JPH01112163A - レコグニン類および関連物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はレコグニン類（Ｒｅｃｏｇｎｉｎｓ）および関
連物質、特に悪性腫瘍または癌の診断および治療に有用
な、新規酸性ペプチドである、レコグニン類およびその
関連物質に関する。

レコグニン類は正常なまたは異常な細胞または組織（た
とえば腫瘍細胞、人為的癌細胞）を処理することによっ
て得られるものであり、これを支持体上に担持するかま
たは担持することなく体液と接触せしめることによりそ
のケモレシプロカル類（Ｃｈｅｍｏｒｅｃｉｐｒｏｃａ
ｌｓ）を得ることができる。これらのケモレシブロカル
類はイン・ビボまたはイン・ビトロにおいて（たとえば
定量沈降試験、ウフタロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
）寒天内抗原抗体ゲル拡散試験、免疫蛍光試験）、レコ
グニン類と免疫化学的特異性を持って反応する物質であ
る。

本発明によって提供されるレコグニン類は、正常または
疾患細胞または組織を中性緩衝液で抽出し、得られた可
溶化蛋白抽出物からｐｌ（値１〜４のフラクションを分
離し、このフラクションから採取される、以下の特性を
持った酸性ペプチドである： （ａ）定量沈降試験およびラフタロ二−寒天内抗原抗体
ゲル拡散試験において、特異的抗体に、Ｊ−り単一線状
沈澱を形成することが出来る。

（ｂ）酸性または中性ｐＨで水および水性溶液に可溶で
ある； （ｃ）アルカリ性ｐＨで水および水性溶液に難溶である
； （ｄ）分光吸収ピーク波長２８０Ｒμを有する；（ｅ）
分子ｆｆ１４，０００−１０，０００を有する。

０）グルタミン酸とアスパラギン酸の含徂が高く、ヒス
デシンに対するグルタミン酸とアスパラギン酸の比率が
高い； （ｇ）動物に注入したとき抗レコグニン抗体を産生し、
その抗体はレコグニン類に属する他の酸性ペプチドと特
異反応する： （ｈ）不活性担体と結合したとき特異的免疫吸着により
抗レコグニン抗体と結合し、これにより該抗体の定量と
精製を可能とし、かつイン・ヒドロとイン・ビポのいず
れにおいても該抗体がレコグニン類に属する酸性ペプチ
ドまたはこれを含む細胞と特異的に結合することを可能
にする。

レコグニン類には具体的に上記の特性を備えた種々の酸
性ペプチドが包含されるが、その代表的なものはアス）
・ロシチン（ＡｓＬｒｏｃｙｔｉｎ）とマリグニン（Ｍ
ａｌｉｇｎｉｎ）である。

アストロシチン・− アストロシチンは脳腫瘍組織、好ましくは脳神経膠原組
織から得られる。まず該組織からアストロンチン前駆体
を含む蛋白質成分を抽出するが、この場合の好ましい抽
出方法としては該組織を中性緩衝液とホモゲナイゼーン
ヨンまたは他の適宜の破壊操作条件下に処理してアスト
ロシチン前駆体を含む蛋白質フラクションを可溶化せし
める。

この時点では、アストロシチン前駆体はまだ蛋白質、糖
蛋白質、脂蛋白質、核酸、核蛋白質等の分子量の大きな
物質と結合している。この可溶化抽出液を清澄化して不
溶性粒子を除き、蒸発濃縮技術によって低分子量不純物
を除去する。残りの溶液を処理して他の不純物からアス
トロシヂン前駆体を分離し、ｐＫ値１〜４の蛋白質フラ
クションを得る。この場合の処理は、たとえば前記溶液
をクロマトグラフィーカラムに注ぎ、段階的に酸性を高
めた溶媒で溶出することによって行う。中性またはｐＫ
４までの酸性で溶出されるフラクションを捨て、ｐＫ１
〜４のフラクションを集め、この集めたフラクションを
処理して分子量約８．０００の物質を得る。この場合の
処理は、たとえば該フラクションを濾過して低分子量物
質すなわち分子量１，０００以下の物質を除去し、つい
で再度濾過を行って分子ｆｉ２５．０００以上の物質を
除去することによって行なわれる。分子ｆｉｔ、０００
〜２５，０００のフラクションをたとえば薄層ゲルクロ
マトグラフィーで処理してアストロシチンを得る。

このようにアストロシチンは脳神経膠原組織を中性緩衝
液で抽出し、ホモゲナイゼーションと高速遠心分離を繰
り返して実施し、得られた抽出物からｌ）Ｋ値約１〜４
のフラクションを分離し、この分離したフラクションか
ら約２３０，０００までの高分子量物質を集め、これか
ら分子量約ｇ、ｏｏｏの物質を単離することによって得
ることができる。

上記の方法によって得られたアストロシチンは定量沈降
試験やウフタロニーゲル拡散試験においてその特異的抗
体と単一線沈降物を形成し、水もしくは酸性または中性
ｐＨの水溶液に可溶であり、アルカリ性ｐＨで難溶であ
り、分光光度計による吸収ピーク波長が２８−μであり
、約ｇ、ｏｏｏの分子量を有していることを特徴として
いる。

アストロシチンはまたグルタミン酸とアスパラギン酸の
残基の割合が極めて高く、ヒスチジンに対するこれらの
酸の割合が非常に高いことも特徴的である。

マリグニンニー マリグニンは人為的な癌細胞、すなイつちイン・ビトロ
培養した癌細胞から得ることができ、約１０゜０００の
分子量を有し、アストロシチンに類似のしかしそれとは
異なったアミノ酸残基組成を有している。すなわちグル
タミン酸とアスパラギン酸の割合が高く、かつヒスチジ
ンに対するこれらの酸の割合が高い。

マリグニンは発酵培地中で生育させた人為的癌細胞を中
性緩衝液でホモゲナイゼーションと高速遠心分離を繰り
返しながら抽出し、この抽出物からｐＫ値１〜４のフラ
クションを分離し、このフラクションから約２３０，０
００以下の高分子量物質を採取し、これから分子量約１
０．０００の物質を単離することによって得ることがで
きる。人為的細胞培養で生産されるマリグニンの量およ
び人為的細胞培養で生産される全蛋白質の割合は人為的
癌細胞培養を大容量培養器中で実施することによって増
大する。

この方法で得られたマリグニンは定Ｍ的沈降試験および
ラフタロ二−ゲル拡散試験においてその特異的抗体と単
一線沈降物を形成し、水もしくは酸性または中性ｐＨの
水溶液に可溶であり、アルカリ性ｐｌ（で難溶であり、
分光光度計による吸収ピーク波長が２８ｈ＋μであり、
約１０．０００の分子量を有していることを特徴として
いる。

なお、レコグニン類はブロムアセチルセルロースと複合
してブロムアセチルセルロース−レコグニンを形成する
ことが可能であり、哺乳動物に注射した場合特異的抗体
である抗レコグニンを生産することができ、該抗レコグ
ニンは特異的にレコグニン前駆体に付着する。たとえば
一つの抗レコグニン、すなわち抗マリグニンはイン・ビ
トロにおいて脳腫瘍細胞に毒性を示す。

アストロヂンン、マリグニンおよびそれらに類似した物
質の如きレコグニン類は、生物学系に導入されてもよい
物質として有用であって、材料をレコグニンで被覆する
が如き異質な反応を減少することができる。生物学系に
ケモレシブロカル類が生じるようにレコグニンを導入す
るその他の例がある。レコグニンはまた、特別な生物学
系の成長を栄養的に促進するのに使用されてもよい。レ
コグニンの有用性はまた、生物学系における適応性を促
進するために担体を有するレコグニンの複合物から成る
ターゲット（Ｔ　ａｒｇｅＬ）剤が製造できることにあ
る。そして例えばそのレコグニン複合物はレコグニン自
体の物理的化学的特性を有している。担体は、レコグニ
ンと複合物を形成するとともに生物学的に実質的に不活
性である物質から選定されるべきである。

ポリペプチドまたは蛋白質と安定複合物を形成するいか
なる公知物質もレコグニンと複合するのにを用である。

その−例としてブロモアセチル−セルロースの如きセル
ロース材がある。生物学系に不活性であることに加えて
、その担体は、本明細書で述べる目的にを用なレコグニ
ンの特有の物理的化学的性質を変更しないものでなけれ
ばならない。レコグニンとその担体とから成る複合物は
、接触される生物学系のケモレシプロカル類を製造し、
分離し、確認するのに有用である。レコグニンー担体複
合物はまた、導入される生物学系のケモレシブロカル類
前駆体の製造を促進するのに有用である。

ケモレシプロカル類の−っの類は、抗レコグニン類すな
わち抗アストロチシンおよび抗マリグニンである。これ
らの物質は生物学系にレコグニンを注射して製すること
ができる。レコグニンの免疫学的に有効な服用量は、従
来の抗体製造技術に従って抗体反応を誘発するように体
内組織または体液と接触させて算出される。抗レコグニ
ンは、抗レコグニンを有する複合膨剤を生物学系に導入
して成る生物学系の特異細胞または位置に診断剤、栄養
剤および治療剤の如き物質を投与するのに使用すること
ができる。その抗レコグニンはまた、着色または放射性
標識が腫瘍細胞にのみ生じるように、染料および放射性
物質の如き標識物質を配合した抗レコグニンを生体組織
に適用することによって、生体組織に腫瘍細胞が存在す
るか否かを診断するのに有用である。更に抗レコグニン
を使用するのは、レコグニンの免疫的に有効な服用量明
細書の浄書（内容；こ変更なしＩ を哺乳動物その他の生物学系に注射することによって、
他の有用なケモレシプロカル類（例えばＴＡＧ１後述）
の哺乳動物から産出高を増加するためである。

従来、糖蛋白質複合物は、脳組織から製造され、抗体が
形成されていた。タイサハス（Ｔａｙ　−Ｓ　ａｃｈＳ
）の病的な脳から製せられたＩＯＢ糖蛋白質として知ら
れた分離物質は、ラビットに注射され抗体が製せられた
。これらのタイサハス抗体は、腫瘍を有する脳の免疫蛍
光性研究に使用されていた。

腫瘍神経膠ではなく反応的な普通の非腫瘍神経膠のみが
これらの抗体によって着色されていた。

これと対照的に、アストロシチンが腫瘍組織から製せら
れた時、アストロシチンに対する抗体（抗アストロシヂ
ン）が製せられ、脳の免疫蛍光性研究に使用され、普通
の（非腫瘍）神経膠ではなく腫瘍神経膠のみが抗アスト
ロシチンによって着色されていた。したがって、原因組
織、抗体の性質および着色された細胞特有のタイプによ
って、＝１４− 抗タイサハス抗体および抗アストロシチンは異なる物質
であるのは明らかである。

