JPH01112982A - アルカリ耐性セルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリ耐性セルラーゼ及びこれを産生
ずる微生物に関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
九菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、７ザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコツカス属、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクチ
ノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界において従来見出されたセルラーゼのほとん
どは、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵素活
性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類され
るものであって、衣料用洗浄剤配合成分としての必要条
件である、アルカリ領域で最大活性を示すか、あるいは
アルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂アルカリセルラ
ーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

ここで言うアルカリセルラーゼとは、至適ｐＨがアルカ
リ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは
、至適ｐＨは中性から酸性領域にあるが、アルカリ領域
に於いても至適ｐＨに於ける活性に比較して充分に活性
を有しかつ安定性を保持するものを言う。

また、中性とはｐＨ６〜８の範囲を言い、アルカリ性と
はそれ以上のｐＨ範囲をいう。

即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーゼＡを採取する方法ｌ公昭５０−２８５１５号公
報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培養
してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特
開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチル
ス？ａｌｌ１３９を培養してカルボキシメチルセル２−
ゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、、　Ｋｕ
ｄｏ、　Ｔ。

ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、　Ｋ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３１゜３３３９、（１９
８５））及びストレプトマイセス属の一種を用いてアル
カリセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１９４８
３号公報）が報告されているに過ぎず、いずれも工業的
発酵生産に適うものでは無かった。

ところが、鍛近、本発明者らは好アルカリ性微生物の一
種であるバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ−
）ＫＳＭ−６３５（ＦＥＢＭ　　Ｐ−８８７２）が、衣
料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーゼＫを
効率良く生産すること、及び更に培養条件を選択するこ
とにより、より高収率で、アルカリセルラーゼＫが得ら
れ、アルカリセルラーゼの工業的発酵生産が可能となる
ことを見出した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ｐＨをアルカ
リ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好
アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は
浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ
性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積さ
れておらず、工業的発酵生産を行うにあたっての培地調
製、培養方法が操作上の難点となっていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはかかる問題点を解決するためにアルカリ領
域に至適ｐＨを有するアルカリセルラーゼ或いは、アル
カリ領域に於いても、至適ｐＨに於ける最高活性に比較
しても高活性を維持し得るアルカリ耐性セル２−ゼを生
産する中性細菌を得べく、中性領域で生育する菌株を宿
主として、該当するセルラーゼ遺伝子をクローニングす
る、所謂遺伝子組換えの手段と併行し、自然界において
該細菌の探索を続けて来た。

そして、その結果、栃木県日光市の土壌から分離した菌
株は、アルカリ側においても充分作用を有し、且つ安定
性を保持する、所謂アルカリ耐性セルラーゼを産生ずる
ことを見出し１０本発明を完成した。

本発明において用いられる菌株は、次のような菌学的性
質を有する。なお、以下の分類同定において用いた培地
は次の通シである。

培地　１．肉エキス、１．０：バクトペデトン、ＬＯ：
ＮａＣｔ、０．５：パクト寒天、１．５（ｐＩ（７２）
（表示は、重量％；以下同じ） 培地　λ肉エキス、１．０：パクトペゾトン、１．０：
ＮａＣｔ、　０．５　（ｐＨ７，２）培地　λ肉エキス
、ｉ、ｏ；パクトペデトン、１．０；ＮａＣＡ　、　０
．５　：ゼラチン、１．０（ｐＨ７，２） 培地　４．バクトリトマスミルク、　１０．０培地　５
．バクトベゾトン、　ｌ、　Ｏ：　ＫＮＯｓ　、　０．
１培地　６．バクトペゾト７　、１．　Ｏ；ＮａＮＯｓ
　、　０．１培地７．　Ａり）”ブト７　、０．７　；
ＮａＣｔ、０．５　ニブドウ糖、α５　（ｐＨ７，０） 培地　＆バクトペデトン、１．０ 培地　９．ＴＳＩ寒天（栄研化学製）；指示量培地１０
．肉エキス、１．０：バクトペデトン、１．０：ＮａＣ
Ｌ　、　０．５　；可溶性澱粉、　０．２　；寒天、Ｌ
５ 培地１１．　ＮａＮＨａＨＰＯａ”４ＨｚＯ１０，１５
；　ＫＨｚＰＯｉ　＋０−１　；　Ｍｇ５Ｏａ　”　７
　ＨｘＯ１０−０２：クエン酸ナトリウム、α２５　（
り）Ｉ　６．８　）培地１ｚクリステンセン培地（栄研
化学製）；指示量 培地１３．シモンズ培地（栄研化学展）；指示量培地１
４．ブドウ糖、　１．　Ｏ；　ＫＨｉＰＯ４Ｈ０，１：
　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０、０，０５；ＫＣｌ、　０．０
２　；窒素源、０．１（窒素源は、硝酸ナトリウム及び
硫酸アンモニウムを用いｆｌ−）　（ｐＨ７，２） 培地１５．キングＡ培地“栄研′″（栄研化学製）；指
示量 培地１６．キングＢ培地“栄研′（栄研化学製）；指示
量 培地１７．尿素培地“栄研′″（栄研化学製）；指示量 培地１８．チトクローム−オキシダーゼ試験用ｐ紙（日
永製薬製） 培地１９．３％過酸化水素水 培地２０．ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社Ｉｆり：指示量
培地２１．　　（ＮＨ４）ＩＨＰＯ４、０，１；　ＫＣ
ｌ　、　０．０２　：ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ、０，０２
；酵母エキス。

