JPS6034181A - ノイラミニダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はノイラミニダーゼの製造法に関する。

さらに詳しくは、本発明はミクロモノスポラ属に糾し、
ノイラミニダーゼを生産する能力を有する微生物を培地
に培養し、培養物中にノイラミニダーゼを蓄積せしめ、
該培養物から該酵素を採取することを特徴とするノイラ
ミニダーゼの製造法に関する。

ノイラミニダーゼ（ＲＣ３，２，１，１８）は生体の重
要な構成成分である糖蛋白質や糖脂質等の末端に位置す
るシアル酸（ノイラミン酸のアシル訪導体の総称）のα
配位のケトシトを基質とし、このジアール酸残基を遊離
させる加水分解酵素である。

このノイラミニダーゼは、ウィルス、細菌、放　−線菌
などの微生物、鳥類、＠乳動物の種々の組織に広く分布
していることが知られている。

また、ノイラミニダーゼは血清等の生体中のシアル酸含
有物質の定量に用いられることはよく知られておシ、ノ
イラミニダーゼを安価に工業的に製造する方法を提供す
ることが望まれている。

従来、微生物を用いてノイラミニダーゼを生産する方法
としては、ノイラミニダーゼ産生能を有する微生物をコ
ロミン酸や各種動物組織の浸出・抽出液をノイラミニダ
ーゼ紡導物質として加えた培養基中で培養してノイラミ
ニダーゼを製造する方法が知られている。〔代謝１ｓ（
５Ｌ７６１　（１９７９）＋　ＢＩｏｃｈｌｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　３５０　＋４２５−４３１　（
１９７４）、　Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、　８２．１４２５
−１４３３（１９７７）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、１１９（２１＋　３９４−４００（１９７４）＋　Ｃ
ａｎａｄｉａｎＪ、　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ１８＋
１００７、（１９７２）、特公昭５０−１１９９１１然
るにこれらのノイラミニダーゼ誘導物質を大量に使用す
ることは経済的に極めて困難であるので、ノイラミニダ
ーゼ生産量向上のためには、ノイラミニダーゼ生産性の
高い微生物を用いる必要がある。

本発明者らは工業的に安価にノイラミニダーゼを製造す
る方法について種々検討した結果、ミクロモノスポラ属
に属する微生物を培地に培養したときに培養物中にノイ
ラミニダーゼが著廿に生産されることを見い出し、本発
明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明によれは、ミクロモノスポラ属に属し、ノイラミ
ニダーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にノイラミニダーゼを蓄積せしめ、該培養物から該酵
素を採取することにより、ノイラミニダーゼを製造する
こと力Ｆｃきる。

本発明に使用する微生物としては、ミクロモノスポラ属
に属し、ノイラミニダーゼを生産する能力を有するもの
であればいずれの菌株でもよい。

具体的に好適な菌株の例としては、ミクロモノスポラ−
ビリディファシェンス（Ｍｉｃｒ（２）ｎｎｓｐｏｒａ
ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）　ＡＴＣＯ３１１４６＊
　ミクロモノスポラ・グロボーサ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏ
ｓｐｏｒａ　ｇｌｏｂｏｓａ）ＮＲＩｔＬ　Ｂ−２６７
３，ミクロモノスポラ・カルセア（Ｍｉｃｒｏｒｎｏｎ
ｏｓｐｏｒａ　ｃｂａｌｃｅａ）　ＡＴＣ（！　１２４
５２があげられる。

これらの菌の属する種の菌学的性質は次の文献に記載さ
れている。’　Ｕ８　Ｐａｔｅｎｔ　３，９９１，１８
３（１９７７）”ミクロモノスポラ・ビリディファシェ
ンス。

”　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅ
ｒｍｌｎａｔｌｙｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”第８
版（１９７４）。

ミクロモノスポラ・グロボーサ（八ｆＩｃｒｏｍｏｎｎ
ｓｐｏｒａ　ｇｌｏｂｏｓａ）ｐ８５２＋　ミクロモノ
スポラ・カルセア（Ｍｉｃｒｃｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｈ
ａｌｃｅａ）　ｐ　８４８゜ 本発明に使用される培地としては、炭素源。

