JPH01115962A - 色素原基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、加水分解酵素検出用色素原基質と、これら色
素原基質の製造方法および色素原基質の使用に関する。

加水分解酵素、いわゆるヒドロラーゼは動物において多
くの反応を担っている。その際、それらの特異性に従っ
て様々な機能を有する・・イドロラーゼ間で区別がなさ
れている： ｔ　カルゼニルエステルを加水分解するエステラーゼ、
例えばアセチルコリンエステラーゼ、 ２　糖相互間または糖とアルコールとの〇−グリコシＰ
結合を加水分解するグリコシダーゼ、例えばβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、＆　燐酸エステルを加水分解するホス
ファターゼ、例えばアルカリ性ホスファターゼ、および ４、硫酸エステルを加水分解するスルファターゼ、例え
ばイズロネートスルファターゼ。

ヒドロラーゼは動物の最も重要な酵素に属する。それら
の不存在、または減少または増加がおこると、しばしば
生物の重篤な病気を示す。

既知の例がムコ多糖類症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｏｓｉｓ　）である；この劣性遺伝する病気に
は７つの異なる発症形態が区別されているがこれは遺伝
的に決定されるヒドロラーゼ欠陥、例えばモルキオ病に
あってはβ−がラクトシダーゼ、およびハンター病にあ
ってはイズロネートサルフエート（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ
　５ｕｌｆａｔｅ）スルファターゼの欠陥に基づいてい
る。例えばモルキオ病は線維芽細胞または白血球のβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼレベルの測定によりはっきりと診
断できる。血中または尿中のもう一つのグリコシダーゼ
であるアミラーゼのレベルは、膵臓病の診断に用いられ
る。

更に加水分解酵素は診断助剤、いわゆるマーカー、とし
て例えば酵素免疫学的測定法に用いられる。

診断目的のための加水分解酵素定量の条件は、低濃度の
酵素であっても正確に測定できるように感度および特異
性が高い検出系であることである。天然基質はこの検出
に向いていない。何故ならば、試験実施前であっても検
体中に加水分解生成物が存在し、あるいは加水分解生成
物の測定が極めて困難だからである。従って従来技術に
おいては、合成基質が用いられ、その加水分解生成物は
、物理的または化学的に検出することができる。検出は
一般に、加水分解反応中に遊離された螢光または高吸収
性色素原物質の量を測定することにより行われる。はぼ
普遍的に適用でき、従ってしばしば用いられる色素原糸
はｐ−ニトロフェノールのそれである。しかしながら、
その極めて声に左右される黄色の発色は、光度計による
評価に対してさえ問題なしとせず、また視覚による評価
にも適していない。螢光態検出系、例えばフルオレセイ
ン類またはメチルウンベリフェロン類は視覚によっては
全く検出できず、機器を以ってしかできない。

またその他の色素原基質、例えば欧州特許１５６．３４
７号に記載されているようなフェノキサジン類および欧
州特許１５７，３８４号に記載されているようなフェノ
チアジン類は結合状態で既に相当な固有吸収を有してい
る。更に、その他の基質、例えばフェノール誘導体およ
びナフトール誘導体およびインドキシルも、その色素原
分子基を着色化合物に変えるには、加水分解反応後に更
なる化学反応を必要とする。更に１多くの色素原基質は
、アルカリ性−範囲において加水分解酵素の測定に使用
できるに過ぎない。

従って本発明の目的は、それらの加水分解に上り一範囲
に拘らず高感度および高特異性の測定信号を与える加水
分解酵素を検出するための色素原基質を提供することに
ある。

