JPH02492A - 新規なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組織型プラスミノーゲン　アクチペーター（以
下ｔ−ＰＡという）に対して特異性がある新規なモノク
ローナル抗体に関する。

更に詳しくは１本発明は抗原に対する特異的親和性に優
れ、ｔ−ＰＡの精製、ｔ−ＰＡ抗原量の測定に、より有
利に用いることができる他１本出願人の出願に係る発明
のｔ−ＰＡ活性の測定法にも供しうる新規なモノクロー
ナル抗体に関する。

（従来の技術） ｔ−ＰＡは線維未溶解機構に関与するセリンプロテアー
ゼの一種であり２組織の破壊、血管の収縮や拡張による
フィブリン形成に伴って。

血管内皮細胞より分泌放出され、フィブリンに吸着して
同じくフィブリンに親和性をもつプラスミノーゲ／を分
解してフィブリン溶解能を有するプラスミンに変換する
。ｔ−ＰＡは、市販のプラスミノーゲンアクチベーター
であるウロキナーゼやストレプトキナーゼと異なり、フ
ィブリンに対する親和性があり血栓部位に集中させるこ
とが可能であるから、これら市販品に代る線維未溶解剤
として注目されている。

また、血中ｔ−ＰＡレベルの測定は、ｔ−ＰＡその他の
線維未溶解剤のスクリーニング、　　１−ＰＡ投与によ
る臨床効果の確認などに必要であり、また血栓症その他
の疾患の診断や病状のモニターに有用であることも知ら
れている。

ｔ−ＰＡＫ特異性があるモノクローナル抗体は、より高
純度ｔ−ＰＡ取得のための簡便な精製法、あるいは血中
ｔ−ＰＡレベルの測定法の確立の必要性から、ポリクロ
ーナル抗体に代るものとして研究されてきており、これ
まで特開昭５９−５］２１号公報（７０６他〕、特開昭
６１−１４８２００号公報（ＦＴＰ　１１６３．　ＦＴ
Ｐ　２１７　）、　　特開昭６１−１８１９６４号、同
６１−１８３２９９号公報（Ｘ−２１，Ｘ−２３）に報
告され公知である。また市販品としては、ＥＳＲ−１〜
ＥＳＰ−７（バイオスコツト社製ｔ−ｐＡモノクローナ
ル抗体）等がある。

（問題点） しかしながら、これらのモノクローナル抗体は、抗原に
対する親和性に劣るため、精製度の向上、あるいは測定
法の精度及び感度の向上に対しては、未だ不十分であり
、その改善が望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、これらの問題点を克服するため、細胞融
合法によりｔ−ＰＡに対して特異性を有し、かつ抗原に
対する親和性に優れた新規なモノクローナル抗体の取得
に成功し、　　ｔ−ＰＡおよびその誘導体の精製および
ｔ−ＰＡの活性測定と抗原量測定への応用が可能となっ
た。

本発明の抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体はｔ−ＰＡに対
して特異性があり１分子景が１５３．０００±１０，０
００．　ＩｇＧサブクラスがＩｇＧ１．特定のし鎖可変
領域アミノ末端アミノ酸配列（後記）、抗原との結合部
位がフィブリン親和性部位あるいはその近傍である点で
特定され、特に前記アミノ酸配列を有する抗ｔ−ＰＡモ
ノクローナル抗体は従来全く知られておらず、新規なモ
ノクローナル抗体である。本発明の抗ｔ−ＰＡモノクロ
ーナル抗体としては、前記理化学的性質や構造を有する
ものであればいずれも包括されるが。

特に黒色腫細胞由来のｔ−ＰＡで感作して製した抗ｔ−
ＰＡモノクローナル抗体Ｓ　Ｐ　−３２２が挙げられる
。モノクローナル抗体Ｓ　Ｐ　−３２２ハマウスハイプ
リドーマＳ　Ｐ　−３２２を培地またはマウスの腹水中
で培養することにより生産される。マウスハイプリドー
マクローン５Ｐ−３２２はヒト黒色腫細胞由来のｔ−Ｐ
Ａで感作したＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの肺臓細胞とマウス
の骨髄腫細胞２例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８・Ｕｌ　（Ｐ３
Ｕｌ）とを常法２例えばケーラーとミルスタイン（Ｋ’
ｃｉｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）の細胞融
合法により融合して得ることができる（後記実施例参照
）。