窒素源、無機物その他の栄養素を程よく含有するもので
あれば、天然培地２合成培地のいずれも用いることがで
きる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース。

シュクロース、マルトース、マンノース、澱粉。

澱粉加水分解液、楯蜜などの種々の炭水化物１、Ｓるい
はグリセロール、ソルビトール、マンニトールなどの種
々の糖アルコール、酢酸、乳酸。

ピルビン酸、フマール酸、クエン酸などの各種有機酸、
メタノール、エタノールなどの各種アルコール、エチレ
ングリコール、フロピレンゲリコールなどの各種グリコ
ール、各種アミノ酸あるいはｎ−ヘキサデカンなどの炭
化水素、牛心賑や牛脳の浸出液、牛血液粉末などが使用
可能である。

窒素源としではアンモニア、あるいは塩化アンモニウム
、炭酸アンモニウム、燐酸アンモニウム・？１１１ｒｔ
ｔアンモニウム、酢酸アンモニウムなど各紳無後および
有様アンモニウム塩、尿素。

アミノ酸およびその他の窒素化合物、ならびにヘフトン
、ＮＺ−アミン、肉エキス、″：Ｉ−ンスチーブリカー
、カゼイン加水分解物、蛸加水分解物、フィツシュミー
ルあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物な
どの窒素含有有核物質などが用いられる。

・　無機物としては燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウ
ム、塩化カリウム、硫酸゛マグネシウム。

硫酸マノガン、硫酸第一鉄、塩化ナトリウム。

炭酸カルシウムなどが用いられる。

培地にコロミン酸やムチンなどのシアル酸含有物質を加
えれば、より大量のノイラミニダーゼを生成させること
ができる。この際、これら添加物の量は培地重量当シロ
。０１〜１．０チ（ｗ／ｖ）で良い結果を得ることがで
きる。

培養はｐ１１６・０〜７・０・温度２５〜３５℃で。

４〜５日間、通気攪拌しながら行う。

このようにして培養するととにより、培養物中、主に培
養液中にノイラミニダーゼが生成苔積する。培養物中か
らのノイラミニダーゼの採取は次のごとく行なう。

培養終了後、培讐液を濾過あるいは遠心分離し、菌体を
除きろ液あるいは上清を得る。このν液あるいは上清液
を通常酵素精製に用いられる方法、例えば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマト、ゲル濾過
、凍結乾燥などの方法にて処理する。かくして精製ノイ
ラミニダーゼを採取することができる。

たとえば、培養ｐ液を、硫酸アンモニウム９０％飽和に
よる塩析を行ない、生じる沈殿を緩衝液に溶解、透析後
、ＤＢＡＥ−セファデックスやＩ）ＢＡ［−セルロース
のような陰イオン交換樹脂を充填したカラムに吸着させ
、吸着した酵素を食塩または硫酸アンモニウムの濃度勾
配によシ溶出させる。溶出された酵素を更にセファデッ
クスＧ−７５やバイオ・ゲルＰ−１００によるゲル濾過
法によシ精製する。

本発明で得られる酵素の有する性質をミクロモノスポラ
・ビリディファシェンスＡＴＯＣ３１１４６から生産さ
れるノイラミニダーゼを代表とじて以下に述べるが、ミ
クロモノスポラ・グロボーサＮＴＬＲＩ、　Ｂ−２６７
３およびミクロモノスポラ・カルセアＡＴＣＯ１２４５
２から生産されるノイラミニダーゼもほぼ同様の性質を
有する。

ノイラミニダーゼの酵素活性の測定は、酵素反応によっ
て生成するＮ−アセチルノイラミン酸に、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸リアーゼ（ｌＥｔＣ４、１，３，３）を作
用させ１、生成したピルビン酸を乳酸脱水素酵素（Ｂｅ
　１．１．１．２７　）の存在下にＮＡＤＨと反応させ
、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの３４０　ｎｍ　における吸光度の減
少量を分光光度計で測定することによって行なう。

