JP7741111B2 - Ｃｄ３及びｃｄ１９に結合する抗体 - Google Patents

Ｃｄ３及びｃｄ１９に結合する抗体

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Description

本発明は、概して、例えば、Ｔ細胞を活性化するために、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、該抗体を生成するための方法、及び該抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。
ＣＤ３（表面抗原分類３）は、４つのサブユニット、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体及びζ鎖と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。
ＣＤ３は、創薬標的として広範に調査されてきた。ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体は、Ｉ型糖尿病等の自己免疫疾患又は移植拒絶反応の治療における免疫抑制治療として使用されてきた。ＣＤ３抗体ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）は、１９８５年にヒトでの臨床使用がこれまで認可された最初のモノクローナル抗体であった。
ＣＤ３抗体のより最近の応用は、一方でＣＤ３を結合し、他方ではＣＤ１９などの標的細胞抗原を結合している、ＣＤ３抗体の二重特異性抗体の形態である。そのような抗体が標的の両方に同時に結合することで、標的細胞とＴ細胞との間の一時的相互作用を強め、任意の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及びそれに続く標的細胞の溶解を引き起こす。ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２０１７／０５５３１４に記載されている。
治療目的のために、抗体が実現すべき重要な要件は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（薬剤の保管のため）及びｉｎ ｖｉｖｏ（患者への投与後）の両方で十分に安定であることである。
アスパラギン脱アミド化のような修飾は、組換え抗体について典型的な分解であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性及びｉｎ ｖｉｖｏ生物学的機能の両方に影響する可能性がある。
抗体、特にＴ細胞活性化のための二重特異性抗体の途方もない治療可能性を考えると、最適化された特性を有する、多重特異性抗体を含むＣＤ３抗体が必要である。
本発明は、ＣＤ３に結合し、例えば、アスパラギン脱アミド化による分解に耐性であり、したがって、治療目的に必要な特に安定な多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を含む、抗体を提供する。提供される（多重特異性）抗体は、優れた有効性と生産性を低毒性と好ましい薬物動態特性とさらに兼ね備えている。
本明細書に示すように、本発明により提供される、ＣＤ３に結合する多重特異性抗体を含む抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３への結合活性を約９０％超維持する。
一態様では、本発明はＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインとを含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、及び／又は第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、（ａ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインとを含む。
一態様において、第１、第２及び／又は存在する場合は第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
一態様では、抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれか一方である。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、抗体は、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、のいずれか一方であり、かつ、存在する場合に第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低減する、及び／又はエフェクタ機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
一態様では、第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３とを含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３をと含むＶＬを含む。一態様では、第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ、あるいは（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドと、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞とが提供される。
別の態様では、（ａ）抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞をインキュベートする工程と、任意選択的に、（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を生成する方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって生成されたＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体も包含する。
本発明はさらに、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明の抗体及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。一態様では、医薬としての使用のための本発明による抗体又は薬学的組成物が提供される。一態様では、疾患の治療に使用するための本発明による抗体又は薬学的組成物が提供される。また、医薬の製造における本発明による抗体又は薬学的組成物の使用、及び疾患の治療のための医薬の製造における本発明による抗体又は薬学的組成物の使用が提供される。本発明はまた、個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に有効量の本発明による抗体又は薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。ある特定の態様では、疾患はがんである。他の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。
本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成例。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成例。（Ｇ、Ｋ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成例。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図である。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図である。 本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構成例。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図である。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 非ストレス条件下、４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔの組換えＣＤ３に対する相対結合活性である（ＩｇＧフォーマット）。 フローサイトメトリで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する結合である（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する抗体結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 実施例３で使用したＣＤ３活性化アッセイの概略図。 元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞活性化である（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、ＣＤ３ｏｒｉｇ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ若しくはＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ、又は陰性対照としてのＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ｗｔの存在下、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ（ＣＨＯ－ＰＧＬＡＬＡ）細胞と共に共インキュベートされた。ＣＤ３活性化を、２４時間後に発光を測定することで定量化した。 （Ａ）実施例で使用されるＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）分子の概略図。試験されたすべてのＴＣＢ抗体は、電荷改変（ＣＤ３バインダにおけるＶＨ／ＶＬ交換、標的抗原バインダにおける電荷改変、ＥＥ＝１４７Ｅ，２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ，１２４Ｋ）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、「反転型」」として作製された。（Ｂ～Ｅ）ＴＣＢのアセンブリのための成分：ＣＨ１及びＣＬに電荷修飾を有する抗ＴＹＲＰ１ Ｆａｂ分子の軽鎖（Ｂ）、抗ＣＤ３ クロスオーバーＦａｂ分子の軽鎖（Ｃ）、Ｆｃ領域にノブ及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｄ）、Ｆｃ領域にホール及びＰＧ ＬＡＬＡ変異を有する重鎖（Ｅ）。 フローサイトメトリで測定した、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ）及びＣＤ１９発現Ｚ－１３８（Ｂ）及びＮａｌｍ－６（Ｃ）細胞へのＣＤ１９－ＴＣＢ抗体の結合。 ＣＤ１９－ＴＣＢ抗体によって誘発されるＣＤ１９＋標的細胞の標的特異的死滅。（Ａ）Ｚ－１３８標的細胞、（Ｂ）Ｎａｌｍ－６標的細胞。 Ｚ－１３８標的細胞を死滅させた後、ＣＤ１９－ＴＣＢ抗体によって誘導されるＴ細胞活性化。（Ａ）ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ２５発現、（Ｂ）ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ６９発現、（Ｃ）ＣＤ４ Ｔ細胞でのＣＤ１０７発現、（Ｄ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ２５発現、（Ｅ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ６９発現、（Ｆ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ１０７発現。 Ｎａｌｍ－６標的細胞を死滅させた後、ＣＤ１９－ＴＣＢ抗体によって誘導されるＴ細胞活性化。（Ａ）ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ２５発現、（Ｂ）ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ６９発現、（Ｃ）ＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ１０７発現、（Ｄ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ２５発現、（Ｅ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ６９発現、（Ｆ）ＣＤ８Ｔ細胞でのＣＤ１０７発現。 実施例１０のｉｎ ｖｉｖｏ研究の設計。 実施例１０の研究における、異なる用量のＣＤ１９－ＴＣＢ又はＣＤ２０－ＴＣＢでの処置による体重変化、ｎ＝３匹のマウス／群。Ｍｅａｎ＋／－ＳＥＭ。 実施例１０の研究における、オビニツズマブ（Ｇａｚｙｖａ（登録商標）前処理（ＧＰＴ））を伴う又は伴わないＣＤ１９－ＴＣＢ又はＣＤ２０－ＴＣＢによる処置の４時間後の血清中のサイトカイン放出。（Ａ）ＭＩＰ－１β、（Ｂ）ＩＬ－６、（Ｃ）ＩＦＮ－γ、（Ｄ）ＩＬ－５、（Ｅ）ＧＭ－ＣＳＦ、（Ｆ）ＴＮＦ－α、（Ｇ）ＩＬ－２、（Ｈ）ＩＬ－１β、（Ｉ）ＩＬ－１３、（Ｊ）ＭＣＰ１、（Ｋ）ＩＬ－８、（Ｌ）ＩＬ－１０、（Ｍ）Ｇ－ＣＳＦ、（Ｎ）Ｌ－１２ｐ７０、（Ｏ）ＩＬ－１７．パネルのバーは左から右へ：ＣＤ１９－ＴＣＢ ０．５ｍｇ／ｋｇ、ＣＤ１９－ＴＣＢ ０．１５ｍｇ／ｋｇ、ＣＤ１９－ＴＣＢ ０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＧＰＴ＋ＣＤ１９－ＴＣＢ ０．５ｍｇ／ｋｇ、ＣＤ２０－ＴＣＢ ０．１５ｍｇ／ｋｇ、ＧＰＴ＋ＣＤ２０－ＴＣＢ ０．１５ｍｇ／ｋｇ。Ｍｅａｎ＋ＳＥＭ。 実施例１０の研究における、オビニツズマブ（Ｇａｚｙｖａ（登録商標））前処理（ＧＰＴ）を伴うか又は伴わない、ＣＤ１９－ＴＣＢ又はＣＤ２０－ＴＣＢの処理後４時間、２４時間、及び７２時間での血液中のＢ細胞数。Ｍｅａｎ＋ＳＥＭ。 治療スケジュールと実験装置。ヒト化ＮＳＧマウスの皮下に、リンパ腫患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）（５００万個の細胞）を移植した。腫瘍体積はキャリパー測定から計算した。マウスが２００ｍｍ３に達したとき、腫瘍サイズに基づいてマウスを８匹のグループに無作為化した。次いで、マウスにビヒクル又は０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９－ＴＣＢを毎週注射（ｉ．ｖ．）した。 腫瘍増殖に対するＣＤ１９－ＴＣＢ治療の効果。腫瘍体積は、図１５に示すように、グループＢのｎ＝７マウス及びグループＡのｎ＝８マウスについて、週に２回（体積＜１０００ｍｍ３）又は３回（体積≧１０００ｍｍ３）のキャリパー測定値から計算された。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定による＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１の平均＋ＳＤ。矢印は、ＣＤ１９－ＴＣＢ又はビヒクルによる４つの処理のそれぞれを示している。
Ｉ． 定義
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
「抗ＣＤ３抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗体」との用語は、抗体が、ＣＤ３を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、ＣＤ３に結合することが可能な抗体を指す。一態様では、無関係な非ＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３抗体の結合度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、ＣＤ３に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、ＣＤ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、又は≦１００ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、ＳＰＲにより測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗体は、ＣＤ３に「特異的に結合する」と称する。特定の態様では、抗ＣＤ３抗体は、異なる種由来のＣＤ３の中で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。
同様に、「抗ＣＤ１９抗体」及び「ＣＤ１９に結合する抗体」との用語は、抗体が、ＣＤ１９を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、ＣＤ１９に結合することが可能な抗体を指す。一態様では、無関係な非ＣＤ１９タンパク質に対する抗ＣＤ１９抗体の結合度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、ＣＤ１９に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、ＣＤ１９に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、又は≦１００ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、ＳＰＲにより測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗体は、ＣＤ１９に「特異的に結合する」と称する。特定の態様では、抗ＣＤ１９抗体は、異なる種由来のＣＤ１９の中で保存されているＣＤ１９のエピトープに結合する。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、さまざまな抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない多様な技術によって作製され得る。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ）法によって決定される場合、純度が９５％又は９９％より高くなるまで精製される。抗体精製の試験方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明により提供される抗体は、単離抗体である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＣＤＲのすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに対応する。そのような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリ等のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。一部の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来する。一部の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片もまた、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
用語「抗原結合ドメイン」は、ある抗原の一部又は全部に結合し、且つある抗原の一部又はすべてに相補的な領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。可変領域配列に関連して本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載される番号付けシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０頁参照）を、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け」と言及することによってさらに明確にしている。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般的に、抗体は、６つのＣＤＲを含み、ＶＨに３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる：ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。
別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。
本明細書の目的において「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）， ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのさらなるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的になる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換わっている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、を含む。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、カバットＥＵインデックスによる番号付け）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよい、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別段の指示がない場合、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドを含まないもが示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、ダイマーＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ（すなわち、安定な自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチド）を指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかにより結合されていることである。
「多重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体でありうる。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。一部の態様では、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
用語「価数」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、用語「抗原に対する一価の結合」とは、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つ（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、すなわち１つ以上のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する、抗原結合ドメインが結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。好ましい態様では、抗原はヒトタンパク質である。
「ＣＤ３」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＣＤ３、及び細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ３も包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号４５（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ０７７６６（バージョン２０９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１．１を参照されたい。別の態様では、ＣＤ３は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号４６（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照されたい。一部の態様では、本発明の抗体は、異なる種由来のＣＤ３抗原、特にヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３の中に保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体は、ヒトＣＤ３に結合する。