ケモレシプロカル類の他の類は、それらのケモレシブロ
カル類と複合したターゲット剤である。

例えば、ターゲット（ブロムアセチル−セルロースの如
き担体と複合したアストロシチン物質）は抗アストロシ
チンとの接触に使用される。このタイプの化合物は、複
合されて、生物学系の特異細胞または位置に診断剤、栄
養剤および治療剤を投与するために使用することができ
る。これらの化合物はまた精製処理のためにも使用でき
る。例えば、抗アストロシチンは、プロムアセチルセル
ローズーアストロシチンー抗アストロシチンを酸または
プロテイナーゼ酵素で加水分解して製することができる
。ターゲット剤はまた、ターゲットの免疫学的に有効な
服用量を体内組織または体液に接触させるなどによって
、生物学系のＴＡＧ物質（後述）の量を増加するのに役
立つ。

付加的なケモレシプロカル類はＴＡＧ剤（ターゲットに
付加するグロブリン）である。ＴＡＧ物質は、ＴＡＧを
複合および分解するための期間を変化するためにターゲ
ット剤を体液と接触させて得られる。

二つの有用な実施態様は５−ＴＡＧ及びＦ”−ＴＡＧで
ある。

Ｓ　−Ｔ　Ａ　Ｇ　（Ｓ　Ｌ　０Ｗ−Ｔ　ｒａｇｅｔ　
−Ａｔｔａｃｈｉｎｇ　−Ｇ　１ｏｂｕｌｉｎ）の製造
方法は、血清その他の体液をターゲット（即ち、ブロモ
アセチルセルローズ−マリグニン）と約２時間又はそれ
以上、低温例えば約４℃で反応させ、５−ＴＡＧを生成
物から開裂すること、例えば約３７℃の温度で約２時間
希酸で開裂することから成る。この方法に従って製造さ
れた製品５−ＴＡＧは水性緩衝液に可溶であり、寒天内
抗原抗体ゲル拡散試験においてその相当レコグニンとの
単系沈澱物を生成し、セロファン膜で透析不能であり、
２５，０００分子量以上の分子を保持するミリポアーフ
ィルターで保留され、マクログロブリン域が約５０，０
００及びその倍数の薄膜ゲル・クロマトグラフィーによ
って定められるような異った状態の凝固をする分子量を
有し、そして２８０ｍμの分光光度計吸収ピーク波長を
有することを特徴とする。

Ｆ　−Ｔ　Ａ　Ｇ　（Ｆａｓｔ−Ｔａｒｇｅｔ　−Ａｔ
ｔａｃｈｉｎｇ−Ｇ　１ｏｂｕｌｉｎ）を製造する方法
は、血清その他の体液をターゲット（即ち、ブロモアセ
チルセルローズ−マリグニン）と約１０分間低温例えば
４℃で反応させ、Ｆ−ＴＡＧを生成物から開裂すること
、例えば約３７℃の温度で約２時間希酸で開裂すること
から成る。この方法に従って製造された製品Ｆ−ＴＡＧ
は水性緩衝液に可溶であり、寒天内抗原抗体ゲル拡散試
験においてその相当レコグニンとの単系沈澱物を生成し
、セロファン膜で透析不能であり、２５，０００分子量
以上の分子を保持するミリポアー・フィルターで留保さ
れ、マクログロブリン域から約５０．０００及びその倍
数の薄層ゲルクロマトグラフィーによって定められるよ
うな異った状態の凝固をする分子量を有し、そして２８
０ｍμの分光光度計吸収ピーク波長を有することを特徴
とする。

ＴＡＧ製品は既知量の哺乳動物の血清その他の＝１７− 体液によって作られる５−ＴＡＧ及び１−ＴＡＧの濃度
を決定してこの濃度と、癌を示すものとして定められた
値とを相関させることによって、生きた哺乳動物の癌腫
瘍を探知するのに有用である。

ＴＡＧ製品はまた組織部位の腫瘍細胞の存在を診断する
のに有用であるが、これは染料とか放射性物質のような
標識物質と接合したＴＡＧを当該部位に適用することか
ら成り、それによって腫瘍細胞にのみ着色又は放射性標
識が生じるものである。

更にＴＡＧ製品は腫瘍細胞に対して細胞毒性があること
が判明した。ＴＡＧ製品はまた、診断、栄養、及び施療
用剤をＴＡＧ製品と錯状にしたものを導入することによ
って、これらの剤を特定の細胞又は部位に届かせるのに
有用である。

植物または動物における正常の細胞分割は細胞が特定の
空間を充分に占拠するに至った段階で制限されるかまた
は抑止される。（ａ）正常の細胞が自己の占めうる空間
を占拠するに至ったことを「認識する」機構および（ｂ
）この認識機構の作用が次いで細胞の分割を抑止する機
構は、これまで知られていなかった。正常の認識および
感知が生じたときその前駆体の濃度が増大し、粒子およ
び細胞の認識および感知に関係している一群の化合物で
あって、細胞を互いに連結したものが製造されるように
なった。これらの化合物をレコグニン類と称する。正常
の癌細胞からこれまで化合物を製造しようと試みたとこ
ろ、それらはそのようなものとしては存在せず、また癌
細胞が（ａ）その正常な空間を占めたことを認識する能
力および／または（ｂ）その正常な体積を占めた際に分
割を止めるという能力を失うと同時にその分子構造に変
化を生ずることがわかった。

レコグニン類は、細胞分裂を認識し、止めることができ
ないという点で癌細胞の形態的特性を模倣する物理化学
的特性を有する新規化合物である。

レコグニン類の使用は癌の作用機構を見極める以上に優
れたものである。何故ならばこれによって癌の診断およ
び治療ならびにその予防に役立つ直接製品ならびに方法
が提供されるからである。

本発明は癌研究の分野に優るものであり、またすべての
生長および新陳代謝に影響を与えようと望む一切の生物
学系に直ちに適用できるものである。かように、特定の
化合物または人為的に培養した適当な細胞型の化合物を
製造することにより、またこれらの物質から製品を更に
製造することにより、まず最初に生物系における組織、
細胞、細胞小器官、亜小器官分子あるいは分子集合体に
特定の影響を及ぼすことができよう。こうして、発育期
の重要時期における特定の栄養効力、特定の診断上の、
予防上の、および治療上の方法、および人工生物電気シ
ステムの構成（組織または器官移植における如く）がす
べて最初に影響を受けることができる。これらの人工生
物電気系は今やこれらに隣接する通常の組織または組成
の特定のしコグニン、マリグニンまたはそれらのケモレ
シプロカル類の特性を持つようにすることができるので
、「異物」として「認識」され、それゆえ拒絶を含む異
物に対する反応を避けるものである。

本発明のさらに他の態様は、二つの新製品の生物学的流
体からＴＡＲＧＥＴ−ＡＴＴＡＣＨＩＮＧ−ＧＬＯＢＵ
Ｌ　ｌＮ５（ＴＡＧ）を製造することである。これは二
つの反応すなわち第一は生物学的流体をマリグニン類を
模倣する物理化学的形態を含む合成錯体と反応させたも
のでターゲットと呼ばれ、第二は特定のＴＡＧを錯体か
ら開裂させたもので、その生体に腫瘍があるかどうか生
きた生体の生物学的流体からの定量的表示を得て、すな
わち腫瘍の診断試験からそのようにさ作られたＴＡＧの
測度によってそのように命名されたものである。ＴＡＧ
製品および抗マリグニンは物理化学的にマリグニンを補
うものであるため、これらはケモレシプロカル類と命名
される。

更に、血清と使用する特定のターゲット試薬との反応に
許される時間によって、また錯化された＝２０− 明細書の浄書（内容に変更なし） 製品の開裂に許される時間によって、二つの定量的及び
定性的に明かに区別されるＴＡＧ製品を製造することが
できることが発見された。

脳腫瘍のある、及び種々の他の医学的故障のある、なら
びになんら明らかな疾病の徴候のない多数の異った人々
から製造することができたこれらの製品の量を検査した
後、一定の個人について製造することができたこれらの
二つの新規製品の景は、その個人に脳腫瘍があったかど
うかを示すものであることが明らかとなった。それゆえ
脳腫瘍の新規血清診断試験法が発見されたのである。

これらの新規製品の血清その他の生物学的流液から脳そ
の他の腫瘍を診断する用途のほかの効用は、ＴＡＧ及び
レコグニン化合物は脳腫瘍の外科手術で取除かれた脳腫
瘍及びその周囲の組織の組織学的部位において優先的に
神経膠腫瘍細胞につくという証拠で説明される。この腫
瘍細胞のＴＡＧ及び抗レコグニン類による優先的標識は
標準免疫蛍光技術によって証明される。このように、新
規方法はまた、組織学的検査によって新規を確度をもっ
て、腫瘍細胞が除去した組織の極端部まで浸透している
かどうかを決定するのに用いることができ、腫瘍が脳そ
の他の器官にまだ残っている可能性又は腫瘍細胞が除去
した組織の周辺からなくなっている可能性を示し、腫瘍
のすべてが脳又は他の器官から取除かれた可能性を示す
ことができる。更に、記述したように製造したＴＡＧ及
び抗マリグニン類は試験管内で組織培養体に生成した膠
原脳腫瘍細胞に対して細胞毒性があることがわかった。

こ＼では組織培養体に生成させた、他の媒体での腫瘍細
胞に対するこの高親和性は、新製品ＴＡＧの特定結合潜
在力を更に証明するものであり、合成製品ターゲットに
関して及び組織学的部位における腫瘍細胞に関してＴＡ
Ｇの性質が表わすようにＴＡＲＧＥＴ−ＡＴＴＡＣＨＴ
ＮＧ−ＧＬＯＢＵＬ　ｌＮ５（ＴＡＧ）の名称の採用を
説明するものである。更に、腫瘍細胞に対するＴＡＧ及
び抗レコグニン類の細胞毒性は腫瘍にか＼った疑いのあ
る患者の血清の更に新しい診断試験法を提供する。この
ように、例えば、これらの患者の血清又は他の体液をタ
ーゲットと反応させてＴＡＧを製造し、製品ＴＡＧは組
織培養体中で腫瘍細胞の生長を細胞毒性検査する。一定
の個人の血清から製造することができるＴＡＧによって
表イっされるＴＡＧの濃度及び細胞毒性度は単に診断」
二の利点があるばかりでなく、特定の患者についての手
術前及び手術後の疾病の経過を探索する上にも価値のあ
るものである。放射性及び染色探知物をＴＡＧと結合す
れば、腫瘍の診断及びその正確な部位の判定をする場合
生体に有用である新規なＴＡＧ製品を作ることができる
。かようにして、動脈内又は静脈内のいずれかに適当に
標識したＴＡＧを脳を髄液内に、又は直接脳組織又はそ
の窩に注射すれば、放射性手段により、又は結合した染
料の視覚化により、脳腫瘍の存在に説明することができ
る。というのはＴＡＧが特別に付着するのは腫瘍細胞に
のみであるからである。更に、この方法は脳腫瘍の部位
を正確に視覚化することができる。

これは脳腫瘍を標識するため兎の血液で作った抗アスト
ロシチンを用いるこの生体内診断方法の改良と見なすこ
とができる。なぜならば人間の血清から作ったＴＡＧを
用いれば異蛋白反応の可能性を避けられるからである。

