JPH01112157A - 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血中の組織プラスミノーゲンアクチベーター
（以下ｔ−ＰＡという）の真のアクチベーター活性を測
定するための新規な測定法。

該測定に使用する測定用キットや測定具に関する。更に
詳しくは９本発明はｔ−ＰＡの活性部位以外の部位に親
和性を有し、　　ｔ−ＰＡに特異性があるｔ−ＰＡ抗体
ＩｇＧフラグメントを結合させた固相と、検体として血
漿あるいは血清分離をしない全血又はその希釈物を用い
、前記固相と検体中ｔ−ＰＡとの成積体のアクヂベータ
ー活性を測定することにより、血中ｔ−ＰＡの真の活性
を測定しようとするものである。

（従来技術） ｔ−ＰＡは線維素溶解機構に関与するセリンプロテアー
ゼの一種である。その作用は血管や組織に生じたフィブ
リンを溶解除去することにより血栓の形成を妨げること
が知られている。また、　　ｔ−ＰＡは血管内皮細胞で
合成され、必要に応じて分泌放出されるので血栓形成の
予防と血流の保全に必須の因子である。このようなこと
から、血液中のｔ−ＰＡ活性の高値で出血傾向。

低値で血栓傾向をきたすことが容易に推測されるが血液
中のｔ−ＰＡに対するインヒビター（ＦＡＩ）の存在や
半減期の短いこと、さらに血液から分離した血漿中でも
水冷下容易に不活性化されることから適当と思われる測
定法は今迄のところ開発されていない。しかしながら、
従来の測定法での結果は、高値を示した臨床例は、肝障
害［Ｊ、Ｃｌ１ｎ−Ｉｎｖｅｓｔ、、　４３．６８１　
（］　９６４）　、　Ｊ−Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、。

？１．　７７２（１９８３）］、卵巣癌［Ｅｕｒ−Ｊ、
　ＣａｎｃｅｒＣｌｉｎ、０ｎｃｏ１．、２０．５７７
（１９８４）］　、脳出血［Ｂｌｏｏｄ。

６１．２６７（１９８３）］が報告され、低値の患者に
っいては深部静脈血栓［Ｂｒ、　Ｊ、　Ｓｕｒｇ。、７
０．３６９（１９８３）、　　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄ
、　Ｊ−、２９（１，１４５３（１９８５）］Ａｔｒｏ
ｐｈｉｃ　Ｂｌａｎｃｈｅ　［Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏ
ｌ、　Ｌａｂ、　Ｍｅｄ、＋　１１０　＋５１７（１９
８６）］　、子子宮膜性性腫瘍　Ｃａｎｃｅｒ＋　４８
＋１４８４（＋９８２）］　、心筋梗塞や高脂血症［Ｔ
ｈｅ　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　　３１３．　　Ｎｏ２５，
１５５７（１９８５）］　　などの報告がある。さらに
ｔ−ＰＡ産生機構の異常により静脈血栓を繰り返えす家
系の報告もある［　Ａｃｔａ、Ｃｈｉｒ、５ｃａｎｄ、
＋　−ｉ　ａｓ、　３１３（１９７２）　、　Ａｃｔａ
、　Ｍｅｄ、　５ｃａｎｄ、、　　２０３　、４７７（
１９７８）］上記のことから血液中のｔ　−Ｐ　ｆｉ、
濃度を知ることは臨床的にも非常に重要な事である。

−船釣に今迄は血漿中のｔ−ＰＡ濃度をその抗原量と活
性値とで測定されてきて（・る。抗原量の測定には抗ｔ
−ＰＡ抗体を使ったＲＩＡ　（ラジオイムノアッセイ）
やＩＲＭＡ　（ｉｍｍｕｎｏ　ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ
ａｓｓａｙ　）＋　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍ
ｅ　　１ｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａ
ｓＳａｙ）等が用いられている（特開昭５９−１７４７
５９号。

同６１−１．４８２００号）。

一方、活性の測定には、フィブリン溶解法と合成基質法
に大別され、フィブリン溶解法としては次のような文献
が挙げられる。

Ｔｈｒｏｍｂ−Ｈａｅｍｏｓｔａｓ・、　５２（１）、
　１９（１９８４）Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓ、、　４５（２）、１０７１０７（１９８１）Ｔｈｒ
ｏ　Ｄｉａｔｈｅｓ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、、　３２．
３５６（１９７４）又合成基質法としては次のような文
献がある。

Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、、　４３．１２９（１
９８６）ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ
、５３（３）、　３５６（１９８５）Ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓＲｅｓ、、　４６．２１３（１９８７）Ｃ１ｉｎｉ
ｃａ、Ｃｈｉｍｉｃａ、Ａｃｔａ、＋　１２７＋　２７
９（１９８３）又通常血液中のｔ−ＰＡ活性を調べる材
料としては血漿が使用されているが、　　ｔ−ＰＡに対
するインヒビターを除去する目的でいろいろな処理が行
われている。例えば、血液を５分間遠心分離後、血漿を
分離し、ただちにｐＨ５，９に酢酸水で調整してＥｕｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　（ニーグロブリン
分画）を沈殿、遠心分離する方法［Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓ、＋旦（３）、　２６６（１９８２）
］’、又は血漿をｐＨ３，９に調整して一７０°Ｃ（ド
ライアイス）で即座に凍結する方法（使用時に加温溶解
し、　　ｐ　Ｈ７，４位に修正する）、さらには血漿中
のｔ−ＰＡをリジンセファロース（Ｌｙｓｉｎｅ　５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　）　　に吸着させ洗浄してｔ−ＰＡイ
ンヒビターを除去する方法［Ｔｈｒｏｍ−ｂｏｓｉｓ　
Ｒｅｓ、＋　４←４１３（１，９８７）］がある。

