JPH034788A - アルカリセルラーゼ、これを産生する微生物及びアルカリセルラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼ及びこれを産生ずる
微生物に関する。

〔従来の技術〕

従来、繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、バイオマス
資源（特にセルロース資源）の有効利用を一大目標とし
て、進められてきており、多くの場合、カビ類にその供
給源を求めてきている。セルラーゼ生産菌として分離さ
れて来た菌株は、多種類にわたり、アスペルギルス属、
ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミ
コーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌（カビ）を中心
に、シュウトモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更にストレプトマイセス属
、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告されて
いる。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有する
、所謂アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼ
の存在は極めて少ないのが実情である。ここでアルカリ
セルラーゼとは、至適ｐＨがアルカリ領域にあるものを
言う。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生
産方法としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養に
よりセルラーゼＡを採取する方法（特公昭５０−２８５
１５号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細
菌を培養してアルカリセルラーゼ３０１Ａを生産する方
法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性
バチルスＮｏ、１１３９を培養してカルボキシメチルセ
ルラーゼを生産する方法（Ｐｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、、
　Ｋｕｃｌｏ、　Ｔ、　ａｎｄ　１ｌｏｒｉｋｏｓｈｉ
。

Ｋ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３
１．３３３９．（１９８５））及びストレプトマイセス
届の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（
特開昭６１１９４８３号公報）が報告されているに過ぎ
ず、しかもいずれも工業的発酵生産に適うものでは無か
った。

ところが最近、本発明者らは好アルカリ性細菌の一種で
あるバチルス・エスピー　に５Ｍ−６３５（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ−６３５，ＦＢＲＭ　［ＩＰ　
−１４８５、特開昭６３−１０９７７１号公報）が衣料
用洗浄剤配合成分として適したアルカリセルラーゼＫ（
特開昭６３−１０９７７６号公報）を収率良く生産する
こと及び更に培養条件を選択することにより、より生産
性が高まり、アルカリセルラーゼの工業的発酵生産が可
能となることを見出した。更に好アルカリ性菌によらず
とも、培養が容易な中性細菌によってもアルカリセルラ
ーゼ（特開昭６３−１３７６７７．２４０７８５．２４
０？７７．２４０７８６号公報、特開昭６４−３７２８
５号公報、　　３．　　ｌ（ａｗａｉ　　ｅｔ　　ａ＋
、　　八ｇｒｉｃ、　　Ｄｉａｌ、　　Ｃｈｅｍ、。

５２　、１４２５（１９８８））及びアルカリ耐性セル
ラーゼ（特開昭６３−１４１５８６．１４６７８６．２
７３４７４．２７３４７５．２７９７９０号公報、特開
昭６４−３７２８６号公報）を生産し得ることも見出さ
れている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、工業的発酵生産に適うアルカリセルラー
ゼの例は現在までのところ上記の例のみであり、更に様
々な特色を有するアルカリセルラーゼ及びその生産菌の
開発が望まれていた。

〔部類を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県那
須郡の土壌より採取したバチルス属に屈する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規なアル
カリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を完成
した。

従って、本発明は新規なアルカリセルラーゼ及びこれを
生産する微生物を提供するものである。

本発明のアルカリセルラーゼを生産する微生物は次のよ
うな菌学的性質を示す。なお、以下において菌株の分類
に用いた培地は次の培地１〜２１の２１種類であり、こ
れらは何れも別途滅菌した炭酸ナトリウム（Ｎａａ［１
，０３）を１．０重量％（以下単に％で示す）含有する
。

使用した培地の組成（表示は、％）： 培地１．　ニュートリエンドブロス、０．８バクト寒天
、１．５ 培地２．　二ニートリエンドブロス、０．８培地３．　
　二ニートリエンドブロス、０．８バクトゼラチン、２
０．０；バクト寒 天、１．５ 培地４．　バタトリトマスミルク、１０．５培地５．　
ニュートリエンドブロス、０．８；ＫＮＯ，、０，１ 培地６．　バタトベプトン、　０．７　　；　　ＮａＣ
ｊ！。