上記ハイプリドーマを培養する培地としてはダルベツコ
比変法イーグル氏最少必須培地（Ｄａ−Ｉｂｅｃｅｏ’
ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｊｎｊｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔ
ｔａｌ　ｍｅｄｉｕｒｎ、以下ＤＭＥＭと略称する）に
ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、クルコース、ピルビン
酸ナトリウム。

２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（例えハヘニ
シリンＧ、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等）を
含有せしめた培地等が使われる。

この発明のハイプリドーマの培養は通常、培地中で３７
℃にて５％二酸化炭素、９５％空気の気相で２〜４日間
あるいは２，６，１０．１４−テトラメチルペンタデカ
ン（プリスタン、商品名、アルドリッチ社製）で前処置
されたＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内にてＩＯ〜２０日
間程度で行なわれ、精製可能な量の抗体が生産される。

このように製造されたモノクローナル抗体は培養上清あ
るいは腹水から蛋白質の単離精製の常法により分離精製
することができる。そのような方法としては例えば、遠
心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥ
−セルローズ、ハイトロキシルアパタイト、フロティン
Ａ−アガロース、セファデックス（商標、ファルマシア
ファインケミカルズ社製）等によるカラムクロマトグラ
フィー等が挙げられる。

（発明の効果） このようにして得られた抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体
Ｓ　Ｐ　−３２２はｔ−ＰＡに対し高い親和性を示し、
ｔ−ＰＡおよびその誘導体の精製に用いるイムノアブツ
ーバントあるいはｔ−ＰＡの抗原量測定あるいは活性測
定の試薬として有３２２を活性化されたアガロースゲル
、例えばシアン化臭素活性化セファロース４Ｂ（商標、
ファルマシアファインケミカルズ社Ｍ）あるいはアフィ
ゲル１０（商標、バイオラッドラボラトリーズ社製）と
常法により反応させ、５Ｐ−３２２結合アガロースを調
製する。これを用いてカラム方式またはパッチ方式でｔ
−ＰＡを常法により精製すればよい。

抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体Ｓ　Ｐ　−３２２はｔ−
ＰＡの酵素免疫定量法（Ｆ：ＩＡ）および放射能免疫定
量法（ＲＩＡ）における試薬として使用できる。酵素免
疫定量法では、マイクロタイタープレート等の固相忙ま
ずＳ　Ｐ　−３２２をコートシアウシ血清アルブミン等
でブロッキングした後、これに既知あるいは未知量のｔ
−ＰＡを推定される。

本発明の抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体をｔ−ＰＡおよ
びその誘導体の精製に用いるためにはマス、抗ｔ−ＰＡ
モノクローナル抗体ＳＰ−未標識あるいはピオチンを結
合させた抗ｔ−ＰＡ抗体を添加、酵素の発色性発光性基
質、もしくは酵素標識したアビデインとその基質を用い
て発色発光させる。被検体中の ｔ−ＰＡ濃度をｔ−ＰＡの標準品を用いて前もって作成
しておいた標準曲線と対比して１−ＰＡ定定量行う。

さらにＳ　Ｐ　−３２２抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体
はｔ−ＰＡの線溶活性を狙害しないため。

ｔ−ＰＡをＳ　Ｐ　−３２２でコートしたマイクロタイ
タープレートなどに吸着させ、その活性を直接法、すな
わちｔ−ＰＡに特異性のある色原性基質と作用させるか
、またはその活性を間接法、すなわちまずプラスミノー
ゲンをプラスミンに変換し。

生成したプラスミン九よりプラスミンに特異的な色原性
基質を分解２発色反応を生じせしめる。

被検体中のｔ−ＰＡ濃度をｔ−ＰＡ標準品を用いて前も
って作成しておいた標準曲線と対比してｔ−ＰＡ定量を
行う（本出願人による別途出願、特願昭６２−１７２３
００号参照）。

