JPH01104199A - 酒類中の尿素定量用キットおよび尿素の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 灸１上Δ秤肛立」 本発明は酒類中の尿素定量分析用キットならびに尿素の
簡易定量法に関するものである。

従来の技術 尿素の定量は、尿素をアンモニアに分解して定量するか
あるいは尿素を直接定量すること等により行なうことが
できる。前者は尿素をウレアーゼによりアンモニアに分
解し、生成したアンモニアと２−オキソグルタレイトを
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）とグルタミン酸脱水素酵素（Ｇ　Ｌ　Ｄ　Ｈ）の存
在下で還元的アミノ化反応によりし一グルタメイトとし
、この時減少するＮＡＤＨを波長３４０ｎｍの吸光度か
ら求めることにより定量する方法（ウレアーゼ・ＵＶ法
）である。後者はジアセチルモノオキシムおよびチオセ
ミカルバジドを溶解した試薬に試料を加え、沸とう水浴
中で２５分加熱し波長５３０ｎｍ付近で比色定量する方
法（ジアセチルモノオキシム法）である。

発明が解決しようとする課題 清酒、ビール、老酒、ワイン等の酒類中に尿素が多く含
−まれでいると、酒に苦味を与え、また加熱殺菌や長期
保存により着色が増加したり、香味の劣化を引きおこす
原因となる。従って、酒類中の尿素の生成防止あるいは
生成後の尿素を除去するミとが品質改良の上から重要で
ある。このことと関連して、酒類に含まれる尿素量を精
度よく簡易に測定する方法の開発が望まれている。

尿素の定量法としては前記のような各方法が挙げられて
いるが、いずれも操作が繁雑であり、また分光光度計や
恒温槽などの機器が必要であることから、酒類の製造工
程現場等において工程管理や品質検査の目的で簡易に利
用し難い面がある。

課題を解決するための手段 上記のような状況に鑑み、本発明者らは酒類中の尿素定
量法について種々検討した結果、酒類中の尿素をウレア
ーゼで分解し生成するアンモニアを定量する方法が本目
的に適した方法であることを見出した。さらに試料とな
る酒類を予め強酸性型陽イオン交換樹脂で処理した後に
ウレアーゼを作用させ、次いでインドフェノール法で発
色させると、目視によっても比色定量が十分に可能であ
ることを知った。本発明はこれらの知見に基づいて、さ
らに検討を進めて完成したらのである。

すなわち、本発明は（＋）　　ウレアーゼを組み込んで
なる酒類中の尿素定量用キット、（２）強酸性型陽イオ
ン交換樹脂および該樹脂に酒類を接触させるための容器
を組み込んでなる上記第（１）項記載の尿素定量用キッ
ト、（３）インドフェノール発色試薬を組み込んでなる
上記第（２）項記載の尿素定量用キット、および（４）
酒類を強酸性型陽イオン交換樹脂で処理し、その処理液
にウレアーゼを作用させて生成するアンモニアをインド
フェノール法により定量することを特徴とする酒類中の
尿素の定量法である。

本発明で用いるウレアーゼは尿素１モルと水１モルから
、アンモニア２モルと炭酸ガス１モルを生成する作用を
有するものであればよい。とりわけ、その活性の至適ｐ
Ｈが２〜５．５にあるもの（以下、酸性ウレアーゼとい
う）が好適に用いられる。

本酸性ウレアーゼは、通常、酸性ウレアーゼを産生ずる
能力を有する微生物菌株を培養して生産される。酸性ウ
レアーゼを産生ずる微生物菌株としては、いわゆる「乳
酸菌」と呼ばれる種類の細菌がよく、例えば、ラクトバ
チルス属の細菌があげられる。その代表例として、ラク
トバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リウ
テリイ（Ｌａｃｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒ
ｉ）あるいはラクトバチルス・ルミニス（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｕｍｉｎｉｓ）など
が好んで用いられるが、菌株はとくに限定されるもので
はなく、新たに、乳製品、土壌、酸敗食品、動物の臓器
や排泄物等から分離した株であっても、酸性ウレアーゼ
を産生ずる能力を有するものであれば差しつかえない。

またそれらの菌株に紫外線照射や変異剤処理を施して、
人為的に変異を誘起させた株や、当該酸性ウレアーゼ活
性の発現に必要な遺伝子断片を人為的にとり出し、それ
を組み入れた他の微生物菌体であっても、本発明の方法
に使用できる。

酸性ウレアーゼを産生ずる菌株の具体例としては、ラク
トバチルス・ファーメンタムＪＣＭ５８６７（ＩＦＯ１
４５１１，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８９９０）、ラクトバチル
ス・ファーメンタムＪＣＭ　　５８６８（ＩＦＯ１４５
１２，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８９９１）、ラクトバチルス・
ファーメンタムＪＣＭ　　５８６９（ＩＦＯ１４５１３
，ＦＥＲＭＰ−８９９２）、ラクトバチルス・リウテリ
イＵＭ−１２（ＩＦｏ　　１４６２９．ＦＥＲＭ　　Ｐ
−９４５６）、ラクトバチルス・リウテリイ　ＵＭ〜１
８（ＩＦ’０　１４６３０．ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４５７
）、ラクトバチルス・ルウテリイＲｔ−５（ＩＦＯ１４
６３１，ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４５８）、ラクトバチルス
・ルミニスＰＧ−９８（１ＦＯ１４６３２、ＦＥＲＭ　
　Ｐ−９４５９）などがあげられる。