ＴＡＧ及び抗レコグニン類は試験管内及び生体内の双方
での腫瘍細胞を含むアストロンチン前駆体に優先的に付
加することができる化学的特殊性を持つので、例えば放
射性の、プロトン捕獲剤又は他の毒性のある物理的又は
化学的剤と組合わせて、これらの毒性のある物質が腫瘍
細胞に隣接する正常細胞と比較して腫瘍細胞に付加する
特殊性によって優先的に局在化することができるように
、診断学的にと同じく治療的にもこれらの製品を用いる
ことができる。この選択性は、腫瘍の効果的な化学的又
は物理的治療を達成するための決定的な、少くとも一つ
の決定的な要素として、またこれまで達成されなかった
要素として、普遍的に認められる。かように、ＴＡＧは
優先的に腫瘍細胞に付加する点で効果のあることを証明
したものであり、これらの理由で新規な治療製品として
の有望性を持つへきものである。

悪性の腫瘍を持った患者の血清においては、下記の実施
例に見られるように、ＦＡＳＴ−ＴＡＧ（Ｆ−ＴＡＧ）
と区別される一つの型のＴＡＧ、即ち５ＬＯＷ−ＴＡＧ
（Ｓ−ＴＡＧ）が、かような腫瘍のない患者におけるよ
りも、一定竜の血清から比較的多量に製造することがで
きる。このことは、ＴＡＧの自然に発生ずる前駆体（Ｐ
−ＴＡＧ）のいずれか一つの濃度が増大するか又はＦ−
Ｔ　Ａ、　Ｇよりも５−ＴＡＧが比較的試験管内で良く
出来るような他の要因があることを示唆するものである
。

実際の合成製品ターゲット及びＴＡＧのその前駆体に対
する、そして、云いかえれば、生体内に存在することが
あり得るこれらに対する仮定されたが証明されてない細
胞「抗原」及び循環する「抗体」の作用に対する、可能
な作用関係は、まだ解明されていない。このように例え
ば、抗体状の様式で、Ｆ−ＴＡＧ及び５−ＴＡＧは寒天
内抗原抗体ゲル拡散においてアストロシヂンと単一で別
々の系統の反応を生成する。それで、兎にターゲットを
注射すれば、ターゲットと反応した後、２６一 兎の血清から作るＴＡＧ製品の収率を増やせることにな
る。循環する抗体に似た前駆体が分裂しない細胞に隠さ
れている細胞抗原に対して正常な水準があり得るという
発見は、一対のもの＼可能な作用についての問題を提起
する。こ＼で、細胞の増殖及び細胞の死滅の制御に作用
するＴＡＧ前駆体（Ｐ−ＴＡＧ）及びターゲット状物質
が生成内に存在することを提起する。かように、例えば
、通常は直接は血清蛋白に曝されることのない細胞構成
物の露出が細胞分裂中に起ることがある。この細胞構成
物の露出の結果、構成物はターゲット状物質に変換され
るようになり、これに血清からＰ−ＴＡＧ状分子の付加
が生し、これが細胞分裂を刺激するか又は抑止すること
が考えられる。あるいは、障害を受けた又は作用不良の
不分裂細胞はＰ−ＴＡＧ状分子の付加が回復可能である
ようなターゲット状物質を露出させることがある。しか
し、ある細胞状態の下ではＰ（ＡＧ状分子の付加は細胞
の破壊を招くことがある（例えばこ＼に記載した合成で
製造したＡＮＴ　Ｉ　Ｇ　Ｌ　ｒ　ＯＭＡ−ＴＡＧは組
織培養体中で生長する膠原瘍細胞に著しく細胞毒性があ
る）。かように、これは、細胞分裂の制御について、ま
た生体の生涯を通じて体内の個々の細胞の修復又は除去
についての正常な機構の模範を示すものといえよう。脳
内膠原の場合のように急速に分裂する癌細胞に生じるよ
うに、細胞構成物の露出が異常に増大して異常に大量の
細胞ターゲット状物質が形成される場合は、一つの型の
血清Ｐ−ＴＡＧの濃度が他のものに比べて増大すること
が起ることがある。

前駆体の実際の作用がどのようなものであろうと、こ＼
な記述した方法によって悪性の腫瘍のある患者の血清か
ら試験管内で製造することができるＴＡＧの主要な一つ
の型、５ＬＯＷ−ＴＡＧ（Ｓ−ＴＡＧ）の相当量の増加
は、下記の実施例に記載した血清診断試験の基礎となる
ものである。

なお、以下の実施例にレコグニン類の具体例としてアス
トロシヂン、マリグニンおよびリーラ−レコグニンを示
すが、これらはいずれも前記（ａ）〜（ｈ）の特性を有
する酸性ペプチドである。

実施例Ｉ 粗アストロシヂン前駆体含有分画の生成ニー人間の脳膠
原腫脹組織を切り取り１表面の血管と普通の脳組織とを
可能な限り分離させる。分離した腫脹組織の代表的な量
１１７をとり、これを１５２の部分６個および１０ｆ！
の部分２個に分ける。ついで各部分を次のように処理す
る。

各部分を中性緩衝溶液中、超音波または他の機械的手段
により均質化する。たとえば、各部分をワーニング混合
機中、０．００５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）の１００ＣＣ
／り組織に均質化す・る。蛋白の変性を防ぐために、上
記均質化処理は冷条件下に行うべきである。たとえば、
該混合機を０〜５℃の冷室であａかじめ冷やし、約３分
間で操作すべきである。　　　′ ついで、均等質を清澄にするために、たとえば冷凍した
超遠心分離で５ｏｏｏｏ倍重力を３０分間作用させて遠
心分離させる。可溶性上澄液を傾斜分離し、冷下に保つ
。不溶性残渣は、さらに中性緩衝液１００−を用いて再
び均質化し、上記と同様に遠心分離処理し、得られる２
番目の可溶性・抽出物と上記１番目のそれと合する。上
澄液中、蛋白が５０マイクロ°グラム／−溶液以下とな
るまで均質化と遠心分離をくりかえすとき、収率は非常
に良好である。このことは、はとんどの組織の場合、５
回の抽出で達成される。

このようにして得た溶液を合し、つづく透析で十分に蒸
発させることにより濃縮する。冷下、０゜００６Ｍ燐酸
Ｍ街液の透析により１５−の溶液を得る。この溶液の量
を記録し、一部を全蛋白の分析に用い、残余を分けてＰ
Ｋ１〜４の蛋白質分画を得る。以下に述べるクロマトグ
ラフィは好ましい分別法である。

溶液を、冷室（４℃）中、０．００５Ｍ燐酸ナトリウム
Ｉ！Ｈ！ｕ液で平衡させたＤＥ、ＡＰ、セルロース（Ｃ
ｅｌｌｅｘ−Ｄ）カラム２．５×ＩＬＯａｌ上で分別す
る。溶出溶媒は以下の溶媒（溶液）を用いることにより
段階的＋ＣＺえる：溶液１１）Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ，ｉ
　４−０４２およびＮａ２ＨＰＯ４６，５０Ｆを蒸溜水
１５０００−に溶解する（０；００５モル、ＰＨ７）：
溶液（２）Ｎλ）Ｉ　２Ｐ　０４　Ｂ−５７７を蒸溜水
２４８０−に溶解する；溶液１３］　ＮａＨ２ＰＯ４１
７，Ｉ　Ｐを蒸溜水２４８０−に溶解する。（０，ｏ　
ｓそル、ｐＨ４，７）：溶液（４）ＮａＨ２ＰＯ４５９
，６５９を蒸溜水２４７ｏ−に溶解する（　０．１７５
モル）；溶液（５）ＮａＨ２ＰＯ４１０Ｌ６５Ｅを蒸溜
水２４５５ｍｊに溶解する（０．３モル、ｐＨ４，３）
；溶液（６）ＮａＨＰＯ４３４０，１グを蒸溜水２４６
５ｍｊに溶解する（１０モ゛ル、ＰＨ４，１）：、溶液
（ｙｌｓｏ％燐酸（Ｈ３ＰＯ４）ｚｓａｓ４Ｆを蒸溜水
２４６０−に加える（１０モル、ＰＨ：ＬＯ）神経組織
抽出物６〜１０−を加える。これをカラムに通す。つい
で溶液（１）を上に加え、溶液（１）３００−を受ける
貯留器を取付けて重力でカラムに落下させる。自動的な
分画収集装置を用いて溶出液３−を集める。ついで１次
の溶出背番号で、゛溶出溶液を変えて用いる。、溶液（
２）：管８８で、カラム上溶液をレジンの頂部に運び、
ついで溶液（２）５０ｔｎｌを上から加え貯溜器を取付
ける：管９８で、カラム」二の溶液をレノンの「ｊ部に
移動させ、ついて、溶液（３）７５−を上から加え、貯
留器を取付ける；溶液（４）：管１１４で、溶液をカラ
ム上、レジンの頂部に運び、つｌ、Ｎで溶液（４）　ｌ
　ｓ　ｏ　ｗｔを上か′　　ら加え、貯留器を取付ける
；溶液（５）：管１５５で、溶液を、カラム上、レジン
の頂部にもっていき、ついで溶液（５）１２５ｘＩ２を
上から加え、貯留器を取付ける；溶液（６）：管１８７
で、溶液をカラム上、レジンの頂部にもっていき、つい
で溶液（７）　１７　ｓ−を上から加え、貯留器を取付
ける；管２６０に到るまで溶出を続けて溶出を完了する
。組織抽出物の各容ごとに新姓に製したレジンを使用す
る。各管を蛋白の定量益析に付す。管２１２〜，２３ｏ
内の溶出液を合す。これは粗生成物を含み、これよりア
ストロシチンが得られる。

この過去においてフラクションＩＯＢと呼ばれる粗生成
物についてのデータは公にされているが〔プロティン・
メタボリズム・オブ・ザ・ナーバスーシステＡｐｐ５５
５　＝　６９　（Ｐｌｅｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　。

１９７０年〕；年子；ナル・オブ・ノイロサージ−？’
Ｊ　−、Ｖｏｌ、３３、ＰＰ２８１　＃２８６（１９７
０年９月）参照）〕、ここでアストロシチンと呼ばれる
特定の、生成物を分画１０Ｂから分離することを達成し
た。粗分側１０Ｂは、はじめの新鮮な神経系組織１１に
つき０．１〜１０１９の生成物として製せられる。これ
はアストロシチン前駆体の他に、多数のへキソシス、す
なわちグルコース、ガラクトース、マンノース；グルコ
ースアミン、ガラクトースアミンおよびマンノースアミ
ンなどを含ムヘキソースアミン類；および時として、他
の糖類、フコース、リボースおよび多分ランノースなど
を包含する共有誌９合炭化水素残基を種々の量含んでい
る。また、高分子重量の蛋白生成物、いくつかの脂質お
°よび核酸を含んでいる。

実施例２ 粗アストロシチン薊−駆体含有分画からの精製アストロ
シチンの生成ニー。

アストロシチン前駆体含有分画をさらに汚染物・か、ら
単離する。好ましい具体例として、実施例１で得た物質
を代表的なカラム（４０ａＩＣ船Ｘ　２．５ｃｘ（直径
）、ｘｐａ−容）を用いてセファデックスＧ−５０レジ
ン上クロマトグラフイに付す。使用圧力は４０　ｏ’Ｈ
ｇ　：流量は３５ｍｇ／Ｈｒ；緩衝液は０．０５モル燐
酸緩衝溶液（ｐＨ７，２）を使用。最初の７　ｏ　−−
ス’／Ｌ／　−（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）のピーク
はアストロシチン前駆体と共に不純物を含むが、つづく
ピークは不純物のみを含む。