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えば、Ｂ細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。好ましくは、標的細胞抗原は、ＣＤ３ではない、及び／又は異なる細胞上に発現されたＣＤ３以外である。本発明によれば、標的細胞抗原はＣＤ１９、特にヒトＣＤ１９である。
「ＣＤ１９」は、分化群１９（Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９又はＢリンパ球表面抗原Ｂ４としても知られる）を表し、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、齧歯類（例えば、マウスやラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ１９を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＣＤ１９、及び細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ１９も包含する。この用語は、ＣＤ１９の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＣＤ１９は、ヒトＣＤ１９である。ヒトタンパク質については、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｐ１５３９１（バージョン２１１）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１７６１．３を参照されたい。一部の態様では、本発明の抗体は、異なる種由来のＣＤ１９抗原、特にヒトＣＤ１９及びカニクイザルＣＤ１９の中に保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体は、ヒトＣＤ１９に結合する。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ又は複数の変化を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、この用語は、親和性がゼロまで低下する（又は分析方法の検出限界未満になる）こと、すなわち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合の増加」は、個々の相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ以上の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適したアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、好ましくは、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別個の改変を含み、この修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補性である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、サブユニットの各々に融合するさらなる構成要素（例えば抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではなくてもよい。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクタ機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が挙げられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合の後に、エフェクタ機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクタ細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの減少」は、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の所定の濃度で、上記で定義されたＡＤＣＣのメカニズムによる、所定の時間内に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法（当業者に知られている）を使用して、同じタイプの宿主細胞によって産生された同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較されるが、それは、設計されていいない。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００６／０８２５１５又は同２０１２／１３０８３１を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「操作する、操作される、操作すること」という用語は、天然に存在するか、又は組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組合せを含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸突然変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが、所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低下、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えることが特に好ましい。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、又は２０種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸突然変異は、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝的方法には、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、ＷＯ２００１／００７６１１に記載されている。
別段の指定がない限り、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５（１９８８）：２４４４－２４４８）、Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ（“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ” Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６（１９９６）：２２７－２５８）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）により作成され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公開されて利用可能である。これに代えて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学的に修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ ２ １０１ ８２３Ｂ１を参照されたい）。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は、染色体外に存在するか、又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗体をコードする単離ポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、このようなポリヌクレオチド分子（複数可）が宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）を含む。
「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している他の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では、「発現ベクター」と呼ぶ。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞インキュベート」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する突然変異型の後代が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、インキュベート細胞、例えば、哺乳動物インキュベート細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物もしくはインキュベート植物、又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
「薬学的組成物」又は「医薬製剤」という用語は、調製物に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態をしており、かつ、薬学的組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない、調製物を指す。
「薬学的に許容され得る担体」は、有効成分以外の薬学的組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、ビヒクル、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
用語「添付文書」とは、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、投与量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
ＩＩ． 組成物及び方法
本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供する。抗体は、例えば、有効性及び安全性、薬物動態、並びに再現性に関連する治療用途に有益な他の特性と組み合わせて、優れた安定性を示す。本発明の抗体は、例えば、がんなどの疾患の治療に有用である。
Ａ． 抗ＣＤ３／ＣＤ１９抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供する。一態様では、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する単離された抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、抗ＣＤ３／ＣＤ１９抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０℃で２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７℃で２週間後にＣＤ３への結合活性を約９０％超維持する。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、（ａ）ＣＤ３に結合する、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体はヒト化抗体である。一態様では、第１の抗原結合ドメインはヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬはヒト化可変領域である。
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、受容体ヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７の重鎖可変領域配列の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号７のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。場合により、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１の軽鎖可変領域配列の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ３に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１１のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。場合により、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、且つ、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号７のＶＨ配列と、配列番号１１のＶＬ配列とを含む、ＣＤ３に結合する、第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
一態様において、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様において、第１の抗原結合ドメインの抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、第１の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様では、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様において、第１の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークを含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供し、抗体は、上に提供される態様のいずれかにおけるＶＨ配列と、上に提供される態様のいずれかにおけるＶＬ配列とを含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号５２及び５３（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号５４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、抗体は、配列番号５２又は配列番号５３のアミノ酸配列、特に配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一態様では、抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されたようなＦｃドメインにおけるアミノ酸突然変異を含んでもよい。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５２又は配列番号５３のアミノ酸配列、特に配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
一態様では、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一態様では、抗体は、完全長抗体である。
別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、第１の抗原結合ドメインは、クロスオーバーＦａｂ分子である）。
さらなる態様では、上記の態様のいずれかによる抗体は、以下のセクションＩＩ．Ａ．１．－８．に記載されるように、特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
好ましい態様において、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットからなり、Ｆｃドメインバリアントに関連して本明細書の以下に記載される特徴のうちのいずれかを単独で、又は組み合わせて、組み込んでもよい（セクションＩＩ．Ａ．８．）。
本発明によれば、抗体は、ＣＤ１９に結合する第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインを含む（すなわち、抗体は、本明細書中以下にさらに記載されるように、多重特異性抗体である（セクションＩＩ．Ａ．７．）。
１． 抗体断片
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆａｂ’－ＳＨ分子、又はＦ（ａｂ’）２分子であり、特に本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域から１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加だけ、Ｆａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’分子である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ． ａｌ， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ．ａｌ， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載されている。
さらなる態様では、抗体断片は、一本鎖Ｆａｂ分子である。「単鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有する：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬ。特に、上記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによる、可変重鎖の４４位と可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化され得る。
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持することができる。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、ＷＯ９３／１６１８５及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。
抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載される、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組み換え産生を含む種々の技術によって作製することができる。
２． ヒト化抗体
一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するようにヒト化される一方、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部分）が非ヒト抗体に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化された抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説され、更に以下に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載する）；Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載する）；Ｄａｌｌ’ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチを記載する）。
ヒト化に用い得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
３． グリコシル化バリアント
ある特定の態様では、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体に付着しているオリゴ糖を変更してもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等のＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾が、特定の改良された特性を有する抗体バリアントを生成するために行われてもよい。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体バリアントを提供する。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、天然又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、ＷＯ２００６／０８２５１５に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合したすべてのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のマイナーな配列変化のために、２９７位の上流又は下流、すなわち２９４位と３００位の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクタ機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＵＳ２００４／００９３６２１を参照のこと。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；ＵＳ２００３／０１５７１０８；及びＷＯ２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、ＵＳ２００４２５９１５０、ＵＳ２００５０３１６１３、ＵＳ２００４１３２１４０、ＵＳ２００４１１０２８２を参照されたい）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分されたオリゴ糖と共に提供される。このような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７， １７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００３／０１１８７８に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有しうる。このような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。
４． システイン操作抗体バリアント
ある特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢＴＭを生成することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、本明細書でさらに説明するように、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又はＷＯ２０１６０４０８５６に記載のように生成することができる。
５． 抗体誘導体
一部の態様では、本明細書で提供される抗体は、技術分野で既知であり、容易に入手可能な、さらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に適した部位には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり得、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であり得るか、又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されるものではないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定することができる。
６． 免疫抱合体
本発明はまた、細胞毒性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療薬にコンジュゲート（化学結合）された、本明細書の抗ＣＤ３／ＣＤ１９抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
一態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、前述の治療剤の１種又は複数にコンジュゲートされている、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療剤の１種又は複数に接続される。治療薬及び薬物及びリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートした本発明の抗体を含み、これには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンが含まれるが、これらに限定されない。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性抱合体を形成する、本発明の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生産には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性抱合体が検出のために使用されるとき、その例には、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のための、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄などのスピン標識が含まれうる。
抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル活性エステル（ジスクシニミジルスベレートなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸－ラビリンカ、ペプチダーゼ感受性リンカー、フォトラビリンカ、ジメチルリンカ又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：１２７－１３１ （１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．， ＵＳＡから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋リンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明確に意図している。
７． 多重特異性抗体
本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。本発明によれば、結合特異性の一方はＣＤ３に対するものであり、他方の特異性はＣＤ１９に対するものである。
多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製され得る。多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）参照）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０：２６（１９９７）参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、ＷＯ２００９／０８９００４参照）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の生成（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及びＷＯ２０１１／０３４６０５参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、ＷＯ９８／５０４３１参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８（１９９４）参照）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、ＷＯ２００１／７７３４２及びＷＯ２００８／０２４７１５を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１３／０２６８３１に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３に、同様に別の異なる抗原に、又はＣＤ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０及びＷＯ２０１５／０９５５３９を参照されたい）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称形態（いわゆる「クロスマブ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）」技術）で、即ちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号参照）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ， １０８（２０１１）１１８７－１１９１及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．， ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０）も参照）を交換することによっても提供されうる。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して正しいＦａｂペアリングを指向することによって操作することもできる。例えば、ＷＯ２０１６／１７２４８５を参照されたい。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
多重特異性抗体の特定のタイプは、標的細胞、例えばＢ細胞上の表面抗原、及び標的細胞を殺すためにＴ細胞を再標的化するためのＣＤ３などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変成分に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体であり、結合特異性の一方はＣＤ３に対するものであり、他方は標的細胞抗原としてのＣＤ１９に対するものである。
この目的のために有用でありうる二重特異性抗体フォーマットの例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１及びＷＯ２００８／１１９５６７、Ｎａｇｏｒｓｅｎ及びＢａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）参照）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ２９９－３０５ （１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（“ＴａｎｄＡｂ”； Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３， ４１－５６ （１９９９））、ダイアボディフォーマットに基づくが、安定化付加のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９， ４３６－４４９（２０１０））、並びに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６， ４５８－４６７（２０１０）に概説）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、具体的なＴ細胞二重特異性抗体形式は、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＷＯ２０１３／０２６８３９、ＷＯ２０１６／０２０３０９；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
本発明の抗体の好ましい態様を以下に記載する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２及び場合により第３の抗原結合ドメインとを含むＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である（即ち、各々が可変ドメイン及び定常ドメインを含む、重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメインである）。一態様において、第１、第２及び／又は存在する場合は第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一態様において、前記Ｆａｂ分子は、ヒトのものである。好ましい態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合ドメインの少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を低減し、それによって、組み換え生成における本発明の（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善する。本発明の（多重特異性）抗体に有用な好ましいクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換によっても、（多重特異性）抗体の調製は、誤対合重鎖及び軽鎖の間の、いわゆる、ベンス・ジョーンズ型相互作用に起因して、特定の副生成物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， １０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照されたい）。異なるＦａｂ分子からの重鎖と軽鎖の誤った対形成をさらに減らし、目的の（多重特異性）抗体の純度と収率を高めるために、本明細書でさらに説明するように、ＣＤ３に結合するＦａｂ分子、又はＣＤ１９に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することができる。電荷修飾は、（多重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば、図１Ａ～図１Ｃ、図１Ｇ～図１Ｊに示される）、又は（多重特異性）抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ～図１Ｆ、図１Ｋ～図１Ｎに示される）において行われる（但し両方ではない）。好ましい態様では、電荷修飾は、（多重特異性）抗体（好ましい態様ではＣＤ１９に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子で行われる。
本発明による好ましい態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３及びＣＤ１９に同時に結合することができる。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３及びＣＤ１９への同時結合によってＴ細胞及び標的細胞を架橋することができる。さらにより好ましい態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＢ細胞などのＣＤ１９発現標的細胞の溶解をもたらす。一態様では、そのような同時結合はＴ細胞の活性化を生じる。別の態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を生じる。一態様では、ＣＤ１９への同時結合なしのＣＤ３への（多重特異性）抗体の結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらさない。
一態様において、（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に向け直すことができる。好ましい態様において、前記向け直しは、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
好ましくは、本発明のいずれかの態様によるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ａ） 第１の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様において、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号４５）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号４６）、とりわけヒトＣＤ３である。一態様において、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３と交差反応性がある（すなわち、それらに特異的に結合する）。いくつかの態様では、ＣＤ３のサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
好ましい態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
一態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
好ましい態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれるＣＤ１９に結合する２つ以上の抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であることが好ましく、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であることが好ましい。
代替的な態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのような態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬは、交換される／互いに置換される。（多重特異性）抗体に含まれるＣＤ３に結合する２つ以上の抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であることが好ましく、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であることが好ましい。
好ましい態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、そのような態様によると、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。１つのそのような態様において、第２の（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様において、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体に存在する（すなわち、この抗体はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
ｂ） 第２（及び第３）の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ１９に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第２及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン）、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位、例えばＣＤ１９を発現する特定のタイプの細胞に向かわせることができる。
一態様において、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
特定の態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ１９に結合する２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。好ましい態様では、これらの抗原結合ドメインのすべては同一であり、すなわち、同じ分子形式（例えば、従来又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一態様では、（多重特異性）抗体は、ＣＤ１９に結合する２つ以下の抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。
好ましい態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのような態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
別の態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬは、交換／互いに置換される。そのような態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号５２及び５３（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号５４（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号５２又は配列番号５３のアミノ酸配列、特に配列番号５２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸突然変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。一部の態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の下に記載されるアミノ酸変異を含み得る。
一態様において、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（に由来する）。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ１９に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１８のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ１９に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号２２のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８の配列を含むＶＨと、配列番号２２の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨ配列と配列番号２２のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに配列番号２２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（に由来する）。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ１９に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号３１のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＣＤ１９に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号３５のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、第２（及び、存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号３１の配列を含むＶＨと、配列番号３５の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号３１のＶＨ配列と配列番号３５のＶＬ配列とを含む。
別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号３５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインは、配列番号３１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに配列番号３５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３５のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む一態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３５のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号３５のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３５のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
ｃ） 電荷修飾
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、さらに多くの）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベース多重特異性抗体の生成において生じうる、軽鎖と適合しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）を低減するうえで特に効率的であるアミノ酸置換を含みうる（全体が本明細書に参照により組み込まれるＷＯ２０１５／１５０４４７、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副生成物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した、所望の（多重特異性）抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置と反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
したがって、（多重特異性）抗体の第１及び第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの１つ（特に、第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、一部の態様では、
ｉ）第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（多重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられていない（即ち、交換されていないままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
１つのこのような態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる板東付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
より好ましい態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらにより好ましい態様では、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様において、上記の態様によるアミノ酸置換が、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１に行われる場合、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
あるいは、上記の態様によるアミノ酸置換は、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。好ましいこのような態様において、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
なお別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、
（ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、この第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、かつ配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び場合により第３の抗原結合ドメインと
を含み、
第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構成を図１に示す。
好ましい態様において、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。このような態様において、第１、第２、第３などの抗原結合ドメインは、それぞれ本明細書において第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれることがある。
一態様において、（多重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。好ましい態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子である。１つのそのような態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のそのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している態様において、追加的に、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
単一の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ分子など）を有する（多重特異性）抗体は、第２の抗原、例えば、ＣＤ１９などの標的細胞抗原に特異的に結合することができる（例えば、図１Ａ、図１Ｄ、図１Ｇに示すように）は、特に、高親和性抗原結合ドメインの結合に続いて、第２の抗原の内在化が予想される場合に役立つ。そのような場合、第２の抗原に特異的な１つを超える抗原結合ドメインの存在は、第２の抗原の内部移行を増強し、それによって第２の抗原の利用能を低減し得る。
しかし他の場合において、第２の抗原、例えばＣＤ１９などの標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合ドメイン（Ｆａｂ分子など）（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｍ又は図宇１Ｎに示される例を参照）を、例えば、標的部位への標的化を最適化したり、標的細胞抗原の架橋を可能にしたりするために、含む（多重特異性）抗体を有することが有利であろう。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体は第３の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、第３の抗原結合ドメインはＣＤ１９に結合する。一態様において、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
