JPS60252265A - 発光試薬およびそれを用いる生物学的に活性な物質の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明はアビジンに水溶性有機高分子化合物を介して発
光剤を結合せしめた発光試薬および該発光試薬を用いた
生物学的に活性な物質の測定法に関する。

［従来の技術〕 近年、臨床検査および医学、獣医学、薬学、微生物学、
生化学，また最近ではバイオテクノロジーなどの研究分
野において、微小成分を定量的に極微量成分を定性的に
検定する方法が考案され利用されている。特に抗原・抗
体艮応を利用した方法を例にとれば、放射性同位元素、
酵素、蛍光剤、生物および化学発光剤などで抗体もしく
は抗原を標識し、抗原もしくは抗体を測定する標識免疫
測定方法がある。

とりわけ、放射性同位元素を用いた免疫測定法（ＲＩＡ
）は、最も高感度の分析法どして広く実用的に利用され
ているが、放射性同位元素を取り扱うため、被爆の危険
が伴うし、特別の施設も必要となる。したがってＲＩＡ
にかわる高感度測定法の実現がめられている。

なかでも、発光免疫測定法（ＬＩＡ）はＲＩＡの利点を
残し、放射性同位元素のかわりに発光剤を利用する取り
扱いやすい方法である。しかし、現在のところＬＩＡは
ＲＩＡに比較して、感度が低いので、適用範囲が限られ
ている。また、一部の物質については、ＲＩＡに四敵す
る測定感度をあげている測定法として酵素免疫測定法（
ＥＩＡ）があるが、必ずしも全ての物質についてＲＩＡ
と同様の感度をあげているわけでもなく、試薬も比較的
高価であり、また取り扱いもＲＩＡやＬＩＡほど容易で
はないので、ＲＩＡを浚駕するまでには至っていない。

一般にＲＩＡ法に代表される免疫測定法は原理的に２方
法に大別される。１つは競争法であり他の１つはサンド
ウィッチ法と称されている方法である。競争法とは、抗
原もしくは抗体である被測定物質を含む測定試料液と、
前もって放射性同位元素などの標識剤で標識しておいた
既知濃度の被測定物質を混合し、そこに抗体もしくは抗
原を混合し反応させると抗原−抗体複合物ができるが、
複合物または複合物を形成しなかった遊離物質には標識
された被測定物質と標識されていない被測定物？１が含
まれでおり、その比率を測定することで検体中の被測定
物質の測定を行なう方法である。他の１つの方法である
サンドウィッチ法は、被測定物質と特異的に結合する結
合のパートナーを固定化しておいた固相と、別に用意し
た被測定物質と特異的に反応しうる物質を放射性同位元
素などで標識して得た標識した結合物質とで被測定物質
をサンドウィッチした俊、固相もしくは液相中の標識物
質の測定を行なうことにより、被測定物質の測定を行な
う方法である。

一方、最近微量最近、ウィルスなどの検出、同定の目的
でＤＮＡプローブという手法が行なわれている。ＤＮＡ
は２本の鎖が互いにまきついて二重らせん構造をとって
いる。二重らせんをほぐくことによって２本の鎖にする
こともできるし、再びもとの構造にもどすこともできる
。検査に当っては検体中のＤＮＡを変性して一本鎖とし
、これを固相に固定した後放射性同位元素酵素などで標
識された一本鎖ＤＮＡとインキュベートする。もし、検
体中のＤＮＡが標識ＤＮＡと相補関係にあればハイブリ
ッドを形成する。しかる後、標識物を検出することによ
り目的とするＤＮＡの検出、同定を行なうことかでさる
。

