JPH01110698A - ヒト胎盤又は臍帯由来レクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はレクチンに間する。より詳細には、ヒト胎盤又
は臍帯由来のレクチンに間する。

［従来の技術］ レクチンは、動植物、微生物由来の蛋白質で、赤血球に
対し、特異的に結合する物質の総称であリ、古くから、
植物由来の赤血球凝集素が知られている。レクチンによ
る赤血球凝集反応は、レクチンが赤血球に存在する糖鎖
と特異的に結合することにより生ずるといわれている［
大沢利昭、森良−編；レクチン、１頁、講談社（１９７
６年）］。

又、成る種のレクチンは、赤血球のみならず、白血球、
癌細胞とも結合し、これを凝集させることが知られてお
り、この性質を利用しての、癌細胞の増殖抑制法［穂積
本男；レクチン、１４１頁（１９７６年）］や血球のサ
ブクラスの分別法［ティー、ナカノ（’ｌ”、ｌ’Ｊａ
ｋａｎｏ）等著；ジェイ、イムツル、（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏ　１．）＋上ユ旦、１９２Ｂ頁（１９８０年）］など
が提案されている。

現在知られているを椎動物由来のレクチンは、高分子量
でＣａ２＋依存性を有する膜蛋白質性のものと、低分子
量でＣａ２＋依存性を有さず、末端のβ−Ｄ−ガラクト
シド構造に親和性を示すものとに大別される。

後者の代表的なものとしては、電気うなぎ（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｕｓ　ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ）が挙げられ
、このものが、最近、重症筋無力症の病態モデルである
実験的筋無力症（ウサギ）の治療に有効であることが報
告されている［ギオヴアンニ　レヴイ（Ｇｉｏｖａｎｎ
ｉ　Ｌｅｖｉ）等著；ニール、ジエイ、イムツル、　　
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．）　＋　−Ｌ」−、５
００頁（１９８３年）］。しかしながら、人間に投与す
るには免疫原性の点で問題がある。

一方、ヒト由来の低分子量のβ−ガラクトシド親和性レ
クチンとしては、まず、心筋、骨格筋及び肺由来のもの
が知られている。このうち、筋由来のものは、未だ研究
が不充分であり、その性質も明らかではない。又、肺由
来のものは、分子量が約１４５００であることは報告さ
れているが、そのアミノ酸配列は不明である［ジャネッ
トティー、ボーウェル（Ｊａｎｅｔ　Ｔ、　Ｐｏｗｅｌ
ｌ）著；バイオケム、ジエイ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
）　＋エエＬ。

１２３頁（１９８０年）］。

又、ヒト胎盤又はヒト堕帯由来のレクチンは特開昭６０
−１８４０２０号公報（昭和６０年９月１９日公開）に
その採取法、種々の性質とともにアミノ酸絹成が報告さ
れているが、アミノ酸配列に間する知見は未だない。

［発明が解決しようとする課題］ 言うまでもなく、ポリペプチドの抽出には、原料入手の
難易性、抽出中の分解或いは変性、装置の大規模化など
の問題が含まれ、又、化学的合成には、ユニットとなる
アミノ酸の種類が多いために、保護基の選択、除去、ラ
セミ化などの問題が含まれる。更に、いずれの方法にも
一般性のある方法はない。一方、ポリペプチドに比べて
、ＤＮＡに間する操゛作は一般的な方法を用いて容易に
可能であることを考えると、レクチンの遺伝子工学的合
成への期待は大きいものがある。しかし、現状ではレク
チンを遺伝子工学的に合成する端緒さえ与えられていな
い。

本発明の目的は、叙上のような状況下において、ヒトの
胎盤又は堕帯に由来するレクチンのアミノ酸配列を解明
し、その遺伝子工学的合成への端緒を提供することにあ
る。

［問題点を解決するための手段］ 本発明により、下記アミノ酸配列で表さ・れる、ヒト胎
盤又は臍帯由来レクチンが提供される。

Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　−Ａｌａ
−Ｓｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ　−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ｖａｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ　−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｈｅ　
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ−９ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ　−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ−Ａ
ｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
　−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−ＣＶｓ　　−１１ｅ−Ｔｈｒ　　
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ　　−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ　−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｍ
ｅｔ　　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｃ　　ｌ　ｙ−Ａ
ｓｐ　　−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１ｉｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　
　−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐｓ ヒト胎盤又は請帯由来レクチンは次のようにして採取で
きる。