本発明によると、この目的は、色素原基質を次の一般式
： ％式％（） 〔ここで式中ＡはＮ、Ｓおよび０より成る群よりの３個
までのへテロ原子を有する環状で５−またはる−員の所
望によりベンゾ縮合しうるラジカルを表わし、セして該
う・クカルは所望によりハロゲン、ニトロ、アルキル、
アルコキシまたはスルホネート基により置換されていて
もよく、Ｂは所望によりハロゲン、アルキル、アルコキ
シ、ジアルキルアミノまたはモルホリノ基により置換さ
れていてもよい芳香族または複素環系例えばフェニル、
ピリジニル、ナフチルまたはキノリニルであり、ハロゲ
ンとは塩素、臭素または沃素ラジカル、好ましくは塩素
または臭素ラジカルを表わし、またアルキルまたはアル
コキシ基とは１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個
の炭素原子を有する鎖を含みモしてＲはカルダニルラジ
カルを除く酵素加水分解により遊離され得るラジカルで
ある〕 で示されるアゾ色素化合物によって達成される。

特に好ましい態様においては、Ｒとしては修飾されたま
たは未修飾の糖ラジカル、ホスフェートラジカルまたは
サルフェートラジカルが用いられる。

驚くべきことに、本発明によるアゾ色素化合物は、選択
されたラジカルＲに依存して様々な特異性を有するヒＰ
ロラーゼと反応し、そしてアルカリ性および酸性−範囲
において視覚的にも光度計的にも測定できる色の変化を
示し、また酸性声範囲における色の変化はコンプレック
ス形成により顕著に増感できることを見出した。

与えられた一般式の色素原アゾ色素化合物を白血球エス
テラーゼ検出に用いることは既に西独特許出願公開２，
８５６，６４４において公知であるがそこでの基質は、
専らカルゼニルエステラーゼに対するもので、ラジカル
Ｒはカルゼン酸ラジカル、またはベプチＰ化学において
慣用の窒素保護基を備えたアミノ酸もしくはペプチドラ
ジカルを表わす。更に、これらアゾ色素化合物に対して
は、アルカリ住戸範囲における使用しか記載されていな
い。

次の一般式 ％式％（） における基ＡおよびＢを適切に選択することにより、特
定の分析課題に対して註文生産の（ｔａｉｌｏｒ−ｍａ
ｄｅ）基質を用意することができる。ここでＡはＮ、　
Ｓおよび０より成る群よりの３個までのへテロ原子′を
有する環状で５−または６員の、所望によりベンゾ縮合
したラジカルであってもよく、また該ラジカルは所望に
よりハロゲン、ニトロ、アルキル、アルコキシマタハス
ルホネート基により置換されていてもよ＜、−方、Ｂは
所望によりハロゲン、アルキル、アルコキシ、ジアルキ
ルアミノまたはモルホリノ基により置換されていてもよ
い芳香族または複素環系例えばフェニル、ピリジニル、
ナフチルまたはキノリニルであってもよい。その際、ハ
ロゲンラジカルは塩素、臭素または沃素ラジカル、好ま
しくは塩素または臭素ラジカルであり：アルキルまたは
アルコキシ基は１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３
個の炭素原子を有する鎖を含む。基ＡおよびＢの選択に
如何によって遊離色素原は高い色強度、すなわち習いモ
ル収光係数を有し、従って高感度酵素アッセイが可能と
なる。ここで特に好ましいアゾ色素は色素原基質を表わ
す化合物、すなわち結合された色素原は可及的にわずか
な色しか有しないが、遊離色素原、すなわち加水分解に
よりアゾ色素化合物から遊離されたアゾ色素は極めて濃
く着色されたものである。例えば、加水分解反応により
赤紫〜青色の遊離色素原を与える無色〜クリーム色のが
ラクトシトを調製することができる。