（実施例） 以下実施例を掲記し１本発明の詳細な説明する。

実施例　１ ハイプリドーマＳ　Ｐ−３２２０調裂 ａ）免疫した牌細胞の調製 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ系雌マウス（免疫開始時で８週令）
に精製されたヒト黒色腫細胞由来ｔ−ＰＡ（バイオスコ
ツト社製）を３０μｇ／匹または７．５μｇ／匹の投与
量で、同容量のフロイントの完全アジュバントと混合し
て乳濁化させた後、腹腔内投与した（第１回免疫）。以
後３〜４週間の間隔で２回、ｔ−ＰＡ３０μｇ／匹また
は７．５μｇ／匹を同容量のフロインド不完全アジュバ
ントと混合乳濁化させて腹腔内注射した。第３回免疫の
６週間後、ｔ−ＰＡを３０μｇ／匹もしくは７．５μｇ
／匹を含む生理食塩液０．４　ｍｌを腹腔内投与した（
最終免疫）。最終免疫の３日後に肺臓細胞を２匹のマウ
スから採取し、　　ＤＭＥＭ培地に懸濁させた。赤血球
は０．１７Ｍ塩化アンモニウムで０℃にて１０分間処理
することにより破壊し、遠心分離することにより除去し
た。

ｂ）ハイプリドーマＳ　Ｐ−３２２の調製上記で調製し
た牌細胞（５Ｘ１０’個）をマウス骨髄腫細胞ｐ３ｘ５
３Ａｇ８・Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１）（ＩＸ　１０’個、大日本
製薬社製）とケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕ
ｒｅ、第２５６巻第４９５頁（１９７５）参照］により
融合した。すなわち牌細胞とＰ３Ｕ１細胞をＤＭＥＭで
数回洗滌した後２両者を５０ｍ１容プラスチツク製試験
管に入れ、充分混合した。次いで遠心分離して培地を除
去し、これに３７℃に保温した５０％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール（シグマ社製、平均分子量３６４０）
を含むＤＭＥＭ　１　ｍｌを１分間を要して攪拌下体々
に加えた。次に３７℃に保温したＤＭＥＭ　１０ｍｔを
滴下して細胞融合反応を終了させた。

反応液を遠心分離し、上澄液を除去した後。

ＨＡＴ培地［ヒボキサンチン（Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ）、
アミノプテリン（４Ｘ　１０−’Ｍ）、チミジン（１，
６Ｘ　１０−’Ｍ）を添加した１０％ウシ胎仔血清を含
むＤＭＥＭ培地コを残渣に加え、牌細胞濃度が５Ｘ１０
’細胞数／ｍｌになるようにした。この懸濁液を２４穴
プラスチツク製プレートに１穴当り２　ｒｎｌ　（牌細
胞１×１０６個）ずつ分注した。４〜５日ごとに培地の
半量を吸引除去し、上記ＨＡＴ培地を加えた。

細胞融合の７〜１０日後すべての穴の中にハイプリドー
マの増殖が見られたので、下記免疫沈降法で培養上清中
の抗ｔ−ＰＡ活性を測定した。

Ｃ）免疫沈降法による培養上清中の抗ｔ−ＰＡ活性の測
定 放射性ヨウ素（＋２５１）で標識した（クロラミンＴ法
による）　ｔ−ＰＡ［１００μｌ、　　０．１％ウシ血
清アルブミン、０．３Ｍ塩化ナトリウム、　０．０５％
（ｗ／ｖ）ツイーン８０を含む２５ｍＭ　トＩＪス緩衝
液（ｐＨ７，４）中に溶解した。以下＋２５１−　ｔ−
ＰＡと略す］とハイプリドーマ培養上清２０μｌを混合
、プラスチックチューブ中で一夜室温にて放置した後、
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清１μｔを加え、さらに３時
間室温で放置した。これにパンソルビン（商標、カルバ
イオケム社製）懸濁液１０μｌを加え混合して３０分後
玉記トリス緩衝液を２　ｒｎｌ添加してすぐに遠心分離
した（　３０００　ｒｐｍ、　１５分間）。上澄液を除
去し。

洗清中の＋　２５１ｔ　ｐ　Ａの放射活性をアロヵ社製
オートウェルガンマカウンターＡＲＣ３００型にて測定
した。有意な＋２５Ｉ−ｔ−ＰＡ免疫沈降を示すハイプ
リドーマ増殖ウェルについては、　　ＤＭＥＭ培地中に
て増殖させ、クローニングを実施した。

ＢＡＬＢ／Ｃマウス胸線細胞（１０６細胞数／ウエル）
をフィーダー層として９６穴マイクロプレートを用いる
限界希釈法によるクローニングを２回行い、得られたハ
イプリドーマクローンを５Ｐ−３２２と命名した。また
ハイプリドーマ５Ｐ−３２２により産生される抗ｔ−Ｐ
Ａモノクローナル抗体も５Ｐ−３２２と命名した。