０．５；ブドウ糖、０．５ 培地７．　３ＩＭ寒天培地、指示量 培地８．　　ＴＳＩ寒天（栄研化学製）、指示量培地９
、　バタトペブトン、　１．５　；酵母エキス、０．５
；可溶性澱粉、２．０； ＬｔｌＰＯ−、０，１：　　Ｍｇ５Ｏ−・７＋１．０゜
０．０２　　；バクト寒天、１．５ 培地１０．　Ｋｏｓｅｒ培地、指示量 培地１１．　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地（栄研化学製
）。

指示ｍ 培地１２．■酵母エキス、　０．０５：　Ｎａ２ＳＯ４
゜０．１；にＨ２ＰＯ，、０，１；ブドウ糖。

１．０ ■酵母エキス、　０．０５：Ｎａ２ＳＯ４゜０．１；Ｋ
Ｈ□ＰＯ，、０，１；ブドウ糖。

１．０；　　ＣａＣ１２−２１１２０，０，０５；Ｍｎ
５Ｏ＝　・４〜６Ｎ２０．　０．００１；Ｆｅ５Ｏ＝　
・７Ｈ２０，０，０２ 窒素源としては、硝酸ナトリウム、 亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニ ラム及びリン酸アンモニウムを総 窒素含量として０．０４１２Ｎ％となる様に上記■及び
■の培地に加えて 用いた。

培地１３．キングＡ培地“栄研”　（栄研化学製）、指
示量 培地１４．キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）、指
示量 培地１５．尿素培地“栄研”　（栄研化学製）。

指示量 培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１７，３％過酸化水素水 培地１Ｂ、バクトベブトン、０．５゜ 酵母エキス、０．５；ブドウ糖。

１、Ｑ、　ＬＩＩＰＯ，、ｏ、ｔ； Ｍｇ５Ｏ＜・７１１２０．　０．０２ 培地１９．バタトベブトン、　２．７；　ＮａＣｌ。

５．５；　ブドウ糖、　　０．５；　ＫｌｈＰＯ，。

０．３；ブロムチモール　ブルー ０．０６；バクト寒天、１．５ 培地２０．　　（Ｎ１１４）２１１ＰＯ，、０，１；　
ＫＣｌ、　０．０２；Ｍｇ５Ｏ＜・７１１２０．０．０
２；酵母エキス。

０．０５；糖、１．０ 培地２１．　　カゼイン、Ｇ、５；　ノくクト寒天。

１．５：酵母エキス、０．５；ブドウ 糖、　１．０；　Ｋ２＋１ＰＯ，、０，１；Ｍｇ５Ｏ＜
・７１ｈＯ，０，０２ （菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは０．５〜１．２μｍｘ１．２〜５．０μ
ｍの桿菌であり、菌体の準端に楕円形の内生胞子（０，
７〜１．２μｍＸ１．２〜１．６μｍ）を作る。周鞭毛
を有し運′ＫＡＪｌ生力（ある。

ダラム染色は陽性。

０〕）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良好。集落の形状は不規則〕しであり、表面
は円滑、周縁は波状である。

又集落の色調は乳白色で光沢がある。

■肉汁液体培養（培地２） 生育は、良好。

■肉汁ゼラチン穿洞培谷（培地３） 生育は、良好。ゼラチンの液化が認められた。

■リドマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化が認められた。

ＩＪ　）マスの変色は培地がアルカリのため、判定でき
ない。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）硝酸塩の還元は
陽性。脱窒反応は陰性。

■ＭＲテスト（培地６） 陰性、陽性は判定できプよい。

■ＶＰテスト（培地６） 陽性。

■インドールの生成（培地７） 陰性。

■硫化水素の生成（培地８） 陰性。

■澱粉の加水分解く培地９） 陽性。

■クエン酸の利用（培地１０．１１） コーサ培地で陽性。クリステンセン培地では、陽性か陰
性か判定きない。

■無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、了ンモニ、ウム塩ともに利用する。

■色素の生成（培地１３．１４） キングＢ培地で黄色色素を生成する。

［株］ウレアーゼ（培地１５） 陰性。

■オキシダーゼ（培地１６） 陽性。

＠カタラーゼ（培地１７） 陽性。

■生育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は１５〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３７℃。生育のｐＨ範囲はρ１１７〜１１、生育最
適ｐＨはｐＨ１０，５であった。

