JPH0365760B2 - - Google Patents
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- JPH0365760B2 JPH0365760B2 JP63239896A JP23989688A JPH0365760B2 JP H0365760 B2 JPH0365760 B2 JP H0365760B2 JP 63239896 A JP63239896 A JP 63239896A JP 23989688 A JP23989688 A JP 23989688A JP H0365760 B2 JPH0365760 B2 JP H0365760B2
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Description
産業上の利用分野
本発明は、血液又は血液から導出した試料中の
血清のフルクトスアミンを特異的に測定する方法
に関する。この方法では妨害試料成分を、フルク
トスアミン含量の測定前に除去する。 従来の技術 血清のフルクトスアミンとは、非酵素グリコシ
ル化血清蛋白質の全含量である。これは、血清の
グルコースがそのカルボニル基によつて遊離蛋白
質アミノ基とシツフの塩基を形成して生じる。続
いてこのものは、アマドリ転移によつて安定なケ
トアミン結合を有するフルクトスアミンに変換す
る。 血清のフルクトスアミンの半減期は、ケトアミ
ン結合の安定性のために実際に血清蛋白質の半減
期と同一であり、その半減期は平均して約21日間
である。相応する研究は、L.Y.Seng及びM.J.
Staley：Journal of Clinical Chemistry（1986
年）第32巻、第560頁に記載された。 フルクトスアミンの形成量は、血液のグルコー
ス含量に比例する。これは、周知のように糖尿病
患者では、不十分な食餌上及び薬物上の物理代謝
の場合には、はつきりと現れた病理学的現象に結
合した著しい変動を蒙むり得る。 血液のグルコール測定によつて、医師には血液
採取の時点に存在する物質代謝の状態に関する情
報が得られるのに過ぎない。これに反して、最後
の120日間の物質代謝の状態に関する長い期間の
検査は、グリコシル化ヘモグロビン（HbA1）の
測定で可能である。血清のフルクトスアミン測定
は、その半減期によつて糖尿病患者の物質代謝の
営みを、生活基準及び治療法によつて約３週間の
平均期間にさか上つて確かめるために適当であ
る。それ故、確立された臨床的診断パラメータの
血液のグルコース並びにグリコシル化ヘモグロビ
ン（HbA1）に関連して、血清のフルクトスアミ
ンを測定する確実で特別の実際的方法で、糖尿病
患者を有用な平均期間のパラメータについて監視
する診断法は拡大することができる。 原理から簡単に実施することのできる血清のフ
ルクトスアミン測定法は、Baker：ヨーロツパ特
許第0085263号明細書及びJohnsonその他：
Clinica Chimica Acta（1982年）第127巻、第87
〜95頁に記載されている。これは、ケトアミン形
がアルカリ性水媒体中でエノール形に変り、エノ
ール形はテトラゾリウム塩、例えばニトロテトラ
ゾリウムブルーに還元作用し、その際ホルマザン
色素を生じることに基づく。一定間隔で37℃で測
光によつて測定した色素形成の量は、存在するフ
ルクトスアミンの量に比例する。 この試料は、試料として血清を使用する場合に
は妨害を受けやすい。それというのも天然の血清
成分、例えばビリルビン、尿酸及びSH基は、同
じようにしてテトラゾリウム塩に対して還元作用
をするからである。アセチルサリチル酸のメタボ
ライトである薬品、例えばα−メチルドパ、薬品
の分解生成物、例えばアセチルサリチル酸の代謝
物質であるゲンチシン酸並びにアスコルビン酸
も、血清の濃度によつて変造測定結果をもたら
す。 この妨害は、既に正常な及び食餌療法患者の血
清で作用を発揮し、例えばSchleiches及び
Wieland（Journal of Clinical Chemistry、
Clinical Biochemistry、第19巻、第81〜87頁、
1981年）によるフロシン／HPLC法と方法を比較
すると、絶対的数値が非酵素グリコシル化の範囲
に関して可能であり、Bakerによる血清のフルク
トスアミン測定法ではフルクトスアミンの直線上
相関性が得られるが、実際でない場合にBaker法
は既に著しい非酵素グリコシル化を示す。これ
は、図式上でBaker法の結果がフロシン／HPLC
法の結果に対して示される図表では、Baker試験
の側で、既に血清のフルクトスアミンが全く存在
しない場合に軸線部分が生じ、その値は平均し
て、非糖尿病患者の値の約50％になる（第１図参
照）。 更に、従来血清のフルクトスアミン測定は妨害
を受け、これは試料から試料に変動する全蛋白質
の含量に起因する。測定は測定値のふれをもたら
し、これにより、測定法の感度は減少する。この
妨害はマトリツクス効果としても公知である。こ
の結果は、例えば通常標準溶液を製造する場合の
ように付加的蛋白質の添加で特に明らかである。
増大する蛋白質の量によつて、フルクトスアミン
と色試薬との反応が遅延する（E.J.Hindleその
他：Annals of Clinical Biochemistry、第22巻、
1985年、第84〜89頁参照）。 他の難点は、高脂肪血症性血清のフルクトスア
ミンの測定で生じる。一般に試料中の低フルクト
スアミン濃度の場合でも、なお十分に大きい測定
シグナルを得るためには、試料／試薬の容量比
0.1が必要である。しかしながら過トリグリセリ
ド濃度の場合、このように大きい試料成分では、
得られる試料パツチの溷濁は測光測定で負であ
る。フルクトスアミンの測定は著しくむづかしく
なるか又はむしろ阻止される。 発明が解決しようとする課題 それ故、更に前記欠点を有しない血液又は血液
から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含
有を特別に測定する方法の必要がある。本発明の
課題は、かかる方法を得ることである。 課題を解決するための手段 この課題は、本発明の特許請求の範囲の記載に
よつて解決される。 本発明によつて血液又は血液から導出した試料
中の血清のフルクトスアミン含量を、適当な色試
薬と反応させ、これによつて生じた色変化を測定
して特異的に測定する方法は、色反応の前に、非
特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹
起する試料成分をほゞ中性PHで除去し、続いてPH
10〜12を調整し、色試薬を添加することを特徴と
する。 非特異的還元作用を有する試料成分を除去する
ためには、試料に１種又は数種の酸化性作用酵素
を添加する。好ましくは酵素酸化剤としては、ア
スコルベート−オキシダーゼ、ビリルビン−オキ
シダーゼ又は／及びウリカーゼを添加する。ペル
オキシダーゼは、場合により生じる過酸化水素と
一緒に付加的酸化分解工程を生ぜしめ、これは酸
化剤の効力をなお付加的に高める。場合により添
加したカタラーゼは、なかんずく過剰量の過酸化
水素を除去するのに役立つ。 殊に脂肪血症性試料を検査するためには、１種
又は数種の酸化性作用酵素に、場合によりリパー
ゼを、場合により１種又は数種の清浄剤又は／及
び強酸塩と一緒に添加するのが有利であることが
判明した。かかる混合物によつて、溷濁を惹起す
る物質を、続く色測定がもはや損なわれないよう
に十分に除去することが達成される。しかしなが
ら、試料の希釈及び清浄剤の添加に応じて、脂肪
血症の妨害は、専ら非酵素的に１種又は数種の清
浄剤によつて除去することもできる。 意外なことにも、更に１種又は数種のSH基封
鎖試薬の添加によつて、本発明による血清のフル
クトスアミン測定法と、フロシン／HPLC−比較
法との十分の相関性が軸線部分を有しないで得ら
れることが判明した。試料中に非酵素グリコシル
化蛋白質が存在しない場合には、このようにして
実際に色反応も認められない（第２図）。 SH基封鎖試薬は、SH基と反応するものであ
る。これは文献に多く記載されている。次の論文
が挙げられる： A.N.Glazer、R.J.Delange、D.S.Sigman著；
Chemical modification of proteins.Laboratory
techniques in biochemistry and molecular
biology（T.S.Work及びE.Work、編集）（1975
