JPH01105162A - 鶏伝染性喉頭気管炎の抗体測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−１１ｎｋｅｄ
ｔｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ、　　以下ｍ
　ＩＳＡと略記する）を用いた鶏伝染性喉頭気管炎（以
下ＩＬＴと略記する）の抗体測定方法に関する。とりわ
け本発明は上記ｆｆ１ＬＩ　ＳＡにおいて、アビジン−
ビオチン系ヲ用いるアビジン−ビオチン標識酵素免疫測
定法（Ｌａｂｅｌｌｅｄ　ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ
　ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ
ｎｔ　ａｓｓａｙ、　　以下ＬＡＢ−ＥＬＩ８Ａと略記
する）を用いたＩＬＴの抗体測定方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、　ＩＬＴの診断方法としては寒天ゲル内沈降反応
、螢光抗体法、中和試験などがあるが感度が悪く診断時
間が長いという問題点があった。

近年、簡便迅速な診断方法としてＫＬ正Ａが実施されつ
つある。

Ｊ！！ＬＺ８Ａは各種感染症の抗体測定に応用されてお
シ、鶏のウィルス性疾病においても報告されている（岩
崎ら、鶏病研報、２０巻１号％　２１〜２４頁（１９８
４）　Ｇ、Ｍｅｕｌｅｍａｎｓら、Ａｖｉａｎ　Ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙｌｌ　：３６１−３６８（１９８２）など
）。しかし鶏の免疫グロブリンは哺乳類の免疫グロブリ
ンに比べて非特異的に固相に吸着しやすいため、非特異
反応を減らすことがＫＬＩＳＡを用いる診断の場合の貞
要な諌題である。

Ｊ、Ｊ、Ｙｏｒｋ　ｅｔ　ａｌは鶏の加令に伴う非特異
反応の増加に対応するため鶏群を１〜１２週までの群と
、１３〜６４週までの群の２つに分けて非特異反応の平
均値を求めそれぞれからカットオフポイント（ｃｕｔ−
ｏｆｆ　ｐａｉｎｔ）を設定している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら上記ＥＬＩＳＡでは加令要因（ａｇｅｆａ
ｃｔｏｒ）による非特異反応が出現し、その後増加して
ゆき、日令の進んだ鶏血清（例えば２１０日令程度）の
陽性及び陰性血清の吸光度にほとんど差が見られず診断
不可能となってしまう。

さらに野外例においては中和価陰性の吸光度にばらつき
が見られ中和価の高いものとの区別がつき難いため判定
を誤る危険性があった。

一方、　Ｃｈａｎｇ、Ｈ，Ｏ，ｅｔ　ａｌはアビジン−
ビオチンの特異的結合を豚の日本脳炎抗体測定に応用し
てお＃）　（Ｊｐｎ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、　、　５２
．５９−７１（１９８４））。

Ｇｕｅｓｄｏｎ　ｅｔ　ａｌもアビジン−ビオチンの特
異的結合がＥＬＩＳＡの特異性を高めると報告している
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｈ１ａｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒ７　ａｎａ　Ｏｙｔｏｃｈｍｉｓｔｒｙ。

Ｖｏｘ２７．ｍ８．１１！＋１−１１３９．（１９７９
））。

しかしながら、上記ＯｈａｎｇのＬＡＢ−ＫＬＩ！３Ａ
は日本脳炎ウィルス抗体を対象としたものであシ、また
ＧｕｅｓｄｏｎのＬＡＢ−ＫＬＩＳＡは単に家兎免疫グ
ロブリン及びウシ血清アルブミンを検出する事に止シ、
このＬＡＢ−ＥｉＬＩＳＡが上記文献に記載されたもの
以外の抗体の検出方法として用いることについては述べ
るところがない。ところでこうした抗原−抗体反応は反
応体に特異性の反応であることからこのＬＡＢ−ＥＬＩ
ＳＡの手法がすべての抗体の検出に適用しえないもので
あることはこの技術分野における技術的常識であって、
上記文献から教示される範囲はＬＡＢ−１ｆ、Ｉ　ＳＡ
によって上記文献に特定された抗体の検出に止まるもの
である。

