JP7720734B2 - 腸内環境改善剤 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 日本消化器病学会雑誌 第１１７巻 臨時増刊号 第１０６回 日本消化器病学会総会抄録集 Ａ１９２頁、Ａ２４８頁（一般財団法人日本消化器病学会発行）にて発明の内容を公開（公開日（発行日）：令和２年７月１０日）

本発明は、腸内環境改善剤に関する。

非ステロイド性消炎鎮痛薬（Ｎｏｎ－Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ；以下、ＮＳＡＩＤｓとも称する）は、アラキドン酸カスケードのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を阻害することで、プロスタグランジン類の合成を抑制し、鎮痛、解熱、及び抗炎症効果を発揮する。
鎮痛薬の第一選択薬である上記ＮＳＡＩＤｓの一つであるインドメタシンは、腸内環境の乱れ又は悪化を引き起こす可能性があることが報告されている（非特許文献１）。

このようなＮＳＡＩＤｓによる腸内環境の乱れ又は悪化を改善するには、プロバイオティクスなどを用いた治療方法の検討が進められているが、プロバイオティクスは長期間の服用により予防的に使用されるものであり、ＮＳＡＩＤｓの服用による腸内環境の乱れ又は悪化の改善には十分とはいえず、単回の投与でも十分な改善効果が得られる有効な治療方法は知られていない。

鎮痛薬として知られているアセトアミノフェンは、胃傷害を抑制することが知られている（非特許文献２、非特許文献３）が、同様に胃傷害を抑制することが知られているプロトンポンプ阻害剤は、腸内環境を悪化させることが知られており（非特許文献４）、アセトアミノフェンが腸内環境を改善することについては知られていない。

Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；７２（１０）：６７０７－６７１５． Ｊ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２０１４ Ａｐｒ；３４９（１）：１６５－１７３ Ｊ. Ｐｈａｒｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. １９７８ Ｆｅｂ；３０（２）：８４－８７ Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．２０１９ Ｎｏｖ ２５；９（１）：１７４９０．

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、薬物等による腸内環境の乱れ又は悪化を改善することができる腸内環境改善剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、薬物等による腸内環境の乱れ又は悪化を改善することができる化合物について鋭意検討した結果、アセトアミノフェン、エテンザミド等を包含する下記一般式（Ｉ）で表される化合物（Ｉ）が前記腸内環境の改善に有効であることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は以下の態様を有する。
［１］ 下記一般式（Ｉ）で表される化合物（Ｉ）を含有する腸内環境改善剤。
（式中、Ｒ^１は水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は水素原子、カルバモイル基、アルキル基、又はアルコキシ基を示し、Ｒ^３は水素原子、アシルアミノ基又はスルホ基を示す）
［２］ 前記腸内環境改善が、腸内フローラ又は腸内細菌叢の改善である、［１］に記載の腸内環境改善剤。
［３］ 前記腸内環境改善が、薬物投与による腸内環境の乱れ又は悪化の改善である、［１］又は［２］に記載の腸内環境改善剤。
［４］ 前記薬物が、非ステロイド性消炎鎮痛薬である、［３］に記載の腸内環境改善剤。

本発明によれば、薬物等による腸内環境の乱れ又は悪化を改善することができる腸内環境改善剤を提供することができる。

ラット小腸の分割する８つのセクションを模式的に示した図である。 実施例１のＵｎｉＦｒａｃ解析におけるＶｅｈｉｃｌｅ群内、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とイブプロフェン（ＩＢＰ）投与群との間、及び、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と、イブプロフェンとアセトアミノフェン（ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ））投与群との間のＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅの結果を示した図である。 実施例１のＵｎｉＦｒａｃ解析におけるＶｅｈｉｃｌｅ群内、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とイブプロフェン投与群（ＩＢＰ）との間、及び、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と、イブプロフェンとエテンザミド投与群（ＩＢＰ＋ＥＴＺ）との間のＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅの結果を示した図である。 実施例２のＶｅｈｉｃｌｅ群、イブプロフェン（ＩＢＰ）投与群、及び、イブプロフェンとアセトアミノフェン投与群（ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ）における、小腸粘膜試料中のＴＮＦ－α遺伝子の発現を示した図である。