好ましい具体例では、上記最初のフロー・スルー嘩ヒー
クにおける生成物をついで、セファデックスｃ−１５上
で濃縮し、ついで実施例１と゛同じ溶＃ｉ、（１）〜（
７）を用い、実施例１と同じ溶出段階を用いてセレン・
クスーＤのカラムに通す。アストロシチン生成物は、上
記と同じ管（番号２１２〜２３０）内に、鮮鋭なピーク
として存在し、セレックスーＤクロマトグラフィー上、
多台の汚染物質の存在なしに、挙動する。

つ・いでイ氏分子量汚染物をミリボアー・ディスク濾過
などの常套手段により除去する。好ましい方法として、
アストロシチン生成物をミリポアー・ベリコン・ディス
クｈｈ’ｌ　ＯＯＯｌｌ　３ｍ（このものは、１Ｏ００
より大きい分子量を有する物質をとらえ、１０００より
小さい分子量を有する物質を透過させる。）に通して濾
過することにより、塩および他の分子量の小さい汚染物
質を分離する。アストロシチン生成物はペリコン・ディ
スク上に残留し、実施例１の溶液（１）で洗浄すること
により回収される。

ついで、分子量約８０００の化合物を上記溶液か゛う単
離することによってアストロシチンを得るクロマトグラ
フを用いるのが好ましい。装置として、ボツフリンゲン
・マンハイムＧｍｂＨ；ファーマシア・ファイン・ケミ
カルズ・アンド・ＣＡＭＡＱ（スイス国）によって設計
された市販のものが使用される。セファデックスＧ−２
００のレジン（極上品質のもの）２．５５’をＱ、０２
ＭＮａ２ＨＰＯ４ＫＨ２ＰＯ４中０．５ｍＮａＣｊの燐
酸塩緩衝液ｐＨ６，８（６，６〜７．０）８５−内！こ
備える。室温で時々ゆるやかに混合しつつ２〜３日間膨
潤（Ｓｗｅｌｌ）させる。（磁性およびその他の攪拌手
段を用いるべきでない。）。膨潤したゲルを冷凍温度で
３週間安定させる。しかし、細菌詔よび菌の増殖は膨潤
ゲルを阻害する。もし、ゲルをより長時間保持するには
、少量の制菌剤（ナトリウムアジド０．０２１を加える
べきである。２．５２の乾燥ゲルを用いて、２０×２０
ａｌ＋、厚さ０．５篇のガラス・プレート２個を作る。

このプレートは室温で１０分間乾燥し、湿潤なチャンバ
ー内で約２週間貯蔵することもできるし、また適当にあ
らかじめ平衡状態にしだ後直ちに使用することもできる
。（通常、夜間ｆこ、最底１２時間要す。）。平衡の主
要な機能は、静置居住５可動層間の割合を正常化するこ
とである。水平位置で予備平衡状態にしたプレートを用
い、測定される物質を、マイク、ロピペットでスタート
ラインにおける斑点または条痕として適用する°。０．
２〜２％の蛋白溶液１０〜２０−を顕微鏡・カバ一番ス
ラ′イド（１８Ｘ１８罵）の端；こ設置し１．・ゲル表
面に対峙させる。数秒後、溶液はゲルに浸潤する。全サ
ンプルをまずカバースライド上に置き、ついですばやく
適合させる。もし使用する物質が十分でないと１分離後
に個々の斑点を位置せしめることが困難である。もし、
余り多くの物質を適用すると、明確に分離することがで
きない。操作を容易にするために緩衝液でサンプルを希
釈し、２２°の角度でてレートを傾斜させる技術で、サ
ンプルの分離を行う。流量は１〜２α／時間が非常に適
している。標識物質（シトクロムＣ。

ヘモグロビン、ミオグロビンまたはブロモフェノールブ
ルーで分類・識別されるアルブミン）はプレートを横切
って異なる位置に適用され、また未知のものの相対的距
離（移動性）の計算のための照合蛋白とルでの機能する
。サンプルを適用した後、プレートを装置内に回置し、
ベーパーの芯をカーろく下方におしてゲル層と十分に接
触させる。

ベーパーの芯は浸漬させてはなｄない。過剰の水分はぬ
ぐい去る。貯留器内の液溶媒は容器上端からＩＣＩ＋に
一定に保つ。操作は、分離の進行に依存して通常４〜７
時間で完結する。直接、有色物質の分離を行う。分離し
た蛋白の斑点は、クロマトグラフィの分離を完結した後
に、ＴＬＧプレートのベーパーシート・レプリカに移す
ことにより、およびあらかじめ洗浄したメタノール十Ｈ
２０＋酢酸−９０：５：５上、４８時間着色することに
より、容易に見えるようになる。ベーパー−シートは３
！Ｉｌ＋１％Ｆ紙である。、２０　Ｘ　２８ｃ１１のペ
ーパー１枚をゲル層の上に置き、ゲルと適当・十分な接
触を確実にするためにおしつける（ロールする）６ペー
パー（レプリカ）の下に空気が捕われないように、かつ
、ゲル層を乱さないように注意する。

ゲル層から液層をペーパーで浸透し、約１分後に除去し
、直ちにオーブン中、６０℃で１５分間乾燥し、通常の
染色法で染色する。染色は、ｌＯ％炭酸ナトリウム中０
．０３％ジアゾ化スルファニル酸（パウリ−試薬）を用
いてレプリカ−ペーパーにスプレィすることによって達
成される。また、メタノール、−酢酸（９，０：ＩＯＶ
／Ｖ使用）中、ア′ミド・ブラ′ツクの飽和溶液を用い
て染色を達成すること私できる；染色時間は５〜１０分
である。

脱色するには１容量の水と混合した２容量のメタノール
と酢酸（９０：１０．）を用いて洗浄する。

多倍の洗浄をせずにバックグランドを低く染色するのは
困難である。もし、アストロシチンが染色される場合の
み、プレート自体を約６０″′ｃｃ空気循環手段を有す
るオーブン中で）乾燥してもよい゛。単離のために、プ
レートを、室温で風乾する。

過熱するとクラックが生ずるが、これは通常、セファデ
ックスＧ−２００プレートを１５〜３０分で乾燥する温
度、５０〜６０℃を用いて回避することができる。乾燥
プレートはメタノール＋Ｈ２０＋酢酸（７５：２０：５
）（７）ｉ合物中、１０分間膨潤させ、同じ溶媒系中飽
和アミツブ°ラック中′。

５時間染色し、ついで乾燥する前に、同じ溶媒中、２時
間浸漬することによって洗浄する。分子量・を決定する
ために、直接プリント（ンテリカ）上またはデ。ンシト
グラム上、スターティングラインか゛ら各帯の中央まで
の距離を０．０５胴の精度で測定する。測定結果を供試
蛋白の移動距離（ｄｐ）に対するしト“クロムＣまたは
ミオグロビン（対照蛋占として使用される）゛の移動距
離（ｄ−）の比として定義される幅値で表わされる：供
試物質に対する標準物−の移動距離の関係は式：（−一
＝Ｐ、）で表わされる。Ｒｆｎに対して、使用された標
準物質の分子量の対数をプロットすることによって直線
の目盛定め線が得られる。この直線から未知の蛋白の分
子量が得られる。非常に正確な結果を得るには、プレー
トに適用する前に、等しいパーツの蛋白サンプル　溶液
を標準物質・、この場合はシトクロムＣと混合すればよ
い。上記ＴＬＧ法により０、アストロシチン生成物は、
標準シトクロムＣと対照して約０．．８３　＋／−０，
０２の距離に個別の斑点として観察され、アストロシチ
ンに対し、分子量約８０００が得られる。この方法によ
り、分子量の若干の相違に基づいて、いくつかの個別の
生成物がアストロシチンから分離される。このようにし
て、この点に汚染物質として運ばれる分子量約６４００
０．１４８０００および２３００００を有する３つの生
成物およびしばしば分子ｆｉ３２０００生成物が見出さ
れ、上記ＴＬＧ法で除去される。アストロシチン生成物
は、乾燥形能で、ゲルに吸われ、溶液（１）に溶解し、
遠心分離または他の類似の手段で、レジンを分離する。

この段階で製したアストロシチン生成物は蒸留水に可溶
であり、中性、酸性ｐＨで可溶、アルカリｐＨで不溶で
あり、分光光度計吸収ピーク波長２“８Ｑｍμを有する
。これは、上記の如く約８０００の分子量を有するポリ
ペプチドである。その共有結合したアミノ酸は、６ＮＨ
Ｃｊでの加水分解ついで自動的な定量測定により次の如
きアミノ酸の平均組成を有することが示される。

残基数（約） ・アスパンキ”ン酸　　　　　　　　　９スレオニ、ン
　　　　　　　　　　　５セリン　　　　　　　　　　
６ グルタミン酸　　　　　　　　　１３ プロｌ）ン　　　　・　　　　　　４ グリシン　　　　　　　、６− ゛ｌ／２システィン　　　　　・　　　２゜メチオニン
　　゛　　　　　　　ｌ・ ゛イソロ、イシン　　　　　　　　　２、＊イシン　　
　　　　　　　″　８ チロシン　　　　　　　　　　　２ フエニルアラニン　　　　　　　３ リシン　　　　　　　　　　　　８ ヒスチジン　　　　　　　　　　２ アルギニン　　　　　　　　　　４ 計　　　　　　　　　　　　　　８８ イ システン酸、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、アン
モニア、インデスモシン、デスモシン。

ビトロキシリジン、リシノ°／ルロイシンおよびガ。

ンマーアミノ、　　酪酸はいづれも検出しうる量は゛存
在せず、グルコ　　プミンが°微量存在する、。

実施例１における出発脳腫、癌組織１１グから、実施例
２人 リーラ−（ＲＥＥし電ｐ、）−レコグニンの４成＝−。

リーラ病は遺伝による専気で２おり、動物は安定な調整
のとれた運動筋肉の活動を行うことができず、特定の展
開時間においである神経細胞が脳の特定の位置、小脳へ
移動することができず、リーリング状態を呈する。電子
顕微鏡での研究によれば、特定の神経膠細胞が垂直の棒
状軸を与え、これに沿って新しい細胞が、正常な状態に
かいて新しい位置に移動する、ことが示された。リーラ
−病で、新しい神経細胞がこれらの神経膠繊維を登るこ
とができないことは神経細胞もしくは神経膠またはその
両方に詔けるいくつかの障害に゛よると考えら、れる。

　　　　・ 、　実施例１および２の方法に従い、マウスのり一う−
脳からのレコグニンｉ得、正常なマウスの脳０ＯＨ５・
０００゛である。１リーラ−？リコグニンは、その非常
に小さい分子量によって示される１う“に異常である；
さらに、リーラ−マウスの脳の対比讐るす、き災いに少
い。これを１工に示す。