実施例　２ モノクローナル抗体の産生と精製 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ系雄マウス、生後６−８週令に２．
６゜１０、１４−テトラメチルペンタデカン（プリメタ
ン。

アルドリンチ社製）０．５ｍｌを腹腔内注射した後。

７−１４日後に１０７個のハイプリドーマ５Ｐ−３２２
を生理食塩液０．５＋ｎ４に懸濁して腹腔内に接腫した
。

１０−２０日経過後産生された腹水を屠殺開腹したマウ
スより採取した。１匹のマウスより５〜１０ｍ１のモノ
クローナル抗体含有腹水が得られた。この腹水は遠心分
離して不溶物除去後９等容量の飽和硫酸アンモニウム溶
液を加え、４°Ｃ下１時間〜−夜放置した。生じた沈澱
を遠心分離し、少量の０．９％の食塩を含む０．１ＭＩ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解、その後１００倍容の同
じ緩衝液に一晩透析した（ガンマグロブリン画分）。こ
の画分より、ＭＡＰＳ−ｎマウスモノクローナル抗体精
製キット（商標、バイオラッドラボラトリーズ社製）を
利用してＩｇＧを精製した。すなわち、ガンマグロブリ
ン画分に同容量のパインディングバッファーを加え、混
合した後、同じパインディングパンファーで充分平ｉ化
したアフィゲルプロティンＡ（バイオラッドラボラトリ
ーズ社製）もしくはプロティンＡセファロースＣＬ　４
　Ｂ　（ファルマシアファインケミカルズ社製）を充填
したカラム（ゲルペッドボリューム５もしくは１０ｍ１
）にかけ、パインディングバッファー１０カラム容量で
洗滌した。次いでキットに含まれる溶出バッファー約３
カラム容量でＩｇＧを溶出した。溶出したＩｇＧは硫酸
アンモニウムによる塩析にて濃縮し、０９％の食塩を含
む０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等で透析し、これ
を５Ｐ−３２２のＩｇＧ標品とした。通常腹水１　ｒｎ
ｔ当り１１１−１８ｆｆ１のｒｇｃが得られた。

実施例　３ モノクローナル抗体の物理化学的性質 以下の物性は項目ｂ）を除き、実施例２で精製したモノ
クローナル抗体５Ｐ−３２２のＩｇＧ画分を用いて測定
した。

ａ）分子量：　１５３，０００（±１０，０００）ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動をＬａｅｍｌｉ　［
Ｎａｔｕｒｅ＋　２２７＋　６８０　（１９７０）　］
の緩衝液系を用いて、９％あるいは１２％の平板ゲルに
て行い。

抗体の分子量を推定した。分子量マーカーはファルマシ
アファインケミカルズ社製の電気泳動分子ｉキャリブレ
ーションキット（低分子量キット。

フォスフォリラーゼｂ、　　９４０００；ウシ血清アル
フミン、６７０００；卵白アルブミン、４３０００；　
カルボニックアンヒドラーゼ、３００００；トリプシン
インヒビター　２０１００　；α−ラクトアルブミン、
　　１４４００）を用いた。

ｂ）　　ｒｇＧサブクラス：ＩｇＧＩ ハイプリドーマ培養上清を用いて、セロチック社製マウ
スモノクローナル抗体タイピング用キットにより５Ｐ−
３２２のＩｇＧサブクラスを決定した。本法は０ｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙの二重免疫拡散法によるもので、中央の
穴に７５μ乙の培養上清を。

外周部の穴に各種抗マウスイムノグロブリン抗体を１０
μＬ入れ、室温で一昼夜放置した後、抗原抗体反応によ
る沈降線の形成を観察した。

Ｃ）アミノ酸配列（アミン末端）： Ｌ鎖：　Ａｓｐ（Ｉｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｎ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−８ｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ｖａｔ−８ｅｒＩｇＧのＬ鎖およびＨ鎖アミノ末端の
配列解析はエドマン分解［Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ＋　Ｊ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、、　Ｉ、
　８０　（１９６７月に基づいて行った。ＩｇＧ画分は
還元下での５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動等によ
りＬ鎖とＨ鎖を分離し、ゲルよりエレクトロエリューシ
ョンにて各類を回収した。