上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所における受託
番号を、またＦＥＲＭ　　Ｐ番号は通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）における受託番号を
それぞれ示す。上記の菌株のうち、ラクトバチルス・フ
ァーメンタム　ＪＣＭ５８６７、ＪＣＭ　　５８６８お
よびＪＣＭ５８６９は財団法人発酵研究所発行の［リサ
ーチ・コミュニイケーション（ＲＥＳＥＲＣＩＩ　ＣＯ
ＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ；Ｎｏ、　Ｉ　３　、第９４頁
、１９８７ヨに掲載されている公知菌株である。その他
の各菌株はＦＲＩに１９８７年７月７日に寄託さ゛れで
いる。

なお、上記の各微生物のＦＲＩへの寄託はブタペスト条
約に基づく寄託に切り替えられて、次のこれらの微生物
菌株を培養して酸性ウレアーゼを生成させるには、通常
の静置培養、振盪培養、通気攪拌培養あるいは固体培養
などにより、連続的あるいは間歇的に行なうことができ
る。用いる１　　培地は、使用されろ微生物の生育しう
ろ通常の組成のものでよく、炭素源としては、炭水化物
、油脂、脂肪酸、あるいはアルコール類などの中から資
化しうるらのを適宜選択し、単独または混合して使用さ
れる。また窒素源としては、例えば、ペプトン、大豆粉
、綿実粉、コーンスチーブリカー、酵母エキス、肉エキ
ス、麦芽エキス、ホエー等の有機窒素源のほか、硫安、
塩安、硝安、燐安等の無機窒素源が、必要に応じて、適
宜混合して、または単独で用いられる。培地には炭素源
、窒素源のほか、生育に必要なミネラル、アミノ酸ある
いはヒタミンなどの生育必須因子や生育促進物質を添加
するのがよい。さらに酸性ウレアーゼの生成を誘導する
ためにカルバミド、チオ尿素等を添加すること゛　らあ
る。培養中のｌ）Ｈおよび泡の管理の目的で苛性アルカ
リ液、炭酸ナトリウム液、カルシウム塩瀬を適宜補添し
たり、消泡剤の添加も有効である。

培養の温度は、用いる微生物の生育に敵した温度を選択
すればよく、通常１５°Ｃ〜５０℃、好ましくは２５℃
〜４０℃で培養するのが有利である。

また培養の時間は、該閑の生育および酸性ウレアーゼの
生成に十分な時間続行されるが、通常５〜５０時間を要
する。

このようにして培養後、酸性ウレアーゼは、通常、微生
物菌体に含有されている。そこで、培養液から遠心分離
、沈降分離、凝集分離、多孔性膜やセラミックによるろ
過などの方法によって集菌された生菌体を、そのまま、
もしくは凍結乾燥、噴霧乾燥、アセトン乾燥などの手段
を用いて乾燥菌体にして、酸性ウレアーゼ粗酵素として
得ることができる。さらには菌体を凍結融解処理、磨砕
処理、超音波処理、浸透圧処理、リゾチーム処理、界面
活性剤処理などの方法を単独もしくは組合わせて行なう
ことによって、該酵素を可溶化し、プロタミン処理、塩
析、有機溶媒処理、等電点沈澱、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、ケルろ過、アフィニティークロマ
トグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段により
精製して本発明方法に使用される。本発明においては、
酸性ウレアーゼの比活性が約２０Ｕ／ｍｇ以上のものが
使用される。

ここでいう、ウレアーゼ活性は、３７℃、ｐＨ４，０に
おいて次のように測定した。適宜に希釈した酵素液２ｄ
を３７℃で正確に５分間加温する。

この液に３７℃に加温した基質溶液２滅を加えて振りま
ぜ、３７℃で正確に３０分間反応させる。

反応終了後、直ちに１０％トリクロル酢酸４ｄを加え、
振りまぜた後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、　５分間
）し、その上清液２滅をとり水を加えて２０滅とする。

この液４−に、発色液Ａ液を２−加え、静かに混和する
。続いて発色液Ｂ液を２滅加え、同様に静かに混和した
後、３７℃で３０分間反応させる。次に、室温で、６４
０ｎｍの吸光度を、水を対照液として測定する。

一方、上記酵素液２ｄに基質溶液のがわりに、０．２Ｍ
クエン酸バッファー２ｄを加えて振りまぜ、３７℃で正
確に３０分間反応させた液について、上記と同様に操作
し酵素液空試験とする。

また、硫酸アンモニウム標準液（５０μｇ／ｄ）２滅、
１０％トリクロル酢酸１ｄおよび０．２Ｍクエン酸バッ
ファー０．５滅をとり、水を加えて２０滅とし、この液
について上記と同様に発色操作し標準液とする。また、
１０％トリクロル酢酸ｌｄ、および０．２Ｍクエン酸バ
ッファー０．５ｄをとり、水を加えて２０滅とし、同様
に発色操作し標準液の空試験とする。