０、０２　；パクト寒天、ＺＯ；ＢＣＰ（０，２％溶液
）　、　０．４ 培地２ｚパクト・サブロー・デキストロース寒天培地（
Ｄｉｆｃｏ社製）；指示量 培地２３．　　フェニルアラニン　マロン酸塩培地（日
永製薬社製）；指示量 培地２４．スキムミルク、５．０：バクト寒天、１．５
（菌学的性質）　　　″ （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、０．５〜０．８μｍ　Ｘ　１．０〜２
０μｍの桿菌であり、菌体の中央に卵円形の内生胞子（
０，５〜０．８μｍ　Ｘ　１．０〜１．２　）ｔｍ　）
を作る。鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

抗酸性はない。

（ｂ）　　各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養　（培地１） 生育状態は普通。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑又は波状である。又集落の色調は淡黄色半
透明で光沢はやや鈍い。

■肉汁寒天斜面培養　（培地１） 生育は普通であり、その状態は拡布状で光沢が有り、乳
白色半透明である。

■肉汁液体培養　（培地２） 生育する。表面生育があり、上層生育も認められる。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　（培地３） ゼラチンの液化が認められる°。

■リドマスミルク培地　（培地４） ミルクの液化は認められるが、リドマス色素の明確な変
化はない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．培地６）硝酸塩
の還元及び脱窒反応は陰性。

■ＭＲテスト　（培地７） 陽性。

■ｖｐテスト　（培地７） 陽性。

■インドールの生成　（培地８） 陰性。

■硫化水素の生成　（培地９） 陰性。

■澱粉の加水分解　（培地１０） 陰性。

■クエン酸の利用　（培地１１．培地１２．培地１３） コーサ培地及びシ七ンズ培地で、ともに陰性。

クリステンセン培地で陽性。

■無機窒素源の利用　Ｃ培地１４） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用しない。

■色素の生成　（培地１５．培地１６）ＫＩＮＧ−Ｂ培
地で黄色色素生成。

［相］ウレアーゼ　（培地１７） 陰性。

■オキシダーゼ　（培地１８） 陰性、陽性はつきシせず。

＠カタラーゼ　（培地１９．） 陽性。

［相］生育の範囲　（培地２） 生育の温度範囲は、１０〜５０℃、生育最適温度範囲は
２０〜４０℃ 生育のｐＨ範囲は、ｐＨ５〜１０であった。

■酸素に対する態度 好気性。

■Ｏ−Ｆテスト　（培地２０） 好気のみ生育。

［相］糖の利用性　（培地２１・）（＋：利用する、−
二利用しない） １、　　Ｌ−アラビノース　　　＋ ＺＤ−キシロース　　　　＋ ３．０−ゲルコース　　　　＋ ４、　０−マンノース　　　　＋ ５、　　Ｄ−７ラクトース　　　＋ ６、　０−ガラクトース　　　＋ Ｌ　麦芽糖　　　　　　　　十 ＆　ショ糖　　　　　　　十 ９、　乳糖　　　　　　　　　− １０、トレハロース　　　　　　＋ １１、　Ｄ−ソルビット　　　　　− １１．　　Ｄ−マンニット　　　　＋ １３、　　イノジット　　　　　　＋ １４、　　グリセリン　　　　　＋ １５、デ／デン　　　　　　　− ■ｖｐ培地に於けるｐＨ（培地７） ｐＨ５，０ ［相］食塩含有培地に於ける生育　（改変培地１）５％
で生育する。