、・　　゛・表工 マウ各Ｑ脳におけるレコグニン濃度（ｖ９／り）　・正
　常　　　リーラ− 皮層（生後４日のマウス）　　　０．２９　　０．５３
脳幹（生後１６日のマウス）　　ｏ、９ｏ、　　１．６
４脳全体（生後１７Ｅｌ（７）？ウス）１．２７　　１
５３脳全体°（生後１日のマウス）、ｓ、ｏｏ　　°５
．８６表工にハ１リーラ−マウスの小脳にレコグニン濃
度の著じるしい減少があり、脳の他の部に同量またはよ
り多くのレコグニ゛ンが有ることが示されている。レコ
グニンは脳の他の部分から小脳へ移動しないかまたは、
リーラ′−マウスの脳の他の個所で若干増加しているこ
とはある補償行為を反映している。

リーラ−ｆウスの脳に右ける病理学的レコグニンは、細
胞内において、認知に詔けるレコグニレ。

の役割を確かなものとし、かつ認識する適当な位置に位
置することを達成するための、移動するｎ工細胞がしな
ければならない接触ができないことと関連してい条。

同量にして、マウスのリーラ−の脳から裂せられるレコ
グニンに対する抗レコグニンが製せられ、ξこにのべた
ように、抗アストク′シチンおよび抗　マリグニンの使
用法と同様にしてマウスに使用されてよい。

実施例３　　。

人工ガン細胞培地発酵におけるマリグニン前駆体の生成
ニー 一般、に、滅菌処理は注意深く３行なわれる。

、すべての溶液（たとえば、“バンクの平衡塩ＣＢＳ’
Ｓ）、Ｆ−１０栄養玲地、子牛の胎児の血清、トリプシ
ン溶液）を、使用前に水浴中、約３５℃で約２０分もし
くはそれ以上の時間培養する。

下記の如き適当な趨尾を用いることにより、細胞をＭ癌
組織から分離し、多世代にわたって試験管内で増殖する
。滅菌溶液、たと、えば、１２−プロパノーケ＄よびア
ムフイルまたはクレオリン溶液で、あら牟じめ洗浄した
ビー力を用いる。

好ましい具体例として、人工ガン細胞（すなわ体坩址を
あらかじめ洗浄したと一カに入れる。つを用い、約３０
秒間静かに洗浄する。攪拌を避ける。すべての壁および
表面を洗浄する。冷下で約１０分間、３０００　ｒＰｍ
の遠心分離により溶液を細胞から清澄にする。培地を上
記の如く、ビーカー１こ注ぐ。少量の緩衝プロティナー
ゼ・エンザイム溶液を加え、細胞の消化を避けるために
すばやく洗浄する。好ましい方法として、・トリプシン
溶液（ＥＤＴＡ）１−２ｒｎｌ’を加え、わずか１０秒
間洗浄する。トリプシン溶液を流′出゛さする。　　、
同じ量の新鮮なトリプシン溶液を加え、顕微鏡観察で細
胞が、チャンバー壁から分離するのが見られるまで培養
する。、これには通常、５〜１０分間を要する。適当、
な増殖ｈｓｗ、たとえばＦ−１０栄養玲夕也１００−中
、子牛の胎児の血清の７〜１０％溶液５０−を加える。

細胞と共に新鮮な培地２５ｍ／を新しい増殖チャンバー
に移して繁殖させる。両チャンバーを培＃機中、３５℃
で約７日間置く。本実施例におけるこれまでの操作によ
り、人工ガンｉｉ％ｌ＆は約７日ごとに２つの新しい培
地に分割される。各増殖チャンバーについて、この全操
作を、はシフ日の間隔をおいて望ましい頻度だけくり返
す。このようにして、試験管内の生育細胞数ははｉ７日
ごとに２倍になる。

約７日間の増殖の後、マリグニンを製するために細胞を
抽出する。たと゛えば、上記各２５〇−増殖用チャンバ
ー壁の増殖細胞は以下の如く再生される。　　　　°゛ 培地を遠心分離管にうつし、冷下、３０００　ｒｐｍで
１０分間遠心分離する。培地を捨てる。増殖用チャンバ
ー内に残っている細胞をチャンバー壁から剥離して、中
性緩衝溶液で遠心分離機内に洗い流し込む。°細胞を中
性緩衝溶液で２回洗い、再び、冷下、３０００　ｒｐｍ
で遠心分離し、局地を捨てる。。粗マリグニン前駆体含
有分画の抽出のための！備ができる−で中性燐酸塩緩衝
液１０−中に洗浄し、た細胞を懸濁さ−せる。　　　　
　　　。

、゛実施例４ 粗マリグニン荊駆体含有分画の生成ニー実施例−３で・
製し、た、中性緩衝液中に懸濁する洗浄した細胞を、大
部分の蛋白の変性を避は得る条件下に機械的に粉砕する
。好ましい方法として１、・洗浄した細胞を冷下ミ超音
波で２０秒間処理する・。超音波処理後、細胞残渣を３
０分間、３０００ｇ　ｒｐｍで遠心分藤し、上澄液を傾
斜分離する。緩衝溶液１〇一部を、用シ）て残留゛する
細胞残渣を洗浄する。超音波処ｍ−ｂよび遠心分離処理
を上記の如、く行い、上澄液を合す。この操作を再度く
りかえす。　　　　１．１１．−３゜ 上澄液を合し、十分に°蒸発させて容量を約３０−から
約６〜７ｒｎｔにする。標本を全蛋白分析に用い、残部
を、アーストロシチン簡駆体１こついての前記実施例１
に記載の方法に従って分別する。

実施例５４．　　　　　゛ 粗マリ６グニン含゛着分画力）らのｆ精製マリグニン生
成物の生成ニー ・　アストロシチン１こついての実施縁２め方法によっ
てマリグニン生成物をさらに汚染物質から単離す・る０
　　、　　　　　・　　　　　　　　　　　　　　　・
好ましい具体例のＴ、Ｌ　Ｇ段階では、マリグニン−４
８＝ 生成物は標準シトクロムＣに対比して約０．９１＋／−
０，０２の距離に個別の斑点として観察され、マリグニ
ンに対し分子口約１００００が与えられる。

この段階で製せられたマリグニン生成物は蒸留水に可溶
であり、中性または酸性ｐＨで可溶、アルカリＰＨで不
溶であり、分光光度計の吸収ビーク２８・Ｏｍ罎有す。

これは・分子量約１００００を有するポリピペチドであ
る。　　　　　− 薄層ゲルク白マドゲラブイ測定により示されるように、
培地の継続する世代において安定せしめた培養培地にお
いて製したマリグニンの分子量を表Ｈに示す。芥子量測
定の再現性はＴＬＧクロマトグラフィのｒＫＪ、％め°
　制約の観点々）ら顕著であ、る゛。

表■ 得られんマリグニンの分子量の再現性　　。

第■表（つづき） マリグニンの共有結合アミノ酸は０ＮＨＣＩで加水分解
し、ついで定酋測定によって以下のアミノ酸の平均組成
を有゛することが示される。

残基の数（、約） アスパラギン酸　　　　　　　　　９ スレオニン　　　　　　　　　　　　′５セリン　　　
　　　　　　　　　５ グルタミン酸　　　　　　　　　　　１３プロリン　　
　　　　　　　　　°　　　４グリシン　　　　　　　
　　　　　６ アラニン　　　　　　　　　　　　・　９バリン　　　
　　　　　　　　　６ １／２システイン　　　　　　　　　　　　ｌメチオニ
ン　　　　　　　　　　　　２インロイシン　　　　　
　　　＋　　　４０イシン、　　　　　　　　　　　　
　８すｂンン：　　　　　　　　　　　　３・′　　　
　　。

フエ旦゛ルアラニン　　　　　　　　　３リシン　°、
°６ ビスチジン　１　°　　　　　　　　　２アルギニン　
　　　　　　　　　　、５ルロイ°レン、ア“ンモニア
、イソデスモシン、デスモシン、ヒトワキシリジン、リ
シノノルロイシンおよびガン→アミ７　　時酸は検出し
得る量存在しない。　　　　゛ 、実施例３の１２個の２５〇−反応チャンバーか・ら°
得られる純マリグニンの収量は、マリグニン約ｌｖ９で
ある。

マリメニンとアストロシチンの特異の構造は１、これら
の組成を実質的に既知の蛋白物質と比較すル徹底的なコ
ンピュータによるサーチによって確かめられる。

マリクニン尉よびアストロシチンめアミノ酸化合物、１
モルあたりのアミノ酸残基の総数の観点からの、各アス
ノ酸コンポネント、の絶対量および相対量、並びに分子
の分子量の観点からの、各。アミノ酸コジボネントの絶
対量＄よび相対量を１世。

界で、蛋白組織について最も広汎に知られた文献、すな
わちナショナル・バイオメディカル・リサーー７．７ア
ウレアイツヨ７（ヮ、ｙｌ−＞−デイ−・シー）のそれ
に対し、てマトリックス・コンピュータ分析にゆだねた
。何百、何千の°蛋白詔よび蛋白フラグメントと比較し
たマトリックス分析において、アストロシチンまたはマ
リグニンの組織と同一もしくは非常に近似する組織すら
見出されない　　　　゛ とにか°く組織的に関係する蛋白のみ、その個々のアミ
ノ化合物と分子量について比較のために表■に示す。無
数の可能性の中から、構造における各程度の類似性を確
定すべくコンピュータのフログラムを組んだにのように
して、たとえば、より大きなまたはより小さい分子量の
蛋白、または８５より少ないかもしくは９５より多い残
基を有する訴白、または１２より少な５）かもしくは１
５より多いグルタミン酸残基を有する蛋白、または５よ
り少ないかもしくは１１より多いアスパラギン酸と合致
しない。

上記のごとき指紋は適合すべき２２個の変数を有する。

ある物質は１個、４個もしくは５個の変数に関して適合
するが、２２個の変数すべてに関して適合す４るものは
ないものと見られる。事実、１４個（その内、８個の変
数において差異を認める。）を越える変数に関してよく
適合するものは。

なり′）。　　　′ それ故、最鉱密に適合す名ものはチトクロームｂｓ（人
間の）！ある。表■中に見られるように・、そのアラニ
ン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シス
ティン、グルタミン、ヒスチジン、メチオニン、チロシ
ン、トリプトファン残基はすべてアスｉロシチンおよび
マリグニンとは著しく差異があることを識別することが
できる。ナトクロムｂ５はヒスチジン分子７個を含むの
に対して、アストロシチンおよびマリグニンはこの分子
２個のみ含むので、両者が同一の化学構造を有する可能
性はない。アストロシチンおよびマリグニンの組成に関
する最も異状な事柄はグルタミン酸濃度が高い点にある
。８９個中、残基５〜６個のみを見出し得るように期待
される。

上記に次いで密接に適合するものはロイカエネ、クラウ
カ（Ｌｅｕｃａｅｎｅ　ｇｌａｕｃｓｃ）およびアルフ
ァルファ中のフェロトキシン類であるが、これらはそれ
ぞれアミノ酸４個および６個を有することにおいて異な
り、且つこの両者はそれぞれ残基９６個および９７個を
有する点で異°なる。その他の適合するものとして大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）２６のアシル担体蛋白が挙げられる
が、これは残基数がアミノ酸１１個におＣ）てマ゛リグ
ニン＄よびアストロシチンと著しく異なり、またこれは
ｉ基７７個のみを有する点で異なる。