年。 C.H.W.Hirs、S.N.Timasheff、編集；
Modification reactions：Methods in
Enzymology 25巻、387−671頁（1972年）。 C.H.W.Hirs、S.N.Timasheff、編集；
Chemical modification：Methods in
Enzymology47巻、407−500頁（1977年）。 R.L.Lundblad、C.M.Noyes著；Chemical
reagents for protein modification。CRC出版、
ボカ・ロタン（Boca Rotan）、フロリダ
（Florida）（1984年）。 適当なSH封鎖剤は、例えばヨードアセトアミ
ド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインイミ
ド、ｐ−ヒドロキシメルクリベンゾエートであ
る。本発明方法の特に適当なものとしては、ヨー
ドアセトアミドが判明した。 妨害成分を除去するための前記物質によつて、
マトリツクス効果として公知の試料中の変動する
全蛋白質量による測定値の変動も抑制するか又は
完全に除かれる。これと共に正確な蛋白質補正の
前提条件は、フルクトスアミン／全蛋白質の商に
よつて得られる。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去するためには、試料
を、適当な非還元性緩衝剤中に酸化作用を有する
酸素及びSH基封鎖剤並びに場合により１種又は
数種の脂質分解酵素、並びに場合により１種又は
数種の清浄剤又は／及び強酸塩を含有する溶液で
培養するのが有利であることが判明した。この溶
液を製造するためには、非還元性作用を有し、そ
の緩衝作用が中性PHであるすべての緩衝剤が適当
である。PH６〜９、好ましくは７〜8.5、特に好
ましくは7.5〜8.0が好ましいことが判明した。緩
衝剤の濃度は、好ましくは10〜100ｍモル／、
特に好ましくは20〜70ｍモル／である。特に好
ましくは、燐酸カリウム緩衝剤水溶液が判明し
た。 添加酵素の濃度は、除去すべき妨害化合物の濃
度による。通常この酵素の濃度は、0.01〜
10000U／mlである。好ましい濃度範囲は、例え
ば次のものである： ウリカーゼ １−15U／ml ビリルビン−オキシダーゼ 0.05−5U／ml アスコルベート−オキシダーゼ ２−20U／ml リパーゼ 0.5−5U／ml ペルオキシダーゼ 0.5−5U／ml カタラーゼ 100−10000U／ml この酵素の特に好ましい範囲は、次のものであ
る： ウリカーゼ ２−10U／ml ビリルビン−オキシダーゼ 0.1−1U／ml アスコルベート−オキシダーゼ ５−15U／ml リパーゼ １−3U／ml ペルオキシダーゼ １−3U／ml カタラーゼ 500−2000U／ml SH基封鎖剤としては、原則として文献での公
知試薬を包含するすべてのもの、例えばヨードア
セトアミド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレ
インイミド及びｐ−ヒドロキシメリクリベンゾエ
ートである。特に適当なものとしては、ヨードア
セトアミドが判明した。SH基封鎖剤の好ましい
濃度範囲としては、0.5〜500ｍモル／、特に好
ましくは５〜50mlモル／である。 清浄剤は陽イオン性清浄剤の他にも、陰イオン
性又は非イオン性清浄剤であつてもよい。陰イオ
ン性清浄剤としては、胆汁酸のアルカリ金属塩又
はアルカリ土類金属塩及びその共役物が好まし
い。陰イオン性清浄剤の好ましい濃度は、２〜10
ｍモル／である。特に好ましくは濃度４〜６ｍ
モル／のコール酸ナトリウムであることが判明
した。 非イオン性清浄剤としては、広いパレツトの清
浄剤が選ばれる。適当なものとしては、なかんず
くアルコール部にＣ原子８〜20個及び分子当りグ
リコール単位４〜15個を有する直鎖状又は分枝状
アルキル−又はアルキルアリール−アルコール−
ポリグリコールエーテルが判明した。アルコール
部にＣ原子８〜12個及び分子当りグリコール単位
４〜８個を有する直鎖状及び分枝状アルキル−ア
ルコール−ポリグリコールエーテルが、特に好ま
しい活性作用を及ぼす。 血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定す
る本発明方法には、アルコール部の構造に関して
単一であるか又はアルコール部の構造に関して異
なる数種のポリグリコールエーテルからなる混合
物であつてもよい非イオン性清浄剤が適当であ
る。適当な非イオン性清浄剤は、例えばオキセタ
ル（Oxetal）RID104〔ツシムマー（Zschimmer）
及びシユウアルツ（Schwarz）、ドイツ国〕、プロ
デユクト（Produkt）RT240R〔Zschimmer及び
Schwars、ドイツ国〕、ルテンゾル（Lutensol）R
ON50、ON60、ON70〔BASF、ドイツ国〕並び
にソプロホル（Soprofor）RＤ／916〔ローヌ・プラ
ン（Rhone‐Poulenc）、フランス国〕である。 本発明により非特異的の還元作用を有するか、又
は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去するため
に使用する非イオン性清浄剤の濃度は、0.05〜15
重量％である。好ましい濃度範囲としては、0.1
〜５重量％である。 溷濁除去作用は、反応溶液中の高イオン強度に
よつてなお増大させることができる。このために
は、アルカリ性PH範囲内で溶解する強酸塩の添加
が好ましいことが判明した。好ましいものは、塩
酸又は硫酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
属塩である。特に好ましくは塩化カリウム又は−
ナトリウムを使用する。添加強酸塩の濃度は、20
〜100ｍモル／である。特に好ましくは、塩を
濃度40〜60ｍモル／で添加する。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去は、温度25〜40℃、好
ましくは37℃で１〜15分間、好ましくは２〜６分
間行なう。選ぶべき培養時間は、非特異的還元作
用を有する及び溷濁を惹起する試料成分の量及び
その除去に使用した添加剤の量による。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去するための培養は、使
用酵素のPH最適値のためにほヾ中性PHで行なう
が、色試薬とフルクトスアミンとの色反応はPH10
〜12で進行するので、培養後に再び緩衝させるの
が必要である。PHの増大は、PHが調整すべきPH以
上である緩衝剤によつて行なう。PH10.5〜12.5、
特に好ましくはPH10.7〜12.2を有する緩衝剤が特
に有利である。このために好ましくは炭酸塩緩衝
剤を使用し、その濃度は150〜300ｍモル／、特
に好ましくは180〜220ｍモル／である。 公知方法で色試薬をアルカリ性範囲内で添加し
て、フルクトスアミンの還元性作用を明らかにす
ることができる。このために好ましくはテトラゾ
リウム塩を使用し、そのホルマザン色素の形成を
視覚によるか又は測光によつて追求することがで
きる。テトラゾリウム塩としては、“Methods of
Enzymatic Analysis”〔H.U.Bergmeyer、第３
版、ヘミー（Chemie）社、ワインハイム
（Weinheim）、1983年、第１巻、第200頁〕に記
載されている塩が好ましい。特に適当なものは、
ニトロテトラゾリウムブルー（NBT）又は３−
（4′，5′−ジメチルチアゾリル−２−）−２，４−
ジフエニル−テトラゾリウムブロマイド
（MTT）である。色試薬は、再緩衝後並びに緩
衝剤と同時に試験バツチに添加することができ
る。このためには、色試薬を、再緩衝に必要な緩
衝剤に溶解するのが好ましいことが判明した。テ
トラゾリウム塩には、濃度0.2〜２ｍモル／が
好ましく、0.4〜1.5ｍモル／が特に好ましいこ
とが判明した。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去した後の再緩衝には、
緩衝剤を、試験バツチのPHが色試薬の存在でPH10
〜12、好ましくは10.3〜10.6を有するように大量
に添加する。 再緩衝溶液は温度25〜40℃、好ましくは37℃で
培養する。色試薬の還元に基づく色変化は、再緩
衝後に一定の時間間隔で、好ましくは１〜15分の