従来、標識法の中でも発光剤による標識は、多くの場合
活性物質に直接発光剤を結合することにより行なわれて
いる。かかる方法は発光の量子収率の低下、および活性
物質の不溶化、または特異性の低下をきたす。また高感
度の測定を目的とする場合、できるだけ多数の発光剤を
結合させる必要がある。しかるに発光剤、特に化学発光
剤の多くは水に対する溶解度が低く、結合する発光剤が
増加すると活性物質は溶化してしよう。ぞこで水溶性の
高い、しかも発光剤が結合可能な官能基を多数有する高
分子化合物に多数の発光剤を結合させたうえ、活性物質
に結合させることで上記欠点を改良できることは特開昭
５８−６１４（’３８により公知であるが、この場合発
光剤結合水溶性有機高分子化合物を直接活性物質に結合
している。このことは活性物質の本来の結合力を低下さ
せ延いては測定感度の低下をきたすものと考える。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、従来の発光標識法に比べぎわめで感度の高い
、生物学的に縮性な物質の測定法を提供することにある
。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、発光剤が結合された水溶性有機高分
子化合物にアビジンを結合してなる発光試薬を提供する
ものである。

さらに本発明は検体中の生物学的に活性な物質を測定す
る方法においてビオチンを被測定物質と特異的に結合す
る物質または被測定物質と同一の物質に結合させたビオ
チン結合物質と、被測定物が特異的に結合する物質およ
び被測定物資とを反応させ、該反応によって生成した複
合体に、上記発光試薬を反応させ、ビオチン−アビジン
結合により複合体に結合した発光試薬または複合体に結
合せず遊離の状態で残った過剰の発光試薬の発光反応に
よる発光剤を測定することを特徴とする生物学的に活性
な物資の測定法をも提供するものである。

本発明で使用するアビジンは卵白中に存在する分子量約
６８０００の塩基性糖蛋白質であり、ビオチンは の構造を持つ物質である。

アビジンとビオチンとは極めて強い親和性をゆうしてお
り、その親和定数は１０Ｍ−１である。発光剤は化学発
光剤でも生物発光剤でもかまわない。生物発光剤にはル
シフェリンなどがあるが、酵素などの生体物質を使用す
るので反応も煩雑かつ複雑となり、特に生体物質を免疫
反応により測定する時には測定誤差を与える可能性もあ
る。したがって発光剤どしでは化学発光剤の方が好まし
い。化学発光剤としては、ルミノール、イソルミノール
、ロフィン、ルシゲニンなどがあるが、発光の量子効率
、安定性、操作性などの点を考慮すると、ルミノール、
イソルミノールおよびその誘導体が好ましい。

また、発光剤を結合づべき水溶性有機高分子化合物どし
ては、アルブミン、グロブリン、糖タンパク質および多
糖などの生体高分子化合物または合成ポリペプチド、あ
るいはヒドロキシル基、ヂオール阜、アミノ基、スルホ
ン酸基、およびカルボキシル基よりなる群から選ばれた
少なくとも一種を側鎖に有する合成有機高分子の化合物
が好ましい。

さらに発光剤の水溶性有機高分子化合物への結合は操作
中に発光剤が遊離し、検査値が変動したりしない為には
、共有結合か儀も好ましい。具体的には発光剤の官能基
（たとえばルミノール、イソルミノールまたはそれらの
誘導体の場合はアミノ基）を利用してポリアルデヒド類
、ジスクシミド類、カルボジイミド類、臭化シアンなど
の水溶性有機高分子化合物の官能基に対応した結合剤を
用いるのが好ましい。たとえば、水溶性有機高分子化合
物どしてカルボキシル基を有するものを使用する時はカ
ルボジイミドを、またアミノ基を有する水溶性有機高分
子化合物を使用する時はグルタルアルデヒド、ジアゾニ
ウム、またはイソチオシアネートなどを結合剤として用
いるのが好ましい。

また発光剤結合水溶性有機高分子化合物をアビジンと結
合する場合は、アビジンのビオチンへの結合力を弱めな
いかぎりその官能基（例えばアミノ基）を利用じて上記
結合剤で結合できる。