本発明の腸内環境改善剤は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物（Ｉ）を含有する。化合物（Ｉ）は、本発明の腸内環境改善剤の有効成分として含有することが好ましい。

（式中、Ｒ^１は水素原子又はアルキル基を示し、Ｒ^２は水素原子、カルバモイル基、アルキル基、又はアルコキシ基を示し、Ｒ^３は水素原子、アシルアミノ基又はスルホ基を示す）

前記式（Ｉ）中、Ｒ^１及びＲ^２におけるアルキル基は、炭素数１～６が好ましく、炭素数１～３がより好ましい。Ｒ^１及びＲ^２におけるアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、具体的には、メチル、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等があげられる。
前記式（Ｉ）中、Ｒ^２におけるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基や２，３－ジヒドロキシプロポキシ基等が挙げられ、メトキシ基、２，３－ジヒドロキシプロポキシ基が好ましい。
前記式（Ｉ）中、Ｒ^３のアシルアミノ基におけるアシル基の炭素鎖長は、炭素数２～６が好ましく、炭素数２～４がより好ましい。
前記式（Ｉ）中、Ｒ^３におけるスルホ基は、医薬的に許容される塩も含み、ナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
前記化合物（Ｉ）としては、例えば、下記式（Ｉ）－１で表されるアセトアミノフェン、及び下記式（Ｉ）－２で表されるエテンザミド、（Ｉ）－３で表されるグアヤコールスルホン酸カリウム、（Ｉ）－４で表されるグアイフェネシン、（Ｉ）－５で表されるクレゾールスルホン酸カリウム等が挙げられる。
上記アセトアミノフェン及びエテンザミドは、発熱や頭痛等の症状を抑制する解熱鎮痛剤の主要な成分の一つとして使用される薬剤であり、グアヤコールスルホン酸カリウム、グアイフェネシン及びクレゾールスルホン酸カリウムは、痰を出しやすくする去痰成分であるが、本発明においては、腸内環境改善剤の有効成分の一つとして使用される。
前記化合物（Ｉ）としては、薬物等による腸内環境の乱れ又は悪化を効果的に改善できる点から、アセトアミノフェン及びエテンザミドがより好ましい。

本発明の腸内環境改善剤が適用される腸としては、小腸、大腸が挙げられる。小腸には、十二指腸、空腸、回腸が含まれる。大腸には、盲腸、結腸、直腸が含まれる。

ヒトには細菌が常在しており、消化管における総菌数が最も多いのは腸である。腸内では、典型的な細菌密度（回腸：１０^８/mL、大腸：１０^１１/mL程度）が、胃（１０^３～４/mL）と比較して高いことに加え、細菌種も約１０００種類が存在する。本発明において、「腸内フローラ又は腸内細菌叢」とは、腸内における細菌全体を意味し、「腸内環境」とは、腸内細菌間、又は、腸内細菌と宿主細胞とにより形成される腸内生態系を意味する。

腸内環境は、腸内フローラ又は腸内細菌叢と宿主間の相互コミュニケーションによって制御されているため、腸内フローラ又は腸内細菌叢の乱れ又は悪化は、腸内環境の乱れ又は悪化を引き起こす。従って、本発明において、「腸内環境の乱れ又は悪化」とは、腸内フローラ又は腸内細菌叢の乱れによる、腸内環境の乱れ又は悪化を含む。腸内環境の乱れ又は悪化は、宿主へ悪影響を及ぼす。宿主への悪影響としては、例えば、腸粘膜において炎症が惹起されること等が挙げられる。

本発明において、「腸内フローラ又は腸内細菌叢の乱れ」とは、正常状態と、腸内フローラ又は腸内細菌叢が異なることにより、宿主に対して悪影響がある状態を意味し、例えば、薬物を投与している場合の腸内フローラ又は腸内細菌叢が、薬物を投与していない場合の腸内フローラ又は腸内細菌叢と類似度が低くなることにより、宿主に悪影響がある状態等が挙げられる。