本発明の好ましい色素原基質では更に、結合色素原と遊
離色素原の吸収スペクトルの重なりを可及的に小さくす
る。色素原基質の溶解度は、基ＡおよびＢの選択に大き
く依存し、かつ色素原基質の使用目的に応じて極めて異
なる要件が課せられるもう一つのパラメータである。こ
のように、反応の定量が光度計による場合には、色素原
基質および遊離色素原の水性媒質における良好な溶解度
が要求されるのに対し、例えば紙またはフィルムに固定
後の担体結合色素原基質は、水性溶液における色のＫじ
み出しくｂｌｅｅｄｉｎｇ）を抑えるために、水性媒質
中の溶解度が低い色素原を特徴とする 特に好ましいのは、加水分解後に、適当な金属イオンと
のコンプレックス形成による深色的色シフトを示す色素
原を与える色素原基質である。

特に適切な色素原基質は前記一般式〔ここで式中 ＼　／ Ａ−は、Ｎ＝Ｃ−構造（ここで式中、示された炭素原子
はりアゾ基に結合したＡの構成分である）を含み、また ＼　　／ −Ｂ（ＯＲ）は、−０１＝０２−ＯＲ構造（ここで式中
、示された炭素原子ｃ１はジアゾ基に結合したＢの構成
分である）を含み、そして ＡＸＢおよびＲは特許請求の範囲の請求項１または２に
与えられた意味を有する〕で示される基質である。

コンプレックス形成たよる吸収の変化によって、これら
の基質は色素原基質の加水分解により達成され得る効果
を超える効果を有する。この効果は注目すべきことに、
酸性およびアルカリ性用範囲の両方において得られる。

特に好ましいアゾ色素は次のとおりである。

５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フェノール ベンゾチアゾール−２−ア／−４’−フェノール６−ニ
ドロペンゾチアゾールー２−アゾ−４’−フエノール チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オール ４，５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２１−ピリジ
ン−３１−オール ６−ニトキシペンゾチアゾールー２−アゾ−２′−ピリ
ジン−３′−オール 嘩 ベンゾチアゾール−２−アゾ−２′−ピ１ノジンー３′
−オール ５−ブロモチアゾール−２−アゾ−２′−ピ１ノジンー
３′−オール ５−クロロチアゾール−２−アゾ−２７−（４／−メチ
ルフェノール） チアゾール−２−アゾ−６’−（２’−ブロモ−３′−
ヒドロキシピリジン） ４．５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−６′−（２′
−ブロモ−３′−ヒｒ口キシヒリ−）ン）６−ニトキシ
ペンゾチアゾールー２−アゾ−６’−（２’−ブロモ−
３′−ヒドロキシピ１」ジン）４′−シアノピラゾール
−３−アゾ−２／−（４／　−メトキシフェノール） ５−ニトロフェニルスルホニル？７：、’−ルー２−ア
ゾー２’−（４’−メチルフェノール）４．５−−／メ
チルチアゾールー２−アゾー２′−（ｓ’−クロロ−３
′−ヒドロキシピリジン）チアゾール−２−アゾ−２／
　−（４／−モルホリノフェノール）。

本発明による前記一般式の化合物を製造するには、所望
とする特定の基ＡおよびＢを有するアゾ色素をまず自体
知られた方法で文献に知られた方法により製造する。慣
用される製造方法の例および文献は、例えば、Ｕｌｌｍ
ａｎｎｓ　Ｅｎｚｙｋｌｏ−ｐａｄｉｅ　ｄｅｒ　Ｔｅ
ｃｈｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　（ウルマンの工業
化学エンサイクロペディア）、第４版、ＶｅｒｌａｇＣ
ｈｅｍｉｅ　、第８巻、２４４頁に見られる。

ホスファターゼおよびスルファターゼ検出用の色素原基
質は、相当するアゾ色素を適当な酸ハライドと反応させ
ることにより製造できる。

ホスファターゼ基質を製造するにはアゾ色素を通常オキ
シ塩化燐と反応させ、一方スル７アターゼ基質の製造に
はアゾ色素をクロロスルホン酸と反応させる。

グリコシＰの製造には、これも同じく知られた方法によ
りアゾ色素をグリコジル化する。β−ガラクトシｒは、
例えば相当するアゾ色素なα−Ｄ−アセトブロモガラク
トースと反応させ、次いで脱アセチルすることにより製
造できる。