ヒト胎盤又は臍帯を、蛋白質保護剤を含有する塩類水溶
液中で冴砕後に遠心分離する。分取した細胞破片を、前
記と同種の蛋白質保護剤を含有する塩類水溶液にガラク
トース残基を有する化合物を加えて調製した溶液で抽出
した後に精製する。

上記廚砕処理は、常法に従い、ミキサー、ホモジエナイ
ザーなどを用いることにより行なうことができる。

塩類水溶液としては、リン酸＠衝化生理食塩水、トリス
−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グツド（Ｇｏｏｄ　）緩
衝液などが挙げられ、そのＩ）　Ｈは６〜８であること
が好ましい。

該塩類水溶液中に添加する蛋白質保護剤としては、エチ
レンジアミン四酢ｒＩｉ（以下、ｒＥＤＴＡＪと称す）
及びそのナトリウム塩、カリウム塩などの金属キレート
剤とβ−メルカプトエタノール、グルタチオン、ジチオ
スレイトール、ジチオエリスリトール、システィン、チ
オグリコール酸などのメルカプト基を有する化合物とを
併用することが必要である。

ガラクトース残基を有する化合物としては、乳糖、メリ
ビオース、ラフィノース、フェニルβ−Ｄ−ガラクトシ
ド、チオジガラクトシド、アシアロフェツインなどが挙
げられる。これらのガラクトース残基を有する化合物の
抽出液中への総添加濃度は、０．０１〜１Ｍであること
が好ましく、０．０２〜０．２Ｍであることが更に好ま
しい。

以上のようにして得られた抽出物の精製は、常法により
行なうことができるが、特に、前述のガラクトース残基
を有する化合物をリガンドとする親和クロマトグラフィ
ーにより精製することが好ましい。

本発明のポリペプチドは、免疫原性における問題が少な
く、人間の重症筋無力症の治療のほか、従来のレクチン
に認められている白血球その他の細胞の活性化等に優れ
た効果が期待される。

又、マウスマクロファージ及びヒト腹腔単球からの細胞
毒素の放出を誘発することが知られている［ティー、カ
シカワ（Ｔ、Ｋａｊｉｋａｗａ）等著；ライフ　サイエ
ンシズ（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　＋　ユニ＋１
１７７〜１．１８１頁（１９８６年）］。

次に、実施例、実験例により本発明を更に詳細に説明す
る。以下の実施例、実験例は、本発明の範囲を何ら制限
するものではない。

工立亘工　　　　　　　　゛　　　・ 水洗し、還流して血液を除去した新鮮なヒト胎盤（湿重
量４０９ｇ）を２ｍＭのＥＤＴＡナトリウム及び４ｍＭ
のβ−メルカプトエタノールを含有するリン酸緩衝化生
理食塩水（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２，１
５０ｍＭ塩化ナトリウム）（以下ｒＥＤＴＡ−ＭＥＰＢ
ＳＪと称す）約４倍量中で、ワーリングブレンダーを用
いて１分間磨砕し、６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
した後、洗浄した。沈渣に０．１Ｍの乳糖を含有するＥ
ＤＴＡ−ＭＥＰＢＳを磨砕における使用量と同容量加え
、４℃で３０分間振盪抽出した。６０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離して上清を取り、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅ
ｌ）　Ｐ　−６（５０〜ｌＯＯメツシユ）［バイオラッ
ド（Ｂｉｏ−Ｌａｄ　）社製ポリアクリルアミドゲル］
を充填し、ＥＤＴＡ−ＭＥＰＢＳて平衡化したカラム（
φ　４．３×９２０　ｍ　ｍ　）を用いてクロマトグラ
フィーを行ない活性画分を集めた０次いて、アシアロフ
ェツインを固定化させたセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）（ファルマシア社製アガロースゲル）を充填した
カラム（φ　２２×１６０ｍｍ）にのせ、ＥＤＴＡ−Ｍ
ＥＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭの乳糖を含有するＥ
ＤＴＡ−ＭＥＰＢＳで溶出して活性両分を集めた。これ
らの操作により、抽出液に比し精製度が約５３０１Ｂと
なり、活性収率は約１３％であった。