本発明の測定法には代表的な方法どじで→ノンドウィツ
チ法および競争法がある。

リーンドウィッヂ法は、検体中の生物学的に活性な被測
定物質と、被測定物質に特異的に結合する結合のパート
ナーを固定化した固相、および被測定物質に特異的に結
合する性質がありかつビオチンを結合させたビオチン結
合物質を反応させた後、発光試薬を反応させ、ビオチン
ーアビジン結合にまり固相に結合した、または結合しな
いで遊離の状態で残った発光試薬の発光反応による発光
呈を測定することにより被測定物を測定する方法である
。

競争法は、検体中の生物学的に活性な被測定物質および
ビオチンを結合させたビオチン結合被測定物質を、被測
定物質に特異的に結合する結合のパートナーを固定化し
た固相に反応させた後、発光試貼を反応させ、ビオチン
ーアヒジン結合により固相に結合した、または結合しな
いで遊離の状態で残った発光試薬の発光反応による発光
量を測定することにより、被測定物質を測定する方法で
ある。

本発明で゛固相と検体の反応を行なう場合に使用りる固
相は特に限定はない。形状は球状、微粒子状、棒状、板
状、膜状なと適当な形状のものでよい。粒子状の固相を
使用すれば、固相をカラムにつめて測定の操作をフロー
形式で行なうことも可能となる。固相の素材は生体構成
成分や金属などでしよいが、形状を一自由に調節でき、
しかも安定である有機高分子化合物が好ましい。例えば
ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロ
ニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリε−カプラミ
ド、ポリエチケンテレフタレートなどの疎水性重合体群
、あるいはセルロース、アセチルセルロース、ニトロセ
ルロース、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド
、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール
、ポリ（２−オキシエヂルアクリレート）、ポリ（２−
オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキ
シプロピル）アクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシ
プロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメ
タクリレートなどの架橋した親水性重合体群、もしくは
両方の性質を持つ共重合体群がある。

検体中の物質、ビオチン結合物質または発光剤結合アビ
ジンなどの非特異的吸着を少くし、Ｓ／Ｎ比を高くりる
為には親水性重合体群もしくは共重合体群が好ましい。

また同相の形状は根、試験管、マイクロプレートなどで
もよいが、微粒子を固相とすれば表面積を容易に増加さ
せることができる。

固相への結合のパートノーの固定化方法としては、物理
吸着と化学結合がある。例えば疎水的な固相には蛋白な
どは物理吸着で固定化できるし、ＤＮＡはセルロースお
よびその誘導体ないしナイロンに物理吸着で固定化でき
る。またアミノ基やカルボキシル基が官能基として存在
する固相にはカルボジイミドでカルボキシル基やアミノ
基を有する物質を共有結合で固定化できるし、アミノ基
またはカルバモイル単を有する固相にはアミノ基を有η
る物質をグルタルアルデヒドなどのポリアルデヒドで共
有結合により固定化できるし、ヒドロキシル基を有する
固相には臭化シアンによりアミノ基を有する物質を共有
結合で固定化できる。また、アルデヒド基またはエポキ
シ基を有する固相にはアミノ基を有する物質を直接反応
をさせて共有結合により固定化できる。

またメルカプト基を有する固相には、メルカプト基を有
する物質をジマレイミドをバインダーとして結合させる
ことができる。固相の洗浄に界面活性剤を含有させた洗
浄液を使用することもあり、固定化方法どしては同定化
した物質が脱制する危険のある物理吸着法に比して共有
結合法が好ましい。

本発明で使用する結合のパートナ−とは被測定物質に特
異的に結合しつる物質である。

例えば、被測定物質が抗原、抗体、ホルモン抗原抗体複
合体、糖類、免疫グロブリン、リンフォカイン、補体な
どの場合には順に抗体、抗原、該ホルモンリセプター、
リューマチ因了、レクチン、プロティンＡ、該リンフオ
カインリセプター、該補体リセブターなどとの絹み合わ
せがそれぞれ被測定物質と結合のパートナ−の組み合わ
せになりつる。また全ての物質について、特異抗体が存
在する場合には、その特異抗体および対応覆る抗原パー
トナーどなりうる。また被測定物質がＤＮＡおよびＲＮ
Ａの場合には相補ＤＮＡまたは相補ＲＮＡが結合のパー
トナーである。