７％で生育する。

１０嘩で生育する。

［相］ｐＨ５，７に於ける生育　（培地２２）生育する
。

＠フェニルアラニンの脱アミノ化（培地２３）陰性。

［相］カゼインの分解　（培地２４） 陽性。

以上の歯学的性質について、バーシーズ・マニュアル拳
オブ・ディタミネイティブ・ノ層りテリオロゾ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ訂）第８版及びザ拳
シーナス・バチルス（“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　’″、　Ｒｕｔｈ、　Ｅ−Ｇｏｒｄｏｎ著Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｍ４２７．
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　５ｅｒｖ
ｉｃｅ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆＡｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、　Ｃ
，（１９７３）　）を参照し比較、検索した結果、本発
明の菌株は、有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　）属の一種であると認められる。そして本菌株は
、最近、掘越と秋葉（“Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ″’　、　ＪａｐａｎＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｔｏ
ｋｙｏ）　、　１９８２年刊）の主張している、所謂好
アルカリ性（Ａｌｋａｌ−ｏｐｈｉｌｉｃ　）微生物が
ｐＨ８以上のアルカリ培地に於いて生育し、これ以下の
中性ｐＨ領域では生育出来ないのに対し、弱酸性領域か
らアルカリ領域（ｐＨ５〜１０）に於いて生育が可能で
ある事から、この好アルカリ性微生物とは明らかに異な
るものであり、一般的な中性で生育可能なバチルス属微
生物と判断できる。

更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較すると
、最も類縁の種としてバチルス−プミルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｉａ）が挙げられる。しかしながら
、゛公知のバチルス・プミルスに属する菌株と本菌株と
を比較すると、公知菌株は少なくともアルカリ耐性のセ
ルラーゼを産生じないので本発明者らは本菌株を新菌株
と判断し、バチルス　エスピー　ＫＳＭ−５９７と命名
して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−９５７３）。

本発明の菌株を用いてアルカリ耐性セルラーゼ、セルラ
ーゼに−５９７を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従って培養すれば良い。培地中には、資化し得る炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。この炭素源及び窒素源については特に制限はないが
、その例としては、窒素源として無機態の硝安、硫安、
塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソータヤ、コーンゲル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、−（ゾトン、ハイゾロ、アゾノ９ワー、コーン
ソイピーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベー
タ、アミフレックス及びアゾゾロン、ゼスト、アゾツク
スなどが挙げられる。

又、炭素源としては、籾殻、鉄、濾紙、−紋紙類、おが
屑などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチ
ルセルロース（ＣＭＣ）、アビセル、セルロース綿、キ
シラン、ペクテンに加、ｔ、貴化し得る炭素源、例えば
、アラビノース、キシロース、クルコース、マンノース
、７ラクトース、カラクトース、蔗糖、乳塘、トレハロ
ース、麦芽糖、ンルビトール、マンニトール、イノシト
ール、グリセリン、可溶性デンプンや資化し得る有機酸
、例えば酢酸、クエン酸等が挙げられる。また、その他
、リン酸、Ｍｇ　　、　Ｃａ”　、　Ｍｎ”　、　Ｚｎ
　　。

Ｃｏ”　、　Ｎａ”　、　Ｋ＋などの無機塩や、必要で
あれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加する
こともできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるセルラ
ーゼに−５９７の採取及び精裂け、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠心
分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得ることが出来る。この粗酵
素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応じ
て、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗
酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製
酵素として使用することも可能である。

斯くシて得られた本発明のアルカリセルラーゼに−５９
７は、以下に示す酵素学的性質を有する。。

なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行ない、
また用いた緩衝液は次の通りである。

ｐＨ３〜８　　　マクルベイン緩衝液 ｐＨ８〜１１　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０１！９ＣＭＣ（Ａ−０１Ｌ、山場国策）９ルデ社）
。

１００μｍｏｌ各種緩衝液（マクルペイン、リン酸、グ
リシン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９　ｍｌに０
、１−の酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反
応後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３゜５−　ｄｉ
ｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮ８
　）　）　　法にて還元糖の定量を行った。すなわち、
反応液１．０−にＤＮＳ試薬１．０　ｍを加え、５分間
、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４、Ｏｄの脱イオ
ン水を加えて希釈した。これを波長５３５　ｎｍで比色
定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｍ
ｏｌのゲルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を
１単位とした。