間測光によつて追求する。最初の測定は再緩衝後
１〜10分の間に、最後の測定は再緩衝後２〜15分
の間に行なう。必要によつて、測定は２回又は数
回行なうことができる。２回の測定の間隔を変え
ることができる。間隔は装置の配置によつて選ぶ
ことができ、数秒並びに数分であつてもよい。 得られた測定値を、標準溶液の測定値と比較す
るのが好ましい。適当な標準溶液は公知である。
このためには、例えばJohnsonその他：Clinica
Chimica Acta（1982年）第127巻、第87〜95頁に
記載の標準物を使用することができる。このもの
は合成フルクトスアミンの一定添加量を有する人
体のアルブミンからなるマトリツクスを基質とし
ている。合成フルクトスアミンとしては、１−デ
スオキシ−１−モルホリノ−フルクトース
（DMF）を使用する。試料中の測定した血清のフ
ルクトスアミン濃度は、この標準物を使用する際
にDMF単位で記載する。同じようにして標準物
として適当なのは、人体の血清アルブミン又は牛
の血清アルブミン又はそれぞれ公知グリコシル化
度を有する他の蛋白質である。 意外なことにも本発明方法によつて、Johnson
その他の方法によつて常用である試料／試薬の容
量比0.1を、同じ測定間隔及び同じ温度での培養
で、試料として使用したフルクトスアミン類似物
の一定量での測定シグナルがJohnsonその他に記
載の方法と比較して著しく小さくならないので下
げることが可能になる。フルクトスアミン類似物
としては、例えばDMFを使用すると、この場合
には試料／試薬の容量比を、測定の感度を低下し
ないで0.02に下げることができる。 本発明による血液又は血液から導出した試料中
のフルクトスアミンを測定する方法（その際非特
異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起
する試料成分を、１種又は数種の酵素及びSH基
封鎖剤並びに場合により１種又は数種の清浄剤及
び／又は塩によつて除去する）は、溶解してだけ
では行なわれない。容易に乾燥化学的試験担持剤
による測定法に移行することができる。このため
には、酵素及びSH基封鎖剤並びに場合により１
種又は数種の清浄剤又は／及び場合により他の助
剤を有する塩は、公知方法で固体担持剤に被覆す
る。適当な固体担持剤並びにかかる担持剤にこれ
らの物質又は物質混合物を被覆する方法は、公知
である。担持剤材料としては、例えばすべての可
能な吸収性材料、例えば紙、フリス等である。被
覆すべき物質は、１種又は数種の含浸液に吸収さ
せることができる。これらの溶液を担持剤に含浸
させるか又はスプレーする。続いて乾燥する。 他の方法は、酵素及びSH基封鎖剤並びに場合
により清浄剤又は／及び塩並びに場合により他の
助剤を試薬フイルム中に装入すことである。この
ためには化合物又は化合物混合物を、例えばドイ
ツ特許第1598153号明細書又はドイツ公開特許第
2910134号による方法に相応して処理して試薬フ
イルムが得らえる。 妨害する非特異的還元作用を有するか、又は／
及び溷濁を惹起する試料成分を除去するために
は、測定すべき試料を、先づ酵素及びSH基封鎖
試薬並びに場合により１種又は数種の清浄剤又
は／及び塩を含有する担持剤と接触させる。十分
な接触後に、予処理試料を色反応に必要な他の反
応成分を含有する層中に入れる。その際生じる色
反応は公知方法で測光により、例えば反射測定に
よつて測定する。予反応及び色反応の時間間隔に
関しては、前記の実施があてはまる。 本発明のもう１つの課題は、血液又は血液から
導出した試料中の血液のフルクトスアミン含量を
特別に測定する試薬組合せ物である。この試薬組
合せ物は、非特異的還元作用を有するか、又は／
及び溷濁を惹起する試料成分を除去する試薬、PH
10.5〜12.5を有する緩衝剤を含有する再緩衝試薬
及びフルクトスアミンを検出する色試薬からな
る。この試薬組合せ物は、本発明方法を実施する
のに必要なすべての成分を含有する。 血液又は血液から導出した試料中の非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去する試薬は、中性PHを有する緩衝剤
中の１種又は数種の酵素酸化剤並びに場合により
ペルオキシダーゼ又は／及びカタラーゼ又は／及
びリパーゼ、１種又は数種のSH基封鎖試薬並び
に場合により１種又は数種の清浄剤及び／又は強
酸塩並びに場合により常用の添加剤からなる。 酵素酸化剤とは、殊にアスコルベート−オキシ
ダーゼ、ビリルビン−オキシダーゼ及びウリカー
ゼである。 SH基封鎖試薬は、殊にヨードアセトアミド、
ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインイミド、
ｐ−ヒドロキシメルクリベンゾエート及びこれら
の物質に使用した化合物である。 血液又は血液から導出した試料中の非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去し場合により清浄剤を含有する本発
明による試薬は、陰イオン性又は非イオン性であ
つてもよい。陰イオン性清浄剤としては、なかん
ずく胆汁酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
属塩及びその共役物が好ましいが、非イオン性清
浄剤には巾広いパレツトの清浄剤を選択する。適
当なものとしては、なかんずくアルコール部にＣ
原子８〜20個及び分子当りグリコール単位４〜15
個を有する直鎖状又は分枝状アルキル−又はアル
キルアリール−アルコール−ポリグリコールエー
テルが判明した。しかしながら、添加清浄剤は付
加的に陽イオン性清浄剤、例えば燐酸オキシエチ
ルアルキルアンモニウム〔例えばデヒクアルト
（Dehyquart）RSP、ヘンケル、ドイツ国〕であつ
てもよい。 特に有効なのは、酵素ペルオキシダーゼ及びウ
リカーゼ、SH基封鎖剤ヨードアセトアミド、非
イオン性清浄剤、例えばルテンゾル（Lutensol）R
ON60並びに陰イオン性清浄剤コール酸塩を含有
する混合物である。 強酸塩としては、本発明の試薬には塩酸又は硫
酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が適
当であることが判明した。特に適当なのは、塩化
カリウム又は−ナトリウムである。 本発明による試薬の中性PHを得るのに必要な緩
衝剤は、PH６〜９、好ましくは７〜8.5、特に好
ましくは7.5〜8.0を有する。緩衝剤の濃度は、好
ましくは10〜100ｍモル／、特に好ましくは20
〜70ｍモル／である。特に好ましいものとして
は、燐酸カリウム緩衝剤水溶液が判明した。 実施例 例 １ Lohnsonその他の方法による自動分析機での血
清のフルクトスアミンの測定。 試薬の組成： 炭酸ナトリウム緩衝剤（PH10.35） 0.1モル／ ニトロテトラゾリウムブルー 0.25ｍモル／ 測定の実施： 試料20μを、試薬200μ及びH2O（希釈剤）
50μと混合し、37℃でコバス・ビオ（Cobas
BioR）自動分析機〔ホフマン・ラ・ロツシユ
（Hoffmann‐La Roche）、スイス国バーゼル〕
で530nｍで吸光を時間に関して測定する。フル
クトスアミンの濃度を確かめるために、動力学
を、試薬の添加後に10〜15分の間判読する。 この結果を、フロシン／HPLC−対象法
〔Journal of Clinical Chemistry、Clincal
Biochemistry、第19巻（1981年）、第81〜87頁〕
で得られる測定値に対して記載した。HPLC−測
定値としては、それぞれ相対ピーク面単位を使用
する（第１図）。 次例でも、フロシン／HPLC法の対照法として
使用する。 例 ２ 本発明方法による自動分析機での血清のフルク
トスアミンの測定。 (A) 試薬の組成 (a) 試薬
血清のフルクトスアミンを特異的に測定する方法
に関する。この方法では妨害試料成分を、フルク
トスアミン含量の測定前に除去する。 従来の技術 血清のフルクトスアミンとは、非酵素グリコシ
ル化血清蛋白質の全含量である。これは、血清の
グルコースがそのカルボニル基によつて遊離蛋白
質アミノ基とシツフの塩基を形成して生じる。続
いてこのものは、アマドリ転移によつて安定なケ
トアミン結合を有するフルクトスアミンに変換す
る。 血清のフルクトスアミンの半減期は、ケトアミ
ン結合の安定性のために実際に血清蛋白質の半減
期と同一であり、その半減期は平均して約21日間
である。相応する研究は、L.Y.Seng及びM.J.