一態様において、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一である。
一部の態様において、第３及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一である。故に、これらの態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（すなわち、従来又はクロスオーバー）を有する。さらに、これらの態様において、第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、第２の抗原結合ドメインと同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷改変」と記載されるアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインのそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。あるいは、前記アミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン（好ましい態様において、これはＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われ得るが、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第２の抗原結合ドメインと同様に、第３の抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。しかし、第２及び第３の抗原結合ドメインがクロスオーバーＦａｂ分子である（並びに、第１の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）態様も考慮される。故に、好ましい態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他の態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合ドメインが存在する場合、好ましい態様では、第１の抗原ドメインはＣＤ３に結合し、第２及び第３の抗原結合ドメインはＣＤ１９に結合する。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明による（多重特異性）抗体は、異なる構造を有することができ、即ち、第１、第２（及び任意選択的に第３）の抗原結合ドメインは、互いに、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に、又は好ましくは１つ以上の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
一部の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｇ及び１Ｋに概略的に描写されている（これらの例における第１の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから実質的になり、第１及び第２のＦａｂ分子は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ａ及び図１Ｄに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
いくつかの態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上記に記載されたように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様において、前記第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｈ及び１Ｌに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
いくつかの態様において、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。好ましいそのような態様において、前記第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
好ましいそのような態様において、第１及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｂ及び図１Ｅ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｊ及び１Ｎ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、各々がＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別のそのような態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｉ及び１Ｍ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合している（多重特異性）抗体の構造において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子を本質的に形成する。好ましい態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより好ましい形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらに好ましい態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の（多重特異性）抗体のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに低減し、本発明の（多重特異性）抗体の一部の発現に必要なプラスミドの数も低減する。
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ、又は（Ｇ４Ｓ）ｎＧ５ペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一態様において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長さ、一態様において５～１００個、さらなる態様において１０～５０個のアミノ酸長さを有する。一態様では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、及びｍ＝０、１、２又は３）あるいは（ｘ＝４、ｎ＝１、２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２、３、４又は５）であり、一態様では、ｘ＝４及びｎ＝２又は３であり、さらなる態様では、ｘ＝４及びｎ＝２であり、さらに別の態様では、ｘ＝４、ｎ＝１、及びｍ＝５である。一態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。別の態様では、前記ペプチドリンカーはＧ４ＳＧ５である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４８及び４９）を含む。別の特に適切なそのようなリンカーは、配列（Ｄ）－Ｇ４ＳＧ５（配列番号５０及び５１）を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。
ある特定の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチド、並びに第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
ある特定の形態において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチド、並びに第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。これらの態様の他において、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））ポリペプチド、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドをさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。これらの態様の他において、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））ポリペプチド、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドをさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体はＦｃドメインを含まない。好ましいそのような態様において、前記第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
１つのそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｏ及び図１Ｓに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
別のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｐ及び図１Ｔに概略的に描写されている（これらの例において、モミ抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
一部の態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。ある特定のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
一部の態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。ある特定のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽定常領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
一態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含み、
（ｉ）ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、及びｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されるか、又は
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＦａｂ重鎖のＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端で融合され、及びａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合される。
好ましい態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置換され、且つ、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含み、
（ｉ）ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、且つ、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されているか、又は
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＦａｂ重鎖のＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端で融合され、且つ、ａ）の下の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端でそれぞれ融合される。
別の態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、
を含む二重特異性抗体を提供し、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
本発明による（多重特異性）抗体の異なる構造のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換（「電荷改変」）は、存在する場合、第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインのいずれかにおけるものであってもよい。好ましくは、これらは第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によると、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、好ましくは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えらえているＦａｂ分子を含む（多重特異性）抗体において行われる。
本発明による（多重特異性）抗体の好ましい態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２（及び存在する場合に第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による（多重特異性）抗体の他の態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。一部の態様において、第２（及び存在する場合に第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、並びに第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
一態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、且つ、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと
を含み、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
（ｉ）ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、且つ、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されるか、又は
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＦａｂ重鎖のＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端で融合され、且つ、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合される。
好ましい態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換され、且つ、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと
を含み、
ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
（ｉ）ａ）の下の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、且つ、ｂ）の下の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されるか、又は
（ｉｉ）ｂ）の下の第２の抗原結合ドメインは、ａ）の下の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＦａｂ重鎖のＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端で融合され、且つ、ａ）の下の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の下の第３の抗原結合ドメインは、ｃ）の下のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端にＦａｂ重鎖のＣ末端でそれぞれ融合される。
別の態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子である第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと
を含み、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
上記の態様のいずれかによれば、（多重特異性）抗体の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に又は様々なリンカーを介して、特に本明細書に記載される又は当技術分野において知られている、１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の整数である。
好ましい態様では、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗体を提供し、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
及びさらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗体を提供し、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
そしてさらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号２８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２９のＨＣＤＲ２及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号３２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗体を提供し、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
そしてさらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、以下を含む（多重特異性）抗体を提供する。
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗体を提供し、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
そしてさらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
本発明のこれらの態様による一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基と置により置き換えられて（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、２３５位のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号２３又は配列番号３９（特に配列番号３９）の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号２３又は配列番号３９（特に配列番号３９）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号２３又は配列番号３９（特に配列番号３９）の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２３又は配列番号３９（特に配列番号３９）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する（多重特異性）抗体を提供する。
好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号３６又は配列番号４０（特に配列番号３６）の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号３６又は配列番号４０（特に配列番号３６）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３８のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号３６又は配列番号４０（特に配列番号３６）の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は配列番号３６又は配列番号４０（特に配列番号３６）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３８のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する（多重特異性）抗体を提供する。
８． Ｆｃドメインバリアント
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一態様において、本発明の（多重特異性）抗体は１つを超えるＦｃドメインを含まない。
一態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらなる好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。より好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号４７に示されている。
ａ） ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組み換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するため、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるものである。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾にいくつかの手法が存在し、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１に十分に記載されている。典型的には、すべてのそのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインとＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを構成する重鎖）が、それ自体でホモ二量体化できなくなるが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインと強制的にヘテロ二量体化されるように（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメイン間にホモ二量体が形成されないように）、両方とも相補的に設計される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンス・ジョーンズ型副生成物を低減する、（多重特異性）抗体における重鎖－軽鎖修飾との組み合わせでの異なる代替例として考慮される（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置き換え、並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
したがって、好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置することが可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出し得る。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３６６位のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
好ましい態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に（任意に、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン及び／又はペプチドリンカーを介して）融合される。）。理論に束縛されるものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインの、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ））を（さらに）最小化する。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾についての他の技術が本発明の代替例として考慮され、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５号、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／０９６２９１に記載されている。