（２）　　ｐ−ニトロフエニルセロビオシド分解活性０
、１μｍｏｌ　ｐ−ニトロフエニルセロビオシド（シグ
マ社）、１００１００ｐリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を
含む反応液Ｌ〇−中に適当量の酵素液を３０℃で作用さ
せた後、Ｉ　Ｍ　Ｎａ＊ＣＯｓを０．３ｍ、脱イオン水
を１．７−順次加え、遊離するｐ−ニトロフェノールを
４００　ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上記の条件
下で１分間Ｋ１μｍｏｌのｐ−二トロフェノールを遊離
させる酵素量ｔ−１単位とした。

（３）　　アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セル
ロース、アルカリ膨潤セルロース、及び濾紙分解活性 ２０■アビセル（メルク社）、２００μｍｏｌ　リン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）を含む反応液２．０ｄ中に適当量
の酵素液を加え、３０℃、２５０ｒｐｍで振とうしなが
ら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃、３０００
ｒｐｍ、２０分）を行い、その上清１．０　ＩＩｔｔを
３．５−ジニトロ−サリチル酸（３゜５−　ｄｉｎｉｔ
ｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ　）　
）法にて還元糖の定量を行った。セルロース粉末分解活
性はセルロース粉末（東洋７紙社）を、リン酸膨潤セル
ロース及びアルカリ膨潤セルロース分解活性はトミタら
の方法（Ｔｏｍｉｔａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ　；Ｊ、Ｆｅｒ
ｍｅｎｔ。

Ｔｈｅｃｈｎｏｌ、、　５２．２３５　、１９７４　）
により処理したセルロースを、Ｆ紙分解活性は７紙（セ
ルラーゼ活性検定用７紙、東洋磁５１−特）をそれぞれ
用い、アピセラーゼ活性の時と・同様に行った。酵素力
価は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのゲルコース
に相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

（４）セロピアーゼ活性 １０ｑセロビオース（関東化学社）　、５０　μｍｏｌ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞を含む反応液１．　Ｏｍｌ
中に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃
、５分処理し酵素を失活させた後、生成ゲルコース量を
ムタロターゼ−ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔｅｓ
ｔ　、和光紬薬工業社）で測定した。酵素力価は、上記
の条件下で１分間に２μｍｏｌのゲルコースを生成する
酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）作用 セルロース、７紙、アビセル、ＣＭＣ等の繊維素によ〈
作用し、これらを溶解せしめ、ゲルコース等の還元糖を
生成する。

（２）基質特異性 本酵素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、
濾紙及びｐ−ニトロフエニルセロビオシドに対する活性
を有していた。

（３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１３と極めて広範囲にわたる。最
適ｐＨは、７であり、４．５〜１１，５の範囲に於いて
も至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有し
ており、過去に研究されたセルラーゼの中でも最もアル
カリ側で作用ｐＨ範囲が広い酵素と言えるＣ第１図）。

（４）　　ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性をｐ
Ｈ６で測定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果は、ｐＨ
５〜１１５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４，５〜１２
．５に於いても、約５０％以上の活性を維持していた。

本酵素は、このように高アルカリ領域に於いても充分に
安定である（第２図）。

（５）最適温度 ｐＨ６で活性測定をおこなったときの作用温度は、１５
〜８０℃の広範囲にわたり、その至適温度は６０℃であ
った。又、４５〜７５℃の範囲に於いても、至適温度で
の活性の５０％以上を有していた（第３図）。

（６）温度安定性 ３０分間各温度で処理（ｐＨ７）した後、至適ｐＨ（ｐ
Ｈ６）で残存活性を測定した結果、５０℃では安定して
おり、５５℃に於いても約５０％の残存活性を有してい
た（第４図）。

（７）分子量 本酵素をバイオゲルＰ−１５０（’　Ｂｌｏ−Ｇｅ１Ｐ
−１５０’″）によるゲル濾過法に基づき分子量を測定
したところ、約４．０万に主たるピークが観察された。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ａｔ。

Ｆｅ”　、　Ｂａ　　　、　Ｃａ　　、　Ｃｄ　　、　
Ｃｏ”　、　Ｃｕ”２＋ ２＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２＋Ｆｅ　　、Ｈｇ　　、Ｍｎ　　、Ｍ
ｇ　　、Ｎｉ　　、Ｐｂ　　。

Ｚｎ”　、　Ｋ”　、　Ｎａ”　）を活性測定時に共存
させて、その影響を検討した（各種金属イオン濃度は１
ｍＭ　、　Ｋ＋、　Ｎａ＋は５０ｍＭである）。

その結果、Ｈｇ”＋で阻害が、ＣＯ２＋により活性化が
認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳＳＡＳＳ　ＥＳ。