Staley：Journal of Clinical Chemistry（1986
年）第32巻、第560頁に記載された。 フルクトスアミンの形成量は、血液のグルコー
ス含量に比例する。これは、周知のように糖尿病
患者では、不十分な食餌上及び薬物上の物理代謝
の場合には、はつきりと現れた病理学的現象に結
合した著しい変動を蒙むり得る。 血液のグルコール測定によつて、医師には血液
採取の時点に存在する物質代謝の状態に関する情
報が得られるのに過ぎない。これに反して、最後
の120日間の物質代謝の状態に関する長い期間の
検査は、グリコシル化ヘモグロビン（HbA1）の
測定で可能である。血清のフルクトスアミン測定
は、その半減期によつて糖尿病患者の物質代謝の
営みを、生活基準及び治療法によつて約３週間の
平均期間にさか上つて確かめるために適当であ
る。それ故、確立された臨床的診断パラメータの
血液のグルコース並びにグリコシル化ヘモグロビ
ン（HbA1）に関連して、血清のフルクトスアミ
ンを測定する確実で特別の実際的方法で、糖尿病
患者を有用な平均期間のパラメータについて監視
する診断法は拡大することができる。 原理から簡単に実施することのできる血清のフ
ルクトスアミン測定法は、Baker：ヨーロツパ特
許第0085263号明細書及びJohnsonその他：
Clinica Chimica Acta（1982年）第127巻、第87
〜95頁に記載されている。これは、ケトアミン形
がアルカリ性水媒体中でエノール形に変り、エノ
ール形はテトラゾリウム塩、例えばニトロテトラ
ゾリウムブルーに還元作用し、その際ホルマザン
色素を生じることに基づく。一定間隔で37℃で測
光によつて測定した色素形成の量は、存在するフ
ルクトスアミンの量に比例する。 この試料は、試料として血清を使用する場合に
は妨害を受けやすい。それというのも天然の血清
成分、例えばビリルビン、尿酸及びSH基は、同
じようにしてテトラゾリウム塩に対して還元作用
をするからである。アセチルサリチル酸のメタボ
ライトである薬品、例えばα−メチルドパ、薬品
の分解生成物、例えばアセチルサリチル酸の代謝
物質であるゲンチシン酸並びにアスコルビン酸
も、血清の濃度によつて変造測定結果をもたら
す。 この妨害は、既に正常な及び食餌療法患者の血
清で作用を発揮し、例えばSchleiches及び
Wieland（Journal of Clinical Chemistry、
Clinical Biochemistry、第19巻、第81〜87頁、
1981年）によるフロシン／HPLC法と方法を比較
すると、絶対的数値が非酵素グリコシル化の範囲
に関して可能であり、Bakerによる血清のフルク
トスアミン測定法ではフルクトスアミンの直線上
相関性が得られるが、実際でない場合にBaker法
は既に著しい非酵素グリコシル化を示す。これ
は、図式上でBaker法の結果がフロシン／HPLC
法の結果に対して示される図表では、Baker試験
の側で、既に血清のフルクトスアミンが全く存在
しない場合に軸線部分が生じ、その値は平均し
て、非糖尿病患者の値の約50％になる（第１図参
照）。 更に、従来血清のフルクトスアミン測定は妨害
を受け、これは試料から試料に変動する全蛋白質
の含量に起因する。測定は測定値のふれをもたら
し、これにより、測定法の感度は減少する。この
妨害はマトリツクス効果としても公知である。こ
の結果は、例えば通常標準溶液を製造する場合の
ように付加的蛋白質の添加で特に明らかである。
増大する蛋白質の量によつて、フルクトスアミン
と色試薬との反応が遅延する（E.J.Hindleその
他：Annals of Clinical Biochemistry、第22巻、
1985年、第84〜89頁参照）。 他の難点は、高脂肪血症性血清のフルクトスア
ミンの測定で生じる。一般に試料中の低フルクト
スアミン濃度の場合でも、なお十分に大きい測定
シグナルを得るためには、試料／試薬の容量比
0.1が必要である。しかしながら過トリグリセリ
ド濃度の場合、このように大きい試料成分では、
得られる試料パツチの溷濁は測光測定で負であ
る。フルクトスアミンの測定は著しくむづかしく
なるか又はむしろ阻止される。 発明が解決しようとする課題 それ故、更に前記欠点を有しない血液又は血液
から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含
有を特別に測定する方法の必要がある。本発明の
課題は、かかる方法を得ることである。 課題を解決するための手段 この課題は、本発明の特許請求の範囲の記載に
よつて解決される。 本発明によつて血液又は血液から導出した試料
中の血清のフルクトスアミン含量を、適当な色試
薬と反応させ、これによつて生じた色変化を測定
して特異的に測定する方法は、色反応の前に、非
特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹
起する試料成分をほゞ中性PHで除去し、続いてPH
10〜12を調整し、色試薬を添加することを特徴と
する。 非特異的還元作用を有する試料成分を除去する
ためには、試料に１種又は数種の酸化性作用酵素
を添加する。好ましくは酵素酸化剤としては、ア
スコルベート−オキシダーゼ、ビリルビン−オキ
シダーゼ又は／及びウリカーゼを添加する。ペル
オキシダーゼは、場合により生じる過酸化水素と
一緒に付加的酸化分解工程を生ぜしめ、これは酸
化剤の効力をなお付加的に高める。場合により添
加したカタラーゼは、なかんずく過剰量の過酸化
水素を除去するのに役立つ。 殊に脂肪血症性試料を検査するためには、１種
又は数種の酸化性作用酵素に、場合によりリパー
ゼを、場合により１種又は数種の清浄剤又は／及
び強酸塩と一緒に添加するのが有利であることが
判明した。かかる混合物によつて、溷濁を惹起す
る物質を、続く色測定がもはや損なわれないよう
に十分に除去することが達成される。しかしなが
ら、試料の希釈及び清浄剤の添加に応じて、脂肪
血症の妨害は、専ら非酵素的に１種又は数種の清
浄剤によつて除去することもできる。 意外なことにも、更に１種又は数種のSH基封
鎖試薬の添加によつて、本発明による血清のフル
クトスアミン測定法と、フロシン／HPLC−比較
法との十分の相関性が軸線部分を有しないで得ら
れることが判明した。試料中に非酵素グリコシル
化蛋白質が存在しない場合には、このようにして
実際に色反応も認められない（第２図）。 SH基封鎖試薬は、SH基と反応するものであ
る。これは文献に多く記載されている。次の論文
が挙げられる： A.N.Glazer、R.J.Delange、D.S.Sigman著；
Chemical modification of proteins.Laboratory
techniques in biochemistry and molecular
biology（T.S.Work及びE.Work、編集）（1975
年。 C.H.W.Hirs、S.N.Timasheff、編集；
Modification reactions：Methods in
Enzymology 25巻、387−671頁（1972年）。 C.H.W.Hirs、S.N.Timasheff、編集；
Chemical modification：Methods in
Enzymology47巻、407−500頁（1977年）。 R.L.Lundblad、C.M.Noyes著；Chemical
reagents for protein modification。CRC出版、
ボカ・ロタン（Boca Rotan）、フロリダ
（Florida）（1984年）。 適当なSH封鎖剤は、例えばヨードアセトアミ
ド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインイミ
ド、ｐ−ヒドロキシメルクリベンゾエートであ
る。本発明方法の特に適当なものとしては、ヨー
ドアセトアミドが判明した。 妨害成分を除去するための前記物質によつて、
マトリツクス効果として公知の試料中の変動する
全蛋白質量による測定値の変動も抑制するか又は
完全に除かれる。これと共に正確な蛋白質補正の
前提条件は、フルクトスアミン／全蛋白質の商に
よつて得られる。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去するためには、試料
を、適当な非還元性緩衝剤中に酸化作用を有する