次いで逆相高速液体クロマトグラフィーにより純化した
後、それぞれを気相シーケンサ−（アグライドバイオシ
ステムズ社製、モデル４７０Ａ）に導入し、自動的にカ
ップリング反応、ペグチド結合切断反応、ＰＴＨ（フェ
ニルヒダントイン）アミノ酸形成反応を行った。得られ
たＰＴＨアミノ酸はシーケンサ−と直結したアプライド
バイオシステムズ社製のモデル１２０ＡＰＴＨアナライ
ザーにより分離し、標準ＰＴＨ−アミノ酸の保持時間と
対比することにより各ＰＴＨ−アミノ酸を同定した。

その結果、Ｌ鎖については上記の配列を有するアミノ末
端から１４残基のアミノ酸が同定された。一方、Ｈ鎖て
ついては、アミン末端が何らかの形態でブロックされて
いる可能性があったためと考えられ、上記の手法では直
接アミン末端から配列を決定するには至らなかった。

ｄ）抗原との親和性 抗原との親和性は上述の＋２５■標識ｔ−ＰＡの５Ｐ−
３２２による免疫沈降反応において、非標識のｔ−ＰＡ
を各種濃度に加えて拮抗を起こさせ、阻害曲線（第１図
）を作成した。５０％阻害を与える非標識ｔ−ＰＡｇ度
より、凡その解離定数を推定したが、モノクローナル抗
体５Ｐ−３２２のそれは、バイオスコツト社製抗ｔ−Ｐ
Ａモノクローナル抗体ＥＳＰ−２と比較して約２０〜４
０倍高い親和性を持つものと推定された。なお、この親
和性は、抗原に対して最も親和性のあるポリクローナル
抗体＋３８７（アメリカンダイアグツステイカ社製）に
匹敵する。

またｔ−ＰＡの鎧型の差による本発明モノクローナル抗
体の親和性の差をアメリカンダイアグツステイカ社製の
１本鎖および２本領ヒト黒色腫細胞由来のｔ−ＰＡを用
いて検討した。上述の１２５ｒ−ｔ−ＰＡの免疫沈降反
応に１〜１００　ｎｇ／　ｔｕｂｅ　（７）１本鎖ある
いは２本領ｔ−ＰＡを加えた場合の阻害曲線でその親和
性の差を見たが、第２図に示すように５Ｐ−３２２は１
本鎖、２本鎖の両鎖型のｔ−ＰＡに対しほぼ同等の親和
性を持つものと推定された。

ｅ）モノクローナル抗体５Ｐ−３２２のｔ−ＰＡ線溶活
性に対する影響 ｔ−ＰＡのインビトロでの線溶活性に対する５Ｐ−３２
２の影響を１２’ｘ−標Ｒフィブリンフィルム溶解法で
検討した。１５■−フィブリンフィルム溶解法はＨｏｙ
ｒａｅｒｔｓらの方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
、　２５７　＋２９１２（１９８２）］に従った。すな
わち、１．８μＭフィブリノーゲンに１２５Ｉ−フィブ
リノーゲン（Ｃｏｍｍ１ｓｓａｒｉａｔ　Ａ　Ｌｅｎｅ
ｒｇｉｅ　Ａｔｏｍｉｑｕｅ社製）を適当量混合して９
６穴フイクロタイタープレート（Ｌｉｍｂｒｏ）に５０
μｇ／穴ずつ入れ、４０℃で一晩乾燥させた。

これに１．６ｕ／ｍｔのトロンビン（持出製薬製）を１
００μＬずつ入れ、３７°Ｃで４時間放置してフィブリ
ン化させた。このプレートを２回、０．２％タウン清ア
ルブミンと０．９％食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で
洗滌した後、活性測定に供した。

各式に５０μｔの２００　ｎＭのプラスミノーゲンを入
れ、さらに５０μｔのｔ−ＰＡ標準品もしくはｔ−ＰＡ
を含む未知試料を添加し、混合した後３７℃で２時間反
応させた。各式より５０μ乙を取りアロカ社製オートウ
ェルガンマカウンターにて溶解した１２５　Ｉ−フィブ
リンを測定し、標準ｔ−ＰＡで作成した標準曲線よりｔ
−ＰＡの線溶活性を定量した。