一態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の形態では、本発明の多重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、ＷＯ２０１３／１５７９５３に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸変異（特に、Ｌ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、ＷＯ２０１２／０５８７６８に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、ＷＯ２０１１／１４３５４５に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、上記に記載されたノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様において、（多重特異性）抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、ＷＯ２０１０／１２９３０４に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、荷電アミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含む。１つのこのような態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より詳細にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を追加的に又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、ＷＯ２００７／１４７９０１に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
また別の態様では、ＷＯ２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
一態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｂ） Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これはＴ細胞活性化特性及び（多重特異性）抗体の長い半減期と組み合わさって、全身投与するとサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用を生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体担持）免疫細胞の活性化は、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性によって、（多重特異性）抗体の有効性さえも低減し得る。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクタ機能の低減を呈する。１つのこのような態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満のエフェクタ機能を呈する。一態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクタ機能を誘導しない。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様において、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様において、エフェクタ機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）の約７０％超、特に約８０％超、さらに詳細には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに対して呈するとき、達成される。
一部の態様において、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減される及び／又はエフェクタ機能が低減されるように操作される。好ましい態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を低減する１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。一態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する１つを超えるアミノ酸変異が存在する態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１にまで低減し得る。一態様において、操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらに詳細には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一部の態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低減される。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性（具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、即ち、前記受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は前記Ｆｃドメインの非操作形態を含む（多重特異性）抗体）の結合親和性の約７０％超をＦｃＲｎ対して呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を呈しうる。一部の態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低減されるように操作される。エフェクタ機能の低減には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体との架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減の１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一態様において、エフェクタ機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様において、減少したエフェクタ機能は減少したＡＤＣＣである。一態様では、減少したＡＤＣＣは、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。一態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一部の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より好ましい態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様において、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。ＷＯ２０１２／１３０８３１は、そのような突然変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクタ機能の決定方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクタ機能の低減を示す。したがって、いくつかの態様において、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクタ機能をさらに低減させるため、一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。好ましい態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン突然変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されている。
好ましい態様において、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクタ機能の低減を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一部の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化が排除された。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位におけるアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニンにより置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本明細書の上記及びＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製し得る。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、シーケンシングによって確認し得る。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体などを容易に決定し得る。あるいはまた、Ｆｃ受容体に関するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のエフェクタ機能は、当技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８３， ７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいはまた、非放射性アッセイを用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリ用非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクタ細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
いくつかの態様では、Ｆｃドメインの補体成分、特にＣ１ｑへの結合が減少する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクタ機能を有するように操作されるいくつかの形態では、前記低減されたエフェクタ機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体がＣ１ｑに結合できるかどうか、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために行うことができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；ＷＯ２０１３／１２０９２９を参照されたい）。
Ｂ． ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。前記単離ポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであってよい。
本発明の（多重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗体を形成し得る。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現すると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち一方と、任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方と、任意選択的にＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現する場合、Ｆｃドメインサブユニットが会合し、Ｆｃドメインを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってよい。
Ｃ． 組換え方法
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組み換え産生によって得られてもよい。組換え産生のために、例えば上記のような、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（とりわけ単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（即ちコード領域）が、プロモータ及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられるが、しかし、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば、単一のベクター上に、存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に、存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合するか、又は融合しない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが含まれる。操作可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ又は複数の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモータなど）は、プロモータ機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「操作可能に結合している」。したがって、プロモータ領域は、プロモータが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に会合し得る。プロモータは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモータであってもよい。プロモータ以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレータ、リプレッサ、及び転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに操作可能に会合し得る。適切なプロモータ及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモータ及びエンハンサーセグメント（例えば前初期プロモータ、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモータ）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が含まれる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモータ及びエンハンサー、並びに誘導性プロモータ（例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、即ちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に置かれていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の態様では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は操作可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製（例えば、ヒスチジンタグ）を容易にするため又は抗体を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードする抗体（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（即ち単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。特定の態様において本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。そのような一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、それらで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体の複製及び発現補助に適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。そのような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入することができ、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの原核微生物、又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生され得る。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されて得る。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２， １４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と併せて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。植物細胞インキュベート物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６， ５９（１９７７）に、記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に、記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部がん腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３， ４４－６８（１９８２）に、記載されるもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ． ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、インキュベート細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物インキュベート細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又はインキュベート植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）といった哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して他方の抗体鎖も発現させ、発現した産生物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体となるようにすることができる。
一態様では、本発明による抗体を生成する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書に提供される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をインキュベートすること、及び任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む。
本発明の（多重特異性）抗体の成分は、互いに遺伝的に融合され得る。（多重特異性）抗体は、その構成要素が、互いに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定し得、有効性について試験し得る。（多重特異性）抗体の異なる構成要素の間のリンカー配列の例が、本明細書で提供される。必要に応じて、融合の個々の構成要素を分離するための切断部位を組み込むために、追加の配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を含めることもできる。
本明細書で記載するように調製される抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどの当技術分野で既知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明らかであろう。アフィニティクロマトグラフィ精製のために、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体のアフィニティクロマトグラフィ精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続プロテインＡ又はＧのアフィニティクロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィを使用して、実施例に本質的に記載されるように抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィを含む種々の周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
Ｄ． アッセイ
本明細書に提供される抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定、スクリーニング、又は特徴付けされ得る。
１． 結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。あるいはまた、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体の結合が、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。ＣＤ３に対する結合活性を測定するための特定の説明的且つ例示的な態様が、以下に記載される。
一態様では、ＣＤ３に対する結合活性は、以下のようにＳＰＲによって決定される。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われる。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリング化学を用いて、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化される。実行バッファ及び希釈バッファとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用するｄ。２μｇ／ｍｌの濃度（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０）のＣＤ３抗体を、５μｌ／分の流量で約６０秒間注入する。使用されるＣＤ３抗原は、ノブ・イントゥ・ホール修飾及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体である（配列番号４１及び４２を参照されたい）。ＣＤ３抗原は、１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入され、解離は、５μｌ／分の流量で約１２０秒間監視される。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１のそれぞれ約６０秒間の２つの連続した注入によって再生される。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク制御フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正される。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合を、抗Ｆａｂ応答（固定化された抗Ｆａｂ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分割する。特定の処置の後の抗体のＣＤ３に対する結合活性であって、異なる処置の後の抗体のＣＤ３に対する結合活性に対して相対的なもの（相対活性濃度（ＲＡＣ）とも呼ばれる）は、異なる処置の後の対応する抗体の試料の結合活性に対して、特定の処置の後の抗体のサンプルの結合活性を基準とすることにより計算される。
２． 活性アッセイ
本発明の（多重特異性）抗体の生物活性は、実施例に記載されるように、様々なアッセイによって測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、Ｂ細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮の誘導及び／又は生存率の改善が含まれ得る。
Ｅ． 組成、調合及び投与経路