酸素及びSH基封鎖剤並びに場合により１種又は
数種の脂質分解酵素、並びに場合により１種又は
数種の清浄剤又は／及び強酸塩を含有する溶液で
培養するのが有利であることが判明した。この溶
液を製造するためには、非還元性作用を有し、そ
の緩衝作用が中性PHであるすべての緩衝剤が適当
である。PH６〜９、好ましくは７〜8.5、特に好
ましくは7.5〜8.0が好ましいことが判明した。緩
衝剤の濃度は、好ましくは10〜100ｍモル／、
特に好ましくは20〜70ｍモル／である。特に好
ましくは、燐酸カリウム緩衝剤水溶液が判明し
た。 添加酵素の濃度は、除去すべき妨害化合物の濃
度による。通常この酵素の濃度は、0.01〜
10000U／mlである。好ましい濃度範囲は、例え
ば次のものである： ウリカーゼ １−15U／ml ビリルビン−オキシダーゼ 0.05−5U／ml アスコルベート−オキシダーゼ ２−20U／ml リパーゼ 0.5−5U／ml ペルオキシダーゼ 0.5−5U／ml カタラーゼ 100−10000U／ml この酵素の特に好ましい範囲は、次のものであ
る： ウリカーゼ ２−10U／ml ビリルビン−オキシダーゼ 0.1−1U／ml アスコルベート−オキシダーゼ ５−15U／ml リパーゼ １−3U／ml ペルオキシダーゼ １−3U／ml カタラーゼ 500−2000U／ml SH基封鎖剤としては、原則として文献での公
知試薬を包含するすべてのもの、例えばヨードア
セトアミド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレ
インイミド及びｐ−ヒドロキシメリクリベンゾエ
ートである。特に適当なものとしては、ヨードア
セトアミドが判明した。SH基封鎖剤の好ましい
濃度範囲としては、0.5〜500ｍモル／、特に好
ましくは５〜50mlモル／である。 清浄剤は陽イオン性清浄剤の他にも、陰イオン
性又は非イオン性清浄剤であつてもよい。陰イオ
ン性清浄剤としては、胆汁酸のアルカリ金属塩又
はアルカリ土類金属塩及びその共役物が好まし
い。陰イオン性清浄剤の好ましい濃度は、２〜10
ｍモル／である。特に好ましくは濃度４〜６ｍ
モル／のコール酸ナトリウムであることが判明
した。 非イオン性清浄剤としては、広いパレツトの清
浄剤が選ばれる。適当なものとしては、なかんず
くアルコール部にＣ原子８〜20個及び分子当りグ
リコール単位４〜15個を有する直鎖状又は分枝状
アルキル−又はアルキルアリール−アルコール−
ポリグリコールエーテルが判明した。アルコール
部にＣ原子８〜12個及び分子当りグリコール単位
４〜８個を有する直鎖状及び分枝状アルキル−ア
ルコール−ポリグリコールエーテルが、特に好ま
しい活性作用を及ぼす。 血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定す
る本発明方法には、アルコール部の構造に関して
単一であるか又はアルコール部の構造に関して異
なる数種のポリグリコールエーテルからなる混合
物であつてもよい非イオン性清浄剤が適当であ
る。適当な非イオン性清浄剤は、例えばオキセタ
ル（Oxetal）RID104〔ツシムマー（Zschimmer）
及びシユウアルツ（Schwarz）、ドイツ国〕、プロ
デユクト（Produkt）RT240R〔Zschimmer及び
Schwars、ドイツ国〕、ルテンゾル（Lutensol）R
ON50、ON60、ON70〔BASF、ドイツ国〕並び
にソプロホル（Soprofor）RＤ／916〔ローヌ・プラ
ン（Rhone‐Poulenc）、フランス国〕である。 本発明により非特異的の還元作用を有するか、又
は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去するため
に使用する非イオン性清浄剤の濃度は、0.05〜15
重量％である。好ましい濃度範囲としては、0.1
〜５重量％である。 溷濁除去作用は、反応溶液中の高イオン強度に
よつてなお増大させることができる。このために
は、アルカリ性PH範囲内で溶解する強酸塩の添加
が好ましいことが判明した。好ましいものは、塩
酸又は硫酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
属塩である。特に好ましくは塩化カリウム又は−
ナトリウムを使用する。添加強酸塩の濃度は、20
〜100ｍモル／である。特に好ましくは、塩を
濃度40〜60ｍモル／で添加する。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去は、温度25〜40℃、好
ましくは37℃で１〜15分間、好ましくは２〜６分
間行なう。選ぶべき培養時間は、非特異的還元作
用を有する及び溷濁を惹起する試料成分の量及び
その除去に使用した添加剤の量による。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去するための培養は、使
用酵素のPH最適値のためにほヾ中性PHで行なう
が、色試薬とフルクトスアミンとの色反応はPH10
〜12で進行するので、培養後に再び緩衝させるの
が必要である。PHの増大は、PHが調整すべきPH以
上である緩衝剤によつて行なう。PH10.5〜12.5、
特に好ましくはPH10.7〜12.2を有する緩衝剤が特
に有利である。このために好ましくは炭酸塩緩衝
剤を使用し、その濃度は150〜300ｍモル／、特
に好ましくは180〜220ｍモル／である。 公知方法で色試薬をアルカリ性範囲内で添加し
て、フルクトスアミンの還元性作用を明らかにす
ることができる。このために好ましくはテトラゾ
リウム塩を使用し、そのホルマザン色素の形成を
視覚によるか又は測光によつて追求することがで
きる。テトラゾリウム塩としては、“Methods of
Enzymatic Analysis”〔H.U.Bergmeyer、第３
版、ヘミー（Chemie）社、ワインハイム
（Weinheim）、1983年、第１巻、第200頁〕に記
載されている塩が好ましい。特に適当なものは、
ニトロテトラゾリウムブルー（NBT）又は３−
（4′，5′−ジメチルチアゾリル−２−）−２，４−
ジフエニル−テトラゾリウムブロマイド
（MTT）である。色試薬は、再緩衝後並びに緩
衝剤と同時に試験バツチに添加することができ
る。このためには、色試薬を、再緩衝に必要な緩
衝剤に溶解するのが好ましいことが判明した。テ
トラゾリウム塩には、濃度0.2〜２ｍモル／が
好ましく、0.4〜1.5ｍモル／が特に好ましいこ
とが判明した。 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁
を惹起する試料成分を除去した後の再緩衝には、
緩衝剤を、試験バツチのPHが色試薬の存在でPH10
〜12、好ましくは10.3〜10.6を有するように大量
に添加する。 再緩衝溶液は温度25〜40℃、好ましくは37℃で
培養する。色試薬の還元に基づく色変化は、再緩
衝後に一定の時間間隔で、好ましくは１〜15分の
間測光によつて追求する。最初の測定は再緩衝後
１〜10分の間に、最後の測定は再緩衝後２〜15分
の間に行なう。必要によつて、測定は２回又は数
回行なうことができる。２回の測定の間隔を変え
ることができる。間隔は装置の配置によつて選ぶ
ことができ、数秒並びに数分であつてもよい。 得られた測定値を、標準溶液の測定値と比較す
るのが好ましい。適当な標準溶液は公知である。
このためには、例えばJohnsonその他：Clinica
Chimica Acta（1982年）第127巻、第87〜95頁に
記載の標準物を使用することができる。このもの
は合成フルクトスアミンの一定添加量を有する人
体のアルブミンからなるマトリツクスを基質とし
ている。合成フルクトスアミンとしては、１−デ
スオキシ−１−モルホリノ−フルクトース
（DMF）を使用する。試料中の測定した血清のフ
ルクトスアミン濃度は、この標準物を使用する際
にDMF単位で記載する。同じようにして標準物
として適当なのは、人体の血清アルブミン又は牛
の血清アルブミン又はそれぞれ公知グリコシル化
度を有する他の蛋白質である。 意外なことにも本発明方法によつて、Johnson
その他の方法によつて常用である試料／試薬の容
量比0.1を、同じ測定間隔及び同じ温度での培養
で、試料として使用したフルクトスアミン類似物