なお用いたｔ−ＰＡ標準品はインターナショナルｔ−Ｐ
Ａスタ／ダート［Ｇａｆｆｎｅｙ　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｊ
ｇ＋　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、、　５３＋１３４（１９８５）　
］で標準化したバイオスコツト社製のヒト黒色腫細胞由
来のｔ−ＰＡである。

予め一晩室温にて０．８〜８０　ａ　ｇｌｏｌのＳ　Ｐ
−３２２とインキュベートしたｔ−ＰＡ　（５ｕ／ｒａ
ｔ）の活性値を測定したところ、第３図に示すように若
干の（約１５％）の活性低下は認められたが、対照とし
て用いたｔ−ＰＡと結合しないモノクローナル抗体（抗
ヒト腫瘍壊死因子抗体）と大差なかった。これに対し、
ポリクローナル抗ｔ−ＰＡ抗体（ヤギ、アメリカンダイ
アグツステイカ社製）あるいはバイオスコツト社製モノ
クローナル抗体ＥＳ　Ｐ−２は、最低量でも大きく活性
の阻害を示した。

ｆ）抗原との結合部位 ｔ−ＰＡと５Ｐ−３２２を重量比１　：　１０００にて
室温で１０時間インキュベートした後、　　Ｖｅｒｈｅ
ｉｊｅｎらの方法［ＥＭＢＯ，Ｊ、、　５　、３５２５
　（１９８６）　］でｔ−ＰＡノフイプリンへの親和性
を検討した。ｔ−ＰＡ（最終濃度２μｇ／ｍｔ）とフィ
ブリノーゲン（最終濃度１〜１２５μｇ／ｍｔ）混合液
にトロンビン１ｕを加え、攪拌し、３分間室温にでフィ
ブリンを形成させたのち、チューブを遠心分離して（１
６０００ｒｐｍ、　８分間）、上清中のフィブリン非結
合のｔ−ＰＡ活性をフィブリン平板法で測定した。なお
フィブリン平板法では５Ｐ−３２２はｔ−ＰＡ活性を大
きく阻害しない。第４図に示したように５Ｐ−３２２で
前処置した場合はｔ−ＰＡのフィブリンへの結合が大き
く阻害され、　　５Ｐ−３２２はｔ−ＰＡのフィブリン
親和性部位あるいはその近傍に結合部位を有し、ｔ−Ｐ
Ａの活性部位とは結合しないものと考えられる。

ｇ）ウロキナーゼとの交叉反応性 卑２ ＳＰ−３２２とウロキナーゼ（ミドリ十字製）との交叉
反応性を上述の免疫沈降法および１２５■−フイプリン
フイルム溶解法で検討した。免疫沈降法では”５Ｉ−ｔ
−ＰＡの５Ｐ−３２２による免疫沈降に対するウロキナ
ーゼの阻害効果で交叉反応性を見たが、ウロキナーゼ１
５０ｕ／１ｕｂｅを添加した場合のみ４４％の阻害が見
られた（第５図）。

これをｔ−ＰＡによる阻害曲線（第１図）と比較した場
合、ウロキナーゼの交叉性はｔ−ＰＡの約０．１％程度
と判断された。また、５Ｐ−３２２は８０μｇ／ｍｌま
での濃度では１２５ニーフイブリンフイルム法でのウロ
キナーゼ活性（３ｕ／ｍ７）を全く阻害しなかった。

実施例　５ を０．３　ｍｇの　Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドビオ
チ９６穴平底マイクロプレートの各ウェルに０．０５　
Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，６）に１μｇ／ｒｎｌで溶
解したモノクローナル抗体５Ｐ−３２２を２００μｔず
つ添加した。

室温で４時間、または４°Ｃで一晩インキユベートした
後、溶液を捨て、１％ＢＳＡを含むｌ０ｍＭ　）　！Ｊ
ス緩衝食塩水（ＴＢＳ）＊を２００μを添加し、室温で
２時間静置し、各ウェルの未成着分をブロックした。

その後、００５％ツィー７２０（Ｔ究ｅｎ　２０商品名
）を含むＴＢＳ　（ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）　溶液で数分
間、数回洗浄を行った。