得られた精製品は凍乾し、使用時まで一８０℃で貯蔵し
た。

１土五ユ 実施例１と全く同様にして、ヒト臍帯レクチンを抽出、
精製した。精製度は約５３０倍、活性収率は約１３％で
あり、これも実施例１の結果と同じであった。

実験例１　　　　　　　　゛　　　　　　・（１）等電
点 ３　Ｗ／Ｖ％のサーブアリット（Ｓｅｒｖａｌｙｔ）　
　［サーブ７　（Ｓｅｒｖａ）社製、ｐＨ域３〜６］を
含む薄層ポリアクリルアミドゲルを使い、ラドラ（Ｒａ
ｄ−ｏｌａ）法［ラドラ　ビー、ジエイ、　（Ｒａｄｏ
ｒａ　Ｂ、Ｊ、）著；エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、上、４３〜５６頁（１９８
０年）コにより測定した。ｐＩママ−−蛋白としてはア
ミログルコシターゼ（ｐ　Ｉ　３．５）　、グルコース
　オキシダーゼ（４，１５）、大豆トリプシンインヒビ
ター（４，５５）、牛β−ラクトグロブリン（５，２０
）。

牛カーボニックアンヒドラーゼ（５゜８５）を使用した
。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では均一と思
われたが、ｐＨ５付近に多重帯が観測された。１帯はｐ
Ｈ４，９で観察された（第１図）。

（２）分子量 非変性条件下で、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ　）社製
の６０００Ａポンプと４４０Ａ検出装置とが備わったア
サヒバツクＧ５−５１０カラム［旭化成工業（株）製、
７．６Ｘ　１５０ｍｍ］を使い、高速ゲルクロマトグラ
フィーにより分子量を測定した。

クロマトグラムはウォーターズ社製の７３０データモジ
ユールにより記録した。

即ち、凍乾レクチンをｐＨ７，２の１５０ｍＭのＮａＣ
ｆｆ１　（又はＰＢＳ）を含む２０　ｍ　Ｍのリン酸ナ
トリウム中に、又は、１０ｍＭのラクトースを含むＰＢ
Ｓ中に１ｍｇ／ｍｆｆ１の濃度で溶解した。

４℃で０時間、８時間、２８時間経過時に各１０μｇの
サンプルをカラムに入れた。平衡緩衝液はＰＢＳであり
、流速は１ｍ！／分であった。

本発明のヒト胎盤レクチンは主として二量体（２８００
０）に対応する位置で溶出したが、小量は単量体（１４
０００）位置で溶出した。溶液を数時閏放置したら、二
量体に対する単量体の比率が増した（第２図）。

なお、第２図において、矢印の付いたａ％ｂ１Ｃはそれ
ぞれ、マーカー蛋白としてのチキンオバルブミン（分子
量４５０００）　、大豆トリプシンインヒビタ（２２０
００）　、牛リボヌクレアーゼＡ　（１３７００）の溶
出位置を示す。

（３）紫外部吸収スペクトル ジャスコ（Ｊａｓｃｏ　）社のウヴイデック（ＵＶＩＤ
ＥＣ）−５０分光光度計を使い、非変性条件下と、変性
条件下で測定した。即ち、１５０ｍＭのＮａＣＬ。

２ｍＭのＥＤＴＡ及び４ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）中で
０．０８ｍｇ／ｍｇ、の濃度で、又、２０ｍＭのリン酸
ナトリウムを含むｐ　Ｈ６，５の一６Ｍ塩酸グアニジン
中で、０　、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの濃度で測定した
ら同一の結果が得られたく第３図）。

２５０〜２７０ｎｍの間で多くの肩部が観察されたが、
この傾向は電気うなぎ由来のレクチンで報告されている
もの［レヴイ　ジー、　　（Ｌｅｖｉ　Ｇ、）等著；ジ
ェイ、パイオル、ケム、　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、）、２５６．５７３５〜５７４０頁（１９８１年）］
と同じであり、チロシン残基に比ベフェニルアラニン残
基が多く存在するためと考えられる。