本発明において、「腸内環境の改善」とは、腸内フローラ又は腸内細菌叢を改善することを含む。腸内フローラ又は腸内細菌叢の改善としては、宿主に有用な細菌（善玉菌）の数または割合を増加させることであっても、宿主に有用な細菌の数または割合の減少を抑制し、正常状態又は正常状態に近い腸内フローラ又は腸内細菌叢とし、宿主に対する悪影響を抑制することであっても、いずれであってもよい。宿主に対する悪影響を抑制することとしては、例えば、腸粘膜における炎症が抑制されること等が挙げられる。すなわち、本発明の腸内環境改善剤は、宿主に有用な細菌の数または割合を増加させる腸内環境改善剤であっても、宿主に有用な細菌の数又は割合の減少を抑制する腸内環境改善剤であってもよい。
宿主に有用な細菌としては、例えばプロバイオティクスとしても用いられるラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌などの乳酸菌等が挙げられる。

上記において、「正常状態に近い腸内フローラ又は腸内細菌叢」とは、正常状態の腸内フローラ又は腸内細菌叢と類似度が高い腸内フローラ又は腸内細菌叢を意味する。従って、「正常状態に近い腸内フローラ又は腸内細菌叢とする」とは、例えば、腸内フローラ又は腸内細菌叢を、正常状態の腸内フローラ又は腸内細菌叢との類似度を高くすること又は低くしないことを意味し、例えば、薬物投与により、薬物を投与していない腸内フローラ又は腸内細菌叢との類似度が低くなった腸内フローラ又は腸内細菌叢の、薬物を投与していない腸内フローラ又は腸内細菌叢との類似度を高くすること等が挙げられる。

なお、腸内フローラ又は腸内細菌叢の乱れ又は悪化は、アレルギー、腸炎、腸管出血の増悪、腸管の透過性、肥満、糖尿病等への関与が報告されており、腸内フローラ又は腸内細菌叢の乱れ又は悪化の改善によりこれら症状への改善が期待される。

本発明の腸内環境改善剤において、腸内環境の乱れ又は悪化の原因は特に制限はなく、例えば、食習慣、喫煙、ストレス、薬物投与等が挙げられるが、本発明の腸内環境改善剤は、薬物投与による腸内環境の乱れ又は悪化に対して好ましく適用され、ＮＳＡＩＤｓ投与による腸内環境の乱れ又は悪化に対して、より好ましく適用される。

前記腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物としては、特に制限はないが、例えば、ＮＳＡＩＤｓが挙げられる。前記ＮＳＡＩＤｓとしては、ジクロフェナク、インドメタシン、エトドラク、ナプロキセン、メロキシカム、イブプロフェン、ロキソプロフェン、セレコキシブ、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸やこれらの医薬的に許容可能な塩等が挙げられる。

腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物投与の投与経路としては、経口投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等）等が挙げられる。本発明の腸内環境改善剤は、これらの中でも、薬物の経口投与（内服）による腸内環境の乱れ又は悪化に対して好ましく適用される。

本発明の腸内環境改善剤の使用において、化合物（Ｉ）の1回当たりの投与量は、化合物（Ｉ）を成人で、３～４０００ｍｇとすることが好ましく、３～２０００ｍｇとすることがより好ましく、５０～１０００ｍｇとすることがさらに好ましい。

本発明の腸内環境改善剤の使用において、化合物（Ｉ）の１日当たりの投与量は、化合物（Ｉ）を成人で、３～５０００ｍｇとすることが好ましく、１０～４０００ｍｇとすることがより好ましく、１５０～４０００ｍｇとすることがさらに好ましい。例えば、化合物（Ｉ）として、アセトアミノフェンを用いる場合は、１日当たり１５０～４０００ｍｇとすることができ、化合物（Ｉ）として、エテンザミドを用いる場合には、１日当たり２５０～１５００ｍｇとすることができる。