サンドウイッチ法では、一般にはまず結合のパートナー
を固定化した同相と検体とを反応させ次に、被測定物質
が結合のパートナーを介して結合した同相どビオチン結
合物質とを反応させる。この後にサンドウィッチ法では
一般的に固相と液相どを分離し洗浄する操作がある。し
かし、個相側とビオチン結合物質側とに同一物質に対す
るしかも別の抗原結電部位に対する抗体を結合させるな
どして、１段階の反応で同相とビオチン結合物質によっ
て被測定物質をサンドウィッチすることによりこの段階
での分離および線状操作をはぶくことも可能である。

一方、競争法でも検体とビオチン結合物質とを同時に加
えないで、検体と固相との反応後にビオチン結合物質を
加えることがあるが、どちらにしてもビオチン結合物質
を固相の結合のパートナーと反応させている。

本発明のサンドウィッチ法で使用するビオチン結合物質
は被測定物質と特異的に結合する物質であればよく、固
相に固定化した結合のパートナーと同一物質であっても
かまわないし、異なる物質であってもかまわない。

例えば被測定物質がイムノグロブリンの場合、固相に結
合さける結合のパートナーとしてプロテインＡを用い、
ビオチン結合物質として抗イムノグロブリン抗体を用い
てもよいし、また両者共に抗イムノグロブリン抗体を用
いてもにい。

被測定物質と特桿的に結合する物質または被測定物質と
同一の物質へのビオチンの結合は、アビジンとビオチン
との親和性が極めて強いことから、共有結合が最も好ま
しい。具体的には、ビオチンのカルボキシル基をスクシ
イミジル化するか、もしくはそのままでカルボジイミド
を用いて結合させる方法などが好ましく使用される。

本発明において被測定物質となりうる物質は、生物学的
に特異的な親和性を有する物質をパートナ−どして有し
ている物質であり、具体的には例えば連鎖球菌、ブドウ
球菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、赤痢菌などの細菌
およびその構成成分に対する抗体；梅毒トレポネーマな
どのスピロヘータおよびその構酸成分に対する抗体；マ
イロプラズマおよぴその構成成分に対する抗体：マラリ
ア原虫などの原虫類およびその構成成分に対する抗体；
リケッチャアおよびその構成成分に対する抗体；インフ
ルエンザ、アデノウイルス、ポリオーマ、麻珍、風疹、
肝炎、おたふくかぜなどのウイルスおよびその構成成分
ならびにそれらに対づる抗体；多糖類、ヒトアルブミン
、卵白アルブミンなどの異種抗原ならびにぞれらに対す
る抗体；インシュリン、サイロイドホルモン、絨毛性ゴ
ナドトロビンなどのホルモン：リボヌクレアーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼ、アスパラギナーゼなどの酵素；
腎臓細胞膜、肝臓細胞膜、α−フエトプロテイン、ＣＥ
Ａなどの器管固有の抗原またはリセプター；コラーゲン
、アミロイドなどの結合組織成分；赤血球、面小板など
の血球抗原、またはリセプター；フィブリン、ブラズミ
ノーゲンなどの血漿タンパク質：リコーマチ因子やＣ反
応性タンパク質などの病理グロブリン；免疫複合体；細
胞膜などに対する自己抗体；前記ウィルスおよび細菌の
ＤＮＡ、ヒトおよび動物白血球のＤＮＡ，ヒトおよび動
物内蔵組織細胞のＤＮＡ、癌細胞中のＲＮＡなどがある
。