■酸素に対する態度 好気性。

＠Ｏ−Ｆテスト（培地１９） アルカリ性のため変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

■糖の利用性（培地２０．十：生育する：生育せず） １、　　Ｌ−アラビノース　　　　　＋２、　　Ｄ−キ
シロース　　　　　　＋３、　　Ｄ−グルコース　　　
　　　＋４、　　Ｄ−マンノース　　　　　　＋５、　
　Ｄ−フラクトース　　　　　＋６、　　Ｄ−ガラクト
ース　　　　　＋７　麦芽糖　　　　　　　　　　十 ８、ショ糖　　　　　　　　　　　　十９、乳糖　　　
　　　＋ １０．トレハロース　　　　　　　　＋１１、　　Ｄ−
ソルビット　　　　　　　＋１２、　　Ｄ−マンニット
　　　　　　　＋１３、イノジット １４、グリセリン　　　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　　　　十〇食塩含有培地
に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が７％で生育し、１０％で生育しない。

■カゼインの分解（培地２１） 陽性。

［相］Ｇ＋Ｃ含量（Ｔｍ法） 本発明にかかる菌のＤＮＡのＧ十〇含量は、約３７．６
ｍｏ１％である。

以」二の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ
・マニュアル・オブ・システィマティク・バクテリオロ
ジ−（［］ｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
　）第　２巻およびザ・ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ
Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ　、　Ｂ、
Ｇｏｒｄｏｎ。

八ｇｒ＋ｃｕｌｔｕｒｅ　　１ｌａｎｄｂｏｏｋ　　Ｎ
α４２７．八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ
　５ｅｒｖｉｃｅ、　ＩＩ、　Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｎ　　Ｄ、　　Ｃ１（１９７３））　　を参照し、
比較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ａの一種テあると認められる。

しかし、本菌株は中性領域では生育できず、専らアルカ
リ領域で良好な生育を示すことから、最近、１ｌｏｒｉ
ｋｏｓｉと＾ｋｉｂａ　　（”Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉ
ｃ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＪａｐａｎ　５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉａｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｔｏｋ
ｙｏ）。

１９８２年刊）の主張している、所謂好アルカリ性（八
１ｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）細菌に属し、従来の中性で生
育するバチルス属細菌と区別される。

そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカリ
性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌
株と判断して、バチルス・エスピーに５Ｍ−５２０と命
名し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄
第１０４８３号（Ｆ口ＲＭ　Ｐ−１０４８３）として寄
託した。

本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、上記の好アル
カリ性バチルス・エスピーＫＳＭ−５２０（Ｅｌｌ！１
１Ｍ　Ｐ−１０４８３）及びこれより誘導された高力価
の当該酵素生産性を有する各種突然変異株を用いる発酵
法により製造することができる。

上記の菌株を用いて本発明のアルカリセルラーゼを得る
には、適当な培地に該菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培養培地としては、資化し得る窒素源と炭
素源を適宜組み合わせて含有せしめたものが使用される
。この炭素源及び窒素源については、特に制限はない。

例えば、窒素源としては、硝安、硫安、塩安、リン酸ア
ンモニウム、硝酸ソーダ、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ヘフトン
、バイブロ、アジパワー、コーンソイビーンミール、コ
ーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アジブロン、ゼ
ストなどがまた、炭素源としては、籾殻、麩、池紙、般
紙類、おが屑等の植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、ＣＭＣ
、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、リボ
ース、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノ
ース、フラクトース、ガラクトース、麦芽糖、蔗糖、乳
糖、トレハロース、マンニット、ソルビット、グリセリ
ン、澱粉、酢酸、クエン酸なとが挙げられる。その他に
、リン酸、Ｎ　ｇ　ｘ　＋　、　Ｃａ　２“Ｍｎ２＋、
　ｌｎ２°、　Ｃｏ”、　Ｎａ”、　Ｋ＋などの無機塩
や、必要であれば、無機、有機微蚤栄養源を添加するこ
ともできる。