本発明の腸内環境改善剤には、必要に応じて、前記化合物（Ｉ）以外の他の薬物を含有することができる（配合剤と称する）。
前記他の薬物としては、例えば、
解熱・鎮痛・消炎薬（例えばアセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチルアミド、サザピリン等のサリチル酸系薬剤、イブプロフェン、ロキソプロフェン等のプロピオン系薬剤、フルフェナム酸、メフェナム酸等のフェナム酸系薬剤、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン等のアリール酢酸系薬剤、フェニルブタゾン、オキシフェニルブタゾン等のピラゾリジン系薬剤、ブコローム等のピリミジン系薬剤、ピロキシカム等のオキシカム系薬剤、スルピリン等のピリン系薬剤、イソプロピルアンチピリン等）；
抗ヒスタミン薬（例えば塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、フマル酸クレマスチン、マレイン酸カルビノキサミン等）；
鎮咳薬（例えば臭化水素酸デキストロメトルファン、リン酸ジヒドロコディン、リン酸コディン、ヒベンズ酸チペピジン、塩酸クロペラスチン、ベンゾナテート等）；
去痰薬（例えば塩酸ノスカピン、塩酸ブロムヘキシン等）；
塩酸Ｌ－システイン、塩酸Ｌ－メチルシステイン、アセチルシステイン等の粘膜溶解液；カルボシステイン等の粘液修復薬；
塩化リゾチーム等の消炎酵素剤；
グリチルリチン酸等の抗炎症剤；
アリルイソプロピルアセチル尿素等の催眠鎮静剤；
塩酸アンブロキソール等の粘液潤滑薬；
塩酸テルビナフィン等の抗真菌剤；
気管支拡張薬又は喘息治療薬（例えばシュードエフェドリン、塩酸エフェドリン、塩酸メチルエフェドリン、塩酸テルブタリン、イソプロテレノール、サルブタモール、テルブタリン等のβ２－アドレナリン受容体刺激薬、テオフィリン、アミノフィリン、プロキシフィリン等のキサンチン系薬剤、クロモグリク酸等）；
アミノ酸類；生薬；ビタミン類（ビタミンＡ，Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｕ等の脂溶性ビタミン類；ビタミンＢ，Ｃ，Ｐ等の水溶性ビタミン類）；等が例示できる。
これら他の薬物は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
本発明の腸内環境改善剤における前記他の薬物の含有量は、目的とする医薬製剤の用途により、有効性と安全性を鑑み各々適切な処方量で設定する。
本発明の腸内環境改善剤には、薬物投与により生じる腸内環境の乱れ又は悪化を改善することができるため、前記の他の薬物のうち、解熱・鎮痛・消炎薬（例えば、アセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチルアミド、サザピリン等のサリチル酸系薬剤、イブプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン等のプロピオン系薬剤、フルフェナム酸、メフェナム酸等のフェナム酸系薬剤、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン等のアリール酢酸系薬剤、フェニルブタゾン、オキシフェニルブタゾン等のピラゾリジン系薬剤、ブコローム等のピリミジン系薬剤、メロキシカム、ピロキシカム等のオキシカム系薬剤、スルピリン等のピリン系薬剤、イソプロピルアンチピリン、セレコキシブ等）を含有する配合薬が有用であり好ましく、ＮＳＡＩＤｓの中でも、ジクロフェナク、インドメタシン、ナプロキセン、メロキシカム、イブプロフェン、ロキソプロフェン、セレコキシブ、ケトプロフェン、アセチルサリチル酸やこれらの医薬的に許容可能な塩が特に有用であり好ましい。
前記配合剤において、前記化合物（Ｉ）以外の他の薬物が腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物である場合、腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物に対する化合物（Ｉ）の含有質量比は、０．０５～２０が好ましく、０．２～１０が好ましい。前記範囲内とすることで、腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物による薬効を維持しつつ、腸内環境の乱れ又は悪化の原因となる薬物による腸内環境の乱れ又は悪化が効果的に改善される。