さらなる態様において、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。さらには、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態で本発明の抗体を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを調合し、それによって、抗体の調剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために調合することとを含む。別の態様では、薬学的組成物は、本発明による抗体と、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、以下に記載するものとを含む。
さらには、ｉｎ ｖｉｖｏでの与に適した形態で本発明の抗体を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを配合し、それによって、抗体の製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することとを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散された有効量の抗体を含む。「薬学的に許容される」という語句は、使用される投与量及び濃度で受容者に対して一般に非毒性である、すなわち、適当な場合、例えばヒトなどの動物に投与した場合、有害反応、アレルギー反応、又はその他の有害な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を指す。抗体と、任意選択的にさらなる有効成分とを含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示される本開示の観点から、当業者に既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調剤は、ＦＤＡ生物基準局又は他の国の対応する当局によって要求される滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥調合物又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、当業者には知られているように（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０， ｐｐ． １２８９－１３２９を参照されたい）、任意及びすべての溶媒、バッファ、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダ、ビヒクル、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、かかる類似の材料及びこれらの組合せを含む。従来の担体が有効成分と不適合である場合を除いて、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所的な治療が望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行い得る。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものを含む。注射のために、本発明の抗体は、水溶液、特に、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩バッファなどの生理学的に適合するバッファで製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。あるいはまた、抗体は、適切なビヒクル、例えば、殺菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための粉末形態であってもよい。無機の注射可能な溶液は、必要に応じて以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗体を必要な量で適切な溶媒に組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、無菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成することができる。一般的に、分散物は、種々の殺菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む殺菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に無菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、バッファ、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含んでもよい。任意選択的に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術若しくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内に、又はマクロエマルジョン内に、それぞれ封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の態様では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせの組成物での使用によってもたらすことができる。
前述の組成物に加え、抗体は、デポ剤として調合することもできる。そのような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として調合することができる。
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、薬学的に使用できる製剤へのタンパク質のプロセッシングを促進する、1つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル又は助剤を使用して、従来の方法で調合することができる。適切な調合物は、選択する投与経路によって変わる。
抗体は、遊離酸若しくは遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に調合されてもよい。薬学的に許容され得る塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、又は例えば塩酸もしくはリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸等の有機酸と形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
Ｆ． 治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗体のいずれも、治療方法に使用することができる。本発明の抗体は、例えばがん又は自己免疫疾患の治療において、免疫療法剤として使用することができる。
治療方法における使用のために、本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で調合され、用量決定され、投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の抗体が提供される。特定の態様では、治療方法における使用のための本発明の抗体が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための本発明の抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法において使用するための抗体を提供する。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＣＤ１９発現がんである。具体的な態様では、がんはＢ細胞がんである。一態様におけるＢ細胞がんは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病である。他の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。特定の態様において、疾患はループス、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループス腎炎（ＬＮ）である。
特定の態様では、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合の抗がん剤又は治療される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様において、本発明は、標的細胞、特に、Ｂ細胞の溶解を誘発する際に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘発するのに有効な量の抗体を個体に投与することを含む、個体において標的細胞、特にＢ細胞の溶解を誘発する方法において使用するための本発明の抗体を提供する。上記のいずれかの態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＣＤ１９発現がんである。具体的な態様では、がんはＢ細胞がんである。一態様におけるＢ細胞がんは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病である。他の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。特定の態様において、疾患はループス、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループス腎炎（ＬＮ）である。一態様では、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬、例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤、又は治療される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、医薬は、標的細胞、特に、Ｂ細胞の溶解を誘発するためのものである。またさらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘発するために個体に対して有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特にＢ細胞の溶解を誘発する方法における使用のためのものである。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
更なる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、この方法は、そのような疾患を有する個体に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、組成物は、上記個体に投与され、本発明の抗体を医薬的に許容される形態で含んでいる。特定の態様では、疾患は増殖性疾患である。特定の態様では、疾患はがん、特にＣＤ１９発現がんである。具体的な態様では、がんはＢ細胞がんである。一態様におけるＢ細胞がんは、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病である。他の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。特定の態様において、疾患はループス、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループス腎炎（ＬＮ）である。特定の態様では、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合の抗がん剤又は治療される疾患が自己免疫疾患である場合、免疫抑制剤を個体に投与することをさらに含む。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様において、本発明は、標的細胞、特にＢ細胞などのＣＤ１９発現細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様において、個体における標的細胞、特にＢ細胞などのＣＤ１９発現細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。１つのこのような態様では、方法は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、「個体」は、ヒトである。
当業者であれば、多くの場合に、抗体は治癒を提供せずに部分的な恩恵のみを提供する場合があることを容易に認識する。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化を与える抗体の量は、「有効量」と考えられる。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。
いくつかの態様では、有効量の本発明の抗体が、疾患を治療するために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度、及び個々の対象での適切な用量を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明の抗体は、好適には、患者に一度に又は一連の治療にわたって投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を、例えば、１回又は複数回の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかにかかわらず、患者に投与するための初期の候補投薬量とすることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、症状に応じ、治療は通常、疾患症候の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、投薬量はまた、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重までを含んでいてもよく、又は投与あたり更に多くてもよく、これらから誘導される任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重等が、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１つ又は複数の用量を患者に投与してもよい。そのような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の抗体は、通常、意図した目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の抗体、又はその薬学的組成物が、有効量で投与又は塗布される。
全身投与の場合、有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞インキュベートアッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞インキュベート物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルにおいて製剤化してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定し得る。
初期投与量もまた、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算し得る。
治療効果を維持するために十分な抗体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は個々に調節することができる。注射による投与に有用な通常の患者用量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
本発明の抗体の有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を提供する。抗体の毒性及び治療有効性は、細胞インキュベート物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞インキュベートアッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療的に有効である用量）を決定し得る。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表し得る。大きい治療指数を呈する抗体が好ましい。一態様では、本発明による抗体は、高い治療指数を呈する。細胞インキュベートアッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用し得る。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、様々な要素、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の病状等に応じて、この範囲内で変動し得る。実際の製剤、投与経路及び投薬量は、患者の症状という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５のＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈ．１， ｐ． １を参照されたい）。
本発明の抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ、投与を中止、中断、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には、治療レベルを上げるように調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、治療される病状の重症度、投与経路などによって変わる。症状の重症度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量及びおそらくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答に応じて変化するであろう。
本発明の抗体は、治療において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、かかる治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の疾患に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含むことができる。一部の態様では、追加の治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の態様では、追加の治療薬は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。他の態様では、追加の治療剤は免疫抑制剤である。特定の態様では、追加の治療薬は、コルチコステロイド、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、カルシニューリン阻害剤、ベリムマブ、リツキシマブとオビヌツズマブの群から選択される１つ又は複数である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の因子に依存する。抗体は、通常、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のかかる併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。また、本発明の抗体を、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
Ｇ． 製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）組成物を含む第１の容器を含み、この組成物は本発明の抗体を含み、（ｂ）組成物を含む第２の容器を含み、この組成物は細胞疾患性又は他の治療剤をさらに含む。本発明のこの態様における製造物品は、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示すパッケージ添付文書をさらに含んでいてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得るバッファ、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。これは、他のバッファ、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
Ｈ． 診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のいずれも、生物学的サンプル中のその標的（例えば、ＣＤ３又はＣＤ１９）の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。一部の態様において、生体試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一態様において、診断又は検出の方法における使用のための、本発明による抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＣＤ３又はＣＤ１９の存在を検出する方法が提供される。特定の態様では、この方法は、ＣＤ３又はＣＤ１９への抗体の結合を許容する条件下で生体試料を本発明の抗体と接触させること、及び抗体とＣＤ３又はＣＤ１９との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一態様では、本発明の抗体を使用して、例えば、ＣＤ３及び／又はＣＤ１９が患者選択のためのバイオマーカーである場合、ＣＤ３及び／又はＣＤ１９に結合する抗体による治療に適格な対象を選択する。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、がん、特にＢ細胞がんが含まれる。
一部の態様において、標識された、本発明による抗体が提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、色素体、電子密度の高い、化学発光、及び放射性標識）、及び例えば酵素反応又は分子相互作用によって、間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）が挙げられる。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）などのルシフェラーゼ類、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの糖オキシダーゼ、過酸化水素を使用して、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と結合した、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。
ＩＶ． 実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されてもよいことが理解される。
実施例１－最適化ＣＤ３バインダの生成
既に記載した（例えば、本明細書に参照により組み込まれる、ＷＯ２０１４／１３１７１２を参照されたい）、本明細書で「ＣＤ３ｏｒｉｇ」と呼ばれ、かつそれぞれ配列番号６及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含むＣＤ３バインダから開始して、本発明者等は、重鎖ＣＤＲ３のＫａｂａｔの９７位及び１００位における２つのアスパラギン脱アミド配列モチーフを除去することによって、このバインダの特性を最適化することを目指した。
この目標に対して、本発明者らは、ファージディスプレイに適した、Ｋａｂａｔの９７位と１００位の両方のアスパラギンが除去された重鎖の抗体ライブラリを生成し、更にＡｓｎ９７及びＡｓｎ１００を置き換えることによって引き起こされる親和性の喪失を親和性成熟プロセスを通して補償するためにランダム化されたＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３を生成した。
このライブラリは、マイナーコートタンパク質ｐ３への融合を介して線状ファージに置かれ（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２， ５８１－５９７）、組み換えＣＤ３εへの結合のために選択された。
初期のスクリーニングにおいて１０の候補クローンが特定され、ＳＰＲによってＦａｂ断片（大腸菌内で産生された）として測定された、組み換え抗原上の許容可能な結合を示した。
しかしながら、これらクローンのうち１つだけが、ＩｇＧフォーマットへの変換後、フローサイトメトリによって測定された、ＣＤ３を発現する細胞への許容可能な結合活性を示した。
本明細書で「ＣＤ３ｏｐｔ」と呼ばれ、且つそれぞれ配列番号７及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含む選択されたクローンは、以下で説明されるように、さらに評価され、二重特異性フォーマットに変換された。
実施例２－最適化ＣＤ３バインダのＣＤ３への結合
組み換えＣＤ３への結合
両方ともＦｃ領域内のＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）変異のヒトＩｇＧ１フォーマットである、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とについて（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））、組み換えＣＤ３への結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。