の一定量での測定シグナルがJohnsonその他に記
載の方法と比較して著しく小さくならないので下
げることが可能になる。フルクトスアミン類似物
としては、例えばDMFを使用すると、この場合
には試料／試薬の容量比を、測定の感度を低下し
ないで0.02に下げることができる。 本発明による血液又は血液から導出した試料中
のフルクトスアミンを測定する方法（その際非特
異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起
する試料成分を、１種又は数種の酵素及びSH基
封鎖剤並びに場合により１種又は数種の清浄剤及
び／又は塩によつて除去する）は、溶解してだけ
では行なわれない。容易に乾燥化学的試験担持剤
による測定法に移行することができる。このため
には、酵素及びSH基封鎖剤並びに場合により１
種又は数種の清浄剤又は／及び場合により他の助
剤を有する塩は、公知方法で固体担持剤に被覆す
る。適当な固体担持剤並びにかかる担持剤にこれ
らの物質又は物質混合物を被覆する方法は、公知
である。担持剤材料としては、例えばすべての可
能な吸収性材料、例えば紙、フリス等である。被
覆すべき物質は、１種又は数種の含浸液に吸収さ
せることができる。これらの溶液を担持剤に含浸
させるか又はスプレーする。続いて乾燥する。 他の方法は、酵素及びSH基封鎖剤並びに場合
により清浄剤又は／及び塩並びに場合により他の
助剤を試薬フイルム中に装入すことである。この
ためには化合物又は化合物混合物を、例えばドイ
ツ特許第1598153号明細書又はドイツ公開特許第
2910134号による方法に相応して処理して試薬フ
イルムが得らえる。 妨害する非特異的還元作用を有するか、又は／
及び溷濁を惹起する試料成分を除去するために
は、測定すべき試料を、先づ酵素及びSH基封鎖
試薬並びに場合により１種又は数種の清浄剤又
は／及び塩を含有する担持剤と接触させる。十分
な接触後に、予処理試料を色反応に必要な他の反
応成分を含有する層中に入れる。その際生じる色
反応は公知方法で測光により、例えば反射測定に
よつて測定する。予反応及び色反応の時間間隔に
関しては、前記の実施があてはまる。 本発明のもう１つの課題は、血液又は血液から
導出した試料中の血液のフルクトスアミン含量を
特別に測定する試薬組合せ物である。この試薬組
合せ物は、非特異的還元作用を有するか、又は／
及び溷濁を惹起する試料成分を除去する試薬、PH
10.5〜12.5を有する緩衝剤を含有する再緩衝試薬
及びフルクトスアミンを検出する色試薬からな
る。この試薬組合せ物は、本発明方法を実施する
のに必要なすべての成分を含有する。 血液又は血液から導出した試料中の非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去する試薬は、中性PHを有する緩衝剤
中の１種又は数種の酵素酸化剤並びに場合により
ペルオキシダーゼ又は／及びカタラーゼ又は／及
びリパーゼ、１種又は数種のSH基封鎖試薬並び
に場合により１種又は数種の清浄剤及び／又は強
酸塩並びに場合により常用の添加剤からなる。 酵素酸化剤とは、殊にアスコルベート−オキシ
ダーゼ、ビリルビン−オキシダーゼ及びウリカー
ゼである。 SH基封鎖試薬は、殊にヨードアセトアミド、
ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレインイミド、
ｐ−ヒドロキシメルクリベンゾエート及びこれら
の物質に使用した化合物である。 血液又は血液から導出した試料中の非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去し場合により清浄剤を含有する本発
明による試薬は、陰イオン性又は非イオン性であ
つてもよい。陰イオン性清浄剤としては、なかん
ずく胆汁酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金
属塩及びその共役物が好ましいが、非イオン性清
浄剤には巾広いパレツトの清浄剤を選択する。適
当なものとしては、なかんずくアルコール部にＣ
原子８〜20個及び分子当りグリコール単位４〜15
個を有する直鎖状又は分枝状アルキル−又はアル
キルアリール−アルコール−ポリグリコールエー
テルが判明した。しかしながら、添加清浄剤は付
加的に陽イオン性清浄剤、例えば燐酸オキシエチ
ルアルキルアンモニウム〔例えばデヒクアルト
（Dehyquart）RSP、ヘンケル、ドイツ国〕であつ
てもよい。 特に有効なのは、酵素ペルオキシダーゼ及びウ
リカーゼ、SH基封鎖剤ヨードアセトアミド、非
イオン性清浄剤、例えばルテンゾル（Lutensol）R
ON60並びに陰イオン性清浄剤コール酸塩を含有
する混合物である。 強酸塩としては、本発明の試薬には塩酸又は硫
酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が適
当であることが判明した。特に適当なのは、塩化
カリウム又は−ナトリウムである。 本発明による試薬の中性PHを得るのに必要な緩
衝剤は、PH６〜９、好ましくは７〜8.5、特に好
ましくは7.5〜8.0を有する。緩衝剤の濃度は、好
ましくは10〜100ｍモル／、特に好ましくは20
〜70ｍモル／である。特に好ましいものとして
は、燐酸カリウム緩衝剤水溶液が判明した。 実施例 例 １ Lohnsonその他の方法による自動分析機での血
清のフルクトスアミンの測定。 試薬の組成： 炭酸ナトリウム緩衝剤（PH10.35） 0.1モル／ ニトロテトラゾリウムブルー 0.25ｍモル／ 測定の実施： 試料20μを、試薬200μ及びH2O（希釈剤）
50μと混合し、37℃でコバス・ビオ（Cobas
BioR）自動分析機〔ホフマン・ラ・ロツシユ
（Hoffmann‐La Roche）、スイス国バーゼル〕
で530nｍで吸光を時間に関して測定する。フル
クトスアミンの濃度を確かめるために、動力学
を、試薬の添加後に10〜15分の間判読する。 この結果を、フロシン／HPLC−対象法
〔Journal of Clinical Chemistry、Clincal
Biochemistry、第19巻（1981年）、第81〜87頁〕
で得られる測定値に対して記載した。HPLC−測
定値としては、それぞれ相対ピーク面単位を使用
する（第１図）。 次例でも、フロシン／HPLC法の対照法として
使用する。 例 ２ 本発明方法による自動分析機での血清のフルク
トスアミンの測定。 (A) 試薬の組成 (a) 試薬
【表】
(b) 試薬
【表】
(B) 試験の実施
試験を、ヒタチ（Hitachi）704自動分析機で
行なつた。 波 長：546nｍ 温 度：37℃ 層の厚さ：10mm（ハーフミクロクベツト） クベツトに、次のものをピペツトで採取する。
行なつた。 波 長：546nｍ 温 度：37℃ 層の厚さ：10mm（ハーフミクロクベツト） クベツトに、次のものをピペツトで採取する。
【表】
これを37℃で５分間培養する。更に次のものを
混合する：
混合する：
【表】
更に培養し、色素形成の動力学（△EP又は△
ERL）を一定の時間間隔△ｔ（８〜10分）で測定す
る。 前記のようにして試料に行なつた相応する方法
で、公知フルクトスアミン含量を有する標準溶液
Ｓを測定し、このようにして得られた値から三率
法によつて試料のフルクトスアミンの濃度を計算
する。 第２図には、このようにして得られた測定値が
フロシン／HPLC法で測定した値に対して記載さ
れている。 例１及び例２の結果の比較は、公知方法に対す
る本発明方法で、HPLC対照法と比較する場合
に、測定値の相関性の改良及び軸線部分の著しい
減少が得られることを示す。 例 ３ 例２のようにしてゞあるが、ヨードアセトアミ
ドを有しない血清のフルクトスアミンの測定。第
３図には、このようにして得られた測定値がフロ
シン／HPLC法に対して記載されている。 第３図は第１図に対して著しく減少した軸線部
分を示し、これによつて既に実際の血清のフルク
トスアミン含量の確実な記載が可能であるが、第
３図と第２図との比較からSH基封鎖試薬の付加
的妨害対抗の影響を推定することができる。 例 ４ 増大量のSH基、例えばグルタチオンの影響。
血清のフルクトスアミンの測定に関しては第４図
に示されている。 (a)では例３と同じ試薬組成。 (b)では例２と同じ試薬組成。 フルクトスアミン含量の測定は、それぞれ相応