次式により、酵素活性を算出する。

なお、１分間当り１μｍｏｌのＮＨ，を生成する酵素量
を１単位（Ｕ）とする。上記測定法中の試薬および試液
の調製法は以下のとおりである。基質溶液は尿素１．０
ｇを０．２Ｍクエン酸バッファーに溶解し、１００ｄと
する。１０％トリクロル酢酸溶液はトリクロル酢酸１０
ｇを水に溶解し、１００ｄとする。発色液Ａ液（フェノ
ール・ニド　　　□ロプルシッドナトリウム溶液）はフ
ェノール５ｇおよびニトロプルジッドナトリウム２５ｍ
ｇを水に溶解し、５００ｄとする。発色液ＢｔＬ（アル
カリ性次亜塩素酸ソーダ溶液）は水酸化ナトリウム５．
０ｇおよび次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度５
％）７．５ｄを水に溶解し、５００成とする。

０．２Ｍクエン酸バッファーはクエン酸（１水塩）２５
．１８ｇ、およびクエン酸ナトリウム（２水塩）２３．
５９ｇを水に溶解し、１０００ｄとする（ｐＨ・１．０
になる。）。硫酸アンモニウム標準液（５０ｇｇ／７ｎ
１．）は硫酸アンモニウム２５０．０ｍｇを正確にとり
、水に溶解して２５０成とする。この液５戒をとり水を
加えて１００ｄとする。

本発明の尿素定量法を適用する酒類は特に限定されず、
尿素を含有する酒類に広く適用できる。

たとえば、清酒、老酒、ビール、ワイン等の醸造酒、ウ
ィスキー、ブランデー、焼酎などの蒸留酒、味醗などの
調味料酒などが挙げられ、これらの製造工程中の各種試
料および製品に含まれる尿素量の測定に用いることがで
きる。

本発明は酒類中の尿素を定量する際に、該尿素　　′を
ウレアーゼにより分解して生成するアンモニアを定量す
ることにより行なわれる。

このアンモニアの定量は、たとえばアルカリ性下でニト
ロプルジッドナトリウムを反応促進剤としてフェノール
、次亜塩素酸ナトリウムと反応させ、インドフェノール
（青色）を生成させて測定す　　。

る方法（ウレアーゼ・インドフェノール法）や前述のウ
レアーゼ・ＵＶ法によって実施できる。ウレ　　′アー
ゼ・インドフェノール法を採用すると、後述　　・する
ように尿素定量が簡易に実施できる点において有利であ
る。

ウレアーゼ・インドフェノール法は、試料にウレアーゼ
を作用させた後インドフェノール発色試薬を加え、発色
後の可視部の吸光値からウレアーゼを作用させない場合
の吸光値すなわち空試験値を差し引いた値を求めて、こ
の値を標準液での同様の操作により求めた検量線から読
みとり尿素を定量する。醸造酒ではこの空試験値が特に
大きく、清酒、老酒、ワインでは測定しようとする尿素
由来の発色の１０〜２０倍となる場合もある。希釈すれ
ばこの空試験値は小さくなるが、吸光度測定による比色
定量においても感度上の問題から定量の精度が悪くなり
、又尿素含有型が低い酒類の場合は実際上測定できなく
なる。従って本発明の目的とする呈色強度の比較判定が
可能となるには空試験値をできるだけ低くする必要があ
る。

一方、酒類にはインドフェノール反応発色阻害物質が多
く含まれている。希釈度を上げれば、この発色阻害物質
の影響をなくすることができる。

しかし、このためには、例えば清酒では約１００倍の希
釈が必要となるが、清酒に含まれる尿素は通常ｌＯ〜３
０ｐｐｍであり、このように希釈度を高くするとインド
フェノール法での検出限界をこえるため、実際には希釈
度に限界がある。

そこで本発明者らは酒類に含まれるインドフェノール反
応呈色物質と同時に発色阻害物質を除去すれば、呈色強
度の比較判定が可能となり、しかもその際発色阻害もな
く分析精度が向上すると考え、これら物質の除去方法に
つき種々検討した。

その結果、酒類を強酸性型陽イオン交換樹脂（以下、単
に樹脂と称することがある）であらかじめ処理すること
により上記の目的を有利に達しうろことを見い出した。

以下、この点について説明する。

強酸性型陽イオン交換樹脂はその再生型によりＮａ型、
Ｋ型あるいはＨ型等に分けられるが、本発明においては
原則的にいずれも使用することが可能である。通常、試
料となる酒類中に含まれる尿素量、インドフェノール反
応呈色物質あるいは発色阻害物質の量を考慮することに
よって、より好ましい樹脂を選択することができる。た
とえばインドフェノール反応呈色物質および発色阻害物
質の比較的少ない酒類の場合は、Ｎａ型あるいはに型を
好ましく使用できる。また、インドフェノール反応呈色
物質および発色阻害物質が比較的多い酒類の場合は、Ｈ
型樹脂を使用するのが適当である。一般に、Ｎａ型およ
びに型は尿素の吸着は少ないが、インドフェノール反応
呈色物質および発色阻害物質の除去率がやや少ない傾向
があり、Ｉ（型はこの反対の傾向がある。また樹脂の粒
度や架橋度についても、酒類中のインドフェノール反応
呈色物質および発色阻害物質をなるべく多く除去し、尿
素量の吸着量ができるだけ少なくなるように選択すれば
よい。たとえば、粒度が約３０〜１２００μ、架橋度が
１−１２程度のものを用いることができる。