本発明の腸内環境改善剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の任意成分を含有することができる。前記任意成分としては、結合剤、賦形剤、滑沢剤、香料、矯味剤（甘味料、酸味料等）、色素、安定化剤、コーティング剤、可塑剤、隠蔽剤等が挙げられ、１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて適量を用いることができる。
結合剤としては、例えば、澱粉、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム末、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、プルラン、デキストリン等を用いることができる。
賦形剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、乳糖、タルク、結晶セルロース（セオラス等）、粉糖、マンニトール等の糖アルコール類、軽質無水ケイ酸等を用いることができる。
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸、ショ糖脂肪酸エステル、フマル酸ステアリルナトリウム等が挙げられる。香料としては、メントール、リモネン、植物精油（ハッカ油、ミント油、ライチ油、オレンジ油、レモン油等）等が挙げられる。
甘味料としては例えば、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、ステビア、グリチルリチン酸二カリウム、アセスルファムカリウム、ソーマチン、スクラロース等が挙げられる。
酸味料としては、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、乳酸又はそれらの塩等を用いることができる。
コーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、「オパドライ（商品名）」（日本カラコン合同会社製）等を用いることができる。
可塑剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、トリアセチン等を用いることができる。
隠蔽剤としては、例えば、酸化チタン、タルク等を用いることができる。

本発明の腸内環境改善剤の投与形態は特に限定されない。例えば、経口投与（例えば、口腔内投与、舌下投与等）、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等）等が挙げられる。これらの中でも侵襲性の少ない投与形態が好ましく、腸内環境の乱れ又は悪化を効果的に改善する観点から、経口投与（内服）がより好ましい。

経口投与剤（内服剤）又は経口投与用組成物（内服用組成物）の剤形としては、例えば、液状（液剤）、シロップ状（シロップ剤）、錠剤（錠剤、タブレット）、カプセル状（カプセル剤）、粉末状（顆粒、細粒）、ソフトカプセル状（ゼラチン基剤等のソフトカプセル剤）、ハードカプセル状（ハードカプセル剤）、液状（液剤）、シロップ状（シロップ剤）、固形状、半液体状、クリーム状、ペースト状が挙げられる。
本発明の腸内環境改善剤を製剤形態とする方法は特に限定されず、製剤形態に応じ、常法により実施できる。例えば、本発明の腸内環境改善剤の有効成分である化合物（Ｉ）と他の成分とをそのまま混合し、あるいは前記成分の一部または全部に造粒やコーティングを施してから混合して粒状混合物を製造し、これを粒状剤（顆粒剤、細粒剤、散剤）とすることができる。また、前記粒状混合物を打錠し、さらに必要に応じてコーティングを行い、錠剤とすることができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

［実施例１］
（１）動物
７週齢のＳＤ雄性ラット（日本チャールスリバー）を４日以上検疫馴化後、健康な個体を選定した。１６時間以上絶食させた（水は自由摂取）後、給餌し、１時間後試験に供した。

（２）試料（懸濁液）
ラットに対する試料の投与量を、１０ｍＬ／ｋｇ体重とし、イブプロフェン（ＩＢＰ）の投与量が２００ｍｇ／ｋｇ体重となる試料、イブプロフェン（ＩＢＰ）とアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）との投与量がそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇ体重、２００ｍｇ／ｋｇ体重となる試料（ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ）、イブプロフェン（ＩＢＰ）とエテンザミド（ＥＴＺ）との投与量がそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇ体重、１１６ｍｇ／ｋｇ体重となる試料（ＩＢＰ＋ＥＴＺ）の調製を行った。コントロール試料（Ｖｅｈｉｃｌｅ）としては、各薬液の懸濁溶媒である５％アラビアゴム液を試料として調製した。

（３）試料の投与
各試料をそれぞれ、１０ｍＬ／ｋｇ体重として投与した。具体的には、あらかじめ測定しておいたラットの体重にあわせた量の試料（例えば、ラット体重が２００ｇであれば２ｍＬ）を、ラット用経口投与ゾンデを装着したディスポーザブル注射筒にとり、強制経口投与した。各例について、ラット５匹を用いた（ｎ＝５）。

（４）試験サンプルの採取
各試料投与１６時間後にイソフルラン麻酔下にて小腸を摘出した。摘出した小腸を図１に示すように８つのセクションに分割し、胃側から７番目のセクションを開き、内容物を洗浄した後に小腸粘膜を採取した。