（発明が解明しようとする課題） しかしながら、　　ｔ−ＰＡの抗原量を測定する方法は
、いずれもｔ−ＦＡとそのインヒビターとの反応成積体
をも抗原量として測定してしまい真のｔ−ＰＡ活性を測
定しえない欠点がある。

また、ｔ−ＰＡ抗原量やｔ−ＰＡ活性を測定する上記の
従来法は。

（１）血液から血漿を分離するために遠心に必要な時間
は、遠心開始から終りまで最低１０分間であり、その間
に血漿中のｔ−ＰＡ活性は失なわれる。

（２）結果の判定まで長時間（約２０時間）必要であり
、簡便さに欠けるばかりでなく。

方法によっては反応時間中にｔ−ＰＡのインヒビターの
影響を受は続けるため真のｔ−ＰＡ活性を測定すること
ができない。

など問題点があった。また、従来法は、　　ｔ−ＰＡイ
ンヒビターの影響を避けるために数十倍から数千倍の希
釈が必要で、感度及び精度の優れた測定法でないと、　
　ｔ、−ＰＡ活性すらとらえることはできないという問
題点があった。

以上の理由から血液中のｔ−ＰＡ活性をそのままの状態
で測定する方法は親在までのところ成功していない。

（課題を解決するための手段） そこで１本発明者らは、真のｔ−ＰＡ活性の測定法を確
立するため、　　ｔ−ＰＡ活性を失なわせるような遠心
分離を施さない全血あるいはその希釈物で測定する方法
につき鋭意研究した結果。

抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を固定した固相と検体中
ｔ−ＰＡとを短時間で反応させて生成した反応成積体に
、直接ｔ−ＰＡ特異的合成基質を作用させるか、あるい
はｔ−ＰＡに特異的な酵素基質を作用させ、生成する酵
素に該酵素に特異的な合成基質を作用させる方法によれ
ば、検体中の真のｔ−ＰＡ活性を、極めて簡便かつ短時
間処埋で、精度及び感度よく測定しうろことを見出し９
本発明を完成させるに至った。

すなわち１本発明は、　　ｔ−ＰＡの活性部位以外の部
位に親和性を有するｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメントを
結合させた固相と、全柚又はその希釈物中のｔ−ＰＡと
を反応させ９次いで該成積体の活性を測定することを特
徴とし、該測定法の提供を目的とする。また１本発明は
、少なくともｔ−ＰＡの活性部位以外の部位に親和性を
有するｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメント÷−奄一←÷←
ジ許を結合させた固相と、該フラグメントを結合させた
固相と全血又はその希釈物中のｔ−ＰＡとの反応成積体
の活性を測定するための測定試薬とを含有することを特
徴とし、該測定用キットの提供を目的とする。

さらに２本発明は、プラスチック製スティックの一方の
端部に、ｔ−ＰＡの活性部位以外の部位に親和性を有す
るｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメントの被覆層を固定した
ことを特徴とし、該測定具の提供を目的とする。

以下本発明につき更に詳細に説明する。

（測定法） 本発明の測定法は、抗ｔ”−ＰＡモノクローナル抗体を
結合した固相を用いるものではあるが。

（１）　　二次抗体を用いない （２）　　抗Ｗ量でなく、ｔ−ＰＡ活性を測定するもの
である。

という点において従来のモノクローナル抗体使用エリザ
（ＥＬＩＳＡ）法とは全く異なる。従来のエリザ法は、
インヒビター共存下では、検体を−ＰＡの一部がｔ−Ｐ
Ａインヒビターと結合してｔ−ＰＡ活性が失なわれてい
るにも拘らず、該ｔ−ＰＡとｔ−ＰＡインヒビターの成
積体をもｔ−ＰＡ抗原量として測定している。本発明は
、インヒビターをも共存する全血又はその希釈物を短時
間に測定する方法であり、かつ既にｔ−ＰＡとｔ−ＰＡ
インヒビターとの反応成積体を測定対象とはしないので
、血中の真のｔ−ＰＡ活性をとらえることができる。

本発明に用いられるｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメントは
、ｔ−ＰＡとはそのアクチベーター活性部位において結
合せず、ｔ−ＰＡに特異性がある抗ｔ−ＰＡモノクロー
ナル抗体であればよく、市販のＥＳＰ−２（バイオスコ
ツト社製、　　ｔ−ＰＡモノクローナル抗体）、特開昭
５９−５１２１号公報。

特開昭６１−１４８２００号公報、特開昭６１−１８１
９６４号（や同６１−１８３２９９号）公報に記載され
た抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体であって、ｔ−ＰＡ活
性部位と結合しないものの全てを用いることができるが
、ブロムシアン処理フィブリノーゲンによって　ｔ　−
ＰＡ　活性が増強される点で格別に優れた抗ｔ　−ＰＡ
モノクローナル抗体５Ｐ−３２２（本出願人の別途出願
、特願昭６２−１７８０７３号、同６２−３２８００４
号）が特に好ましい。

また１本発明で用いられる固相としては、上記ｔ−ＰＡ
抗体を結合する能力を有するものが使用可能であり１例
えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン
、ポリビニール等のポリマー製のマイクロプレート、ビ
ーズ、ステインク、試験管等が用いられる。中でも使用
の簡便性に優れた後記ｔ−ＰＡモノクローナル抗体結合
ステインクが好ましい。

本発明の測定法は、短時間処理な目標とするものであり
、従って、検体としての全血は抗凝固剤の存在下被験対
象者から採血した直後の全血が好ましい。また、全面の
希釈物は、全血を生理食塩水等の希釈媒体で４〜１６倍
程度に希釈したものが好ましく９本発明の測定法におい
ては４倍程度でｔ−ＰＡインヒビターの影響を少なくす
ることが可能である。

ｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメント結合固相と検体中ｔ−
ＰＡとの反応成積体の活性を測定するには。