する例２及び例３に記載のようにして行なう。
SH基の封鎖によつて、妨害は確実に除去される
ことが確かめられる。SH基封鎖試薬を添加しな
ければ、SH基によつて非酵素グルコシル化蛋白
質が見せかけられる。
ERL）を一定の時間間隔△ｔ（８〜10分）で測定す
る。 前記のようにして試料に行なつた相応する方法
で、公知フルクトスアミン含量を有する標準溶液
Ｓを測定し、このようにして得られた値から三率
法によつて試料のフルクトスアミンの濃度を計算
する。 第２図には、このようにして得られた測定値が
フロシン／HPLC法で測定した値に対して記載さ
れている。 例１及び例２の結果の比較は、公知方法に対す
る本発明方法で、HPLC対照法と比較する場合
に、測定値の相関性の改良及び軸線部分の著しい
減少が得られることを示す。 例 ３ 例２のようにしてゞあるが、ヨードアセトアミ
ドを有しない血清のフルクトスアミンの測定。第
３図には、このようにして得られた測定値がフロ
シン／HPLC法に対して記載されている。 第３図は第１図に対して著しく減少した軸線部
分を示し、これによつて既に実際の血清のフルク
トスアミン含量の確実な記載が可能であるが、第
３図と第２図との比較からSH基封鎖試薬の付加
的妨害対抗の影響を推定することができる。 例 ４ 増大量のSH基、例えばグルタチオンの影響。
血清のフルクトスアミンの測定に関しては第４図
に示されている。 (a)では例３と同じ試薬組成。 (b)では例２と同じ試薬組成。 フルクトスアミン含量の測定は、それぞれ相応
する例２及び例３に記載のようにして行なう。
SH基の封鎖によつて、妨害は確実に除去される
ことが確かめられる。SH基封鎖試薬を添加しな
ければ、SH基によつて非酵素グルコシル化蛋白
質が見せかけられる。
第１図はJonhsonその他の方法による血清のフ
ルクトスアミンの測定図であり、第２図は本発明
方法による血清のフルクトスアミンの測定図であ
り、第３図は本発明方法によるが、SH基封鎖剤
を有しない血清のフルクトスアミンの測定図であ
り、第４図は本発明方法による血清のフルクトス
アミンの他の測定図である。
ルクトスアミンの測定図であり、第２図は本発明
方法による血清のフルクトスアミンの測定図であ
り、第３図は本発明方法によるが、SH基封鎖剤
を有しない血清のフルクトスアミンの測定図であ
り、第４図は本発明方法による血清のフルクトス
アミンの他の測定図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 血液又は血液から導出した試料中の血清のフ
ルクトスアミン含量を、適当な色試薬と反応さ
せ、生じた色変化を測定し、その際色反応の前
に、非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷
濁を惹起する試料成分を除去し、続いてPH10〜12
で色試薬を添加して特別に測定する方法におい
て、非特異的還元作用試料成分を除去するため
に、試料を中性PHで、１種又は数種の酵素酸化剤
及び１種又は数種のSH基封鎖剤で、場合により
ペルオキシダーゼ又は／及びカタラーゼと一緒に
処理することを特徴とする血液又は血液から導出
した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異
的に測定する方法。 ２ 酵素酸化剤として、アスコルベート−オキシ
ダーゼ、ビリルビン−オキシダーゼ又は／及びウ
リカーゼ及びSH基封鎖剤として、ヨードアセト
アミド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレイン
イミド又は／及びｐ−ヒドロキシメルクリベンゾ
エートを使用する請求項１記載の方法。 ３ 付加的に１種又は数種の清浄剤を添加する請
求項１又は２記載の方法。 ４ 非イオン性又は／及び陰イオン性清浄剤及び
SH基封鎖剤として、ヨードアセトアミドを添加
する請求項３記載の方法。 ５ 溷濁を惹起する試料成分を除去するために、
試料をリパーゼで、場合により１種又は数種の清
浄剤又は／及び強酸塩と一緒に処理する請求項１
記載の方法。 ６ 測定すべきフルクトスアミンを含有する試料
に、予培養後に、非特異的還元作用を有するか、
又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去するた
めに、PH10〜12の範囲内のPHで緩衝作用させるた
めPH10.5〜12.5を有する緩衝剤を添加する請求項
１記載の方法。 ７ 非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷
濁を惹起する試料成分を除去する試薬、アルカリ
性PHを有する緩衝剤を含有する緩衝作用試薬及び
フルクトスアミンを検出する色試薬からなる、血
液又は血液から誘導した試料中の血清のフルクト
スアミンを特異的に測定する試薬組合せ物におい
て、非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷
濁を惹起する試料成分を除去する試薬は、中性PH
を有する緩衝剤中に１種又は数種の酵素酸化剤及
び１種又は数種のSH基封鎖剤並びに場合により
ペルオキシダーゼ又は／及びカタラーゼ又は／及
びリパーゼ並びに場合により１種又は数種の清浄
剤又は／及び強酸塩並びに場合により常用の添加
剤を含有することを特徴とする試薬組合せ物。 ８ 酵素酸化剤として、アスコルベート−オキシ
ダーゼ、ビリルビン−オキシダーゼ又は／及びウ
リカーゼ及びSH基封鎖剤として、ヨードアセト
アミド、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレイン
イミド又は／及びｐ−ヒドロキシメルクリベンゾ
エートを含有する請求項７記載の試薬組合せ物。 ９ 清浄剤として、陽イオン性、陰イオン性又
は／及び非イオン性清浄剤及び強酸塩として塩酸
又は硫酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属
塩を含有する請求項７記載の試薬組合せ物。 １０ 非イオン性又は／及び陰イオン性清浄剤及
びSH基封鎖剤として、ヨードアセトアミドを含
有する請求項７記載の試薬組合せ物。 １１ 血液又は血液から導出した試料中の血清の
フルクトスアミンを測定するために、非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去する方法において、中性PHを有する
緩衝剤中に１種又は数種の酵素酸化剤及び１種又
は数種のSH基封鎖剤並びに場合によりペルオキ
シダーゼ又は／及びカタラーゼ又は／及びリパー
ゼ並びに場合により１種又は数種の清浄剤又は／
及び強酸塩並びに場合により常用の添加剤を含有
する試薬を使用することを特徴とする非特異的還
元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試
料成分を除去する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873732688 DE3732688A1 (de) | 1987-09-29 | 1987-09-29 | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
| DE3732688.0 | 1987-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01108997A JPH01108997A (ja) | 1989-04-26 |
| JPH0365760B2 true JPH0365760B2 (ja) | 1991-10-14 |
Family
ID=6337076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63239896A Granted JPH01108997A (ja) | 1987-09-29 | 1988-09-27 | 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5149633A (ja) |
| EP (1) | EP0309882A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01108997A (ja) |