〔問題点を解決するための手段〕

ところが本発明者らは鋭意研究の結果、意外にもＩＬＴ
ウィルス抗体がＬＡＢ−１！ｔＬＩｓＡによって測定し
うろことを見出して本発明を完成したのである。

即ち、本発明の鶏伝染性喉頭気管灸（ＩＬＴ）の酵素免
疫測定法（ｇＬＩｓＡ）による抗体測定方法は、ＩＬＴ
ウィルスに界面活性剤を直接作用させて抗原としたもの
に、被検サンプルを作用させビオチンで標識された抗体
を接触させ、その後にアビジンの結合した標識酵素を作
用させることを特徴としている。

本発明は以下のように構成されているため、鶏の加令に
伴う非特異的な抗原抗体反応をな（し感度の高い抗体測
定を可能にするという有利な効果を奏するものである。

本発明に使用できる分画用界面活性剤としては、Ｎｏｎ
１ｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ　２０
、Ｔｗｅａｎ４Ｑ。

Ｔｗｅｅｎ　８０、Ｂｒ１ｊ　５８またはＴｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００などの非イオン性界面活性剤（ｄｅｔｅｒ
ｇｅｎｉ）が例示される。

本発明に使用できる標識酵素としては、西洋わさびペル
オキシダーゼ（以後Ｈ，Ｒ，Ｐ、と略記すル）、グルコ
ースオキシダーゼ、大腸菌β−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、フェリチンが例示される。

以下、実施例および比較例に従って本発明の抗体測定方
法について詳述するがこれに限定する主旨ではない。

〔実施例〕

実施例及び比較例に使用する材料及びその調製法 ■　ウィルス ＩＬＴウィルスＭＳ−１７５株 ■　抗原 １日令ｓｐｙ　（特定病原体の無い：８ｐｅｃｉｆｉｃ
−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ　、ＳＰＦと略記）鶏由
来腎単層培養細胞（ＯＫ　ｃｅｌｌ、　）　　に上記Ｉ
Ｌ’Ｉ’ウィルスＭＳ−１７５株を接種し％３６時間後
に凍結融解を３回縁シ返した。３．００Ｏｒｐｍにて２
０分間遠心し、上清をラボカセットシステム（Ｌａｂ。

０ａａｓｅｔｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ、ミリポア社製）によ
シ約１００分の１に濃縮した。これをさらに２０〜６０
ｅｓショ糖密度不連続勾配法によＦ）　２５，０００　
ｒｐｍにて１時間超遠心してウィルスを精製した（以下
抗原人という）。

この抗原Ａを１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（牛丼化学
＃りトリス−Ｈｅ名緩衝液に１町／−の割合で加え、３
７℃で１時間処理し、さらに２５Ω００ｒｐｍにて１時
間超遠心して得た上清を抗原（以下抗原Ｂという）とし
た。これらの抗原は使用時まで一８０℃にて保存した。

また前記ＴｒｉｔｏｎＸ　１００　Ｋ代えて２％　Ｔｗ
ｅｅｎ２０　ＰＢ８緩衝液を用いた以外は前記と同様に
処理して抗原Ｃを得、また０、　４　％　ＮＦ−４０Ｒ
８Ｂ液（Ｒ８Ｂ：０．０１Ｍ　Ｎａ０ｎ　、　０．００
１５ＭＭｇＯＪ１２　。

０、ＯＩＭ）リス−ＨｅぶｐＨ７，４）で処理して抗原
りを得た。

■　８ＰＦ賜血清 ８ＰＦ鶏Ｌｉｎｅ−Ｍ　（１日令）（日本生物科学研究
所よシ購入）１０羽よシ毎週採血してＳＰＦ鶏血清とし
た。

■　ＩＬＴ陽性血清 ２週令ＳＰＦ鶏１０羽にＩＬＴ生ワクチン（化血研１１
）をそれぞれ１ドーズ（ｄｏｓｅ）を点眼接種し、さら
に２週間後にも点眼接種してその後５週目に得られた血
清を陽性血清とした。