強酸性型陽イオン交換樹脂は、上記のように再生型によ
ってその性質が若干界なることから、本発明においては
それぞれの特徴を生かしてＮａ型および（または）Ｋ型
と■］型を混合して用いるのが実用的に有利である。こ
のｍ比は樹脂の粒度、架橋度等によっても異なるが、た
とえばＮａ型および（または）Ｋ型を５０〜９０重量％
とＨ型を５０〜ＩＯ重量％の割合で混合したものが好ま
しく用いられる。さらに好ましくはＮａ型および（また
は）Ｋ型を５０〜８０重量％とＨ型を５０〜２０重量％
の混合割合である。

本発明において使用し得る強酸性型陽イオン交換樹脂の
具体例としては、三菱化成工業社製のダイヤイオンＳＫ
　Ｉ　Ｏ２，１０４，１０６，Ｉ　Ｂ。

１１０．１１２，１　１６．ＰＫ２０４，２０８，２１
２．２１６，２２０，２２４，２２８．ダウ・ケミカル
社製のダウエックス　５０Ｗ−Ｘｌ、Ｘ２．Ｘ４゜Ｘ８
．ＸＩＯ，Ｘ１２．Ｘ１６あるいはローム・アンド・ハ
ース社のアンバーライト　ＩＲ−１１２゜１１８．１２
０，１２０Ｂ、１２２，１２４などがあげられる。

次に、樹脂の使用量はインドフェノール反応時の空試験
での青色呈色をなくするための最小量で使用するのが最
も良い。たとえば、ダイヤイオン５Ｋ１０２でＮａ型７
５％、Ｈ型２５％を併用した場合、酒類１−に対し清酒
、ビールでは約１ｇ、白ワインでは約１．２ｇ、老酒で
は約２ｇの使用量で上記の目的が達せられる。

酒類を強酸性型陽イオン交換樹脂で処理する方法は、通
常の樹脂による処理方法、たとえばカラム方式あるいは
バッチ式の接触方法を採用し得る。

キットとして使用する場□合は、酒類と樹脂を適宜の容
器中で混和するバッチ式の方が簡便である。

混和は約ｌＯ秒程度振りまぜるだけで充分である。

この場合の容器は、試験管、ビー力、フラスコなどの適
宜の容量のものを使用すればよく、キットに組み込む場
合は、樹脂の必要量を予じめ秤取しておく方が操作が簡
便である。

なお、尿素の樹脂への吸着ができるだけ少ない方が好ま
しいことは当然であるが、その吸着量は使用する樹脂の
条件が決まれば尿素濃度と比例関係にあるため定量性は
保たれる。たとえば、ダイヤイオン５Ｋ−１０２（Ｎａ
型７５％、Ｈ型２５％）を酒類１滅に対しＩｇをバッチ
式で処理した場合の樹脂への吸着量は９％であり、さら
に粒度の小さいダウエックス５０Ｗ−Ｘ２．粒度１５０
〜３００μ（Ｎａ型＝Ｈ型＝７５：２５）では５％であ
るが、標準試料で補正できるためこの程度の吸着量は本
発明の目的上支障とはならない。

従って、酒類を以上述べた適正な条件の樹脂を使用して
処理することにより、インドフェノール反応時の空試験
での青色呈色がなくなるため、呈色強度の比較判定が可
能となることはもちろん、分光光度計による吸光度測定
においても精度が向上する。又、発色阻害も少なくなる
ため、酒類の希釈度を下げることができ、従って検出限
界濃度も下がる。さらに尿素の樹脂への吸着も最小限に
することが可能となり精度が向上する。

酒類に樹脂を添加して樹脂処理した液から樹脂を静置（
約ｌＯ秒モよい）等により樹脂を取り除いた液（以下、
処理液ということがある）は以後のウレアーゼ・インド
フェノール反応に供せられる。

この場合、比較判定のできる呈色強度となるように、必
要に応じて希釈される。この呈色強度の比較判定には、
インドフェノール反応液での尿素濃度を約０．０３〜２
ｐｐｍ、好ましくは０　、２〜２１）ｐＩ＋１とするの
が適当である。

本発明において酒類を樹脂により処理する方法を、通常
尿素１０〜３０ｐｐｍを含む清酒を例にあげ具体的に記
載する。強酸性型陽イオン交換樹脂Ｉｇ（ダイヤイオン
５Ｋ１０２．Ｎａ型再生＝Ｈ型再生＝７５：２５）に清
酒１ｄを加え約１０秒間振り混ぜた後、水を加えて１０
ｄとする。よく混合後静置して上澄液をとり、処理液と
して以後の反応を行う。ここで樹脂に清酒を加える萌に
あらかじめ酒類を希釈して、全量樹脂処理してもよいか
、少ない液量で樹脂と接触する方がインドフェノール反
応呈色物質および発色阻害物質の樹脂への吸着が短時間
で行なわれるため好ましい。従って希釈度を変えるには
加える水の量で調節する。なお、静置により処理液をう
るには液量として最小的３ｄが必要である。

次に、この処理液にウレアーゼを加え、尿素を分解する
。このときの反応は、ウレアーゼとしては尿素分解力が
約２〜１００Ｕ／ｄのらのを使用し、反応温度は約１０
〜７５℃、好ましくは１５〜５０°Ｃ，ｐＨ２〜６．好
ましくは３〜５で反応時間約１〜６０分間で実施できる
。通常、処理液ｌ戒に対し、尿素分解力２５Ｕ／−の酵
素液０．１戒を加える。この場合、１５℃では１２分、
２５℃では９分で反応は完了し、又、それぞれ６分。