ビオチン結合物質と検体が結合した固相を反応させた後
、発光試薬を加えて反応させる。

ビオチン結合物質と発光試薬は検体溶液に同時に加えて
もよいが、後で発光試薬を加えた方が、誤差が少なくな
り好ましい。

またビオチン結合物質が結合した同相と発光試薬との反
応後、液相ど固相とを分離し、どちらかの発光を測定す
る。発光試薬を発光さける方法は、Ｍ離の発光剤の場合
と同様である。発光剤が生物発光剤の場合には酵素、例
えばルシフェリンルシフェラービや補酵素、例えばＡＴ
Ｐを添加し測定する。化学発光剤の場合には触媒の存在
下に酸化剤を加えて反応させる。

酸化剤としては例えば過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウ
ム、過硫酸アンモニウム、過ホウ酸ナトリウム、ヨウ素
、過ヨウ素酸ナトリウム、分子状酸素、過酸化カリウム
、過マンガン酸カリウムなどを挙げることができる。

触媒は一般に金属化合物で、例えば赤血塩、ヘモグロビ
ン、ヘチマン、ヘミン、フェリチン、ポルフィリン、塩
化第一コバルト、酢酸銅、チトクロームＣなどをはじめ
、ニッケル、マンガン、クロムなどの塩類、錯塩類およ
び有機金属化合物を使用することができる。

発光量の測定には、フォトンカウンター、シンチレーシ
ョンカウンターなど発生した光子数を計測できる装置を
使用することがのぞましい。

既知濃度の被測定物質を本方法で測定し、被測定物質濃
度と発光強度との関係をめておき、未知濃度の被測定物
質の発光強度から逆に被測定物質の定量を行う。

〔発明の効果］ 本発明の発光試薬を用いることにより従来の発光標識法
と比較し、格段に改良された感度が得られた。

以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的的に説明する
。

実施例１ ポリアクリル酸５０ｍ９のジオキサン溶液１ｍｌにＮ−
ヒドロキシスクシンイミド４０ｍｇとジシクロヘキシル
カルボジイミド７２ｍｇを加え室温で２時間撹拌した後
、析出した固体を除きポリアクリル酸活性エステルのジ
オキサン溶液を調整した。

アビジン１０ｍｙどＮ、Ｎ−アミノブチル−エチルーイ
ソルミノール（ＡＢＥ＋”）１ｍｇを０．１Ｍ炭酸緩衝
液（ｐＨ＝１０）１ｍｌに溶解し、上記ポリアクリル酸
活性エステルのジオキサン溶液１０μｌを加えて室温で
２時間撹拌した。反応液を０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液
（ＰＢＳ）１ｌで１７時間、さらに０．８ｌで５時間透
析して未反応ＡＢＥＩを除き、ＡＢＥＩ標識アビジンを
調整した。

上記ＡＢＥＩ標識アビジンを用いて、ウサギＩｑＧの定
量を行った。シアノゲンプロマイドで活性化した粒子径
６μｍのグリセリルメタクリレートを主成分とするポリ
マー粒子に抗ウサギＩｇＧを固定化してウシ結線アルブ
ミン（ＢＳＡ）１％を含むＰＢＳに１％に分散した。

分散液１００μｌと種々濃度のウサギＩｇＧのＰＢＳ（
ＢＳＡを１％含む）溶液１００ｕｌを混合し、室温で１
時間振誠してから非イオン慴界面活性剤゛ツイン２０“
を０．１％含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ１００μｌとビ
オチン結合抗ウサギＩｇＧ１０μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液１
００μｌを加えて室温で１時間振盪した。ポリマー粒子
を″ツイン２０”を０．１％含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢ
Ｓ１００μｌとＡＢＥ標識アビジン溶液のＰＢＳによる
１０倍希釈液１００μ℃を加え、さらに室温で１時間振
盪後、ツイン２０を０．１％含む０．１Ｍ炭Ｍ緩画液（
Ｉｌｌ−１＝１０）で洗浄してＰ１３３１００μｔに分
散した。この分散液５０μｆに０．５ＮＮａＱｌｌ水溶
′ａ１００μｉおよび０．０１％次ｒｎｉ塩索酸す１ヘ
リウム１００μｌを加えることにより粒子表面に存在す
るＡＢＥＩを発光させた。ＬＵＭＡＣ（バイオカウンタ
ーＭ２０１０）で発光量を測定して表１に示すようにウ
サギＩｇＧを１０ｎｇ／ｍｌ以上で測定できた。