斯くして得られた培養物からの目的物質であるアルカリ
セルラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精
製の手段に檗じて行うことができる。即ち、遠心分離又
は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養物から
除去して粗酵素液を得るこ゛とができる。この粗酵素液
は、そのまま使用することもてきるが、必要に応じて塩
析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を
得、さらに公知の方法により精製結晶化して、精製酵素
として使用することも可能である。

次に、斯くして得られる本発明の提供する新規酵素、ア
ルカリセルラーゼに−５２０の酵素学的性質について説
明する。

なお酵素活性の測定は、以下の方法に従って行った。

（１）ＣＭＣアーゼ活性 ２．５％ＣＭＣ（サンローズＡＯＩＬ　、南陽国策パル
プ社製）’０．４ｍｆ、５００１　グリシン緩衝液（ｐ
ｆ１９　）　０．２　ｍｌ、及び脱イオン水０．３ｄか
らなる基質溶液に酵素液０．１ｍｅを加え、３０℃で２
０分間反応させた。反応後、３゜５−ジニトロ−サリチ
ル酸（３，５ ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（Ｄ
ＮＳ　））法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応
液１．０−にＤＮＳ試薬１．０ｍｇを加え、５分間、１
００℃で加熱発色させ、冷却後４．０ｍｊ！の脱イオン
水を加えて希釈し、波長５３５ｎｍで比色定量した。

酵素の力価は、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当
する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

尚、用いた緩衝液は、次の通りである。

ｐＨ３〜８　　　マクイルパイン緩衝液ｐ］１８〜１１
　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 ｐＨ１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 （２）　ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロ
フェニルセロビオシド分解活性 ０．８μｍｏｌ　ｐ−二トロフェニルセ口ビオシド（シ
グマ社製）又はｐ−ニトロフェニルグルコシド（シグマ
社製）と５０μｍｏｌ　　リン酸暖衡液（ｐＨ７，０）
又は、１００　μｍｏｌグリシン緩衝液（ｐＨ９）とを
含有する反応液１．Ｏｄ中に適当量の酵素液を３０℃で
作用させた後、ｌ　Ｍ　１ｌａｚｃＯ＊を０．４−加え
、遊離するｐ−ニトロフェノールを４１０ｎｍで比色定
量した。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロ
フェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末、リン酸Ｗ潤セルロー
ス、アルカリ膨潤セルロース及ヒ濾紙分解活性 １０＋Ｉ１ｇアビセル（メルク社製）及び、１００μｍ
ｏｌグリシン緩衝液（ｐｆ１９）を含有する反応液１．
０−中に適当量の酵素を加え、３０℃で２８　Ｏｒｐｍ
で振盪しながら反応させた。反応後、ＤＮＳ法にて還元
糖の定量を行った。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌの
グルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位
とした。

その他の活性も、上記の方法に準じて行った。基質とし
ては、東洋濾紙社製のセルロース粉末、セルラーゼ活性
検定用濾紙（東洋Ｎ［ＬＳＩ−特）及び、富国等の方法
（Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ。

ａｔ　ａｌ、、：　Ｊ、Ｆｅｒｍａｎｔ、　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ、、　５２．２３５゜１９７４）に従って処理した
アルカＩＪ　Ｏｇ潤セルロース、リン酸膨潤セルロース
を使用した。

（４）β−１，３−；１，４−グルカナーゼ、β−１，
３−グルカナーゼ活性 β−１，３−；１，４−グルカナーゼ、β−１，３−グ
ルカナーゼ活性は、基質としてリケナン（ｆｒｏｍ　Ｌ
ｌｓｎｅｒａ　ｂａｒｕｂａｔａ、　　シグマ社製）及
びラミナリン（ｆｒｏｍ　Ｌ濾紙ｉｎａｒｉａｄｉｇｉ
ｔａｔａ、　　シグマ社製）を用いて、（３）　ニ４’
ｔじて活性を測定した。

（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ、セルロース粉末、アビセル等の礒維素によ（作
用し、これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。