脱アミド部位除去の効果と抗体の安定性へのその効果とを評価するために、元々の最適化ＣＤ３バインダの組み換えＣＤ３への結合を、３７℃又は４０℃の１４日間の温度ストレス後に試験した。－８０℃で保存した試料を参照として使用した。基準試料及び４０℃でストレスを加えられた試料は、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０であり、３７℃でストレスを加えられた試料は、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４であり、すべて濃度１．２～１．３ｍｇ／ｍｌであった。ストレス期間（１４日間）後、更なる分析のために、ＰＢＳ中の試料を透析して２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に戻した。
試料の相対活性濃度（ＲＡＣ）を、以下の通りＳＰＲにより決定した。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われた。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリングケミストリーを用いて、結果として４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化された。実行バッファ及び希釈バッファとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体を、５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。ＣＤ３抗原（以下を参照されたい）は、１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入され、解離は、５μｌ／分の流量で１２０秒間監視された。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１のそれぞれ６０秒間の２つの連続した注入によって再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク制御フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正された。評価のために、結合反応は、注入終了から５秒後に取られた。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合は、抗Ｆａｂ応答（固定化された抗Ｆａｂ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分けられた。相対活性濃度は、各温度ストレスを加えられた試料を、対応するストレスを加えられていない試料に対して参照することにより計算した。
使用された抗原は、ノブ・イントゥ・ホール修飾及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体であった（配列番号４１及び４２を参照されたい）。
この実験の結果を図２に示す。見ることができるように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔは、元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、温度ストレス（３７℃、ｐＨ７．４で２週間）後、ＣＤ３への強く改善された結合を示した。この結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期とともに中性ｐＨでの抗体の製剤に関連して、脱アミド部位除去が成功であったことと、脱アミド部位除去によって優れた安定性特性を有する抗体が得られたことを示している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合
両方ともＦｃ領域内のＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）変異のヒトＩｇＧ１フォーマットである、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とについて（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））、ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、ＦＡＣＳによって決定された。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ＮＦＡＴプロモータを伴うヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株であり、ヒトＣＤ３を発現する。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１× ＮＥＡＡ、１× ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞でインキュベートした。最終濃度であるハイグロマイシンＢ １ｍｌ当たり２００μｇを、細胞を継代するときにはいつでも添加した。
結合アッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳバッファ中で再懸濁した。抗体染色を、９６ウェル丸底プレート内で行った。したがって、１ウェルあたり１００，０００～２００，０００細胞が、播種された。プレートを４分間４００×ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。試験抗体をＦＡＣＳバッファで希釈し、２０μｌの抗体溶液を４℃で３０分間細胞に添加した。未結合抗体を除去するため、細胞をＦＡＣＳバッファで２回洗浄した後、希釈二次抗体（ＰＥ抱合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－１１６－１７０）を添加した。４℃で３０分のインキュベーションの後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定の前に、細胞を２００μｌ ＦＡＣＳバッファ中で再懸濁し、次いでＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ装置を使用してフローサイトメトリによって分析した。
図３に示すように、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良く結合した。
実施例３－最適化されたＣＤ３バインダの機能活性
最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」の機能活性を、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験し、元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」の活性と比較した。ＩｇＧの機能活性を試験するために、ＣＤ３ｏｐｔヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ又はＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡの濃度を増加させながら、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞をＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共インキュベートした。Ｔ細胞架橋のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上のＣＤ３の活性化は、ルシフェラーゼの産生を誘発するのであり、活性化マーカーとして発光を測定することができる。ＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ｗｔが、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞に結合できず、したがってＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に架橋されることができない、陰性対照として含まれていた。アッセイの概略図を図４に示す。
抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する抗体を、その表面上に発現するように操作されているＣＨＯ－Ｋ１細胞である（本明細書に参照により組み込まれる、ＷＯ２０１７／０７２２１０を参照されたい）。これらの細胞は、５％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕＭａｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地でインキュベートされた。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、実施例２で説明されている通りである。
ＣＤ３ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡが、ＣＨＯ上に発現された抗ＰＧＬＡＬＡ及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現されたＣＤ３に同時に結合する際、ＮＦＡＴプロモータが、活性化されて、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞は、懸濁物中で成長するのであり、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎ、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞、ハイグロマイシン１ｍｌあたり２００μｇでインキュベートされた。アッセイのために、ＣＨＯ細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を決定した。平底、白壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ＃６５５０９８）内で、１００μｌ培地に３００００標的細胞／ウェルをプレートし、５０μｌ／ウェルの希釈された抗体又は培地（対照のため）を、ＣＨＯ細胞に添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞培地内でハイグロマイシンＢなしで再懸濁し、６００００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）でＣＨＯ細胞に添加し、最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１、及び１ウェルあたり最終体積２００μｌを得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ１２９１）を、各ウェルに添加した（最終体積の２％）。細胞を、加湿したインキュベータ内において３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを使用して発光を検出した。
図５に示すように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞上で、ＣＤ３ｏｒｉｇとしての架橋の際に類似の活性を有していた。
実施例４－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の生成
実施例１で同定された最適化されたＣＤ３バインダ（「ＣＤ３ｏｐｔ」、配列番号７（ＶＨ）及び１１（ＶＬ））を使用して、ＣＤ３及びＣＤ１９を標的とする、ＣＤ１９結合部分として抗ＣＤ１９抗体２Ｂ１１又は０１８を使用する（それぞれ、配列番号１５～２２又は２８～３５）Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）（「ＣＤ１９－ＴＣＢ」）を生成した。
ＴＣＢ分子の模式図を図６Ａに示し、それらの全配列を配列番号３９、２４、２５及び２７（２Ｂ１１）、並びに配列番号３６、３７、３８及び２７（０１８）に示す。
標的細胞抗原結合部分として上記の抗ＣＤ１９抗体のいずれか、及びＣＤ３バインダとしてＣＤ３ｏｒｉｇを含む対応する分子も調製した（配列番号３９、２４、２５及び２６（２Ｂ１１）、並びに配列番号４０、３７、３８及び２６（０１８））。
図６Ｂ～図６Ｅに示すように、重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。
軽鎖と対応する重鎖との正しい対合を改善するために、ＣＤ１９結合Ｆａｂ分子のヒトＣＬ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）及びヒトＣＨ１（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）に変異を導入した。
重鎖の正しい対合（ヘテロ二量体分子の形成）のために、ノブ・イントゥ・ホール変異を抗体重鎖の定常領域に導入した（それぞれＴ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）。
さらに、Ｆｃγ受容体への結合を消失させるために、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を抗体重鎖の定常領域に導入した。
従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁インキュベート液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａ（スイス国）により、ＴＣＢを調製した。産生のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに、専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。細胞を１：１：２：１（「ベクターノブ重鎖」：「ベクターホール重鎖」：「ベクターＣＤ３軽鎖」：「ベクターＣＤ１９軽鎖」）で対応する発現ベクターでトランスフェクトした。遠心分離及びその後のろ過（０．２μｍフィルタ）によって上清を回収した。
Ｅｖｉｔｒｉａでの調製に代わるものとして、ＴＣＢ分子は、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって社内で調製した。細胞を遠心分離し、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， ＃１０７４３０２９）により培地を置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ，＃２３９６６－１）を加え、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベート後、補充物（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ． Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ． Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）によって細胞上清を採取した。
標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。手短に言えば、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによってろ過された細胞インキュベート上清から精製した（平衡バッファ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５、＃ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィにより、単量体タンパク質から分離した。
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ４， ２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニングバッファ（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌアルギニンモノヒドロクロリド、ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィにより２５℃にて、凝集内容物の測定を実施した。
調製したＴＣＢ分子の生化学的及び生物物理学的分析の結果を表１に示す。
４つのＴＣＢ分子はすべて、高品質で生成できた。
実施例５－表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化された抗ＣＤ３（多重特異性）抗体の機能特性評価
ＳＰＲ実験は、実施例４で調製したＣＤ１９－ＴＣＢ分子を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で、２５℃で、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニングバッファとして用いて行った（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、＃ＢＲ－１００６－６９））。Ａｎｔｉ－Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ）に特異的に結合する抗体、「抗ＰＧ抗体」－本明細書に参照により援用されるＷＯ２０１７／０７２２１０を参照）は、Ｃ１チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でアミンカップリングによって直接固定化された。異なるＴＣＢ分子は２５ｎＭで捕捉された。ＣＤ１９抗原（ヒトＣＤ１９細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－Ｆｃ融合；配列番号４３及び４４を参照）又はＣＤ３抗原（ＣＤ３ε／δ－Ｆｃ融合；実施例２参照、配列番号４１及び４２）を３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上に通過させて会合相を記録した。解離相は、１５００秒（ＣＤ１９抗原）又は８００秒（ＣＤ３抗原）についてモニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋に切り替えることによってトリガーされた。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を６０秒間２回注入することにより、サイクルごとに再生された。バルク屈折率の差は、基準フローセル（捕捉されたＴＣＢなし）で得られた応答を差し引くことによって補正された。親和性定数を、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。測定は、３つの独立した希釈系列で実行された。
１：１ラングミュア結合の動力学的定数は、組換えヒトＣＤ１９（表２）及び組換えヒトＣＤ３（表３）に対する４つの試験済みＴＣＢについて決定された。
異なるバインダは、異なるＴＣＢで同様の親和性を示す。ＣＤ１９バインダ２Ｂ１１のＫＤは、それぞれのＴＣＢで約０．４ｎＭである。ＣＤ１９バインダ０１８は、それぞれのＴＣＢで約１．１ｎＭのＫＤとわずかに低い親和性がある。ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔを有するＴＣＢは、ＣＤ３に匹敵する親和性を有し、ＫＤは約３．４ｎＭである。ＣＤ１９抗原とＣＤ３抗原との相互作用のＫＤは似ているが、反応速度は異なる。ＣＤ１９はＣＤ３よりも解離が遅くなるが、ＣＤ３はＣＤ１９よりも速く結合するため、同様のＫＤ値が得られる。
実施例６－最適化された抗ＣＤ３抗体によるＣＤ１９－ＴＣＢ分子のヒトＣＤ１９及びヒトＣＤ３発現細胞への結合
実施例４で調製したＣＤ１９－ＴＣＢ分子のヒトＣＤ１９及びＣＤ３発現標的細胞への結合を試験した。ＣＤ１９発現レベルが異なる２つのＣＤ１９発現細胞株を使用した。Ｎａｌｍ－６、ＣＤ１９発現が高い急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株、及び平均発現レベルのＺ－１３８（マントル細胞リンパ腫）。不死化Ｔリンパ球株（Ｊｕｒｋａｔ細胞株）を用いてＣＤ３結合を評価した。簡単に説明すると、細胞を回収し、計数し、生存率をチェックし、ＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウム）に１ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（０．１ｘ１０６細胞を含む）を丸底９６ウェルプレートで４℃で３０分間インキュベートし、ＣＤ１９－ＴＣＢ分子（Ｊｕｒｋａｔ細胞では２００ｎＭ－０．０５ｎＭ；２００ｎＭ－Ｚ－１２８及びＮａｌｍ－６細胞で０．０００２ｎＭ）の濃度を増加させ、冷ＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ ＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃でさらに３０分間再インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、すぐにＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ １０．５．３）を使用してＦＡＣＳで分析した。結合曲線と結合に関連するＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して計算された。
結果を、図７及び表４と及び表５に示す。ＣＤ３バインダとしてＣＤ３ｏｐｔを含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子は、ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含む分子に匹敵する（又はわずかに優れた）ＣＤ３結合を示す（図７Ａ及び表４）。
ＣＤ１９－ＴＣＢ分子（ＣＤ１９バインダとして２Ｂ１１又は０１８のいずれかを含む）は、ＣＤ１９発現細胞に匹敵する結合を示す（図７Ｂ、図７Ｃ、及び表５）。Ｚ－１３８細胞の場合、結合曲線が飽和に達しなかったため、ＥＣ５０値を計算できなかった。
実施例７－最適化された抗ＣＤ３抗体を含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子によって誘発される腫瘍細胞の溶解とＴ細胞の活性化
実施例４で調製したＣＤ１９－ＴＣＢ分子によって媒介されるＣＤ１９発現腫瘍細胞の溶解及びその後のＴ細胞活性化を、Ｎａｌｍ－６細胞（ＡＬＬ）とＺ－１３８細胞（マントル細胞リンパ腫）で評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクタとして使用し、様々なＴＣＢ分子との２０時間のインキュベートで腫瘍溶解を検出した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーから得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）の組織不透過性密度遠心分離によって調製した。新鮮血を、不稔ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）に積層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断無し、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離し（３５０×ｇ、１０分、室温）、上清を捨て、ＰＢＭＣペレットを赤血球溶解溶液中、３７℃で５分間インキュベートした後、不稔ＰＢＳ（遠心分離３００×ｇ、１０分）で洗浄した。得られたＰＢＭＣ集団をＰＢＳに再懸濁し、自動的にカウントした（ＶｉＣｅｌｌ）。サイロバイアル当たり５０ｍｉｏのＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ２６５０）を含む１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃２１８７００７６）で凍結した。ＰＢＭＣをアッセイの日に解凍し、自動的に再度カウントした（ＶｉＣｅｌｌ）。必要な量を不稔ＰＢＳで１回洗浄した。製造元の指示に従って、ＣＤ２０マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－０９１－１０４）を使用してＢ細胞の枯渇を実行した。Ｂ細胞枯渇ＰＢＭＣを計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
殺傷アッセイのために、０．２５ｍｉｏのＢ細胞枯渇ＰＢＭＣをＵ底９６ウェルプレートに添加した。簡単に言えば、標的細胞を回収し、洗浄し、５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、最終的なエフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比を５：１とした。ＴＣＢ分子は、示された濃度（０．０２ｐＭ～１０００ｐＭの範囲、３倍）で添加された。ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）は、すでにアッセイで直接染色されている（ＰＥ抗ヒトＣＤ１０７ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３２８６０８）。