４分で９５％以上尿素は分解される。なお、キットとし
て利用する場合、ウレアーゼは粉末、溶液いずれの状態
でもよい。

次いで、酵素反応液についてインドフェノール反応を行
い比色定量する。この反応は、フェノールおよびニトロ
プルシドナトリウムを含む水溶液（Ａ液）および水酸化
ナトリゲムおよび次亜塩素酸ナトリウムを含む水溶液（
Ｂ液）を加えて行なわれる。本発明の場合、試料、Ａ液
およびＢ液をそれぞれ１−使用する場合のそれぞれの試
薬濃度（ＶＶ％）としてはフェノール０．７５〜７，５
．好ましくは３〜７，５．ニトロプルジッドナトリウム
０．００５〜０，２．好ましくは０．０２〜ｏ、１．水
酸化ナトリウム０．２５〜２．５．好ましくは１〜２．
５３次亜塩素酸ナトリウム・有効塩素濃度０．０５〜０
．５．好ましくは０．１〜０．２５とする。このような
濃度範囲にすることにより、発色阻害がなく、室温でも
短時間に呈色強度を大きくすることができる。

上記の範囲より小さ′くなると呈色強度が弱くなり呈色
しなくなり、又、上記の範囲よりも大きくなると黄色が
強くなり目視による判定が困難になる。水酸化ナトリウ
ムについてはフェノールと水酸化ナトリウムの最適濃度
、すなわち２％。

０．６７％の関係をほぼ保ちながら比例的に変動させる
ことが好ましい。このバランスがずれると例えば水酸化
ナトリウムの量が多すぎると異常発色し、反応液は青色
でなく緑色を呈することがある。又、少ない場合は呈色
強度が低下する。さらにこの最適な濃度条件下では酒類
中に含まれる発色阻害物質の悪影響が軽減される。

インドフェノール反応呈色液から濃度を求めるに当って
は、キットの場合は呈色強度の比較判定のできる適度な
濃度の尿素標準液について本試験と全く同じ操作をした
呈色液を呈色標準液として比較判定するか又は、その呈
色標準液から製作した標準色見本から比較判定する。

本発明において、試料液、Ａ液、Ｂ液をそれぞれ１−と
し、最適な試薬条件で内径１４ｍｍの試験管を使用して
目視で比較判定した場合、酒類中の尿素の検出限界は清
酒、ビール等ではｉｐｐｍ、老酒、白ワイン、味醗等で
は２　ｐｐｍである。

又、呈色強度の比較判定は呈色液の尿素の濃度差として
０　、１　ｐｐｍあれば充分である。樹脂処理が充分な
ときは空試験での青色呈色は無いが、若干の呈色がある
場合であってもその濃度を比較判定により求め、本試験
値からその値を差し引き尿素濃度の値とすることができ
ろ。

分范々度計により測定する場合はキットと同様に樹脂処
理した試料液について酵素反応有の未試験値と酵素反応
無の空試験値を求め、その差を尿素の吸光度とし、試料
と同様に操作して得た検量線から尿素の濃度を求める。

この方法での酒類中の尿素濃度の検出限界は０　、１　
ｐｐｍでも可能であるが、０　、５　ｐｐｍで明確であ
る。

実施例 次に、参考例、実験例および実施例をあげて本発明をさ
らに具体的に説明する。

参考例Ｉ グルコース０．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エキ
ス１．０％、肉エキス０．５％９食塩０，５％、炭酸カ
ルンウム１．０％、寒天１．５％からなる培地中に穿刺
、生育したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｒｍｅ
ｎｔｕｍ、ＩＣＭ　　５８６７（ＩＦＯ１４５１１，Ｆ
ＥＲＭＢＰ−１４５４）を、グルコース２．θ％、無水
酢酸ナトリウム２．０％、ポリペプトン１，０％、肉エ
キス１．０％、酵母エキス０．２％１食塩０．５％。

硫酸マンガン（約４水塩）０．００５％、ｐＨ７、０（
３０％苛性ソーダにて中和）からなる滅菌培地５０躍を
含む２００ｄ容三角フラスコ２本に接種して、３７℃で
２４時間、静置培養した。このシード培養物をそれぞれ
、同じ組成からなる滅菌培地ｔＱを含む２Ｑ容三角フラ
スコ２本に移植し、３７℃で２４時間、静置培養した。

この培養物のウレアーゼ活性を測定したところ、０．Ｉ
Ｕ／ｄであった。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム・食塩に懸濁した後、超音波処理し遠心分離し
て上澄液を得た。上澄液−容にエタノール４容を加えて
沈殿物を集め０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，７を加え
て一昼夜放虐後メンプラン（０，３μｍ）ろ過した。ろ
液を予め０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６゜７で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着させ、同一の緩衝
液で洗浄後、０．４Ｍ〜０．５Ｍ食塩の直線的濃度勾配
法で溶出して活性区分を集めた。活性区分を予め０．０
２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６、７で平衡化したセファデック
スＧ−７５のカラムでゲルろ過して、脱塩、脱色し活性
画分を集め、凍結乾燥して酵素粉末を得た。この方法で
得られた酵素の尿素分解力は３０Ｕ／ｍｇでその至適ｐ
）（はＩ）Ｈ４付近、至適温度は６０°Ｃ付近である。