該成積体に直ちにｔ−ＰＡに特異的な合成基質を作用さ
せ、該合成基質から遊離する発色性あるいは発光性の物
質の量を光学的に測定するか。

あるいは該成積体にｔ−ＰＡに特異的な酵素基質を活性
刺激剤の存在下又は非存在下に作用させ。

生成する酵素に、該酵素に特異的な合成基質を作用させ
、遊離する発色性９発光性の物質の量を光学的に測定す
ることにより行なわれる。

ここに、　　ｔ−ＰＡに特異的な合成基質は、　ｔ−Ｐ
Ａと反応することにより分解し１発色９発光性の物質を
遊離し、その発色性２発光性物質の量が。

ｔ−ＰＡ活性と相関するものであればよい。このような
合成基質で市販されているものには、Ｓ−２２８８（Ｈ
−Ｄ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｃ）１−Ｎ
ｏ、・２ＨＣ１；カビ社製）　、　Ｓ　−２４４４（Ｈ
−Ｌ−ｐＧｌｕ　−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ−ＣｙＮ
Ｏ２・ＨＣＩ　　；カビ社製）等［特開昭５２−２４５
８１号（特公昭５６−１５．２３８号）、特表昭５５−
５０００７６号等参照］があり、これらはいずれも色原
性基質であり、ｐ−ニトロアニリンを遊離する。ｐ−ニ
トロアニリンは黄色帯域の可視光線に特性波長４０５　
ｎｍを有するものである。市販はされていないが、上記
基質中の色原性残基が９例えば４−メトキシ−β−ナフ
チルアミド残基あるいは７−アミノ−４−メチルクマリ
ン残基となれば２発けい光性基質となる。

遊離する４−メトキシ−β−ナフチルアミン及び７−ア
ミノ−４−メチルクマリンは、それぞ光を測定すること
によってその量を検出することができる。

一方、ｔ−ＰＡに特異的な酵素基質としては典型的には
プラスミノーゲンであり、好ましくはヒトのリジンプラ
スミノーゲンやグルタミルプラスミノーゲン等が挙げら
れろ。

本発明測定法に用いられてもよい活性刺激剤には例えば
ブロムシアン処理フィブリノーゲン。

可溶性フィブリノーゲンモノマー、ポリリジン。

フィブリン等か挙げられる。

成積体とｔ−ＰＡに特異的な酵素基質との反応により生
成する酵素は、酵素基質としてプラスミノーゲンを用い
ればプラスミンとなる。

生成酵素に特異的な合成基質は、生成酵素と反応するこ
とにより分解し１発色１発光性の物質を遊離し、その発
色性９発光性物質の量が。

生成酵素活性、ひいてはｔ−ＰＡ活性と相関するもので
あればよい。例えば生成する酵素がプラスミンであれば
、前記特開昭５２−２４５８１号（特公昭５６−１５２
３８号）、特表昭５５−５０００７６号や特開昭５２−
３４９４号（特公昭５６−２２５１９号）、特開昭５７
−２２５３号（特公昭６２−５７１．９７号）、特開昭
５８−６３３９９号（特公昭６１−９８４０号）、特開
昭５８−１７２３５４号、特開昭６２−２９４．６９５
号、特開昭６２−２９４６９６号公報などに記載された
もののうち。

プラスミンの基質となるもの等が例示できるが。

特にプラスミンに対して特異性が高い市販品Ｓ−２２５
１，（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＮＨ
−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ＋ＮＯｚ・２ＨＣ
１：カビ社製）　、　Ｎｒ、　５１−３２　（ＨＤ−Ｖ
ａｎ、　　５ＨＴ−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ・２ＡｃＯＨ；　
ペンタファルム社製）。

クロモチーム　Ｐ　Ｌ　（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ　ＰＬ　
；　Ｔｏｓ　−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ　；
ベーリンガーマンハイム社製）が好適に用いられる。こ
れらを合成基質とするときは２発色性物質としてｐ−ニ
トロアニリンを遊離する。その測定及び発げい光性基質
については前記と同様である。

測定は具体的には （１）　　固相にｔ−Ｐ　Ａ抗体ＩｇＧフラグメントを
コーティングし。

（２）　　これを洗浄して結合しなかったｔ−ＰＡ抗体
ＩｇＧフラグメントを除去し。

（３）　　これに全血又はその希釈物を加えて検体中の
ｔ−ＰＡと短時間内に反応させて結合させ。

（４）　　これを洗浄して、結合しなかった成分を除去
しくインヒビターも除去される）。

（５）　　これに、直接ｔ−ＰＡに特異的フエ合成基質
例えばＳ−２２８８を加えてインキ−ベートするか、又
は（４）に更にｔ−ＰＡに特異的な酵素基質例えばリジ
ンプラスノーグン、活性が低ければさらに活性刺激剤例
えばブロムシアン処理フィブリノーゲンと、生成酵素例
えばプラスミンに特異的な合成基質例えばＳ　−２２５
１、Ｎｒ−５１−３２又はクロモチームＰＬを加えてイ
ンキ−ベート１−９ （６）遊離する物質を検出定量し。

（７）必要によりｔ−ＰＡ活性に換算することにより行
われる。

洗浄、インキュベートなどの処理は、定められたｐＨ，
イオン強度の緩衝液を用いて行われる。

このような緩衝液としては、リン酸、炭酸、ホウ酸、ク
エン酸、バルビッール酸の緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
アミノ酸緩衝液などが挙げられる。処理手段によっても
若干具なるが、中でもトリス塩酸緩衝液あるいはこれに
塩化ナトリウムやツイーン（ポリオキシエチレンソルビ
タン脂肪酸エステル）を混入したものが有利に用いられ
る。反応温度は、成積体の作成では室温下で充分であり
、検出定量のためのインキュベートでは約３７℃で行う
のが有利である。