腫瘍細胞溶解を、３７℃、５％ＣＯ２での２０時間のインキュベート後に、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清内に放出されたＬＤＨの定量化により評価した（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトを有しないエフェクタ細胞と共インキュベートした標的細胞を基準とする。
腫瘍細胞の溶解時に発生するＴ細胞の活性化を評価するために、ＰＢＭＣを４００ｘｇで４分間遠心分離し、ＦＡＣＳバッファで２回洗浄した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、生死染色を行った（Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２３１０２、室温で２０分）。最初にＰＢＳで、続いてＦＡＣＳバッファで繰り返し洗浄した後、ＣＤ３（ＰＥ－Ｃｙ５抗ヒトＣＤ３；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、＃５５５３４１）、ＣＤ４（ＢＶ６０５抗ヒトＣＤ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１７４３８）、ＣＤ８（ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０１０４４）、ＣＤ２５（ＰＥ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ２５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０２６１２）及びＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３１０９３０）の表面染色を、製造元の指示に従って行った。細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、１２０μｌ／ウェルの１×溶解液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃３４９２０２）で固定した。試料は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦｌｏｗＪｏ １０．５．３）で分析した。
図８は、ＣＤ１９－ＴＣＢ分子がＣＤ１９＋標的細胞の標的特異的な死滅を誘発したことを示している。４つの異なるＣＤ１９－ＴＣＢ分子は、ＣＤ１９発現腫瘍細胞の溶解の誘導において全体的に同等であった。図９と図１０は、ＣＤ３ｏｒｉｇバインダを含む分子と比較した、ＣＤ３ｏｐｔバインダを含むＣＤ１９－ＴＣＢは、腫瘍死滅後のＴ細胞活性化のわずかに優れた誘誘発を示している（Ｎａｌｍ－６又はＺ－１３８標的細胞の死滅時のＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞でのＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ１０７発現）。ＣＤ１９バインダ２Ｂ１１及び０１８のＴ細胞活性化に対する効果は観察されなかった。
実施例８－最適化された抗ＣＤ３抗体によるＣＤ１９－ＴＣＢ分子の熱安定性の測定
最適化された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｐｔ（及びＣＤ１９バインダ２Ｂ１１、実施例４参照）を含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子の熱安定性は、Ｕｎｃｌｅシステム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ， ＵＳ）を使用して温度ランプを適用して静的光散乱（ＳＬＳ）によって監視された。
タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌのろ過済みタンパク質試料９μｌをＵｎｃｌｅデバイスに適用した。温度を０．１℃／分で３０から９０℃まで上昇させ、２６６ｎｍでの散乱強度を収集した。
結果を図９に示す。
実施例９－ストレス後の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による最適化された抗ＣＤ３抗体によるＣＤ１９－ＴＣＢ分子の特徴付け
脱アミド部位除去の効果と抗体の安定性への影響を確認するために、最適化された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｐｔ（及びＣＤ１９バインダ２Ｂ１１、実施例４参照）を含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子を、３７℃、ｐＨ７．４及び４０℃、ｐＨ６で１４日間インキュベートし、ヒトＣＤ３ε／δへの結合能力についてＳＰＲによってさらに分析した。－８０℃、ｐＨ６で保存した試料を参照として使用した。基準試料及び４０℃でストレスを加えられた試料は、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０であり、３７℃でストレスを加えられた試料は、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４であり、すべて濃度１．０ｍｇ／ｍｌであった。ストレス期間（１４日間）後、更なる分析のために、ＰＢＳ中の試料を透析して２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に戻した。
すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で、ランニングバッファ及び希釈バッファとしてＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いて行った。ビオチン化ヒトＣＤ３ε／δ（実施例２、配列番号４１及び４２を参照のされたい）、並びにビオチン化抗ｈｕＩｇＧ（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃７１０３２６２１００）を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２９１０４９９２）に固定化し、少なくとも１０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。濃度２μｇ／ｍｌのＴＣＢを流速５μｌ／分で３０秒間注入し、解離を１２０秒間監視した。表面は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を６０秒間注入することによって再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランクコントロールフローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。評価のために、注入終了５秒後の結合応答を取得した。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合は、抗ｈｕＩｇＧ応答（固定化された抗ｈｕＩｇＧ抗体上でのＴＣＢの捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分けられた。相対的結合活性は、各温度ストレス負荷サンプルを対応する非ストレス負荷サンプルと参照することによって計算した。
表１０に示すように、最適化された抗ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを含むＣＤ１９－ＴＣＢのＣＤ３ε／δへの結合は、本質的にストレスの影響を受けず、ＣＤ３バインダ自体の結果と一致している（実施例２）。
実施例１０－最適化された抗ＣＤ３抗体を用いたＣＤ１９－ＴＣＢ分子によって誘導されるｉｎ ｖｉｖｏＢ細胞枯渇及びサイトカイン放出
最適化された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｐｔと２Ｂ１１ＣＤ１９バインダを含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子の有効性と安全性プロファイルを理解するために、ヒト化ＮＳＧマウスにおける末梢Ｂ細胞の枯渇とサイトカイン放出を評価するｉｎ ｖｉｖｏ作用機序研究を実施した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＺＨ２２３－１７）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる治療群に無作為に分けられた。無作為化の後、過剰なサイトカインの放出を防ぐ手段として、３つのグループのマウスをオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ（登録商標））（３０ｍｇ／ｋｇ）で１回前処理した。
この前処置の７日後の０日目に、すべてのグループに異なる用量のＣＤ１９－ＴＣＢ、ＣＤ２０－ＴＣＢ（ＣＤ２０を標的とし、ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢ）、又はビヒクルを投与した。３つの異なる用量（０．５、０．１５、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ）のＣＤ１９－ＴＣＢを注射した。Ｇａｚｙｖａ（登録商標）前処理ありとなしのＣＤ２０－ＴＣＢ（０．１５ｍｇ／ｋｇ）を比較剤として使用した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。グループごとに３匹のマウスから、治療後４時間、２４時間、及び７２時間で採血した（０日目）。
研究設計を図１１に示し、研究グループを表１１にまとめる。
終了時（３日目）に、マウスを屠殺し、脾臓、リンパ節（ＬＮ）、及び骨髄（ＢＭ）を採取し、重量を測定し、その後のＦＡＣＳ分析のためにリベラーゼ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化によって単細胞懸濁液を調製した。脾臓の単一細胞とすべての血液試料をヒトＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０で染色し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した。さらに、３つの出血時点からの血清を、マルチプレックス分析によってサイトカイン含有量について分析した。
図１２は、治療グループの体重変化（％）を示している。ＣＤ１９－ＴＣＢ分子は、ＣＤ２０－ＴＣＢ治療と比較して、より少ない体重減少を誘発した。この体重減少は、使用した用量とは無関係であった。さらに、治療を受けた動物の血清中のサイトカイン分析により、ＣＤ２０－ＴＣＢ分子による治療の４時間後にサイトカインレベルの上昇のピークが明らかになった（これは、Ｇａｚｙｖａ（登録商標）（ＧＰＴ）による前処理によって減少する可能性がある）一方で、ＣＤ１９－ＴＣＢ分子では低レベルのサイトカインしか検出されなかった（図１３）。
血液中のＢ細胞枯渇の動態に関するＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータ（図１４）は、ＣＤ１９－ＴＣＢによる経時的なＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｂ細胞の強力な枯渇（ＣＤ１９＋又はＣＤ２０＋細胞／μｌ血液の平均数＋／－ＳＥＭ）を明らかにし、用量依存性を示唆した。このＢ細胞枯渇効果は、ＣＤ２０－ＴＣＢと同程度に強力なＣＤ１９－ＴＣＢで処理して７２時間後に分析したすべてのリンパ器官でも見られた（データは示していない。）。
実施例１１－最適化された抗ＣＤ３抗体を用いたＣＤ１９－ＴＣＢ分子によるマウス異種移植実験における腫瘍増殖制御
最適化された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ｏｐｔと２Ｂ１１ＣＤ１９バインダを含むＣＤ１９－ＴＣＢ分子の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ヒト化ＮＳＧマウスに、Ｒ－ＣＨＯＰ治療を再発した患者由来のＣＤ１９＋リンパ腫患者由来異種移植片（ＰＤＸ）細胞を移植した。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で、マウスを腫瘍サイズに基づいて８匹のグループに無作為化した。次に、図１５に示すように、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９－ＴＣＢ又はビヒクルを毎週注射した（静脈内）。腫瘍増殖に対するＣＤ１９－ＴＣＢの効果を評価するために、腫瘍体積を、週に２回又は３回のキャリパー測定から計算した。
その結果、毎週の治療ＣＤ１９－ＴＣＢは、ビヒクルによる治療と比較して、有意な腫瘍増殖制御を発揮した（図１６）。このデータは、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９－ＴＣＢによる週１回の投与がリンパ腫ＰＤＸ保有ｈｕＮＳＧマウスで有効であることを示しており、Ｒ－ＣＨＯＰ治療を再発したリンパ腫患者がＣＤ１９－ＴＣＢ治療の恩恵を受ける可能性があることを示唆している。
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (49)

  1. ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体であって、
    （ａ）配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと
    を含み、
    第１及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、抗体。
  2. ＣＤ１９に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項２に記載の抗体。
  4. 第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置換されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置換されている、請求項５に記載の抗体。
  7. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 第２及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸は独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸は独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸は独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 第１及び第２の抗原結合ドメインが、ペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 第１、第２、及び存在する場合に第３の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、抗体が第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され且つ第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され且つ第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 第１、第２及び第３の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとからなり、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項１０に記載の抗体。
  12. Ｆｃドメインを含み、当該ドメインがＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項４から１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の抗体。
  14. Ｆｃドメインを含み、当該ドメインがヒトＦｃドメインである、請求項４から１３のいずれか一項に記載の抗体。
  15. Ｆｃドメインを含み、当該ドメインがヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項４から１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項４から１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置することが可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能である、請求項４から１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項４から１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. （ａ）Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、３６６位のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、且つ３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）；及び／又は
    （ｂ）Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、且つＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１８に記載の抗体。
  20. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクタ機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項４から１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃが、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項４から２０のいずれか一項に記載の抗体。
  22. Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、請求項４から２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 第２及び存在する場合に、ＣＤ１９に結合する第３の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含むか、又は
    （ｉｉ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、及び配列番号３０のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ１、配列番号３３のＬＣＤＲ２及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 第２及び存在する場合に、ＣＤ１９に結合する第３の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又は
    （ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項２３に記載の抗体。
  25. ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、
    ｂ）ＣＤ１９に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
    ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含み、
    ここで、
    ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
    そしてさらに、
    ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
  26. ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられており（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、さらに、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、且つ３２９位のプロリン残基がグリシン残基で置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項２５に記載の抗体。
  27. 配列番号３９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つのポリペプチド、及び配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  29. 請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  30. （ａ）抗体の発現に適した条件下で請求項２９に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体を産生する方法。
  31. （ｂ）抗体を回収する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 請求項３０又は３１に記載の方法によって産生される、ＣＤ３及びＣＤ１９に結合する抗体。
  33. 請求項１から２７又は３２のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  34. 医薬として使用するための、請求項１から２７又は３２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３３に記載の薬学的組成物。
  35. 疾患の治療に使用するための、請求項１から２７又は３２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３３に記載の薬学的組成物。
  36. 疾患が、がん又は自己免疫疾患である、請求項３５に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  37. がんが、（ｉ）ＣＤ１９発現がん、及び／又は（ｉｉ）Ｂ細胞がんである、請求項３６に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  38. がんが、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である、請求項３６又は３７に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  39. がんが、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  40. 自己免疫疾患が、ループスである、請求項３６に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  41. 自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループス腎炎（ＬＮ）である、請求項３６又は４０に記載の使用のための抗体又は薬学的組成物。
  42. 請求項１から２７又は３２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３３に記載の薬学的組成物の、医薬の製造における使用。
  43. 請求項１から２７又は３２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項３３に記載の薬学的組成物の、疾患の治療のための医薬の製造における使用。
  44. 疾患が、がん又は自己免疫疾患である、請求項４３に記載の使用。
  45. がんが、（ｉ）ＣＤ１９発現がん、及び／又は（ｉｉ）Ｂ細胞がんである、請求項４４に記載の使用。
  46. がんが、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である、請求項４４又は４５に記載の使用。
  47. がんが、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病である、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の使用。
  48. 自己免疫疾患が、ループスである、請求項４４に記載の使用。
  49. 自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループス腎炎（ＬＮ）である、請求項４４又は４８に記載の使用。
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