（４）チオール基 ５．５−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴ
ＮＢ）を使い、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）法［エルマン
　ジー、エル、　　（Ｅｌｌｍａｎ　Ｇ、Ｌ、）著；ア
ーク、バイオケム、バイオフィズ、　（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　８２　、７０
〜７７頁（１９６９年）コで測定した。

即ち、ヒト胎盤レクチンを０　、２５Ｍ　）リスーＨＣ
ｆｆ１中の１　、０　ｍ　ｌの８Ｍ尿素（ｐＨ８，０）
に溶かし、２５モル過剰量のＤＴＮＢを加えた。

４１２ｎｍでの吸収により反応を１５分間モニタ−し、
色原体２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸のモル吸光
係数（４１２ｎｍてｔ　３６００Ｍ−’）に基づいてチ
オール基の数を計算した。

１サブユニツト当たり４．２個のチオール基が見い出さ
れた。還元カルボキシメチル化体のアミノ酸分析によっ
ても１サブユニツト当たり４．７個のシスティン残基の
存在が確認された。

（５）糖鎖結合活性に対するチオール１＠飾剤の影響他
レクチンと同様に、ヒト胎盤レクチンも、２−メルカプ
トエタノールが存在しないと赤血球凝集活性を失う。

この糖鎖結合におけるチオール基の役割を調べるために
、これらの基をｐ−クロロマーキュリ安息香酸（ｐＣＭ
Ｂ）と、Ｎ−エチルマレインイミド（ＮＥＭ）で１：１
飾し、アシアロフェツイン［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社か
ら入手したフェツインをｐＨ２，８０℃で１時閉酸処理
して調製した］に対する残存活性を固相しクチン結合能
分析法により測定した。結果を第４図に示す。

第４図において、・を結んだグラフは、いずれの修飾剤
をも使用せずに反応させた場合の、３０分経過後の残存
活性を示す。Ｏを結んだグラフは、同一の条件下で２０
時間経過後の残存活性を示す。

ムを結んだグラフは、ＮＥＭで修飾してから反応させた
場合の、３０分経過後の残存活性を示す。

Δを結んだグラフは、同一の条件下で２０時間経過後の
残存活性を示す。■を結んだグラフは、ｐ　ＣＭＢで修
飾してから反応させた場合の、３０分経過後の残存活性
を示す。口を結んだグラフは、同一の条件下で２０時間
経過後の残存活性を示す。

ｐＣＭＢは３０分以内にレクチン活性を完全に不活性化
したが、ＮＥＭの効果は３０分経過後も不完全であった
（残存活性はコントロールの場合の２５％であった）、
いずれの修飾剤も存在しなければ、当初の活性は２０時
間経過後でも約５０％残存していた。

１）還元・カルボキシメチル化体の生産本発明のポリペ
プチドはＮ−末端アミノ基を欠くので、アミノ駿分析機
にかける前に開裂し、断片に分ける必要がある。

ヒト胎盤レクチン５．６ｍｇを、ＩＯＭの尿素と３ｍＭ
のＥＤＴＡとを含む５．６ｍｆｆ１の０．５５Ｍトリス
−ＨＣＬ　（ｐＨ８，８）に溶かし、ついで１０μ之の
２−メルカプトエタノールを加えた。

この反応混合物を窒素雰囲気下、３７℃で４時間経過さ
せた。ついで２２ｍｇの再結晶モノヨード酢酸を加え、
窒素雰囲気下、３７℃で２０分間反応を進行させた。暗
所で、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムで平衡化され
たバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）　Ｐ　−６［バイオ
−ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）社製、５０〜１００メツシユ、４．３
Ｘ９２ｃｍｌカラムでのゲル濾過により過剰試薬を除去
した。

２）　　　　　　　苦。・ 得られた還元・カルボキシメチル化体（１１０ノナモル
）を室温で２４時間、１．０ｍｆｆ１の７０Ｖ／Ｖ％の
ギ酸中で約２００倍モル過剰量の臭化シアン（ＢｒＣＮ
）で処理した。ついで５ｍｅの水を加え、凍乾した。

運転サンプルを１．０ｍｌの１００ｍＭ炭酸水素アンモ
ニウムに再溶解し、１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム
で平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　
Ｇ、−５０フアインカラム［ファルマシア社製、１．８
Ｘ１３５ｃｍｌで分配して、１２０残基からなるＣＮ−
１断片と、１４残基からなるＣＮ−２断片とを単離・精
製した。