野外陽性血清は愛知県下の養鶏場由来のサンプルで中和
試験陽性のものを使用した。

■　標識抗体 抗ニワトリＩｇＧ家兎免疫ＩｇＧ　Ｈ，Ｒ，Ｐ、標識抗
体（比較例用）及び抗二ワ）　ＩＪ　ＩｇＧ家兎免疫ビ
オチン標識抗体（実施例用）（いづれも米国Ｚｙｍｅｃ
１社ｌｉりを使用した。使用時まで一８０℃にて保存し
た。

■　Ｈ，Ｒ，Ｐ、標識アビジン（実施例用）Ｈ，Ｒ，Ｐ
、標識アビジン（米国Ｆｌｔ−Ｙ社製）を使用した。使
用時まで一８０℃にて保存した。

■　基質 ４０ｍＭのＡＢ’ｒ８　（米国Ｓｔｇｍａ　製）　ｉ’
！液を蒸留水で作製した。５０μｌｌの上記４０　ｍＭ
　ＡＢＴ８　溶液に１０−の０．０５Ｍクエン酸バッフ
ァー（ｐＨ４，０）および４０バの１　％　Ｈ２ｏ２を
混和してＡＢ’ｒＳ基質とした。

実施例 １）　　ＬＡＢ−Ｊ！ｔＬＩｓＡの実施抗原Ｂ　（ＩＬ
Ｔ抗原）を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９６）で至適濃
度に希釈し、　ＫＬＩＳＡ用マイクロプレー）　（Ｎｕ
ｎａ、Ｄｅｎｍａｒｋ製）の各ウェルに１００μ慮ずり
入れ、４℃にて１晩靜置した。プレートを０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水１７．４）（
以下Ｔｗｅｅｎ　２０　　ＰＢ８と略記）で１回洗浄し
た。被検鶏血清ｔ−１％牛血清アルブミンを含むリン酸
緩衝生理食塩水（以下Ｂ８Ａ−ＰＢ８と略記）で１００
倍に希釈し％　１００μｎスつ各ウェルに加え、６７℃
にて４０盆間反応させた。

Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン標識抗
体を０．１％Ｔｗｅθｎ８０を含むリン酸緩衝生理食塩
水（以下Ｔｗｅｅｎ　８０　ＰＢＳと略記）で至適濃度
に希釈し各ウェルに１００鱈ずつ加え、３７℃で４０分
間反応させた。Ｔｗｅｅｎ　２０　ＰＢＳで３回洗浄後
、　Ｈ，Ｒ，Ｐ、標識アビジンを０．０５　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に０．１４　Ｔｗｅｅｎ−２０と０
．５　Ｍ　Ｎａ０１を含む希釈液で至適濃度に希釈し、
１００．ａｊｌずつ各ウェルに加え、５７℃にて４０分
間反応させた。Ｔｗｅｅｎ　２・ＯＰＢＳにて５回洗浄
後、各ウェルに１００バずつＡＢＴ８基質を加え、３７
℃にて６０分間反応させた後％ＥＬＩＳＡ用吸光度計（
日本インターメツド製）で４０５　ｎｍの吸光度を測定
した。

１１）中和試験 ブラック形成法により中和指数を求めた。即チ２４　ｗ
ｅｌｌマイクロプレート上で培養した０Ｋｃａｌｌに、
１０倍階段希釈したＩＬＴウィルス柩と等量被検血清を
混和し３７℃、１時間感作させたものを加えた。３７℃
で１時間放置後１９９培地に３％カルボキシメチルセル
ロース、を含む重曹液を加え３７℃、５％００２で３日
間培養した。