以下の実験例および実施例では本酸性ウレアーゼを用い
た。

実験例１ 市販の酒類の尿素を測定する場合について樹脂処理の有
無によるウレアーゼ・インドフェノール法への影響を液
体クロマトグラフ法を対照として比較した。

樹脂処理をしない場合は、酒類を水で１０ｄに希釈した
希釈試料液２滅に参考例１で得た酸性ウレアーゼ（２５
Ｕ／成）０．２Ｍｌを加え、室温（測定時２７°Ｃ）、
１０分間放置し尿素を分解した。この液にインドフェノ
ール発色液Ａ（フェノール６％、ニトロプルジッドナト
リウム０．０５％）２旙を加えて振り混ぜ、続いて発色
液Ｂ（水酸化ナトリウム２％１次亜素酸ナトリウム有効
塩素０゜２％）２成を加えて同様に振り混ぜ、室温で１
５分間放置し発色させ、６４０ｎｍの吸光度を測定し、
Ａ１とする。同時に希釈試料液２滅をとり、酸性ウレア
ーゼのかわりに水０．２Ｍ／、を加えて同様に呈色操作
を行ない試料の空試験の吸光度を測定しＡ。

とする。また、水および尿素標準液の５．１０゜１５．
２０ｐｐｍにつき試料の場合と同様に操作して、試薬空
試験値および検量線を求めた。この検量線を基に各酒類
につき（ＡＩ−Ａ２）の値から尿素濃度を求め、（Ａｔ
−試薬空試験）の値から酒類の空試験の尿素換算値を求
めた。なお、液体クロマトグラフ法での測定法は希釈試
料液を三菱化成工業製のダイヤイオンＧＫ−１００を充
填したカラム（４，０φｌ　５０　ｍｍ）に注入し、溶
離液にはｐＨ３。

１のクエン酸緩衝液を使用した。検出はニンヒドリン発
色液を波長５７０ｎｍで測定し、尿素濃度を求めた。樹
脂処理をする場合、清酒およびビールは各ＩＴｎ１に強
酸性型陽イオン交換樹脂（三菱化成工業製ダイヤイオン
５Ｋ１０２．Ｎａ型：ｌ］型＝７５％：２５％の混合品
）をＩｇ、老酒は強酸性イオン交換樹脂（ダウケミカル
社製ダウエックス５０Ｗ−Ｘ　２　５０〜Ｉ　００ｍｅ
ｓｈ　　Ｈ型再生品）を２ｇそれぞれ加えて振り混ぜた
後、水で１０ｄに希釈してから静置し、樹脂を除去し、
以下樹脂処をしない場合と全く同様にしてインドフェノ
ール法による尿素濃度、空試験の尿素換算値を求めた。

また液体クロマトグラフ法についても同様に操作し尿素
濃度を求めた。結果を表１に示した。

樹脂処理をしない場合、インドフェノール法の空試験の
尿素換算値は尿素濃度の数倍〜数十倍であった。また尿
素値は発色阻害のため液体クロマトグラフ法と比較し、
Ｉ／２〜Ｉ／３の値であった。

樹脂処理をする場合、空試験の呈色は除かれ、尿素換算
値はいずれも１　ｐｐｍ以下であった。またインドフェ
ノール法と液体クロマトグラフ法の尿素値に差のないこ
とから発色阻害の影響もない。しかし液体クロマトグラ
フ法での尿素濃度が樹脂処理により若干低くなっており
、尿素の樹脂への吸着が起きている。

表１　各酒類の樹脂処理とインドフェノール反応実験例
２ 清酒を強酸性型陽イオン交換樹脂で処理する際のＨ型再
生品とＮａ型再生品の比率とインドフェノール反応時の
空試験での呈色と発色阻害および尿素の樹脂への吸着等
との関係を調べた。

操作方法は清酒！−に対し、強酸性型陽イオン交換樹脂
のＮａ型とＨ型の再生品の比率を０〜１００重量％の範
囲に替えた混合樹脂ｔｇを加え以下、実験例１と同様に
樹脂処理、希釈１発色を行ないインドフェノール法の尿
素値および空試験の尿素換算値並びに液体クロマトグラ
フ法尿素値を求めた 結果は第１図に示すようにＨ型の比率か２０重量％以上
ではインドフェノール法と液体クロマトグラフ法の値が
ほぼ一致し、発色阻害が無くなるので好ましい。一方、
Ｈ型比率の増加と共に尿素の樹脂への吸着は多くなる傾
向があ′す、この点からはＨ型の比率が約５０重量％程
度までとするのが好ましい。また、インドフェノール反
応における空試験での呈色はいずれの比率でも低い。

実施例１ ■、尿素分析用キット （１）　　強酸性型陽イオン交換樹脂；三菱化成工業製
ダイヤイオン５Ｋ１０２．架橋度２゜Ｎａ型再生品７５
％、Ｈ型再生品２５％の混混合比品１．０ｇを１０蔵の
試験管に充填したもの。

（２）酵素液；尿素分解力２５Ｕ／ｄの酸性ウレアーゼ
水溶液（グリセリン５０１／Ｖ％、ＥＤＴＡ　　Ｏ，０
４Ｗ／Ｖ％、β−メルカプトエタノール０．００８Ｗ／
Ｖ％を含む）。