３）　　　ヨー゛１　申　　　　　、 １１０ノナモルの前記カルボキシメチル化体を暗所で、
室温で２４時間、０　、５　ｍ　ｌの４Ｍ塩酸グアニジ
ン８０％酢酸中の３ｍｇの０−ヨードソ安息香酸（ＩＢ
Ａ）で処理した。ｌＯμｔの２−メルカプトエタノール
の添加により反応を止め、３００μｉの５ＭＮａ０Ｔ（
で中和した。

１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムで平衡化されたセフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５フアイン
［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）社製、１．４Ｘ
１３５ｃｍ］カラムでのゲル濾過により過剰の試薬を除
去した。流出した両分を集め、乾燥した。

乾燥サンプルを１．０ｍｌ！の１００ｍＭ炭酸水素アン
モニウムに再溶解し、１００ｍＭアンモニア水で平衡化
されたセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）Ｇ−５０
フアインカラム［ファルマシア社製、１．８Ｘ１３５ｃ
ｍｌで分配し、６８残基からなるＩＢ−１断片と、６６
残基からなるＩ　Ｂ−２断片とを単離・精製した。つい
で、デヴエロシル（Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ）　ＯＤ　Ｓ　
−５（野村化学薬品社製）カラムでの逆相クロマトグラ
フィーにより更に精製した（０．ＩＶ／Ｖ％トリフルオ
ロ酢駿中のアセトニトル量を増加させてゆく直線勾配溶
出を行った）。結果を第６図に示す。ＡはＩ　ＢＡ−１
の、ＢはＩＢＡ−２の精製を表している。

前記還元・カルボキシメチル化体（１１０ノナモル）を
０．１５ｍｆｆ１の１０ｍＭ）リスーＨＣｆｆ１緩衝液
（ｐＨ８，８）に溶解後、モル比で１／２００倍量のア
クロモバクタ−プロテーゼ！を加え、３７℃で、１２時
間消化した。消化物は、逆相系クロマトグラフィー（デ
ヴエロシル０ＤＳ−５カラム、４．６Ｘ２５０ｍｍ、０
．１％トリアリフルオロ酢酸／アセトニトリル）による
分画を行ない、８つの断片（ＡＰ−１〜８）を精製した
。

前記還元カルボキシメチル化体（７９ノナモル）を、０
．２ｍＬの０．１　Ｍ　）リスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，
０）に溶解し、重量比で１７５５倍量のサブマキシラリ
スプロテアーゼを加え、３７°Ｃで、１６時間消化した
。消化物は、上記４）と同一条件の逆相系クロマトグラ
フィーによる分画を行ない、１１の断片（ＳＭＩ−１１
）を精製した。

６）立エニ２　　−　　　で　　　　１　゛−４７ＯＡ
シーケンサー［アプライド　バイオシステムズ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製コてアミノ酸配
列を分析し、下線部分のアミノ酸配列（表示は１文字記
号による）を決定した。

断片の名称 ｉＶｃ　Ｉ　ＴＦＤＱＡＮＬＴＶＫＬＰＤＧ　Ｙ　Ｅ　
Ｆ　Ｋ　Ｆ　Ｐ　Ｎ　ＲＬ　Ｎ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｉ　Ｎ　
ＹＭＡＡＤＧＤＦＫ　ＩＫＣＶＡＦＤ ４７７Ａシーケンサ−［アプライド　バイオシステムズ
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製］でア
ミノ酸配列を分析し、第７図に示す下線部分のアミノ酸
配列（表示は１文字記号による）を決定した。

なお、Ｎ−末端断片５Ｍ−８のアミノ酸配列は、Ｎ−末
端がブロックされているため、まず、ダンシルヒドラジ
ン分解法でアセチル基を同定した後、次の通りに行なっ
た。

１０ノナモルの５Ｍ−８を、０．０５単位のアシル化ア
ミノ酸遊ｍｓ素ＡＡＲＥで窒素気流下、３７℃で１６時
間消化した。アシル化アミノ酸、切断された残りの断片
、未消化の断片は、逆相系クロマトグラフィー（ＯＤＳ
８０７Ｍカラム、Ｔ　ＯＳ　ＯＨ社製、４．６Ｘ１５０
ｍｍ、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）で
分離し、消化断片は前記４７７Ａシーケンサ−により、
そのアミノ酸配列を決定した。アシル化アミノ酸は、逆
相系クロマトグラフィー（ＯＤ　Ｓ　８０７Ｍカラム、
Ｔ　ＯＳ　ＯＨｉｆ製、４．６Ｘ　１５０ｍｍ、０゜１
％トリフルオロ酢酸）により同定した。