（５）小腸粘膜からのＤＮＡ抽出
小腸粘膜からのＤＮＡ抽出は、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の使用方法に準じ、下記のように行った。
採取した小腸粘膜を、付属のＰｏｗｅｒＢｅａｄ Ｔｕｂｅにサンプルを移し、ボルテックスミキサーで混合した後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ１を６０μＬ加え、数回反転させた。その後、Ｖｏｒｔｅｘ Ａｄａｐｔｅｒ ｔｕｂｅｓ ｈｏｌｄｅｒを使用して、ＰｏｗｅｒＢｅａｄ Ｔｕｂｅを水平に固定し、ボルテックスミキサーで１０分間撹拌した。
次に、１０，０００×ｇで１分間遠心分離後、上清を新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに移し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ２を２５０μＬ添加して、ボルテックスミキサーで５秒間撹拌した。その後、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを４℃で５分間インキュベートし、１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。得られた上清を新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに移し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ３を２００μＬ添加し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。
次に、上記Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅを４℃で５分間インキュベートした後、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに移した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ４をよく混合し、１．２ｍＬを上清に加え、５秒間ボルテックスミキサーで撹拌した。その後、ＭＢ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに６７５μＬを添加し、ＭＢ Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎにＤＮＡを吸着させ、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し、ろ液は破棄した。全てのサンプルについて、上記処理を行った。
上記で得られた各サンプルについてのＭＢ Ｓｐｉｎ ＣｏｌｕｍｎにＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ５を５００μＬ加え、１０，０００×ｇで１分間遠心分離した後、ろ液を破棄し、さらに、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し、残留溶液を除去した。次に、ＭＢ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを、新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに載せ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ６の５０μＬをＭＢ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎの中央に加えＤＮＡを溶出した。１０，０００×ｇで１分間遠心分離し、溶出したＤＮＡをサンプルとした。

（６）細菌叢解析
次世代シーケンサー ＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、次のようにして細菌叢の解析を行った。
表１に示した、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ１－Ｖ２領域の増幅プライマー（フォワードプライマー：配列番号１で表される塩基配列からなる２７Ｆｍｏｄ、リバースプライマー：配列番号２で表される塩基配列からなる３３８Ｒ）を用い、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、表２に示す組成、表３に示す条件でＰＣＲを行うことにより増幅した。得られたＰＣＲ産物は、電気泳動を行い、目的領域の配列長の増幅を確認した。ＤＮＡの精製はＡＭ Ｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、所定の手順に準じて行った。精製後のサンプルは、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で濃度を測定し、各サンプル同ＤＮＡ量となるよう混合しライブラリを作成した。ライブラリの精製は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、所定の手順に準じて行った。ライブラリの濃度は、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、リアルタイムＰＣＲで測定した。ライブラリの配列長は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で確認した。配列情報の取得は、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ３（ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び次世代シーケンサーＭｅＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用い、所定の手順に準じて行った。

得られた配列を、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを両方含む配列、配列の信頼性を示すＱｕａｌｉｔｙ ｖａｌｕｅが２５以上の配列、データベースの遺伝子配列と比較し、アライメント長が９０％以上の配列を条件にフィルタリングを行った。以降の解析には、フィルタリングをクリアした配列のみを使用した。サンプルごとに、ランダムに３０００配列抽出し、データ数を統一した。９７％以上の相同性を持つ配列を一つのグループとしてＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）を作成した。各ＯＴＵの代表配列を３つの公的なデータベース（ＲＤＰ，ＣＯＲＥ，ＮＣＢＩ）と照合し、細菌種を同定した。相同性が９７％以上の細菌種のみを採用し、それ以外はＵｎｄｅｆｉｎｅｄとした。統計解析は、統計分析フリーソフトウェアＲ ｖｅｒ ３．４．４を使用して行った。