４６目に細胞の固定染色をおこないブラック数を測定し
た。中和指数は、それぞれウィルス感染価（ｐｌａｑｕ
ｅ　ｆｏｒｍｉｎｑ　ｕｎｉｔ：ＰＦＵ）を求めた後、
Ｒｅｅｄ　＆　Ｍｕｅｎｃｈ法（Ａｍ、Ｊ　、Ｈｙｇ、
、２７，４９５．１９５８年）によシラ０チブラツク減
少クイルス希釈培数を出し被検血清と対照との差で表わ
した。

また前記と同様にして抗原Ｏおよび抗原りを使用して測
定した。

比較例 １）従来のＩＬＩＳＡの実施 抗原Ａ　（ＩＬＴ抗りを０．０５　Ｍ炭酸緩衝液（≠９
６）で至適＠度に希釈し、　ｆｆ１ＬＩｓＡ用マイクロ
プレートの谷ウェルに１００μβずつ入れ４℃にて１晩
静置した。プレートを上記したＴｗｅｅｎ２′０ＰＢＳ
　（１）ｆ’１７．４　）で１回洗浄した。これに被検
血清をＢＳＡ−ＰＢＳで１００倍に希釈し、１００μＬ
ずつ各ウェルに加え、５７℃にて４０分間反応させた。

Ｔｗｅｅｎ２０　ＰＢＳで３回洗浄後、　Ｈ，Ｒ，Ｐ、
標識抗体を１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで至適濃
度に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ加えたあと、３
７℃にて４０分間反応させた。Ｔｗｅｅｎ　２’（ＬＰ
ＢＳで３回洗浄後谷ウェルに１００μぶずつＡＢＴＳ酸
基質全基質３７℃にて６０分間反応させた後、　ＩＬＩ
ＳＡ用吸光度肝吸光度計ンターメツド製）で４０５ｎｍ
の吸光度を測定した。なお抗原Ａに代えて抗原Ｂを用い
て前記と同様に行った。

ｉ）中和試験 実施例と同様に行なった。

従来方法による結果および本発明の方法による結果の比
較 ■　抗原人および抗原Ｂを使用し前記比較例によシ行っ
たＳＰＦ鶏における非特異反応の推移を第１図に示した
。第１図よ・９明らかなようにウィルス粒子を抗原にし
たもの（抗原Ａ）よシもウィルス粒子に界面活性剤（Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を作用させたもの（抗原Ｂ）
のほうが！！！ＬＩＳＡ法で行った場合加令による非特
異反応が減少する傾向にあった。

０８ＰＦ鶏４羽における抗原Ｂを使用した比較例および
実施例の吸光度の経時的推移を第２図に示した。ただし
血清のサンプリングは１ｉＭ令から２５週令まで１週間
ととに採血することにより行った。比較例においては６
週令以後吸光度の上昇傾向を示し、２５週令までの間に
約０．２吸光度が上昇した。一方本発明の実施例におい
ては、加令に伴う吸光度の上昇はほとんど認められなか
った。

■　ＩＬＴ中和試験陽性および陰性の鶏血清（２１０日
令）の各希釈における抗原Ｂを用いて比較例（ｍＬｘｓ
Ａ）および抗原Ｂを用いた実施例（ＬＡＢ　−ＫＬＩＳ
Ａ）の吸光度を第３図に示した。比較例ではＩＬＴ陽性
血清（中和価２．７）とＩＬ’ｒ陰性血清（中和価０．
６５未満）の吸光度にほとんど差が見られず陽性・陰性
の判定が不可能であったのに対し、実施例においては３
２０倍の血清希釈まで陽性血清と陰性血清との間に吸光
度の差が見られた。

■　ＩＬＴ陽性血清２０例と陰性血清３０例のテンプル
における中和指数と、比較例及び実施例の吸光度の対応
関係を第４図に示した。比較例においては陽性血清に対
しては吸光度が高くなるものの、中和指数０．６５未満
の陰性面ｆ＃５０例に対しては吸光度が０．０６〜０．
５２までと非常にばらついておシ、陽性血清の吸光度よ
シも、逆に高いものもあった。一方、実施例においては
、陽性血清に対して０．０７〜０．２２、陰性血清に対
して全て０．０５未満という良好な対応間２係を示して
いる。