第８図に示すように、アミノ酸配列が決定された各断片
の重複部分を手懸かりにして、本発明のヒト胎盤レクチ
ンの全アミノ酸配列を決定した。

ｍユ　　　Ｐ　　　゛ 実施例１で得られたヒト臍帯レクチンの物理化学的特性
を、実験例１と同様な方法で測定したら、等電点、分子
量、紫外部吸収スペクトル、チオール基、糖鎖結合活性
に対するチオール修飾剤の影響とも全て、実験例１の結
果と同一であった。

工１且土　　　　−゛　　々 真空管内で、ｅＭＨＣｆｆｉ中で、１１０’Ｃで２０時
間加水分解し、日立８３５アミノ酸分析機で分析した。

結果を表２（数値はモル分率を示す）に、ヒト胎盤レク
チンのアミノ酸分析の結果と共に示す。メチオニン及び
チロシンの値は、４％チオグリコール酸存在下で同様に
加水分解してアミノ酸分析を行なった結果である。シス
ティン及びトリプトファンの値は未決定である。

表　　２ ヒト胎盤レクチン　　ヒト臍帯レクチンＡｓｐ　　　　
１９．５　　　　　　１９．４Ｔｈｒ　　　　　１．２
　　　　　　　１．ｌ５ｅｒ　　　　　４．２　　　　
　　　４．０Ｇｌｕ　　　　　８．６　　　　　　　８
．５Ｐｒｏ　　　　　４．８　　　　　　　４．７Ｇｌ
ｙ　　　　９．０　　　　　　　９．４Ａｌａ　　　　
１１．５　　　　　　１１．５Ｖａｌ　　　　　　　　
　７．７　　　　　　　　　　　　　　７．７Ｍｅｔ　
　　　　　　　　Ｏ，９０，８１ｉｅ　　　　　　　　
　３．１　　　　　　　　　　　　　　３．２Ｌｅｕ　
　　　　　　　　９．　２　　　　　　　　　　　　　
　９．　３Ｔｙｒ　　　　　　　　１．　１　　　　　
　　　　　　　　１．　０Ｐｈｅ　　　　　　　　　７
．　８　　　　　　　　　　　　　７．　９Ｌｙｓ　　
　　　　　　８．　０　　　　　　　　　　　　　Ｂ、
　　０Ｈｉｓ　　　　　　　　　１．　５　　　　　　
　　　　　　　１．　５Ａｒｇ　　　　　　　　３．９
　　　　　　　　　　　　　１Ｌ、０実験例３．４の結
果から、ヒト胎盤レクチンとヒト臍帯レクチンは同一物
質と結論された。

見！且 １）レクチンｃＤＮＡを単離するため、レクチンアミノ
酸配列のＣ−末端側（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−１１ｅ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ−Ｖａ　Ｉ）に対応するオリゴＤＮＡをアブラ
イドバイオシステムズジャパン（株）のＡＢＯ３８１Ａ
型ＤＮＡ合成装置を使って次の様に作製した。

５’　−ＣＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣ
ＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴ−３’２）次に、人間
３４週齢胎盤より抽出したｍＲＮＡに対して作製したｃ
ＤＮＡライブラリー［クローンチック社（Ｃ１ｏｎｔｅ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　！！］
Ｉ　Ｘ　１０’を２０枚の寒天培地に巻き込み、−晩３
７℃で培養した。その後、ファージプラークを直接、そ
れぞれ２枚のニトロセルロースフィルター（Ｇ　Ｓ　Ｎ
　−６、１３８ｍ　ｍφ）にレプリカした。