合成基質による測定は、ｔ−ＰＡあるいは生成酵素を失
活させるか又はせずして遊離物質の種類に応じて２分光
光度計やけい光検出器など。

常用の測定機器を用いて行うのが好ましい。

（測定キット） 本発明には前記測定法に適用するキットが包含され、好
適には前記測定法に使用する固相。

ｔ−ＰＡモノクローナル抗体、ｔ−ＰＡ活性測定試薬す
なわちｔ−ＰＡ特異的合成基質、あるいはｔ−ＰＡ　　
特異的酵素基質、（必要により活性刺激剤）生成酵素特
異的合成基質、その他標準液などの全てを網羅するのが
使用の簡便性の点で好適であるが、必ず１２もこれら全
ての試薬を備えたものだけに限定されない。すなわち２
本発明の測定用キットは、少な（とも抗ｔ−ＰＡモノク
ローナル抗体又はこれを固相に結合したものと、成積体
のｔ−ＰＡ活性測定試薬とを含有することを特徴とする
ものであり９本発明にはこれらを含む全血あるいはその
希釈物のｔ−ＰＡ活性測定用キットの全てが含まれる。

（測定具） 本発明には、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を結合させ
た固相のうち、特に使用の簡便性に優れ、測定の短時間
処理に最も適した抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体結合ス
ティックが含まれる。

具体的には１本発明のｔ−ＰＡ活性測定用ステインク状
測定具は、プラスチック製であり、その一方の端部にｔ
−ＰＡの活性部位以外の部位に親和性を有するｔ−ＰＡ
抗体ＩｇＧフラグメントの被覆相を固定してなるもので
ある。中でも易切断部を設け、測定に使用する容器の開
口縁部を支点として折曲げることにより容易に切断しう
るものが好ましい。また、このスティックを真空採血管
に予め収容した測定具も本発明の好適な具体例として挙
げられる。

以下２本発明測定具につき、実施例である図面に基づい
て詳細に説明する。第１図は本発明スティック状測定具
１の斜視図であり、第２図は該測定具１を用いて測定す
る方法の工程図を示す。

ステインク本体２は抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体が結
合しつるプラスチックを素材とし９図面においては矩形
平板状となっている。プラスチック素材としては前記固
相素材として挙げられたものが例示されるが、特に易切
断部を設け。

容器の開口縁部を支点として折曲げることにより容易に
切断しうる素材が適切である。本発明の実施例において
はポリスチレンのスティックナル抗体を被覆していない
側の端部を指でつまんで作業できるものであればいずれ
でもよく。

図示の矩形や平板状に限定されるものではない。

しかし、易切断部を設け、容器の開口縁部を支点として
折曲げることにより容易に切断しうるようにするために
は、棒状よりも図示の平板であるのが好適である。

スティック本体２の一方の端部には抗を−ＰＡモノクロ
ーナル抗体被覆部３が設けられており、抗ｔ　−ＰＡモ
ノクローナル抗体が被覆され固定されている。被覆、固
定は常法によって行なわれる。すなわち、スティックを
洗浄して乾燥後、抗ｔ　−ＰＡ　モノクロ−ナル抗体の
緩衝液を入れた容器に端部を浸漬し。

室温であれば４時間程度、４℃以下であれば一晩程度放
置してコーティングし、血清アルブミンなどを含む緩衝
液を入れた容器にコーティングスティックを投入し、室
温であれば１時間程度。

４℃下であれば一晩程度放置して固定する。

コーティングはスティック基端部４より測定容器に入れ
られるべき基質溶液の上面迄に完全に浸る程度（図面に
おいては基端部４より６ｍｍ程度）のところまで行うの
が好ましい。また。

コーティングは通常スティック本体２．端部の表裏全面
に行われるが９片面だけにコーティングすることを妨げ
ない。

図中５は血清アルブミンでブロッキングした領域を示す
。固定領域５はその固定目的が達成できる領域であれば
よく、前記被覆部以上であればよい。

ステインク本体２には、予め易切断部６を設けておくの
が好ましく２図面においてはスリり非コーテイング側に
寄ったところ（その非被覆側近縁部）で、測定容器の開
口縁部に当接するあたり（図面においては基端より１０
ｍｒｎ程度）に設けるのが好適である。

易切断部６は、容易に切断、殊に測定容器の開口縁部を
支点として折曲げることにより容易に切断できるもので
あれば図示のスリットに限定されず、ミシン目等であっ
てもかまわない。

このスティック状測定具１を用いて測定する方法は、第
２図（１）で説明すれば、真空採血管７に全血８を採り
［（ａ）、但し、この真空採血管７には予め、クエン酸
ナトリウムやヘパリンなどの抗凝固剤を収納していても
よい］、これにスティック状測定具１を採血後直ちに入
れ、室温下であれば５〜１２０分程度放置して、全血と
反その開口縁部１０を支点として折曲げて切断し。

抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体被覆部３を含む切断片１
１のみを容器９中に投する［　（ａ）　］。この切断片
１１を収納した容器９中に基質溶液を入れ。

３７℃で約３０分〜２０時間インキュベー）　［（ｅ）
　］した後、スティック片を取り出し、測定器（図示せ
ず）に付し、基質から遊離する発色又は発光物質の量を
測定する［　（ｆ）　］。（なお２反応の停止後でも比
色測定は可能である）。

また、全血希釈物を用いる場合を（２）で説明すれば、
予め希釈媒体１２及びスティック状測定具１．必要によ
り抗凝固剤を収容した真空採血管７に採血し［（ｍｌ　
］　、直ちに混合して５〜１２０分間放置して全血希釈
物１３と反応させた［　ｆｂ’１］後、洗浄して、上記
（ｃｌ〜（ｅ）と同様に処理して測定する。