Ｎ−アセチルノイラミン酸＋アグリコン　（１）Ｎ−ア
セチル−Ｄ−マンノサミン＋ピルビン酸（２１ピルビン
酸十ＮＡＤＨ二４！！ｔ＊ｒｉｓ奥−→乳酸　＋　Ｎ　
Ａ　Ｄ　（３１ （イ）試薬 ■　基質＝４０賜句コロミン酸水溶液　０１．１ゴ■　
緩衝液：２００ｍＭクエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５，０）　０．１ｍｊ■　Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸リアーゼ溶液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＩ（７
，０）で１単位／ｍｅになルヨうに調製　０．０５ｍ１
■　ＮＡＤＨ：　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐｉ−１７
，４）で０．３ｍＭになるように調Ｒ２プ ■　乳酸脱水素酵素：　１００ｍＭＩＪン酸緩衝液（１
）Ｉ（７，４）で３０萌粕しｉになるように調製　０．
０１１１１１！■　１＃累溶液　Ｑ、１ｗＬｌ （ロ）　操　作 上記試薬■、■を試験管に入れ、３７℃５分間予φ；ｈ
加温する。次いで酵素溶液■を加えて溶液の全針をＱ、
　５　ｍｌに調整し３７℃で１５分間振とうして反応さ
せる。１００℃３分間の加熱処理によって反応を停止す
る。

次いで■を添加して７０℃で１５分間反応させる。さら
に■を添加してすぐに３４０　ｎｍの吸光度をめる（　
ＯＤｏｍｉｎ）。■を添加して２５℃で１０分間反応さ
せた後３４０　ｎｍの吸光度（ＯＤ□。ｍ１ｎ）を測定
して、その差として Δ０Ｄｔｅｓｔをめ為。一方コントロール酵素の八 代シに、水を用いたものを上記と同様の操作を行ない吸
光度の変化ΔＯＤｂｌａｎｋをめる。

（ハ）力価の計算法 ノイラミニダーゼの１単位は３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅのＮ−アセチルノイラミン酸を生成する酵素量と定
醗する。一方、１ｍＭのＮＡＤＨの吸光係数は６，２２
と報告されている（　Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ
　、　９版、ｐ８２４）から請求める酵素溶液１ｔｉ当
シの力価（Ａ）は ＝（Δ０Ｄｔ６ｓｔ−Δ０Ｄｂｌａｎｋ）Ｘｏ、２７３
　（単位／ｍｌ　）よ請求められる。

次に本発明で得られたノイラミニダーゼの諸性質を示す
。

（１１作用 本酵素はシアロ糖複合体の末端に位置するＮ−アセチル
ノイラミン酸のα配位のケトシトを基質とし、とのＮ−
アセチルノイラミン酸残基を遊離させる反応を触媒する
。

（２）基質特異性 本酵素はコロミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸ラクト
ース、フェツイン、ムチｙ等の各種Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸ケトシトを加水分解する。

ハ フェツイン　α、２−３　８１．０ ムチン　α、２−６　２０３ Ｎ−アセチルノイラミン酸ラクトースに対するｈ値は約
２ｍＭであった。

（３）　至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは３７℃、１５分間の反応でｐＨ５，
０〜５．５付近にある。

（４）゛安定ｐ）（範囲 本酵素の安定ｐＨ領域は４℃、２０時間の処理でｐＨ６
，０〜９．０の間にある。

（５）作用適温の範囲 本酵素の最適温度はｐＨ５，０＋１５分間の反応におい
て５０°〜６０℃付近にある。

（６）温度安定性 本酵素はｐＨ６，０，１５分間の処理で５０℃まで安定
、５５℃では５０％程度失活する。

（７）阻害 ３７℃＊ｐＨ５，０で反応させた場合、下記の物質によ
って阻害される。

１０−”　１０１ ００ＰＣ”　１０”　０゜６ １０−”　９９．２ ＴＮＢ８”　１０”’　３０．４ ※　ＰＣＭＢ＝パラクロロマーキュリ−ベンゾエイト峯
１［ＴＮＢｓ＝）リニトロペンゼ／スルホン酸（８）分
子量 セファデックスＧ−１５０ゲル濾過法によシ、本酵素の
分子量は約３０，０００と算出された。

（９）結晶構造および元素分析値は本酵素が結晶化され
ていないので測定していない。

ａＱ　本酵素はディスク電気泳動によシ単一のバンドが
得られた。

すなわち、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、
トリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８，３）中で約９０分間
泳動を行なった。そしてゲルをアミドブラック染色液で
染色することにょシ、単一の蛋白質のバンドが観察され
た。