（２）基質特異性 本酵素の基質特異性の一例を第１表に示した。本酵素は
、ＣＭＣの他にも、ラミナリン、リケナン、１１紙、ｐ
−ニトロフェニルグルコシ）’　及ヒＩ）−二トロフェ
ニルセ口ビオシドに対して若干の活性を有していた。

第１表 本ｐ−ニトロフェニルセロビオシド 本本ｐ−ニトロフェニルグルコシド （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ ＣＭＣに対する作用ｐＨ範囲は、３〜１３．０と広範囲
であり、至適作用ｐＨは、８．５〜９．５である。また
、７．０〜１１．０の範囲に於いても至適ｐＨに於ける
活性の５０％以上の相対活性を有する（第１図）。

（４）ｐＨ安定性 それぞれのｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性
を測定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ρ１１６．
０〜１１．０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ５．０〜
１１．５に於いても約５０％以上の活性を維持する（第
２図）。

（５）作用温度及び至適温度 本酵素は、１０〜７５℃の広範囲で作用し、その至適温
度は、５０℃である。又、３５〜６０℃の範囲に於いて
も至適温度での活性の５０％以上を有する（第３図）。

（６）温度安定性 グリシン−Ｎａ叶緩衝液（ｐＨ９．０）中、各温度で１
０分間加熱処理後の残存活性を測定した結果、本酵素は
、４０℃でもほとんど失活せず、５０℃に於いても約５
０％の残存活性を有していた（第４図）。

（７）分子量 本酵素は、セファクリルＳ−３００（ファルマシア製）
を用いたゲル濾過法によれば、約１７±１万及び８．０
±０．２万にピークををする。

（８）金属イオンの影響 各種金属イオン（Ｎａ＋，　Ｋ”　、　Ｃａ”、　Ｃｕ
”Ｃｏ”、　Ｃｄ”、　ＭＴ＋”、　Ｍｇ”、　Ｄａ”
、　Ｎｉ”、　ｌ１ｇ”ｐｅ２＋，　Ｐｂ”、　ｌｎ２
＋．　ＡＩ”、　Ｐｅ３（−、　）を活性測定時に共存
させてその影響を検討した結果、ｌ　ｇ２　＋、Ｃｄ”
、Ｐｂ”　（各１　ｍＭ）の添加は、阻害効果を与え、
Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋（　１　ｍＭ）の添加は、活性化効
果を与えた。

（９）界面活性剤の影響 本酵素は、００５％の各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ
　、＾Ｓ，　ＥＳ，八〇Ｓ　、　ＳへＳ，石鹸、ポリオ
キシエチレンセカンダリ−アルキルエーテル）の酵素活
性の阻害は認められなかった。

０１プロテアーゼの彩り 洗剤用プロテアーゼ、例えば、八ＰＩ−２１（昭和電工
）、マクサターゼ（ＩＢＩｓ）　、サビナーゼ、アルカ
ラーゼ、エスペラーゼ（ノボ）を活性測定時に共存（０
．　２ＡＵ＃　）させ、そ・の影響を調べたところ、何
れのプロテアーゼに対しても強い耐性を有することが判
った。

００キレート剤の影響 キレート剤である［ｉＤＴＡ，　ＩＥＧＴ八、トリポリ
リン酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸等を活性測定時に
共存させ、その影響を検討したが、阻害は認められなか
った。

〔発明の効果〕

本発明のセルラーゼは、アルカリ側に至適ｐＨををし、
広いｐＨ範囲に於いて安定な新規のアルカリセルラーゼ
である。更に、本酵素は、界面活性剤、プロテアーゼ、
キレート剤等の洗浄剤配合成分によっても殆ど阻害を受
けず、洗浄剤組成物の配合成分として有利に使用するこ
とができるものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県那須郡の土壌薬匙−杯（約０．５ｇ）を滅菌生理
食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した。この熱
処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培地
Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養
し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣ’の溶解に
基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣアーゼ生
産菌を取得した。更に、取得菌をｊ８地Ｂの液体培地に
接種し、３０℃で３日間振の培養した。培養後、遠心分
離した上清液について、ＣＭＣアーゼ活性をｐＨ３〜１
３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌を選択した。