実施例２ アルギン酸ナトリウム５ｍｇとＡＢＥ１２ｍｌおよびア
ビジン２ｍｇを５ｍｇの水に加え、希塩酸でｐＨを４．
５ヘ５．０に調節した。氷水中で撹拌しつつ、Ｎ−アセ
チル＝Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）６ｍｇを加え希塩酸でｐＨを
４．５〜６．０に調節してざらに４時間撹拌後ｐＨを７
．０とした。ＰＢＳ１ｌで１６時間、さらに１ｉで５時
間透析して未反応ＡＢＥＩを除きＡＢＦＥＩ標識アビジ
ンを調製した。

上記ＡＢＦＴ標識アビジンを用いて実施例１と同じ操作
でウサギＩｇＧの定量を行なった結果、表１に示すよう
に１ｎｇ／ｍｌ以上で測定できた。

比較例 抗ウサギ１ｇＧ３ｍｇ／ｍｌ溶液５００μｌとＡＢＥ１
２ｍｇを４ｍｌの水に加え、希塩酸でｐＨを４．５〜５
．０に調節した。氷水中で撹拌しつつ、ＥＤＣ５ｍｇを
加え、希塩酸でｐＨを４．５〜６．０に調節して、さら
に４時間攪拌後ｐＨを７．０とした。ＰＢＳ１ｌで１６
時間、さらに１ｌで５時間透析して未反応ＡＢＥＩを除
き、ＡＢＥＩ標識抗体を調整した。

上記ＡＢＥＩ標識抗体を用いてウサギＩｇＧの定量を行
った。抗ウサギ１ｇＧ固定化ポリマー粒子分散液１００
μｌと種々濃度のウサギＩｇＧのＰＢＳ（ＢＳＡを１％
含む）溶液１００μｌを混合し、室温で１時間振湯した
。ポリマー粒子を“ツイン２０”を０．１％含むＰＢＳ
で洗浄し、ＰＢＳ１００μｌとＡＢＥＩ標識抗体溶液の
ＰＢＳによる１０倍希釈液１００μｌを加え、室温で１
時間振湯した。ポリマー粒子をツイン２０を０．１％含
む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｌ−１＝１０）で洗浄し、粒
子表面に存在覆るＡＢＥＩの発光量を実施例１と同じ操
作で測定した。その結果、表１に示すようにウサギＩｇ
Ｇを１００ｎｇ／ｍ２以上で゛測定できた１゜上記実施
例および比較例に示づ通り、アビジン、ビオチンを使用
した場合、抗体に直接発光剤を標識した場合と比較する
と一桁以上感度が高い。このことは直接標識により抗体
活性の低下または免疫反応が阻害されたことを示１もの
ど名えられる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）発光剤が結合された水溶性有機高分子化合物にア
   ビジンを結合してなる発光試薬。
2. （２）生物学的に活性な物質を測定する方法において、
   ビオチンを被測定物質が特異的に結合する物質または被
   測定物質と同一の物質に結合させたビオチン結合物質と
   、被測定物質が特異的に結合する物質および被測定物質
   とを反応させ、該反応によって生成した複合体に、発光
   剤が結合された水溶性有機高分子化合物にアビジンを結
   合してなる発光試薬を反応させ、複合体に結合した発光
   試薬または複合体に結合せず遊離の状態で残つた過剰の
   発光試薬の発光量を測定することを特徴とする生物学的
   に活性な物質の測定法。