以下実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例１ ミクロモノスポラ・ビリディファシェンスＡＴＣＣ３１
１４６を／　ｋ　：ｒ　−／（ｌ　ｆｄｌ　、　可溶性
デンプンｘｔ／ｄｌ、ペプトン０．７５η〃、肉エキス
０、７５　Ｆ／＃１　食塩ｏ、　ａ　ｏ　ｙ／ｄｌ＊　
Ｈｅマｆ　＋　−／　ｆｙムｏ、ｔ　ｏ　ｆ／（＃＊　
Ｖ７酸二カ’Ｊ　ウＡ　０．１０　ｆ／ｄｉ。

＝ｒ　ロミ７　酸０．１　ｆ／ｄｌ　カラｆｔ、　ル培
ｍ　（ｐＨ７，０、）３０　ＣＪｄヲ含ム２１エルレン
マイヤーフラスコに植菌し、３０℃で４８時間振盪培養
した。

この培養液６００　ｍｌを上記培地と同じ組成の培地１
ｓＪを含む３（ｌジャーファーメンタ−に入れ、通気攪
拌（３００ｒｐｍ）しつつ、３０℃で４日間培養を行っ
た。

この培養物１５１を大型ヌッチェで濾過助剤としてラジ
オライトφ１００を用い濾過し、培養Ｆ液約１５！を得
た。

＞　ｎ〜小を油化よ５詠１ｒｒ駄ｈ−シ、輛シ　ュ土　
＾　ｎｔｔ　番輸イｎで沈殿する部分を採取した。

この沈殿のノイラミニダーゼ活性収率は約８０チで、比
活性は約５倍に上昇していた。

この沈殿を少種゛（約１００１Ｌｔ）の０．０１Ｍ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した。

この溶液を同緩衝液ｘｏｌで２４時間透析した。透析液
を同緩衝液で平衡化したＤｇＡＥ−セファデックスカラ
ム（１１９口径６０ｍｌ　）に通塔した。この操作で、
ノイラミニダーゼはＤＥＡＥ−セファデックスに吸着さ
れる。さらに、同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した。

次に０．　ＯＩ　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）から１．０１Ｖ＋食塩を含む同緩衝液までの食塩の濃
度勾配液で溶出を行った。

溶出してくる活性画分をあわせ、これに硫安を加えて、
硫安９０％飽和で沈殿する部分を遠心分離（１λ０ＯＯ
ＸＩＰ　＋　２０分）で集め、０．０１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐ）１７．０　）　１０ｍに溶解した。

この溶液を同緩衝液５ノで２４時間透析した。

透析後、酵素液を同緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ−７５のカラム（５００１ｊ＋　口径３、５　ｍ　）
に通した。溶出液を分画回収し、比活性の高い分画を集
め凍結乾燥し、ノイラミニダーゼの粉末精製酵素標品５
０１１７（比活性５０単勅いを得た。

精製酵素は細胞ν液に比べて比活性は約２０００倍に上
昇し、活性の収率は約５０ｇ６であった。

実施例２ 使用菌株をミクロモノスポラ・グロポーサＮＲＲＬＢ−
２６７３に替え、発酵培地をペプトン０．２シＵ、肉エ
キス０．１シｍ、酵母エキス０、１　ｆ／ｄｉ、ムチン
２　ｆ／ｄｉからなる培地（ｐＨ７，２）に替えて行う
以外は実施例１と同様に行って比活性　３０単位４ｇの
精製ノイラミニダーゼ約２０１ｇを得た。活性の収率は
約３０％であった。

実施例３ 使用菌株をミクロモノスポラ・カルセアＡＴＣＣ１２４
５２に替えて行う以外は実施例１と同様に行い、比活性
４０単位４ｇのｆ＃製ノイラミニダーゼ約３０■を得た
。活性の収率は約４０チであった。

′ｔノ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ミクロモノスポラ属に属し、ノイラミニダーゼを生産す
   る能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にノイ
   ラミニダーゼを蓄積せしめ、該培養物から該酵素を採取
   することを特徴とするノイラミニダーゼの製造法。