ｔ　−ＰＡ或いは検体を０．２５％ＢＳＡを含むＴＢＳ
／Ｔｗｅｅｎ（ＢＳＡ／ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ　）溶液で
稀釈し、　２００ｐｌずつ各ウェルに添加し、室温で２
時間、または４℃で一晩反応を行った。先と同様にＴＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、　　ＢＳＡ／ＴＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ溶液で１μｇに稀釈したビオチン化−ヤギ抗ヒ
トメラノーマｔ−ＰＡ抗体（５ｍｇのヤギ抗ヒトメラノ
ーマｔ−ＰＡ抗体（中央科学工業）加し、室温で２時間
反応を行った。反応後、　ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で洗
浄し、さらにＢＳＡ／ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液゛　　　
　　で稀釈したストレプトアビジン−ピオチン化西洋ワ
サビパーオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社裂）
を添加し室温で２時間反応させた。

Ｔ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、酵素基質と
して０．００６％過酸化水素、並びに０．１　ｒＴｌｇ
Ａｎｌの３．３：５．５′−テトラメチルベンジジンを
含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，８）を２００μＬずつ添加し、室温で１５分間インキ
ュベートを行った。インキュベート後。

３Ｍ硫酸を５０μｔずつ加え反応を停止し、　　４５０
μｍの吸光度を測定した。

＊トリス緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸、塩化ナトリウム
９ｇ／ｌ、　ｐＨ７，５） ｔ　−Ｐ　Ａ　Ｏ，３ｎｇ／ｍｔまで定量可能であった
。

ヒト血漿中のｔ−ＰＡ抗原量の定量 正常人について９通常採血、並びに１００ｍｍＨｇ。

５分間負荷後採血した血液、各５例についてＥＬＩＳＡ
法によりｔ−ＰＡの定量を行った。

検体はＢｅｒｇａｄｏｒｆらの方法［Ｔｈｒｏｍｂ、　
Ｈａｅｍｏｉｔａｓ、、　５Ｑ。

７４０−７４４　（１９８３）　］に準じ調製した。ク
エン酸加採血した面層を遠心分離して得た血漿５０μｔ
に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３，９）を５０μを加え、
３７℃で１５分間インンキュベートした。インキュベー
ト後、　　０，１Ｍリン酸水素二ナトリウム／　０．４
　Ｍ水酸化ナトリウム水溶液をｌＯＯμを加え、さらに
０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０を２０μを加え検体とした。

結果を表１に示す。この結果から、正常人血漿中のｔ−
ＰＡ濃度は１通常採血の場合は平均６．１　ｎｇ／ｍｌ
、負荷採血の場合は１０．４　ｎｇ　／ｍｌであった。

表１．正常人血漿中のｔ−ＰＡ濃度 通常採血　　　　　　負荷採血

【図面の簡単な説明】

第１図は”Ｉ−ｔ−ＰＡの各種抗体による免疫沈降反応
の各種濃度非標識ｔ−ＰＡによる阻害曲線。 第２図ハ”’Ｉ−ｔ−ｐＡノモノクｏ−ｔル抗体ＳＰ　
−−３２２による免疫沈降反応の１本鎖あるいは２重鎖
非標識ｔ−ＰＡによる阻害曲線、第３図は＋２５１−フ
ィブリンフィルム溶解法における各種抗体のｔ−ＰＡ活
性阻害効果を示した図、第４図はフィブリン非結合のｔ
−ＰＡ活性を示し、モノクローナル抗体５Ｐ−３２２に
よるｔ−ＰＡのフィブリン親和性への影響を示す図、第
５図はモノクローナル抗体ＳＰ　−３２２あるいは他の
抗ｔ−ＰＡ抗体による１２５■ ｔ−ＰＡの免疫沈降反応に対するウロキナ特許出願人　
山之内製薬株式会社 代理人　弁理士　藤　野　清　也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織型のプラスミノーゲンアクチベーターに対して
   特異性があり、下記性質を有することを特徴とするモノ
   クローナル抗体。 （ａ）分子量：１５３，０００±１０，０００ （ｂ）ＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ１ （ｃ）Ｌ鎖可変領域アミノ末端アミノ酸配列Ｌ鎖：【遺
   伝子配列があります】 （ｄ）抗原との結合部位：フィブリン親和性部位あるい
   はその近傍。 ２、組織型のプラスミノーゲンアクチベーターがヒト黒
   色腫細胞由来のものである特許請求の範囲第１項記載の
   モノクローナル抗体 ３、セルラインがマウスハイブリドーマクローンＳＰ−
   ３２２である特許請求の範囲第１項又は第２項記載のモ
   ノクローナル抗体。