なお、全血希釈物１３を用いる場合に限らず。

全血法においてもステインク状測定具」を真空採血管７
に予じめ収納しておくことができる。

すなわち、固定された抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体は
、かかる形態の市販に耐えられる程度に安定であるから
である。

また、希釈物質において希釈媒体１２を予じめ収容せず
、採血後直ちに希釈媒体１２を入れて混合する方法が採
用できないわけではない。

しかし、短時間処理が目的の本発明においては図示の方
法が好都合である。

（発明の効果） 本発明のｔ−ＰＡ活性測定法は、血液中の真のｔ−ＰＡ
活性の測定を初めて可能にするものであり、簡便性、感
度、精度などの点で以下のような種々の利点を有する。

（１）遠心操作が無いから、ｔ−ＰＡのインヒビターの
影響が少なくｔ−ＰＡの失活を最小限にすることができ
る。

（２）ｔ−ＰＡ活性測定が採血後１００〜１３０分以内
に判定可能であり、従来法（約２０時間）より極めて短
時間である。

（３）血漿あるいは従来希釈（一般に５０〜３２００倍
希釈）より軽い希釈度（４〜１６倍程度）の全血希釈物
で測定することが可能でｔ−ＰＡ−２４＝ の失活を極力防ぐことが可能で真のｔ−ＰＡ活性を高感
度に測定することが可能である。

（４）　　酸性（ｐＨ３，９）に調整したり、ドライア
イスで凍結（−７０°Ｃ）する必要もない。

（５）　　操作が極めて簡単である。

（６）活性刺激剤を入れる系においては、さらに感度が
向上する。

従って本発明の測定法は、　　ｔ−ＰＡ、　　ｔ−ＰＡ
誘導体やその他の線溶系充進剤のスクリーニング、臨床
効果等の確認ばかりでなく、特定疾患の診断、病状のモ
ニター、　Ｔ　Ｄ　Ｍ　（ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤ　
ｒｕｇ　Ｍｏｎｔｉｏｒｉｎｇ　）に利用できる。

また２本発明の測定キットは、簡便な測定に供しうる利
点がある。特にｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメント結合固
相特にｔ−ＰＡ抗体ＩｇＧフラグメント被覆固定したス
ティック状測定具及びこれを含むキットはこれに全面、
その希釈物を作用した後成積体測定試薬を加えてインキ
ュベートし検出するだけでよく、極めて簡便である。

また、スティック状測定具を用いると。

■　血中ｔ−ＰＡを該スティックに吸着させたあと、緩
衝液で洗浄したものは活性のロスがなく、１週間保存（
４℃）することができ、測定を容易にすることができる
。

■　すでにモノクローナル抗体を固定しているので洗浄
が簡単である。例えばビーカー中に緩衝液を入れ、又は
常水で直接洗浄することができる。

■　被覆固定したスティック状測定具は緩衝液中４℃で
保存すれば、３ケ月以上安定である。

■　スティック状測定具は、移送の安定性にも優れてい
る。

（実施例） 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

（測定法１） 抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体５Ｐ−３２２を５０ｍＭ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）にて１μｇ／ｍ　ｌに調整
し、マイクロプレート（Ｌｉｎｂｒｏ　　Ｅ　Ｉ　Ａ　
ｐｌａｔｅ　ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｉ
ｎｃ、）に２００μｔずつ分注して室温で４時間又は４
℃下で一晩放置する。

ウェル内容物を吸引除去し、　　１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム（関東化学株式会社）、１係牛血清アルブミン（Ｓ
ｉｇｍａ、　Ａ−７０３０）　、　０．０２％アジ化ナ
トリウムを添加した１０ｍＭ）’Ｊスス−酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）をウェルに２００μｌ　分注し、室温で１時
間又は４°Ｃ下で一晩放置する。

ウェル内容物を吸引除去し、　０．０５％ツイーン２０
（半井化学薬品株式会社）を添加した１０　ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　（緩衝液■とする）３０
０μＬで４回洗浄する。

直ちにｔ−ＰＡを含有する検体（全血又はその希釈物）
２００μｔ　を分注し、室温で１０分間反応させる。

ウェル内容物を吸引除去し、緩衝液Ｉ　３００ＩＬｔで
６回洗浄する。

次いで基質緩衝液として０．４５ｍＭ　Ｓ−２２５１（
Ｋａｂｉ社製）、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、　０．
０１　％ツイーン８０（半井化学薬品株式会社）、　０
．０４２μＭリジン−プラスミノーゲン、１２０μｇ／
ｍｌブロムシアン処理フィブリノーゲンを添加した２　
０　ｍＭトリス−塩酸緩衝液（＋）Ｈ７，４）をウェル
に２００ｔｄ分注Ｌ　、　３７°Ｃ９０分インキュベー
トした後。

５０係酢酸水溶液５０μＬで反応を停止し、吸光光度計
（Ｔ　１ｔｅｒｔｅｋ　’　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　３１０　Ｃ）で４（１５ｎｍにおける吸光度によ
り測定した（原理図を第３図に示す。また、直接ｔ−Ｐ
Ａ活性を合成基質で測定する原理図を第４図に示す）。

なお、リジン−プラスミノーゲン、ブロムシアン処理フ
ィブリノーゲン及び抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体５Ｐ
−３２２調製法は以下の通りである。

リジン−プラスミノーゲンの調製法 リジンープラスミノーゲン（ミドリ十字製。

Ｃｏｄｅ　Ｎｏ、１０８９　、、）　（２１００ＣＵ　
）を純水に溶解し。

混入しているプラスミンを完全に失活させるため過剰の
アプロチニン（シグマ社Ｎｏ　−Ａ−６０１−２）２０
０００ＫＩ／ｉｎＺ　２０ｍＺを加え４°Ｃで一晩放置
する。