（３）発色液Ａ；フェノール６　Ｗ／’／％、ニトロプ
ルジッドナトリウム０．０５Ｗ／Ｖ％水溶液。

（４）発色液Ｂ；水酸化ナトリウム２　Ｗ／Ｖ％１次亜
塩素酸ナトリウム・有効塩素濃度０　、２　Ｗ／ｖ％水
溶液。

（５）標準色見本；尿素０，２，４，６，８，１０，１
２．１４，１６，１８，２０１）ｐｍを含む溶液につい
て試験実施法と同一方法で得た呈色液を色見本化したも
の。

上記の（１）〜（５）を組み合せて酒類中の尿素定量用
キットとした。

２、使用例 樹脂入り試験管（１）に市販清酒１．０ｄを加えて約１
０秒間振り混ぜ、これに水を加えて１０ｄとし混合した
後、静置した。上澄液１　、　ＯｒｎｌをｌＯ滅試験管
（ポリスチレン製、φＩ　４　Ｘ　Ｈ１０４ｍｍ）にと
り、酵素液（２）の０．’ｌｄを加えて室温（測定時２
３°Ｃ）で１０分間放置した。この液に発色液Ａ（３）
！、０．ｄを加えて振り混ぜ、続いて発色液Ｂ（４）１
．０ｇを加えて同様（９振り混ぜ、室温で１５分間放置
し、発色液とした。発色液の呈色強度を標ｑ色見本と比
較し、尿素濃度測定値１８ｐｐｍを得た。これは別に液
体クロマトグラフ法（実験例１参照）で求めた樹脂処理
をしない場合の値と良く一致した。

実施例２ ビールｔ　、ｏｙに強酸性型陽イオン交換樹脂（ダウケ
ミカル社製、ダウエックス　５０Ｗ−Ｘ２．架橋度２．
Ｎａ型：Ｈ型＝７５：２５の混合品）１．０ｇを加えて
振り混ぜ、これに水を加えてＩＯｄとし、混合後、静置
した。上澄’ｅ−２，０ｄをとり、尿素分解力２５　Ｕ
／ｄの酸性ウレアーゼＱ、２．ｄを加え、室温（測定時
２１℃）で１０分放置した。この液に発色液Ａ（フェノ
ール３　、０　Ｗ／Ｖ％、ニトロプルジッドナトリウム
０．０１Ｙ／Ｖ％）２．０滅を加えて振り混ぜ、続いて
発色液Ｂ（水酸化ナトリウム１　、０　Ｗ／Ｖ％１次亜
塩素酸ナトリウム・有効塩素濃度０．１０Ｗ／Ｖ％）２
．０ｄを加えて同様に振り混ぜ、室温で１５分放置した
後、分光々度計を用いて波長６４０ｎｍの吸光度を測定
した。また、試料空試験として上記樹脂処理後の上澄液
２．０１Ｔｆｌをとり、水０．２雁を加え以下試料の場
合と同様に操作した。同時に水および尿素標準液５，１
０，１５゜２０ｐｐｍの６液について試料の場合と同様
に樹脂処理、希釈以後の操作を行ない吸光度を測定し、
試薬空試験値および検量線（第２図）を求めた。ビール
の試薬空試験を補正した吸光度は本検−空試験＝０．０
４９−０．００７＝０．０４２であり、検量線から尿素
濃度２　ｐｐｍを得た。この値は、液体クロマトグラフ
法（実験例１参照）で求めた樹脂処理なしの場合の値２
　ｐｐｍと良く一致した。

実施例３ 老酒１　、Ｏｍｅに強酸性型陽イオン交換樹脂（ダウケ
ミカル社製、ダウエックス　５０Ｗ−Ｘ２　５０〜１０
０メツシユ、架橋度２．Ｈ型再生品）２．０ｇを加えて
振り混ぜ、これに水を加えて１０ｄとし混合後、静置し
た。上澄液２．０Ｔｎ１．をとり、尿素分解力２５Ｕ／
ｄの酸性ウレアーゼ０．２戒を加え、室温（測定時１８
℃）で１０分放置した。この液に発色液Ａ（フェノール
７　、５　Ｗ／Ｖ％、ニトロプルジッドナトリウム　０
．０７５Ｗ／ＩＩ’％）２．０−を加えて振り混ぜ、続
いて発色液Ｂ（水酸化ナトリウム２　、５　Ｗ／Ｖ％１
次亜塩素酸ナトリウム・有効塩素濃度０．２５Ｗ／Ｖ％
）　　２．０ｄを加えて同様に振り混ぜ、室温で２５分
放置した後、分光光度計を用いて波長６４０ｎｍの吸光
度を測定した。また試料空試験として樹脂処理後の上澄
液２．０１ｎ１．をとり、水０．２戒を加え、以下試料
の場合と同様に操作した。同時に水および尿素標準液５
．１０，１５゜２０ｐｐｍの６液について試料の場合と
同様に樹脂処理、希釈以後の操作を行ない吸光度を測定
、試薬空試験値および第３図に示した検量線を求めた。

老酒の試薬空試験を補正した吸光度は本検−空試験＝０
．２５４−０．０１５卒０．２３９であり、検ｍ線から
尿素濃度１３ｐｐｍを得た。これは別に液体クロマトグ
ラフ法（実験例１参照）で求めた樹脂処理しない場合の
値１２ｐｐｍと良く一致した。