次いで、このレプリカしたニトロセルロースを寒天培地
上で３７℃で４時間培養した。その後、このニトロセル
ロースフィルタータを０．５ＮＮ　ａ　ＯＨ溶液、１．
５ＭＮａＣｆｆ１溶液に５分間室温で浸し、次に、ＩＭ
）リス−ＨＣ１ （ｐＨ８，０）、１．５ＭＮａＣｌ溶液に室温で５分間
浸すことで中和した。更に、２ＸＳＳＰＥ溶液中に室温
５分間浸し、その後風乾した。

風乾後、このニトロセルロースフィルターを、真空下、
８０℃で２時間処理してＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに固定した。

３）上記１）に示した合成りＮＡ　（１００ｍｇ）０５
′端を３０００Ｃｉ／ミリモルのγ−３２ｐＡ’ｒｐ　
［アメルシアム（Ａｍｅｒｃｉａｍ）社？！］　。

１００μＣｉのＴ−４ポリヌクレオタイドキナーゼ［タ
カラ（Ｔａｋａｒａ）社製コと共に、５０ｍトリス−Ｈ
ＣＱ　（ｐＨ７，６）　、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭ
ジチオスレイトール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＭ
ｇＣｆｆ１．中で、３７℃で１時間反応させて標識した
。この被標識化合成りＮＡを常法によりセファデックス
Ｇ−５０カラムクロマトグラフイーにより精製した。こ
の操作により、２Ｘ１０’ｃｐｍ／１１００ｎの比活性
を持つ被標識化ＤＮＡを得た。

４）上記２）で準備したニトロセルロースフィルターと
被標識化ＤＮＡを、５０ｍＭ）リス−ＨＣＬ　（ｐ　Ｈ
７、５）　、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ
、０．２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン
、０．２％ＢＳＡ、 ０．１％ＳＤＳ、１ｍｇ　　　ＤＮＡの中で４２℃で一
晩保温した。その後、ニトロセルロースフィルターを、
２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０、３Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ、０．０
３Ｍクエン酸ナトリウム）中に浸し、４２℃５分間の１
采温を３回繰り返した。その後、ニトロセルミースフイ
ルターを瓜乾し、オートラジオグラムを行なった。

５）オートラジオグラムによって得られた合成りＮＡと
特異的にハイブリダイズするプラークを選別した。選別
されたクローンを更に、上記２）から以上に述べた操作
を繰り返すことにより単一のものとし、１つのクローン
を得た。このクローンからＤＮＡを得、これをＥｃｏＲ
Ｉによって消化し、寒天ゲル電気泳動を行なった後、サ
ザン法を行なった。その結果、このクローンには、上記
３）てＸｊｌされた合成りＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡが確かに含まれていることが確認された。

［発明の効果］ 以上に記載の通り、本発明により、ヒト由来レクチンを
遺伝子工学的に合成する端緒が初めて提供される。ポリ
ペプチドに比べてＤＮＡに間する操作は一般的な方法を
用いて容易に可能であるので、本発明の有する意義は極
めて大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のポリペプチドの等電点測定の結果を
示す図である。 第２図は、本発明のポリペプチドの分子量測定の結果を
示す図である。 第３図は、本発明のポリペプチドの紫外部吸収スペクト
ルを示す図である。 第４図は、本発明のポリペプチドの糖鎖結合活性に対す
るチオール修飾剤の影響を示す図である。 第５図は、本発明のポリペプチドを臭化シアン、０−ヨ
ードソ安息香酸で処理して得られた断片の分離を示す図
である。 第６図は、本発明のポリペプチドを０−ヨードソ安息香
酸で処理して得られた断片を逆相クロマトグラフィーで
更に精製した際の挙動を示す図である。 第７図は、ヒト胎股レクチンのＡＰ−２〜４．７．８．
５Ｍ−２，８，１０，１１断片のアミノａ配列を示す。 第８図は、ヒト胎盤又は臍帯レクチンのアミノ酸配列を
示す。 特許出願人　笠井　献−（ほか５名） 第　　２　　図 溶出量（ｍＡ） 第　　３　　日 波長（ｎｍ） 后　共　部　郁 第５図 ０　　　　　　　　　１ｏｏ　　　　　　　　２００溶
出量（ｍ　） 手続補正書 昭和６３年５月ｌ喧

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記アミノ酸配列で表される、ヒト胎盤又は臍帯由来レ
   クチン。 【遺伝子配列があります】