（７）試験結果
試料投与による細菌叢の変化を、ＵｎｉＦｒａｃ解析で得られた細菌叢の類似度により評価した。ＵｎｉＦｒａｃ解析は、各群に属する塩基配列（各ＯＴＵの代表配列）を用いて系統樹を作成し、比較するサンプル間の細菌叢の類似度（即ち、細菌叢構造全体の違い）を計算する手法である。ＵｎｉＦｒａｃ解析によって得られる類似度は、ＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅとして算出され、サンプル間の細菌叢の類似度が高いほど小さな値（０に近づく）を示す。すなわち、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＩＢＰ投与群の距離（ＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ）と比較し、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群の距離が統計学的に有意に小さい値であれば、ＩＢＰ投与群よりＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群がＶｅｈｉｃｌｅ群と細菌叢の類似度が高いことを示す。同様に、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＩＢＰ投与群の距離（ＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ）と比較し、Ｖｅｈｉｃｌｅ群とＩＢＰ＋ＥＴＺ投与群の距離が統計学的に有意に小さい値であれば、ＩＢＰ投与群よりＩＢＰ＋ＥＴＺ投与群がＶｅｈｉｃｌｅ群と細菌叢の類似度が高いことを示す。ＵｎｉＦｒａｃ解析（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ）におけるＶｅｈｉｃｌｅ群内、及び、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と薬剤投与群との間のＵｎｉＦｒａｃ ｄｉｓｔａｎｃｅの結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
図２Ａでは、ＩＢＰ投与群、ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群ともに、Ｖｅｈｉｃｌｅ群内の類似度と比較すると有意に異なる細菌叢であった。しかし、ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群は、ＩＢＰ投与群と比較すると有意にＶｅｈｉｃｌｅ群に近い細菌叢であった。また、図２Ｂでは、ＩＢＰ投与群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群内の類似度と比較すると異なる傾向にある細菌叢であった。しかし、ＩＢＰ＋ＥＴＺ投与群は、ＩＢＰ投与群と比較すると有意にＶｅｈｉｃｌｅ群に近い細菌叢であった。以上の結果は、ＩＢＰ投与による細菌叢の変化をＡＰＡＰもしくはＥＴＺ投与により、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に近い細菌叢に改善できたことを示す。なお、図２Ａ及び図２Ｂに示す統計検定には、Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を用いた。

［実施例２］
実施例１の（１）～（４）と同様の方法により、ラット小腸から試験サンプルを採取した。
得られた試験サンプルから、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍ ｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ ＲｅｍｏｖｅｒＦＳＱ－３０１（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。それをサンプルとしてリアルタイムＰＣＲにてＴＮＦαの発現を確認した。その結果を、図３に示す。なお、遺伝子発現の内在性コントロールとしては、１８Ｓ ｒＲＮＡを用いた。リアルタイムＰＣＲには、表４に示す配列のプライマーを用いた。

ＴＮＦαは炎症性サイトカインの１種であり、その過剰な発現は炎症反応が起こっていることを示す。図３に示す通り、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に対しＩＢＰ投与群のみでＴＮＦα遺伝子の有意な発現上昇を認めた（Ｐ＜０．０５ ｖｓ．Ｖｅｈｉｃｌｅ、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）一方、ＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群はＶｅｈｉｃｌｅ群と同程度の発現であった。すなわち、図２Ａに示したＩＢＰ投与群における腸内細菌叢は、腸粘膜において炎症を惹起しており、腸内環境を悪化させる腸内細菌叢の変化であることが示された。また、図２Ａに示したＩＢＰ＋ＡＰＡＰ投与群における腸内細菌叢は、腸粘膜において炎症が生じておらず、ＡＰＡＰ投与により、悪化した腸内環境が正常状態に近い状態に戻っているか、或いは、ＩＢＰ投与による腸内環境の悪化が抑制されていることが示された。

Claims (4)

1. アセトアミノフェン及びエテンザミドから選ばれる化合物を含有する腸内環境改善剤であって、
   前記腸内環境改善が、薬物投与による腸内環境の乱れ又は悪化の改善である、腸内環境改善剤。
2. 前記腸内環境改善が、腸内フローラ又は腸内細菌叢の改善である、請求項１に記載の腸内環境改善剤。
3. 前記薬物が、非ステロイド性消炎鎮痛薬である、請求項１又は２に記載の腸内環境改善剤。
4. 前記薬物投与の投与経路が、経口投与である、請求項１～３のいずれか１項に記載の腸内環境改善剤。