ＡＯ８，（１−８ＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエチ
レンセカンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼ
す影響を調べた。界面活性剤０．０５％を活性測定時に
共存させ、その影響を検討した。

その結果、何れの界面活性剤によってもほとんど阻害を
受けなかった。強力なデターゾエントであるジブイウム
・ドデシルサルフェートによっても活性の阻害はほとん
ど認められなかった。

（１０）　　プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノゲ社
）を、活性測定時に共存（０，１１１９／　ｍｌ　）さ
せてその影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対
しても強い耐性を有することがわかった。

（１１）　　キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ゼオ
ライト、トリ？リリン酸ソーダを活性測定時に共存させ
、その影響を検討したが、はとんど阻害は認められなか
った。

〔発明の効果〕

本発明のセルラーゼに−５９７は、至適ｐＨを７に有す
るにもかかわらず高アルカリのｐＨ１１．５においても
最適ｐＨの６０％以上の相対活性を有し、ｐＨ５〜１１
．５に於いて極めて安定である。また、界面活性剤、プ
ロテアーゼ、キレート剤等の洗浄剤配合成分によっても
ほとんど阻害を受けない。

したがって、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有
利に使用することができるものである。

また、本発明の菌株、バチルス　エスピーＫＳＭ−５９
７は中性で生育する菌株であるので、好アルカリ性細菌
と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを工業的に生産す
ることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県日光市の土壌を薬匙−杯（約ｏ、　ｓ　ｙ　）を
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上溝を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地２の液体培
地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠
心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、ｐＨ３
〜１３にて測定し、アルカリ耐性セルラーゼ生産菌をス
クリーニングした。

上述の方法により、本発明のバチルス　エスピー　　Ｋ
ＳＭ−５９７株（ＦＩＲＭ　Ｐ−９５７３）を取得する
ことが出来た。

培地１．ＣＭＣ２チ ？リペゾトン　　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ ＮａｚＨＰＯ４”　１２Ｈ２００，２５％ＭｇＳＯ４・
７）（，００，０２チ 寒天　　　　　　　　０．７５％ ｐＨ５，８ 培地２．　　ＣＭＣ１％ ぼりペプトン　　　　１− 酵母エキス　　　　　０．５％ ＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　Ｏ，１％Ｎａ＊ＨＰＯ４
”　１２　Ｈｌｏ　　　０．２５％ｐＨ６，８ 実施例２ 実施例１で得たバチルス　ニスｆ−ＫＳＭ−５９７を実
施例１の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を得
た。この粗酵素液ｌｔに対して、ドライアイス−エタノ
ール中で３Ｌのエタノールを加え、生じた沈澱を遠心分
離し更に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラーゼに
−５９７１ｏｔＣ比活性８単位／　’　；　ｐＨ９にお
ける測定値以下同じ）を得喪。

実施例３ 液体培地２においてＣＭＣを１ｔＩｂ蔗糖に、？リペデ
トンを７％Ｃ３Ｌ（コーン・スチーデ・リカー）に代え
た培地を用い、実施例２に準じて３０″Ｃで３日間振盪
培養した。得られた培養液の遠心分離上清についてその
ＣＭＣアーゼ活性を測定したところ３００単位／ｌであ
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素反応ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第２図は、酵素処理ｐＨと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリ耐性のセルラー
   ゼＫ−５９７。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、濾紙、アビ
   セル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、還
   元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他にも、リ ン酸膨潤セルロース、セルロース粉末、アビセル、濾紙
   及びｐ−ニトロフエニルセロビオシドに対する活性を有
   する。 （３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１３である。最適ｐＨは、７であ
   り、４．５〜１１．５の範囲に於いても至適ｐＨに於け
   る活性の５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１１．５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４．５
   〜１２．５に於いても、約５０％以上の活性を維持して
   いる。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜８０℃の広範囲にわた り、その至適温度は６０℃である。また、 ４５〜７５℃の範囲に於いても、至適温度での活性の５
   ０％以上を有している。 （６）分子量 約４．０万に分子量のピークを有する（バイオゲルＰ−
   １５０を用いたゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋で阻害され、Ｃｏ＾２＾＋により活性化さ
   れる。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル
   は、活性をほとんど阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリポリリン酸ソー ダ、ゼオライト、クエン酸は活性を阻害しない。 ２、バチルス属に属し、セルラーゼＫ−５９７生産性を
   有する微生物。