| DE (1) | DE3732688A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3822749A1 (de) | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Fructosamin-calibrator |
| DE3920364A1 (de) * | 1989-06-22 | 1991-01-10 | Technicon Gmbh | Verfahren und reagenz zur verhinderung von truebungen |
| US5484735A (en) * | 1989-08-23 | 1996-01-16 | Northwestern University | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids |
| US5312759A (en) * | 1989-12-20 | 1994-05-17 | Iatron Laboratories, Inc. | Method for measurement of fructosamines using 1,2-quinones |
| GB9116315D0 (en) * | 1991-07-29 | 1991-09-11 | Genzyme Ltd | Assay |
| CA2098956C (en) | 1992-07-15 | 1999-12-07 | Thomas Charles Arter | Sulfhydryl-complexing agents in clinical test elements |
| CA2127679A1 (en) * | 1993-07-27 | 1995-01-28 | Ewald Vorberg | Set of reagents for determining the fructosamine content |
| DE4401754A1 (de) * | 1994-01-21 | 1995-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Eisen |
| US20120077278A1 (en) * | 2009-06-08 | 2012-03-29 | Protea Biopharma N.V. | Methods and kits for detecting, diagnosing and monitoring diseases |
| CN114112595B (zh) * | 2021-12-03 | 2024-08-20 | 威海威高生物科技有限公司 | 一种果糖胺测定试剂盒液体校准品的制备方法 |
| CN115372605A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-11-22 | 北京常有生物科技有限公司 | 一种尿液巯基化合物检测试剂及检测试剂、检测试纸、检测试剂盒的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2816229C2 (de) * | 1978-04-14 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Mittel zur Beseitigung von Trübungen |
| DE2907628C2 (de) * | 1979-02-27 | 1981-02-05 | C.A. Greiner Und Soehne Gmbh & Co Kg, 7440 Nuertingen | Proberöhrchen für die Untersuchung von Proben im klinischen Bereich, insbesondere von Urinproben |
| DE2910737C2 (de) * | 1979-03-19 | 1984-01-19 | Ewald 6701 Dannstadt-Schauernheim Blees | Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren |
| DE2914487A1 (de) * | 1979-04-10 | 1980-10-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und mittel zur entfernung von ascorbinsaeure aus waessrigen fluessigkeiten |
| US4271024A (en) * | 1979-05-23 | 1981-06-02 | Meyer Dairy Products, Co. | Liquid filter |
| US4460684A (en) * | 1982-08-02 | 1984-07-17 | Miles Laboratories, Inc. | Ascorbate-resistant broad range glucose test composition, test device and method |
| JPH0229318B2 (ja) * | 1982-10-22 | 1990-06-28 | Amano Pharma Co Ltd | Seitaitaiekiseibunnosokuteiho |
| JPS59198971A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
| US4626511A (en) * | 1985-05-13 | 1986-12-02 | Wayne State University | Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids |
| US5002893A (en) * | 1985-09-19 | 1991-03-26 | Isolab, Inc. | Single color reading method for determining fructosamine |
| DE3620817A1 (de) * | 1986-06-21 | 1987-12-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung des serumfructosamingehalts sowie hierfuer geeignetes reagenzgemisch |
| DE3743405A1 (de) * | 1987-05-14 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fructosamin |
| US4956301A (en) * | 1989-11-02 | 1990-09-11 | Miles Inc. | Test device and method of assaying for fructosamines |
-
1987
- 1987-09-29 DE DE19873732688 patent/DE3732688A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-09-21 EP EP88115456A patent/EP0309882A3/de not_active Withdrawn
- 1988-09-26 US US07/249,381 patent/US5149633A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-27 JP JP63239896A patent/JPH01108997A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01108997A (ja) | 1989-04-26 |
| US5149633A (en) | 1992-09-22 |
| EP0309882A3 (de) | 1989-10-25 |
| DE3732688A1 (de) | 1989-04-13 |
| EP0309882A2 (de) | 1989-04-05 |
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