換えるシステイン残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、非システイン残基を置き換えるシステイン残基と、第１の軽鎖のＣＬ部分の、非システイン残基を置き換えるシステイン残基とは、ジスルフィド結合を形成していることを特徴とする請求項２に記載の二重特異性抗体。
  4. 前記第１の重鎖のＣＨ１部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２２０Ｓであり、非システイン残基を置き換えるシステイン残基がＬ１２８Ｃであることを特徴とする請求項２に記載の二重特異性抗体。
  5. 前記第１の軽鎖のＣＬ部分の、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基がＣ２１４Ｓであり、非システイン残基を置き換えるシステイン残基がＦ１１８Ｃであることを特徴とする請求項２～請求項４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  6. 前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、天然のシステイン残基を置き換える非システイン残基を含まず、且つ非システイン残基を置き換えるシステイン残基を含まないことを特徴とする請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  7. 前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第１の重鎖と第２の重鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成することを特徴とする請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  8. 前記第１の重鎖と第２の重鎖は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来することを特徴とする請求項７に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記第１の重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、第１の軽鎖は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖は、配列番号５または配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、第２の軽鎖は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７に記載の二重特異性抗体。
  10. ＣＤ２０に結合可能なドメイン、ＣＤ３に結合可能なドメイン及びヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、
    前記ＣＤ２０に結合可能なドメイン及びＣＤ３に結合可能なドメインは、それぞれ独立してＦａｂ領域、ＳｃＦｖ領域またはｓＤａｂ領域から選択され、
    前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、前記第１の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第１の重鎖と第１の軽鎖とにより形成され、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記第１の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成し、
    又は、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、ＣＤ３に結合可能なドメインは、第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域は、互いに結合された第２の重鎖と第２の軽鎖とにより形成され、前記第２の重鎖の可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の軽鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記第２の重鎖と前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖が互いに結合してヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成することを特徴とする、二重特異性抗体。
  11. 前記ＣＤ２０に結合可能なドメインは、第１の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ３に結合可能なドメインは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含み、
    前記第１の免疫グロブリンＦａｂ領域の重鎖の可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖の重鎖の可変領域ＣＤＲ３は、Ｎ１０６Ｔ変異を含み、変異後のＣＤＲ３配列がＨＧＮＦＧＴＳＹＶＳＷＦＡであることを特徴とする請求項１０に記載の二重特異性抗体。
  12. 前記ＣＤ３に結合可能なドメインが第２の免疫グロブリンＦａｂ領域を含み、前記ＣＤ２０に結合可能なドメインがｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖を含む場合、前記第２の免疫グロブリンＦａｂ領域の重鎖は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、
    前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ領域は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、または前記ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ可変領域は、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する
    ことを特徴とする請求項１０に記載の二重特異性抗体。
  13. カップリング物質と請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体とがカップリングすることにより形成されることを特徴とする抗体コンジュゲート。
  14. 前記カップリング物質は、細胞毒素、放射性同位元素、蛍光標識体、発光物質、発色物質または酵素であることを特徴とする請求項１３に記載の抗体コンジュゲート。
  15. 請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
  16. 腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症または全身性エリテマトーデスを治療する医薬品または医薬組成物の調製における請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
  17. 前記腫瘍は、ＣＤ２０発現に関連する悪性腫瘍であることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
  18. 前記悪性腫瘍は、急性Ｂリンパ性白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病またはバーキットリンパ腫であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
  19. 請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を調製するための方法において、
    請求項１～請求項１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードするヌクレオチドを基本ベクターに連結してなる発現ベクターを構築するステップ（ａ）と、
    ステップ（ａ）で構築された発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換し、宿主細胞を培養するステップ（ｂ）と、
    前記二重特異性抗体を分離および精製するステップ（ｃ）と、を含む方法。
  20. 前記二重特異性抗体を分離および精製するための方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換法または陰イオン交換法である、請求項１９に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981972B (zh) * 2019-12-25 2022-09-30 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
JP7726534B2 (ja) * 2020-06-30 2025-08-20 諾納生物（蘇州）有限公司 抗ｂ７ｈ４抗体及びその二重特異性抗体および用途
WO2022037582A1 (zh) * 2020-08-18 2022-02-24 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cldn-18.2双特异性抗体及其用途
CN112794916B (zh) * 2021-04-08 2021-08-10 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 三特异性抗原结合构建体及构建方法和应用
WO2022218380A1 (zh) * 2021-04-15 2022-10-20 正大天晴药业集团股份有限公司 靶向bcma的多特异性抗体
CN113527493B (zh) * 2021-07-20 2023-10-27 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种b7-h3抗体及其应用
TW202337494A (zh) 2021-11-16 2023-10-01 美商建南德克公司 用莫蘇妥珠單抗治療全身性紅斑狼瘡（ｓｌｅ）之方法及組成物
CN115583995B (zh) * 2022-01-30 2024-12-13 立凌生物制药(苏州)有限公司 双特异性抗体及其制备方法和应用
KR20250057777A (ko) 2022-07-25 2025-04-29 인테리우스 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드 돌연변이된 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물, 및 그 용도(mutated polypeptides, compositions comprising the same, and uses thereof)
CN117603351A (zh) * 2022-08-22 2024-02-27 英脉德医疗科技(广东)有限公司 肿瘤微环境特异激活的Her2-CD3双特异性抗体
CN116143941B (zh) * 2022-09-08 2024-06-04 浙江省血液中心 一种KIR3DL1-IgG-Fc融合重组蛋白、应用及试剂盒
CN118562015B (zh) * 2024-08-01 2024-12-06 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种针对cd20/cd3的双特异性抗体及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140093454A1 (en) 2002-10-17 2014-04-03 Genmab A/S Human Monoclonal Antibodies Against CD20
JP2018508188A (ja) 2015-01-08 2018-03-29 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３およびｃｄ２０に対する二重特異性抗体

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101544694A (zh) * 2008-03-28 2009-09-30 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
JP2016538275A (ja) 2013-11-04 2016-12-08 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン（ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の製造
CN104829728B (zh) 2015-01-21 2019-03-12 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体her2xcd3的构建及应用
EP3307321A4 (en) 2015-08-26 2019-04-17 Bison Therapeutics Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODY PLATFORM AND ASSOCIATED METHODS
CN109475627B (zh) * 2016-05-26 2023-01-06 齐鲁普吉湾生物治疗公司 抗体混合物
JP7033328B2 (ja) * 2016-08-16 2022-03-10 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 一価の非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体
CN108059680B (zh) * 2017-12-26 2020-07-24 北京东方百泰生物科技有限公司 一种针对cd20和cd3的双特异性抗体
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140093454A1 (en) 2002-10-17 2014-04-03 Genmab A/S Human Monoclonal Antibodies Against CD20
JP2018508188A (ja) 2015-01-08 2018-03-29 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３およびｃｄ２０に対する二重特異性抗体

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