他の脳蛋白（牛、豚のノイロフイシンおよびコ゛ナトト
ロピン放出ホルモン）を記録した（表■参、照）がぜこ
のもののコンピュータに記憶された数１゛０万種の蛋白
フラグメントから、いずれも非常に適合の悪いものであ
る。

呼吸蛋白はその元のままの状態に詔いて金属および／°
またはヘム成分を含有することができるが、単離された
。状態の蛋白フラグメント、たとえばアポナトクロムｂ
５は金属およびへ・ム成分のいづれ゛をも、含有しない
ｂア、ストロシチン堰よびマリグニンの微量分析結果に
よれば、鉄、硫黄、リン、マグネシウムを含有すること
な（（０，０１％以下）、２８’Ｏｍμに典型的吸収ス
ペクトル特性を有する。τボブロチインと共にヘム物質
を構成せしめ、その吸収スペクトルを測定した結果、４
００および４５０ｍμの間に典型的吸収が認められた。

アストロシ・チンおよびマリグニンは他のす、べての蛋
白および蛋白フラグメシトと異なり、構造的に異なる゛
ものであるにも拘らず、これらの構造は呼吸蛋白のそれ
と密接な関連性を有するということは注目すべきことで
あって、多分非常に重要である。発生遺伝学的観点およ
びその化学構造ｌこおける機能的観点の双方から、多く
の重要な関連性を引出すことができるということはこの
技術分野においてよく知られている。アストロシチンお
よびマリグニンが新しいｉ白物質であってその構造的等
個物がその位置で呼吸作用を示し、従ってこれらの蛋白
が他に逆作用を宗すのであるから、癌の大問題の１つ（
すなわち貧欲且つ急速に増殖する悪性細胞に対し、エネ
ルギー関係をいかにして満足なものとするかという問題
）を解決するための光切、を与えることとなった。

か′かる発見の理論的重要性はともかくとして、より悪
性な細胞中にマリグニンの割合を増加せし・めた前記デ
ータおよび抗マリグニン物質は癌細胞のマリグニン様化
学物質に結合しているばかりでなく、かく結合した坑了
リグニンもまた癌細胞に対して毒性を・有することを示
した鼻記データは共に重要な意義を有する。本発明にお
ける抗マリグ゛ニン生成物は癌細胞中で分別的にその中
のヘム−化合物に結合しそいるから、もしそのマリグニ
ン様化合物が呼黙蛋白であり、従ってその系内に呼吸、
機能を有する物質を含有するのであれば、その癌軸胞を
死滅せしめ得ることは容易に理解し得るところである。

“°抗マリグニン類および他の類似のケモンシ７°口狡 カルの、治療的効果に対する可能性はマリグニン＃、よ
びアストロ、シチンに関する構造的知見およびマリグニ
ン量の悪性度との間に既に証明された関係により著しく
増大される。

実施例５人 発酵の過程においてその容量および表面積を増加せしめ
たことによる収量、悪性の度合およびマリグニンの割合
の増大； ｚ５０ｆｒＬｔフラスコの代わりに１０００−フラスコ
を用い、試薬の量はすべて３倍量を増加し、実施例３〜
５と同様の操作を行った。

゛悪性細胞の増殖のためのスペースを２５０−から１０
００−に増加することにより、接種から７日間発育させ
た後のマリグニン生成物の収量はほとんど２倍に増加し
た。フラスコの大きさ別に、その総蛋白量！（η）右よ
び生成したマリグニンを連続的世代の発酵物質゛の総蛋
白量に対するチとして表わし、これを表■に示す。２５
０−フラスコを用いたとき、生成した総蛋白量の平均値
は１７．５η、１０００ｔｎ！フラスコを用いたとき、
生成した総蛋白量の平均値は４０．４■であった。

表■ 連続世代を含む培養発酵 による改良されたマリグニン収量 、表　　■（つづき） 表面積を増加せしめることにより、７日発育期間当り、
悪性細胞増殖量（悪性の度合）が増大するに従って総蛋
白の憾として示された生成マリグニン量もまた有意に増
大する。７日の発育期間中に総蛋白量に対するマリグニ
ンの百分率は２５０＋、Ｌｔフラスコ使用時における平
均値ｘｏ、ｒ％から、１０°００ｄフラスコ使用時に＄
ける平均値２８．３％に増加した。　　・　。

生成したマリグニンの割合と悪性の度合（すなわち７日
間試験管内における悪性細胞増殖量に対する生成蛋白量
の関数）との関係を第１図に示す。

ｍ１図はフラスコの大きさが増加したのでマ゛リグニン
生成物の°比率は約３倍に増大することを示している・
。また第１図はマリグニンと悪性の度合との関係を示す
ものである。　磁線は理想的直線藺係を示す線である。

この実証的関係はその細胞の増殖が（病理学的に）より
阻止し得ないものとなるに従ってマリグニンの存在比率
が増大するものであるから重要な関係である。通常のレ
コグニンの機能それ、自体は、前記のごと（細胞に接触
してその増殖を抑制することに関連性を有する。悪性細
胞の増殖がより病的であれば、接触による抑・性効果は
減少し、マリグニンがより優先的な蛋白となって増加す
る。

実施例５Ａにおいては、大なる発育容器中で発育させた
人工的癌細胞培養物は予期に反して生成マリグニンの割
合、すなわち総蛋白量中のマリグニンの百分率が増大す
ることを例証するものである。この発明に詔いて用いら
れたような大容量の発育容器は容器容量の実施例３によ
る細胞入培地総容量に対する比が約８＝１（たとえばそ
の範囲は７：エないし１０：１）より大なる容器である
ことを意味する。実施例５ＡＩＣ：１いてはその比は約
８：１であった。

実施例６ 、レコグニン類からターゲット試薬の製造ニーは実施例
５で製せられたマリグニンを担体と混合してターゲット
試薬を製する。

好ましい実施態様に初いて、アストロシチンまたはマリ
グニンを０．１５Ｍリン酸二水素ナトリウム−クエン酸
緩衝液（ｐ１４．４．０）に溶解する。ブロモアセチル
樹脂、たとえばセルロースＩ　ＳＥ当すＡ素１．θ〜１
．５主１゜ルを有するブロモアセチルセルロース（ＤＡ
Ｃ）を０．１５Ｍリン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，２）中で製し、冷所に貯える。ｐＨ７，２の緩衝溶
液を注ぎ、上記０．１５Ｍ！Ｊン酸二水素ナトリウ・ニ
ークエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）を加えることにより、
得られたｍ街液の声を４に調節する。アストロシチンま
たはマリグニン溶液とＢＡＣの溶液（ＢＡＣのレコグニ
ンに対する比１０：１）を室温で３０時間攪拌した後、
遠心分離する。

レコグニンに結合させるために用いるＢＡＣ上のすべて
のサイトは結合１こ関与していることが好ましい。これ
は次のようにして達成される。直上′に記載した段階に
おいて得られた上澄液を凍結乾’燥し、ＢＡＣに結合し
ていないアストロシチンまたはマリグニンの量を知るた
めに蛋白含量を測一定する。複合Ｂ人Ｃ−アストロシチ
ン（または、Ｂ人Ｃ−マリグニン）を再度０．１Ｍ炭酸
水素塩緩行液（ｐＨ８，９）に懸濁し、４℃で２４時間
攪拌してＢＡＣおよびアストロシチンまたはマリグニン
の間の化学結合を形成させる。２４時間後、この懸濁液
を遠心分離し、上澄液の蛋白を分析する。複合ＢＡＣ−
アストロシチンまたはＢＡＣ−マリグニンを更に０．０
５Ｍアミノエタノール−０，１Ｍ炭酸水素塩ｔ１行液（
ＰＨ８，９）中に再懸濁して未反応臭素を閉塞する。゛
この懸濁液を遠心分離し、アミノエタノールが存在する
からその上澄液はこれを分析に付することなく°そのま
ま保持する。これを遠心分離し、スペクト−ホトメータ
で２６６ｍμに吸収が観測されなくなるまでこの再懸濁
液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムで３回洗浄する。このＢ
’ＡＣ。

アストロシチンまたはＤＡＣ−マリグニン複合体を８Ｍ
尿素中、３８℃で２時間攪拌し、遠心分離後、洗液中に
、２６６ｍμの吸収が現われなくなるまで（通常３回）
、８Ｍ尿素で洗浄する。この複合体を０．１５Ｍ塩化す
）　ＩＪウムセ２回洗浄して尿素を除去する。この複合
体を０．２５Ｍ酢酸中、３７℃で２時間攪拌し、その安
定性を証明する。遠心分離し、得られた上澄液は必然的
に２６６ｍμにおける吸収が存在しない。それ故、この
化学的複合体：　ＢＡＣ−、アストロシチンまたはＢＡ
Ｃ−マリグニンは安定であって下記のごとき方法におけ
る試薬として用いることができる。この安定な試系型に
おいて、これ全合成法により得られた錯体と呼ぶことが
でき、その物理的および化学的性質は潜在的反応状態に
おいて血清成分として理解される時、安定細胞−アスト
ロシチンまたはマリグニンの結合前駆体と見做すことが
できる。保存のため１こほこのターゲット試薬を遠心分
離し、０．１５　Ｍ　＋７・ン酸二水素ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，２）で中性になるまで洗う。

ターゲット試薬はセルローズ以外の配位子を有するブロ
モアセチル担体、たとえばブロモアセチル化樹脂もしく
はν紙からでさえも使用することができる。

実施例７ アストロンチン、マリグニン＃よびターゲットに対する
抗血清の製造：一 アストロシチン、マリグニンまたはターゲット試薬に対
する抗血清ぼ哺乳動物におけるこれら試薬に対する抗体
反応を誘発することにより製せられる。この目的のため
に満足な方法を以下説明する。

レコグニン（アストロシチン堰ヨヒマリクニン、）１グ
を標準フロインに佐薬と共に白色雄家兎の足の肉踵に注
射し、１週間後、更に１０日後、要すれば更に３週間後
腹腔内に同様の注射を行う。

最初の注射か、ら１週間ないし１０日後、早やこれらの
家兎の血清中に特殊な抗体を検出することができる。タ
ーゲット抗原を得るため、アストロシチンまたはマリグ
ニン１キ（プオリンーロウリイ蛋白検出法により測定）
を含有するターゲット量を注射する操作を上記同様の方
法により行う。アストロシチンに対する特殊抗体を抗ア
ストロシチ７　（Ａｎｔｉ−Ａｓｔｒｏｃ７ｔｉｎ）と
呼ぶ。マリ、ゲニンに対する特殊抗体を抗マリグ＝　７
　（Ａｎｔ　ｉ−Ｍａｌ　１ｇｎ１ｎ）と呼ぶ。同様に
ターゲット試薬に対する特殊抗体を抗ター／７．７ト（
Ａｎｔ’ｉ−Ｔａｒｇｅｔ）と呼ぶ。

抗原−抗体反応のための標準的入方天内シ牝４（Ｏｕｃ
ｈｔｅｒｌｏｎ７）ゲル拡散試験法により、ソノ特殊抗
原により得られた特殊抗体はその抗原との反応における
単一鋭敏な直線関係を示すことが明らかである。