実施例４ 味ｍｔ、ｏｙに強酸性型陽イオン交換樹脂（ダウケミカ
ル社製、ダウエックス　５０Ｗ−Ｘ２．架橋度２．Ｎａ
型：１１型＝７５：２５の混合品）１．Ｏｇを加えて振
り混ぜ、これに水を加えてＩＯｄとし、混合後静置した
。上澄液２．０旙をとり、尿素分解力２５　Ｕ／ｄの酸
性ウレアーゼ０．２鑓を加え、室温（測定時２５℃）で
１０分放置した。この液に発色液Ａ（フェノール６　、
０　Ｗ／Ｖ％、ニトロプルジッドナトリウム０．０５Ｗ
／Ｖ％）２．０ｄを加えて振り混ぜ、続いて発色液Ｂ（
水酸化ナトリウム２．０Ｗ／Ｖ％１次亜塩素酸ナトリウ
ム・有効塩素０　、２　Ｗ／Ｖ％）２．Ｏｄを加えて同
様に振り混ぜ、室温で３０分放置した後、分光光度計を
用いて波長６４０ｎｍの吸光度を測定した。また、試料
空試験として上記樹脂処理後の上澄液２．０戒をとり、
水０．２成を加え以下試料の場合と同様に操作した。同
時に水および尿素標孕液１．２．３．４．５　、　Ｉ　
Ｏｐｐｍの６液について試料の場合と同様に樹脂処理、
希釈以後の操作を行ない吸光度を測定し、試薬空試験値
および検量線（第４図）を求めた。味腓の試薬空試験を
補正した吸光度は車検−空試験は、０．０４４−０．０
３２＝０．０１２であり、検量線から尿素濃度１　ｐｐ
ｍを得た。

実施例５ 白ワイン１．０顧に強酸性型陽イオン交換樹脂（ダウケ
ミカル社製、ダウエックス　５０Ｗ−Ｘ２．架橋度２．
Ｎａ型；Ｈ型＝７５＋２５の混合品）１．ｏｇを加えて
振り混ぜ、これに水を加えてｔｏＴｎｌ、とじ、混合後
静置した。上澄液２．０成をとり、尿素分解力２５Ｕ＃
２の酸性ウレアーゼ０．２雁を加え、室温（測定時２５
℃）で１０分間放置した。この液に発色液Ａ（フェノー
ル６　、０　Ｗ／Ｖ％、ニトロプルジッドナトリウム０
．０５Ｗ／Ｖ％）２．０ｄを加えて振り混ぜ、続いて発
色液Ｂ（水酸化ナトリウム２．０＊／ｖ％１次亜塩素酸
ナトリウム・有効塩素０　、２　ｍｌ／Ｖ％）２．０ｄ
を加えて同様に振り混ぜ、室温で３０分放置した後、分
光光度計を用いて波長６・１０ｎｍの吸光度を測定した
。また、試料空試験として上記樹脂処理後の上澄液２．
０１ｎ１．をとり、水０．２歳を加え以下試料の場合と
同様に操作した。同時に水および尿素標孕液１．２．３
．４．５．１０ｐｐｍの６液について試料の場合と同様
に樹脂処理、希釈以後の操作を行ない吸光度を測定し、
試薬空試験値および検量線（第４図）を求めた。白ワイ
ンの試薬空試験を補正した吸光度は本検−空試験一〇、
０６２−０．０４４＝０．０１８であり、検量線から尿
素濃度１　ｐｐｍを得た。

発明の効果 本発明の尿素定量用キットは、酒類中の尿素をウレアー
ゼを作用させ生成するアンモニアをインドフェノール法
等で発色させて定量するに際して、精度よくかつ簡易に
実施できる。特に、強酸性型陽イオン交換樹脂で酒類を
予め処理することにより、インドフェノール呈色性物質
あるいは発色阻害物質を除去することができ、比色が目
視でも可能となる。従って、分光光度計などの測定器が
必ずしも必要ではないことから、酒類の製造工程現場等
において簡易に実施できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例２において清酒を強酸性型陽イオン交換
樹脂で処理する際のＨ型再生品とＮａ型再生品の比率を
変えて本発明を実施したときの尿素測定値（図中、−・
−で示される）およびそのときの空試験値（尿素換算値
）（図中、−一−−−・−一−−−−で示される）、な
らびに液体クロマトグラフ法による尿素測定値（図中、
−〇−で示される）を示す。 第２図、第３図および第４図はそれぞれ実施例２、実施
例３および実施例４と５における尿素測定のための検量
線を示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘 ＄４　に ／Ｌ素＋りｌ）ｍ）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウレアーゼを組み込んでなる酒類中の尿素定量用
   キット。
2. （２）強酸性型陽イオン交換樹脂および該樹脂に酒類を
   接触させるための容器を組み込んでなる請求項（１）記
   載の尿素定量用キット。
3. （３）インドフェノール発色試薬を組み込んでなる請求
   項（２）記載の尿素定量用キット。
4. （４）酒類を強酸性型陽イオン交換樹脂で処理し、その
   処理液にウレアーゼを作用させて生成するアンモニアを
   インドフェノール法により定量することを特徴とする酒
   類中の尿素の定量法。