上述の方法により、本発明のに５Ｍ−５２０菌（Ｆ［！
ＲＭ　Ｐ−１０４８３）を取得することができた。

培地Ａ、ＣＭＣ２％ ポリペプトン　　　０．５　　％ 酵母エキス　　　　０，５　　％ ＫＩｌ、ＰＯ，Ｏ，ｌ　　％ Ｍｇ５Ｏ＝　・７１１ｚυ　　　Ｄ、　０２　　％Ｎａ
２ＣＯ−０，８％ 寒天　　　　　　　ｏ、７５　　％ ｐ＋−＋約１０ 培地Ｂ、　　ＣＭＣ１％ 肉エキス　　　　　１．５　　％ 酵母エキス　　　　０．５　　％ ＫＩｌ、ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＣＯ，０，５％ ｐＨ約１０ 実施例２ 実施例１で得たバチルス・エスピーＫＳＭ５２０菌を実
施例１の液体培地Ｂに接種し、３０℃で３日間振盪培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵累液とし
た。更に、通常の方法に従って、エタノール乾煙粉末と
し、セルラーゼ酵素標品（第２表）を得ることが出来た
。

以下余白 第２表 第１図 （酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である。）実施例３ 実施例１の液体培地已に於いて、ＣＭＣに代えてセロビ
オースを１％、ポリペプトンに代えてＣ６Ｌを５％添加
した培地に、ＫＳＭ５２０菌を接種し、３０℃で２乃至
３日間振盪培養した。遠心分離上清についてＣＭＣアー
ゼ活性を測定した結果、３５４２Ｕ／１のＣＭＣアーゼ
活性が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアルカリセルラーゼのＣＭＣに対す
る反応ρ■と相対活性との関係を示す図面、第２図は、
Ｃ肛に対する処理ｐＨと残存活性との関係を示す図面、
第３図は、本発明アルカリセルラーゼの反応温度と相対
活性との関係を示す図面、第４図は、処理温度と残存活
性との関係を示す図面である。 ８１０ 反応ｐＨ ２ ４ 第２図 処１１ｐＨ 手続補正１「（自発） 第３図 Ｃ％） ０　１０　２０　３０　４０　５０　６０　７０　８０
反応１度　（＠Ｃ） 第４図 （％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次の物理化学的性質を有するアルカリセルラーゼに
   −５２０。 １）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、
   濾紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解
   せしめ、還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
   ス、アルカリ膨潤セルロース、アビセル、濾紙、ｐ−ニ
   トロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロフェニルセロビ
   オシドに対する活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ ＣＭＣに対する作用ｐＨ範囲は３〜１３．０である。至
   適ｐＨは８．５〜９．５であり、７．０〜１１．０の範
   囲においても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対
   活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ＣＭＣを基質とした場合、ｐＨ６．０〜１１．０で極め
   て安定で失活せず、ｐＨ５〜１１．５においても、約５
   ０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 ＣＭＣに対する作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわた
   り、その至適温度は、５０℃である。又、３５〜６０℃
   の範囲に於いても、至適温度での活性の５０％以上を有
   する。 （６）分子量 ＣＭＣを基質とした場合、約１７±１万及び８．０±０
   ．２万（バイオゲルＡ０．５ｍを用いたゲル濾過法によ
   る）。 （７）金属イオンの影響 ＣＭＣを基質とした場合、Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋
   、Ｐｂ＾２＾＋、により阻害され、Ｃｏ＾２＾＋、Ｍｎ
   ＾２＾＋により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、直鎖アルキルベンテンスルホ
   ン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル
   スルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、二級アル
   カンスルホン酸塩、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダ
   リーアルキルエーテルは活性を殆ど阻害しない。 （９）プロテアーゼの影響 ＣＭＣを基質とした場合、プロテアーゼに対して耐性を
   有する。 （１０）キレート剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン
   酸、トリポリリン酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害し
   ない。 ２　バチルス属に属し、アルカリ培地で生育するアルカ
   リセルラーゼに−５２０生産菌。３　バチルス・エスピ
   ー（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｓｐ．）ＫＳＭ−５２０と命
   名され、微工研菌寄第１０４８３号として寄託された請
   求項２記載のアルカリセルラーゼＫ−５２０生産菌。