バイオゲルＰ１００ゲル（ＢＩＯＲＡＤ）を１４０ｍＭ
塩２８塩 化ナトリウムを添加した２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衝化し、同緩衝液で溶離後リジンープラ
スミノーゲンのピークを分取した。本実験によって得ら
れた蛋白量は１１００ｒｌＩであった。得られたりジン
−プラスミノーゲンは分注して一２０°Ｃで凍結保存し
用時溶解する。

ブロムシアン処理フィブリノーゲンの調製法Ｃ，Ｚａｍ
ｍａｒｒｏｎ　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−、２５９
Ｎｏ・４．２０８０〜２０８３（１９８４）］　の方法
に従って調製をおこなった。ヒト　フィブリノーゲン０
．８ｇ蛋白量をブロムシアン１，３ｇを含む７０係ギ酸
に溶解し。

窒素ガス中室温で１７時間処理する。その後。

３０１の純水に対して一昼夜透析し、さらに５１の純水
に加えて透析することによって調製する。

本実験によって得られた蛋白量は７００ｍｇであった。

得られたブロムシアン処理フィブリノーゲンは分注して
一２０℃で凍結保存し用時溶解する。

抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体の調製法■、　ハイブリ
ドーマ５Ｐ−３２２の調製ａ）免疫した牌細胞の調製 ＢＡＬＢ／Ｃ系雌マウス（免疫開始時で８週令）に精製
されたヒト黒色腫細胞由来ｔ−ｐＡ（パイオスコント社
製）を３０μｇ／匹または７．５μｇ／匹の投与量で、
同容量のフロイントの完全アジュバントと混合して乳濁
化させた後、腹腔内投与した（第１回免疫）。以後３〜
４週間の間隔で２回、ｔ−ＰＡ３０μｇ／匹または７．
５μｇ／匹を同容量のフロインド不完全アジュバントと
混合乳濁化させて腹腔内注射した。第３回免疫の６週間
後、ｔ−ＰＡを３０μｇ／［ｆｆｉもしくは７．５μｇ
／匹を含む生理食塩液０．４　ｍｌを腹腔内投与した（
最終免疫）。最終免疫の３日後に牌臓細胞を２匹のマウ
スから採取し、　ＤＭＥＭ培地に懸濁させた。赤血球は
０．１７Ｍ塩化アンモニウムで０℃にて１０分間処理す
ることにより破壊し、遠心分離することにより除去した
。

ｂ）ハイプリドーマ５Ｐ−３２２の調製上記で調製した
牌細胞（５Ｘ１０８個）をマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３
　Ａｇ８　、Ｕｌ　（Ｐ３Ｕｌ）　（ＩＸ１０８個）と
ケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ＋第２５
６巻、第４９５頁（１９７５）参照］により融合した。

すなわち牌細胞とＰ３Ｕｌ細胞をＤＭＥＭで数回洗浄し
た後１両者を５０ｍＺ容プラスチック製試験管に入れ、
充分混合した。

次いで遠心分離して培地を除去し、これに３７℃に保温
したｓｏ％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ
社製、平均分子量３６４０）を含むＤＭＥＭ　１　ｍｌ
を１分間を要して攪拌下体々に加えた。次に３７℃に保
温したＤＭＥＭ　１０ｍ１を滴下して細胞融合反応を終
了させた。

反応液を遠心分離し、上澄液を除去した後。

ＨＡＴ倍地［ヒボキサンチン（］、Ｘ１０−’　Ｍ　）
　。

アミノプテリン（４Ｘ１０−７　Ｍ　）　、チミジン（
１，６×１０−５　Ｍ　）を添加した１０チウシ胎仔血
清を含むＤＭＥＭ培地］培地液に加え、牌細胞濃度が５
Ｘ１０−５細胞数／　ｍｌになるようにした。

この懸濁液を２４穴プラスチツク製プレートに１穴当り
２　ｍｌ　（牌細胞ｌＸ１０６個）ずつ分注した。４〜
５日ごとに培地の半量を吸引除去し、上記ＨＡＴ培地を
加えた。細胞融合の７〜１０日後すべての穴の中にハイ
ブリドーマの増殖が見られたので、下記免疫沈降法で培
養−ト清中の抗ｔ−ＰＡ活性を測定した。

Ｃ）免疫沈降法による培養上清中の抗ｔ−ＰＡ活性の測
定 放射性ヨウ素（＋２５　Ｉ　）で標識した（クロラミン
Ｔ法による）　ｔ−ＰＡ　［ｉｏｏμＺ　、　０．７’
Ｚウシ血清アルブミン、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．
０５係（ｗ／ｖ　）ツイーン８ｏを含む２５ｍＭ）リス
緩衝液ｐ　Ｈ７，４中に溶解。以下１町−ｔ−ＰＡと略
す］とハイプリドーマ培養上清２０μ乙を混合、プラス
チックチー−プ中で一夜室温にて放置した後、ウサギ抗
マウスＩｇＧ抗血清１μＬを加え。

さらに３時間室温で放置した。

これにパンソルビン（商品名、カルバイオケム社製）懸
濁液１０μｔを加え混合して３゜−３２＝ 分後トリス緩衝液を２　ｍｌ添加してすぐに遠心分離し
た（　３０００　ｒｐｍ＋　１５分間）。上澄液を除去
し、沈渣中の１２５Ｉ−ｔ−ＰＡの放射活性をアロカ社
製オートウェルガンマカウンターＡＲＣ３００型にて測
定した。有意な＋２５Ｉ−ｔ−ＰＡ　　免疫沈降を示す
ハイプリドーマ増値ウェルについては。

−ニングを２回行い、得られたハイプリドーマクローン
をＳ　Ｐ−３２２と命名した。またハイブリドーマ５Ｐ
−３２２により産生される抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗
体も５Ｐ−３２２と命名した。