一血清中における特殊抗体の存在は抗原−抗体反応のた
めの沈降素標準定量試験法によっても試験することがで
きる。この試験により良好な沈降素定量曲線を得ること
ができ、これから特殊抗体の々数を計算することができ
る。

更に血清中における特殊抗体の存在は特殊抗体：抗アス
トロシチンを前記のごとき、ブロモアセチ。

ルーセルロースーアストロシチン（ＢＡＣ−アスト・ロ
シチン）上に吸収させることによりその証明を褥ること
ができる。すなわち、特殊抗アストロシチンを含有する
抗血清とＢ“ＡＣ−アストロシチンを反応させることが
できる。血清をＢＡＣ−アストロシチン上に通すとき、
アストロシチンに対する特殊抗体のみがぞの特殊抗原ア
ストロシチンに結合する。アストロレチンはプロそア°
セチル−セルロースと共有結合により結合するので、特
殊抗体：抗アストロシチンはＢＡＣ−アストロシチンと
結合゛してＢＡＣ−アストロシチンー抗アストロシチン
（ＢＡＣＡ−抗アストロシチン）を生成する。これは洗
浄によりＢＡＣ−アストロシチンから分離された血清残
留物を試験することにより証明される。標準的キス内坑
源抗俸拡散試験法により、血清中にアストロシチンと反
応し得る、抗体は残留していないことが認められた。そ
れ故、血清中にあらかじめその存在が示された特殊抗体
（抗アストロシチン）はすべてＢＡＣ−アストロシチン
に吸収されたことが明らかである。更に、抗アストロシ
チンをＢＡＣ−アストロシチンとの結２５Ｍ酢酸ｉ’Ｂ
ＡｃＡ−抗アストロシチン充洗浄（４℃で２時間）する
ことにより行うことができる。

また、血清中における特擁抗体の存在は特殊抗体：抗マ
リグニンを前記のごときブロモアセチル−セルロース−
マリグニン（ＤＡＣ−マリグニン）上に吸収させること
によりその証明を得ることができる。すなわち、特殊抗
マリグニンを含む抗血清とＢＡＣ−マリグニンを反応さ
せることができる。血清をＢＡＣ−マリグニン上に通す
とき１、マリグニンに対する特殊抗体のみが特殊抗原マ
リグニンに結合する。マリグニンばブロモアセチル−セ
ルロースと共有結合により結合するので、特殊抗体：抗
マリグニンはＤＡＣ−’マリグニンと結合してＤ　Ａ　
Ｃ−７リグエンー抗、リレエン（ＢＡＣＭ−抗マリグニ
ン）を生成する。これは洗浄１ヒ、よりＤＡＣ−・マリ
グニンから分離された血清残留物を試験することにより
証明される。標準的宰天由抗原＃Ｌ伴拡散試験法により
、血清中１こマリグニンと反応し得る抗体は残留してい
ないことが認められた。それ故、血清中にあらかじめそ
の存在が示された特殊抗体（抗マリグニン）はすべてＢ
ＡＣ−マリグニンに吸収されたことが明らかである。更
に抗・　　々リグニンをＢＡＣ−マリグニンと℃で２時
間）することにより行うことができる。

抗原−抗体反応のための標準的飢氷天閃ｓ＆苓今・ゲル
拡散試験法により、ターゲット抗原により得られたその
ターゲットに対する特殊抗体は前・記の抗アストロシチ
ンまたは抗マリグニンのごとき抗血清（すなわちアスト
ロシチンまたはマリグ　　　。

エン自体を注射して得られる抗血清）と同様、その抗原
との間の反応に＃ける単一直線関係を示すことが明らか
である。注意すべきことは、家兎の内のあるものはター
ゲットを注射する前にある量の抗ターゲットを保持して
いる。これらの抗ターゲット物質は大血清のテストにお
い、て記載されたように特にターゲット試薬と反応させ
るとき、ＴＡｃ、ｓ’−ＴｈａおよびＦ−ＴＡＧの約当
モル量（２タイプ）を生成する（後記実°流側参照）。

実施例８ 生物学的液体からターゲット−ｆタッチングーグロブリ
ン（ＴＡＧ）を試験管内で定量的に生成させることによ
る悪性腫瘍の検出ニー。

実施例６により製せられたターゲット試薬の劣化により
存在することもある未結合レコグニンを除去するためミ
これを洗浄する。その満足すべき方法は次のとおりであ
る。ターゲット試薬を酢酸と共に３７℃で２時間攪拌し
、遠沈し、上澄波を傾瀉分離し、・こあ上澄液の２６６
ｍμにおける光学密度を測定する。もしその波長ｌこお
ける吸収が存在するならば、物質が溶解しなくなるまで
上記のごとき洗浄を反復実施する。次いでこのターゲッ
トをリン酸緩衝食塩溶液（ｐＨ７，２）に再懸濁する、
（ターゲット試薬を試験するための標準法を参照し、も
し他のターゲット製剤により５−ＴＡＧおよびＦ−ＴＡ
Ｃ，を含むことが試験により明らかとなった家兎全血清
を得ることができるならば、後記方法により大血清の反
応から精製した標準的５−ＴＡＧおよびＦ−ＴＡＧを使
用することができる）。

次の方法によりスロ−−バインデンｆ（Ｓ−ＴＡｌｅ）
を決定する：数日間保存した凍結血清はこれを使用すべ
きでない。常套の方法により、新しく得られた全血液も
しくは他の体液から注意しながら血清をつくる。満足す
べき方法を述べれば次のと詔りである。採取した血液を
ガラス製試験管中、室温で２時間放置し、凝血させる。

ガラス製攪拌棒を用い、凝血を試験管壁から分離し、こ
の血液を４℃で最低２時間（もしくは−夜）放置する。

４℃で４５分間遠心分離（２，０，０００ｒｐｍ）する
ことにより凝血を血清から分離し、血清を遠心分離管中
に傾瀉分離し、更に４℃で４５分間遠心分離（２，Ｏ’
ＯＯｒｐｍ）する。この血清を傾瀉し、メチオレート１
多溶液（水９５−詔よび０．２Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐ
Ｈ１０）　５−中、１グ）を血清に対して１％（容量）
の限度で加える。

上記方法または他の方法で得られた血清それぞれ０．２
４を、ターゲット試薬０，２５４当りルコグニン１００
〜２００哩含有のターゲット懸濁液試薬それぞれ０．２
５４に加え、２個の検査試料とする。ベレット生成が避
けられるような方法により、上記懸濁液を４℃で混合す
る。たとえば小さいゴム製キャップを用いて１〜２秒間
強く振りまぜた後、管をゆるやかに傾瀉させてこれをト
ーマスシエーカ中、約２時間またはそれ以上振盪させる
。ターゲット試薬とそれに結合した蛋白を血清から分離
する。この発明で見出された満足すべき方法により、上
記管を４℃で２０分間遠沈（２００Ｑｒｐｍ）、上澄を
傾瀉した後、どれを０．１５Ｍ食塩水０．２〜０．３−
と再混合し、室温で振盪し、遠沈して上澄液を分離する
操作を３回行うことにより生成したベレットを洗浄する
。

ターゲットに付着して残留する蛋白をそれかち分離し、
この蛋゛白を定量する。たとえば０．２５Ｍ酢酸０．２
−を加え、この懸濁液を３７℃のふ卵器中で、１〜２時
間振りまぜる。管を４℃で３０分間遠沈（２００Ｏｒｐ
ｍ）する。粒状物が移行するのを避けるように注意しな
がら上澄液を傾瀉し、２８０ｍμにおける上澄液の光学
密度を測定する。血清蛋白（Ｓ−ＴＡＧ）−当リグの結
果を得るため、串記光学密１度の測定値を１．４６の因
子で割る。

検査資料２個の間に５嘔以上の差があってはならない。

蛋白含量を検査するため、他の方法たとえ、ばフオリン
ーロウリイ検査法を用いることができるが、対照試料の
濃度と（Ｓ−ＴＡＧ）−（Ｆ−ＴＡＣ，）濃度の値′の
範囲を標準法１ζおいて特定して諺かねばならない。

血清は使用すべきではない。常套の方法により、新しく
得られた全血液もしくはその他の体液から注意して血清
を作成する。血、清をつくる方法はこの実施例の前部に
記載した方法で充分である。

上記の又は他の手法で作成された血清見本は、５−ＴＡ
Ｇ血清測定剤が上記の７−ゲラ・ト試剤と接触させられ
る全時間よりも１０分間少ない時間の間、４℃で放置す
る（例えば「２時間」の５−ＴＡＧ測定をしたならば１
時間５０分）。この方法では５−ＴＡＧとＦ−ＴＡＧの
測定剤の温度履歴が平衡される。

温度平衡した血清の見本０．２ｄを、二重測定において
、グーゲーソト試剤０．２５−につ（＼てし°フルブゝ
二’ｙ、１００乃至２００マイクログラム含有するクー
ザットけん濁試剤の０．２５４整除数のそれぞれに加え
る。けん濁物は、顆粒形成を避けるようにして約１０分
間４℃で混合する。例えば、急速に振り動かした小ゴム
キャップを゛ｌ〜２秒間用いて、それから管を僅かに傾
けてこれらをトーマス振とう器で、約ＩＯ分間振とうす
ればよい。それについている７ニゲ′・ラド基剤及び蛋
白質は血清から分離される。満足であると認められた゛
手法の一つは下記のものである。次に管を２００　Ｑ　
ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離し、上澄液を種属し、
遠心分離で形成した顆粒を０．１５Ｍ塩水０．２〜０．
３ｖｉと再混合し室温で振とうすることによって３同性
から開裂り定量的に測定する。５−ＴＡＧ濃度、を測定
するための本実へにおける上記の手法は満。

足なものである。。７オリン・・ロウリー測定法のよう
な、蛋白質含有量を測定するのに効果のある他の手法を
用いてもよい、しかし制御の範囲及び５−ＴＡＣ；マイ
ナ゛スＦ−ＴＡＧ濃度の腫瘍値を決定するため基準を定
めなければならない。　　　°“最終結果は血清１−に
つきＴＡＧマイクログラムとして表わされ、これはＳ、
−ＴＡＧ？イナスＦ−ＴＡＧに等しい。非脳腫瘍患者及
び他の制御におけるＴＡＣ値は現在のところ血清１−に
つきゼロ（又は負数）から１３５マイクログラムまでの
範囲に亘る。１イにっ＊　ｓ　ｏ　Ｑｍμを越える結果
については、反４’ｌ測定を表示する。他の腫瘍のある
も°のは高いＴＡＧ値埴表わすことがある、特゛に脳内
に二次的（転移した）腫瘍がある場合にそうである。脳
腫瘍患者の’Ｔ　Ａ　Ｇ値は現在では血清１−ｊこつき
１３６乃至５６０以上マイクログラムに及ぶ。アストロ
シチン及びブロモアセチルセルローズから調製したクー
ゲヅド試剤を利扇する本実施例の手法に従って行なった
５０の血液見本についての最初の「盲検」においては、
１１の脳腫瘍のうち１１、及び３２の正常のもの＼うち
２８が正確に判別された。４件の正常と思われていたち
の（即ち、非脳腫瘍対、ｇ、）のうち１件は、明らかに
何年か前に良（手当した甲状腺癌のあることが判明した
。残りの３件の正常者は健康のすぐれない、多分診断　
のついていない癌を持った、年令６０〜７０の個人であ
づた。残りの７例のうち、ホジキンス病の３件中の３件
は正確に判別された。