■　生ワクチン接種鶏１０羽における本発明の実施例に
よシ測定された吸光度の経時的推移を第５図に示した。

２週令および４週令で生ワクチンを点眼接種したところ
、実施例によシ測定された吸光度は５週令以後急激に上
昇し、７週令以後１７週令まで高い吸光度を保持しその
後ゆるやかに低下した。

■　それぞれ２段階連続希釈した抗原Ｂ、ＯおよびＤの
ＬＡＢ−ｉＬＩｓＡ法で行った場合のＩＩＬＴ陽性血清
およびＩＬＴ陰性血清の吸光度の差を第６図に示した。

抗原０およびＤの場合陽性および陰性血清での吸光度は
共にそれぞれ抗原Ｂを用いた吸光度とほぼ一致し抗原Ｃ
およびＤについても同様の結果が得られた。

〔発明の効果〕

上記からもわかるとおシ、従来のＥ！ＬＩ８Ａでは加令
要因（ａｇｅ　ｆａｃｔｏｒ）によると思われる非特異
反応が６週令以後出現し、その後増加してＺ／いくのに
対し、本発明のＬＡＢ−ＩＬＩＳＡでは非特異反応がほ
とんど見られず、また日令の進んだ鶏血清（２１０日令
）の陽性・陰性血清に対しても従来のＪ！！Ｌ工ＳＡで
はほとんど吸光度に差が現われなかったのに対し、本発
明のＬＡＢ−ＩＬＩＳＡでは３２０倍の血清希釈まで吸
光度に差が認められたため１日令の進んだ鶏血清におい
て従来の１１ｉＬＩＳＡでは診断不可能であったものが
本発明のＬＡＢ−ｆｆｉＬＩｓＡによシ診断可能となっ
た。野外例に応用した場合において４１％従来のＩＬＩ
ＳＡでは中ノ 和価陰性・陽性にはつきシした区別がつかず誤判定の危
険がめったが１本発明のＬＡＢ−］！１ＬＩｓＡによれ
ば中和価陰性サンプルは金側吸光度０．０５未満と非特
異反応が全く見られず精度の高い判定が可能となった。

また生ワクチン接種鶏の抗体の上昇、維持及び低下の動
きを正確にとらえること−が可能となったため野外ワク
チン接種鶏の抗体保有状況の正確な把握が可能となった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗原Ａおよび抗原Ｂを使用し比較例によシ行っ
たＳＰＦ鶏における非特異反応の推移を示すもので１Ｌ
第２図はＳＰＦ鶏４羽における比較例および実施例の吸
光度の経時的推移を示すものであシ、第６図はＩＬＴ中
和試験陽性および陰性の鶏血清（２１０日令）の各希釈
における比較例および実施例の吸光度を示すものであり
、第４図はＩＬＴ陽性血清２０例と陰性血清６０例のサ
ンプルにおける中和指数と、比較例及び実施例の吸光度
の対応関係を示すもので６９、第５図は生ワクチン接種
鶏１０羽における本発明の実施例によシ測定された吸光
度の推移を示すものであ＃）、そして第６図は２段階連
続希釈した抗原Ｂ％ＣおよびＤのＬＡＢ−ｆｆｉＬＩｓ
Ａ法で行った場合のＩＬＴ陽性血清およびＩＬ’Ｉ’陰
性血清の吸光度の差を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ＩＬＴウィルスに界面活性剤を直接作用させて抗原
   としたものに、被検サンプルを作用させビオチンで標識
   された抗体を接触させ、その後にアビジンの結合した標
   識酵素を作用させることを特徴とする鶏伝染性喉頭気管
   炎 （ＩＬＴ）の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体
   測定方法。 ２）界面活性剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０
   、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０およびＴｗｅｅｎ８
   ０、Ｂｒｉｊ５８よりなる群より選ばれることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の鶏伝染性喉頭気管炎
   の抗体測定方法。