■　モノクローナル抗体の産生と精製 ＢＡＬＢ／Ｃ系雄マウス、生後６〜８週令に２゜６．１
０．１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン、ア
ルドリッチ社製）　０．５　ｍｌを腹腔内注射した後、
７〜１４日後に１０７個のハイプリド−マ５Ｐ−３２２
を生理食塩液Ｏ０５ｍＺに懸濁して腹腔内に接腫した。

１０〜２０　日経過後、産生された腹水を屠殺開腹した
マウスより採取した。１匹のマウスより５〜１０ｍＺの
モノクローナル抗体含有腹水が得られた。この腹水は遠
心分離して不溶物除去後１等容量の飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を加え、４℃下１時間〜−夜放置した。生じた沈
殿を遠心分離し、少量の０．９％の食塩を含む０．１Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解、その後１００倍容の同
じ緩衝液に一晩透析した（ガンマグロブリン画分）。こ
の画分より９ＭＡＰＳ−■マウスモノクローナル抗体精
製キット（商品名、バイオランドラボラトリーズ社製）
を利用してＩｇＧを精製した。すなわち。

ガンマグロブリン画分に同容量のパインディングバノフ
ァーを加え、混合した後、同じパインディングバノファ
ーで充分平衝化したアフィゲルプロティンＡ（バイオラ
ンドラボラトリーズ社製）もしくはプロティンＡセファ
ロースＣＴ、４Ｂ（ファルマシアファインケミカル社製
）を充填したカラム（ゲルペットボリューム５もしくは
１ｏｍＺ）にかけ、パインディングメソファー１０カラ
ム容量で洗浄した。次いでキットに含まれる溶出バッフ
ァー約３カラム容量でＩｇＧを溶出した。溶出したＩｇ
Ｇは硫酸アンモニウムによる塩析にて濃縮し、０．９％
の食塩を含む０．０１〜０．１Ｍ　ＩＪン酸緩衝液等で
透析し、これを５Ｐ−３２２のＩｇＧ標品とした。通常
腹水１　ｍｌ当り１１〜１８Ｉｒ１ｇのＩｇＧが得られ
た。

（標準化） ｔ−ＰＡ（−水銀）標準検体０．０２〜４０　ｎｇＡｌ
を用いて検量線を作製した。希釈は０２５チ牛血清アル
ブミン添加緩衝液■にておこなった。

との結果によれば０．０３　ｎｇ／ｉ’ｎＺ　〜２０　
ｎｇ／Ｆｎｌの検量線となりうろことが明らかにされた
。

（健常人血中ｔ−ＰＡ活性測定） 被検者を１０分間安静にし、５分間１００ｍｍＨｇの圧
で緊縛した後、対圧中皮静脈に穿刺し、あらかじめ採血
する注射器には薄液９に対して３８係クエン酸ナトリウ
ム（ミドリ十字）１を入れておく。採血後針をはずし、
予め水中に用意しである試験管に入れる。直ちに用意し
ておいた抗体をコーティングしたマイクロブ１／−トに
全血２００μ１分注して検定に供する。

結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 ＋　１６　］〜５　１００ｍｒｎＨｇ　５分負荷後採血
■４６〜１０　通常採血 なお、ｔ−ＰＡ活性１　ｎｇ／ｍｌは国際単位で表示す
れば０．５５　ＩＵ／ｍｔとなる。

（測定法２） ステインク状測定具の作成 ポリスチレンのプラスチックスティック（日本曹達製、
縦１００ｍｍ　、横５．５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を。

エキストラン　エムエイ　０１■（商品名、　　Ｅｘｔ
ｒａｎＭＡＯＩ；メルク製）を２０倍に希釈した洗剤に
籾温６０℃水浴中で一晩浸漬する。スティックを超音波
洗浄機で３時間、常水で３時間洗浄１〜だ後、精製水に
一晩浸漬する。

ステインクを４０℃の乾燥機中で乾燥し、ステインクの
基端より１０ｍｍのところの両面に易切断部であるスリ
ットを設ける。

抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体５Ｐ−３２２を５０ｍＭ
炭酸塩緩衝液＜　Ｔ）４（９，６）にて＋　　１μｇＡ
ｎｌに調整し、　ＰＰＮチー−ブ０（商品名、大日本製
薬製）に２００μ１分注してスティックを入れ、室温で
４時間又は４°Ｃ下で一晩放置して、スティックに抗体
をコーティングする。コーティングスティックを、　　
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１係牛血清アルブミン（シ
グマ製）、０．０２％アジ化ナトリラムを含む１０ｍＭ
　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，）５００μｔを分
注したＰＰＮチューブに入れ、室温で１時間又は４℃下
で一晩放置してその表面をブロッキングする。

前記緩衝液Ｉで洗浄し、該緩衝液■中４℃で保存した。

なお、このコーティングブロッキングされたスティック
は緩衝液中４℃で保存すると３ケ月以上安定であった。

測定 １）全血によるｔ−ＰＡ活性の測定 被検者（健常人）の対圧中皮静脈から。

３．１：３％クエン酸ナトリウムを含む真空採廂管で、
クエン酸ナトリウム１に対し血液が９となるように採血
し、採血後直ちに予め用意しおいた前記抗ｔ−ＰＡモノ
クローナル抗体をコーティングし、ブロッキングしたス
ティックをその採血管に投入し、室温で１０分間反応さ
せる。

スティックを取り出し、緩衝液■で洗浄しマイクロプレ
ートの中に差入れ、マイクロプレートの開口縁部を支点
として折曲げ、切断し、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体
被覆部を含むスティック片のみをマイクロプレート中に
入れる。