腫瘍の範囲に入る１例（１３６〜５００μに人Ｇ／−）
はひどい神経膠症を持つ患者に該当し、非腫瘍の範囲（
６〜１３５μ９ＴＡ（ｙ／４）に入る３例は、それぞれ
不明確ではあるが腫瘍ではない頭−マ、°、す（−ｉ：
　＝・ンお・よび悪性脳腫瘍及び全正常者から・調製し
た°り・菖゛デヴ、゛ト、試剤を利用して本実施例の手
法に従ってその後の検討を行なった。

本実施例の手法に従って行なった更にそれ以上の検府で
は試験した人間の腫瘍の見本の総数が５０から１１４に
及んだ。これらの製品及び手法の有用性を第５゛表に示
すが、と、れはこれらの試験の結果を記録す暮ものであ
机 実施例９ ４！、Ａ貧光玖　　　　　　による腫瘍細胞の診断化合
物抗−アストロシチン、抗−マリグニンおよび５−ｒｈ
ｃ；は腫瘍細胞１こ優先的に付置するこζを示す。この
特異性は組織学の部簡において染料または放射性物質を
抗−アスト°ロシチン、抗−マリグニンまたはｓ、−’
ｒ、Ａａに結合させてこれらの化合物を腫瘍細胞の診断
に用い得る。標準の標識技術がそれゆえ用心）られる。

５−ＴＡＧの使用法は次のとお、りである。

マリ−（ＳＬｏＭａｒｉｅ）法の変形である。９人間の
脳ｍ瘍検体を凍結し５ミクロ″ンの厚さに切る。これら
を湿容器中に染色前に一７０℃に４〜８週間貯える。結
合体は山羊の抗−ウサギ結合体のような標準の抗血清で
ある。結合体はフルオレッセンスまたは他の標準物質で
この技術分野で既知の技ｓｍ山羊抗−ウサギ結合体を用
い得る。雨いるフルオレッセント技法は標準のものであ
って、Ｔ人Ｇの１・：２００〜ｌ：４００溶液を腫瘍切
片上に３０分間またはそれ以上保温し、次に洗浄して付
着しないＴＡＧを除く。燐酸緩衝食塩水で３回洗浄する
のがよい。フルオレツセインー標識結合体で結合保温し
、洗浄したら顕微鏡検査をする。正規の細胞およびその
突起は腫瘍切片および正規の非腫瘍脳の対照切片具に染
色されない。フルオレッセンスは腫瘍神経膠およびその
突起に明るく存在する。

実施例１０ 組織培養で増殖する腫瘍細胞；ｉ対して抗−アストロシ
チン、抗−マリグニンｔよび５−ＴＡＧが細胞毒性を有
することの実験　　。

細胞毒性を測定する標準試験を用いる。一般に、固定し
た計算相中の細胞の数、普通的１００の生きた細胞を含
有するように準備されるが、これを計算す机次に４°れ
らの細胞を試験する試剤モ処理し、なお生きている細胞
の数を計算する。

実施例８の、￥侍で得られた゛Ｓ−，ＴＡＧ溶液の、神
経膠発生が十分に特徴づ１すられる、神経膠芽細胞■〜
■級の”患者からの組織培養中の細胞に対する細胞毒性
の標準試験において、５−ＴＡＧは溶液−当り５−ＴＡ
Ｇｏ、２堰よび０．０２μ２のような少量に相当する１
：１００および１：１０°ＯＯの高希釈度の場合モも計
算相中のすべての細胞を死滅させる。同様な結果が抗−
アストロシチン勿よび抗−マリグニンの高希釈液で得ら
れる。

実施例９で示す特異性＃よび実施例１０で示す細胞毒性
は共に人間の脳腫瘍に対する抗−アストロシチン、抗−
マリグニン環よび５−ＴＡＧの治療可能性に非常に関係
がある。これらの治療的使用は手術で除去された腫瘍組
織に対するこれらの両方の現象の実際の診断可能性１こ
加えて既に証明した組織学による診断を必要とする。

−８５＝ 実施例１ル コグニンの加水開裂 し」ゲニンの溶液、この場合はアストロシチンかマリグ
ニンをｐＨ１〜２で装置する。７〜１４日後に薄層クロ
マトグラフィーでこの生成物は分子量が約ｂ００減少す
ることを示す−この溶液を更に長く放置すると約２００
分子量の単位が７〜１０日に開裂する。すなわちアスト
Ｐシチンでは８゜０００から分子量が減少し、マリグニ
ンでは１０゜０００から分子量が減少し、各場合引続い
て約２００の単位減少する。。

アストロシチンの生理化学的特異性は各生成物で４００
０分子量まで維持される。マリグニンの生理化学的特異
性は各生成物で５，０００分子量まで維持される。これ
は抗−アストロシチンお上び抗−マリグニンのそれぞれ
に対する　　ｇＸｔＲＡ４Ｊｔ４ゲル拡散試験で示され
る。

この開裂はまたトリプシンおよびその他のプロテアーゼ
と共のようＩζ酵素的にも同じ結果で達成することがで
きる。　。

＝８６− レコグニンの加水開裂によって調製されたこれらの化合
物の分子量は次式によってほぼ定義される。・ マリグニンの生理化学的特異性を有する生成物実施例１
２ レコグニンとの人工組織または器官の製造プ゛ラスチッ
ク、金属またはその他の適当なかたい材料あかたい壁の
管をし゛コグニン（この場合アストロシチンまたはマ、
リグニン）の高濃度（即ち１０■／−）のヴイスコース
溶液を、すべての表面が被覆されるまで浸すか含ませる
。あるいはまたレコグニン溶液をすべての表面が十分に
被覆されるまで加圧下に管の中および周を通す。次に管
この管は生きている哺乳動物の隣接する組織または体液
中にアストロシチンまたはマリグニンのような前駆物質
を含有する空洞または組織中に置く準備がかくしてでき
る。この人工組織または器官はレコグニン被覆のない異
種物質が刺激をする反応を最少にするか除くために用い
られる。

その他の形状の人工組織または器官が同様にし製するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明におけるマリグニン生成ｆｉ１（生成全
蛋白量（ＩＩｇ）として）を悪性度合（全蛋白量の％と
して）の関数として示すグラフである。 特許出願人　サミ　ュエル　・　ボゴチ代　理　人　弁
理士　青　山　葆　はか１名ｓｉＩ！！ マップ−ン生へ墾（％） 手続補正書動式） ２、発明の名称 レコグニン類および関連物質 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、レコグニンを担体に結合させたことを特徴とするタ
   ーゲット試薬。 ２、担体がセルロースを基礎とする材料である特許請求
   の範囲第１項記載の試薬。 ３、担体がブロモアセチルセルロースである特許請求の
   範囲第２項記載の試薬。 ４、レコグニンが正常または疾患細胞または組織を中性
   緩衝液で抽出し、得られた可溶化蛋白抽出物からｐＫ値
   １〜４のフラクションを分離し、このフラクションから
   採取される酸性ペプチドである特許請求の範囲第１〜３
   項のいずれかに記載の試薬。 ５、レコグニンが下記の特性を有するものである特許請
   求の範囲第４項記載の試薬： （ａ）定量沈降試験およびウフタロニー寒天内抗原抗体
   ゲル拡散試験において、特異的抗体により単一線状沈澱
   を形成することが出来る； （ｂ）酸性または中性ｐＨで水および水性溶液に可溶で
   ある； （ｃ）アルカリ性ｐＨで水および水性溶液に難溶である
   ； （ｄ）分光吸収ピーク波長２８０ｍμを有する； （ｅ）分子量４，０００〜１０，０００を有する； （ｆ）グルタミン酸とアスパラギン酸の含量が高く、ヒ
   スチジンに対するグルタミン酸とアスパラギン酸の比率
   が高い； （ｇ）動物に注入したとき抗レコグニン抗体を産生し、
   その抗体はレコグニン類に属する他の酸性ペプチドと特
   異反応する； （ｈ）不活性担体と結合したとき特異的免疫吸着により
   抗レコグニン抗体と結合し、これにより該抗体の定量と
   精製を可能とし、かつイン・ビトロとイン・ビボのいず
   れにおいても該抗体がレコグニン類に属する酸性ペプチ
   ドまたはこれを含む細胞と特異的に結合することを可能
   にする。 ６、レコグニンが下記の特性を有するアストロチシンで
   ある特許請求の範囲第４項記載の試薬：正常または疾患
   細胞または組織が脳膠腫瘍組織の反復破壊組織であり、
   分子量約８，０００を有し、アミノ酸組成としてアスパ
   ラギン酸９、スレオニン５、セリン６、グルタミン酸１
   ３、プロリン４、グリシン６、アラニン９、バリン４、
   １／２システイン２、メチオニン１、イソロイシン２、
   ロイシン８、チロシン２、フェニルアラニン３、リジン
   ８、ヒスチジン２、アルギニン４、合計８８（検出し得
   る量のシステイン酸、ヒドロキシプロリン、ノルロイシ
   ン、アンモニア、イソデスモシン、デスモシン、ヒドロ
   キシリジン、リジノノルロイシン、γ−アミノ酪酸は存
   在しない。）の残基概略数を有する。 ７、レコグニンが下記の特性を有するマリグニンである
   特許請求の範囲第４項記載の試薬：正常または疾患細胞
   または組織が培地内で生育した人工癌細胞であり、分子
   量約１０，０００を有し、アミノ酸組成としてアスパラ
   ギン酸９、スレオニン５、セリン５、グルタミン酸１３
   、プロリン４、グリシン６、アラニン７、バリン６、１
   ／２システイン１、メチオニン２、イソロイシン４、ロ
   イシン８、チロシン３、フェニルアラニン３、リジン６
   、ヒスチジン２、アルギニン５、合計８９（検出し得る
   量のシステイン酸、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン
   、アンモニア、イソデスモシン、デスモシン、ヒドロキ
   シリジン、リジノノルロイシン、γ−アミノ酪酸は存在
   しない。）の残基概略数を有する。 ８、レコグニンが式： ４０００＋２００Ｘ＝Ｙ ［式中、Ｙは生成物の分子量、Ｘは０または１〜１９の
   整数を表す。］で示される分子量を有するものである特
   許請求の範囲第４項記載の試薬。 ９、レコグニンが式： ５０００＋２００Ｘ＝Ｙ’ ［式中、Ｙ’は生成物の分子量、Ｘは０または１〜１９
   の整数を表す。］で示される分子量を有するものである
   特許請求の範囲第４項記載の試薬。 １０、レコグニンが哺乳類に注入したときアンチ−レコ
   グニンを生成することができ、上記アンチ−レコグニン
   は試験管内において腫瘍細胞に対し有毒であり、フルオ
   レッセインと結合して腫瘍細胞中で蛍光を生ずるもので
   ある特許請求の範囲第４〜１０項のいずれかに記載の試
   薬。