次いで、基質緩衝液として０．４５ｍＭＳ−２２５１（
カビ社製）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、　０．０１　
％ツイーン８０（牛丼化学薬品製Ｌ　　Ｏ，０４２μＭ
　ＩＪレジンプラスミノーゲン、１２０μｇ／ｍｌ　＋
ブロムシアン処理フィブリノーゲンを添加した２０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，）を、スティックを
入れたマイクロプレートのウェルに２００μＬ分注し、
３７℃で１７時間インキュベートした後、スティックを
取り出し、吸光光度計１タイターチツク０マルチスカン
３１０Ｃ型（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ’　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ
　Ｔｙｐｅ　３１０Ｃ）］　で、　４０５ｎｍにおける
吸光度によりｔ−ＰＡ活性を測定した。

（なお１反応停止液として５０係酢酸水溶液５０μ乙　
を使用することもできるが、この測定実験では用いてい
ない）。

２）全血希釈物によるｔ−ＰＡ活性の測定１）と同様に
採血後、直ちに予め用意してお（・た前記抗ｔ−ＰＡモ
ノクロナール抗体コーティング、ブロッキングしたステ
ィックと緩衝液Ｉ　１．５　ｍｌ　（抗凝固剤を含む）
とを収容した試験管に、血液０．５　ｍｌをただちに分
注し、　６０分間室温に放置する。

以下基質緩衝液との反応時間を４時間とした他は１）と
同様にして血中１−ＰＡ活性を測定した。。

なお、真空採血管に＋１．５ｍＺの緩衝液Ｉ。

抗凝固剤として０．０５　ｍｌ　、及び前記スティック
を予め収納しておいて、その採血管で０．４５　ｍｌの
血液を採血し、同様に操作して血中ｔ−Ｉ）　Ａ活性を
測定することもできた。この方法は。

採血後直ちに反応させることができると（・５点で、優
れているが、下言己データは前記試験管によって得られ
たものを表示した。

（標準化） 測定法１と同様に、このスティック法】）及び２）の方
法についても標準化した。

第５図は、］）即ちステインクを用いた全血法により得
られた片対数の検量線を、第６図は、２）即ちステイン
クを用いた全血希釈物法により得られた片対数の検量線
を、第７図は。

２）の方法により得られた１次関数の検量線をそれぞれ
示す。

これらの検量線によれば、１）及び２）の測定法のいず
れもＱ、ＯＯ８〜’ｌ　ＩＵ／ｍＬの検量線となりうろ
ことは明らかである。

（健常人の血中ｔ−ＰＡ活性の測定結果）前記スティッ
クを用いた全血法によって。

測定した結果を第８図に、希釈法によって測定した結果
を第９図に示す。

この測定結果によれば２通常採血で真の血中ｔ　−ＰＡ
活性が測定できていることは明らかであり、かつ９本発
明測定法殊にこのスティック法は従来法よりも遥かに優
れた方法であることを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体コーティングス
ティックの斜視図を、第２図はスティックを用いた測定
法の工程図を、第３図に実施例の測定法の原理図を、第
４図は成積体のｔ−ＰＡ活性を直接合成基質で測定する
方法の原理図を。 第５図及び第６図はスティックを用いた標準検体の全血
及び希釈物の片対数の検量線を、第７特許出願人　山之
内製薬株式会社 代理人　弁理士　野　野　清　也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織プラスミノーゲンアクチベーターの活性部位以
   外の部位に親和性を有する組織プラスミノーゲンアクチ
   ベーター抗体ＩｇＧフラグメントを結合させた固相と、
   全血又はその希釈物中の組織プラスミノーゲンアクチベ
   ーターとを反応させ、次いで該成積体の活性を測定する
   ことを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベーター
   活性の測定法 ２、成積体の活性を、該成積体と、組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーターに特異的な合成基質とを反応させ、該
   合成基質から遊離する物質の量を検出することによって
   測定するものである特許請求の範囲第１項記載の測定法 ３、成積体の活性を、該成積体と、組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーターに特異的な酵素基質とを、組織プラス
   ミノーゲンアクチベーター活性刺激剤の存在下又は非存
   在下に反応させ、これにより生成する酵素と、該酵素に
   特異的な合成基質とを反応させ、該合成基質から遊離す
   る物質の量を検出することによって、測定するものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の測定法 ４、少なくとも、組織プラスミノーゲンアクチベーター
   の活性部位以外の部位に親和性を有する組織プラスミノ
   ーゲンアクチベーター抗体ＩｇＧフラグメントを結 合した固相と、該フラグメントを結合した固相と全血又
   はその希釈物中の組織プラスミノーゲンアクチベーター
   との反応成積体の活性を測定するための測定試薬とを含
   有することを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベ
   ーター活性の測定用キット ５、反応成積体活性の測定試薬が、組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーターに特異的な合成基質のみである特許請
   求の範囲第４項記載の測定用キット ６、反応成積体活性の測定試薬として、少なくとも該成
   積体と組織プラスミノーゲンアクチベーターに特異的な
   基質との反応により生成する酵素に特異的な合成基質を
   含む特許請求の範囲第４項記載の測定用キット ７、プラスチック製スティックの一方の端部に、組織プ
   ラスミノーゲンアクチベーターの活性部位以外の部位に
   親和性を有する組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
   体ＩｇＧフラグメントの被覆層を固定してなる組織プラ
   スミノーゲンアクチベーター活性測定用スティック状測
   定具 ８、被覆層縁部又はその非被覆側近縁部に、少なくとも
   被覆層固定部分を含むスティック部分が、容器の開口縁
   部を支点にして折曲げることにより、容易に切断しうる
   ように、易切断部を設けてなる特許請求の範囲第７項記
   載の組織プラスミノーゲンアクチベーター活性測定用ス
   ティック状測定具 ９、抗凝固剤及び／又は希釈媒体を含んでいてもよい真
   空採血管に予じめ収納された形態の特許請求の範囲第７
   項又は第８項記載の組織プラスミノーゲン活性測定用ス
   ティック状測定具