グリコジル化方法は、例えば、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　
Ｃｈｅｍｉｅ９８（１９８６）２１５〜２３６頁および
そこに引用されている文献に記載されている。前述の方
法により得られるグリコシドの例は例えばα−およびβ
−Ｄ−ガラクトピラノシド、α−およびβ−Ｄ−グルコ
ピラノシｒ１およびそれらより誘導される２〜１０、好
ましくは３〜７単糖類単位を有するオリ！糖類誘導体で
ある。

本発明による色素原基質は、様々な加水分解酵素、例え
ばホスファターゼ、スルファターゼおよびグリコシダー
ゼの検出に用いられる。酵素検出にあたっては、色素原
基質は、適切な場合には必要な緩衝物質、安定剤、活性
化剤、可溶化剤、補助酵素またはその他の補助薬品を含
んでいてもよい試薬混合物中に提供される。それらの安
定性および化学的相客性が十分な場合、様々な個々の薬
品を溶液中に併存させてよいが、それらは検出反応直前
にはじめて相互に混合してもよい。次に、加水分解活性
酵素の実際の検出はその試薬混合物を検出されるべき加
水分解酵素または試験されるべき生物学的検体と合体後
に相当するアゾ色素化合物から、酵素触媒加水分解によ
り遊離したアゾ色素の吸光度を測定することによって行
われる。この場合、溶液中での反応が好ましく、また適
切な場合には、直接セル内で行い次いで透過光度測定法
（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｐｈｏ　ｔｏｍｅ　ｔｒｙ）
による信号の記録によって直ちに評価することができる
。反応が行われた後反射光度測定法による信号の記録を
可能にする繊維様またはフィルム様試薬担体に本発明の
色素原基質を適用することも好ましい。いずれの場合に
も、本発明による色素原基質を用いるときは、視覚によ
る評価も可能である。

本発明による色素原基質は、様々な形態で提供すること
ができる。本発明による色素原基質と試験に必要な付加
的試薬との組合せを既に含んでいる態様が好ましい。こ
れらの例としては、検出反応を後で溶液中で行う場合に
は、溶液、試薬錠剤、凍結乾燥物の粉末混合物である。

あるいはまた色素原基質は、試験に必要な付加的試薬と
共に１吸収剤担体上に吸収させるかまたは水分を吸収す
る親水性フィルムに取込むこともできる。

本発明を以下図面および実施例によって説明する。

第１図は、色素原基質、すなわちチアゾール−２−アゾ
−２′−ピリジン−３′−オール（ｔａｐ）、の吸収極
大の変化を示している。

ここで３７６　ｎｍ　Ｉｃおけるピーク（スペクトル１
）はアゾ色素ガラクトシｒに相当し、４６８ｎｍにおけ
る吸収極大（スペクトル２）は遊離色素原に相当し、そ
して最後に、５２６ｎｍにおける吸収極大（スペクトル
３）は遊離色素原の銅コンプレックスに相当する。がラ
クトンＰおよび銅コンプレックスのスペクトル比較は、
相当する吸収曲線が重なりあわないことをはっきりと示
している。

実施例　１ チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３７−オール
（ｔａｐ）の製造 ジアゾ化： ５ｔ（５０ミリモル）の２−アミノチアゾールを７５−
〇力濃塩酸に溶解した。３０ｄの亜硝酸ナトリウム溶液
（１１７ｆ＃＝１．７モル／Ｊ）を０〜４℃で３０分間
かけて攪拌下に滴下して加えた。添加終了後、反応混合
物を３０分間攪拌した。

カップリング： ４．３１（４５ミリモル）の３−ヒドロキシピリジンを
５００　ｄの０．１Ｍ　ＮａＯＨＫ溶解し、ソシテソの
溶液な角氷で０〜５℃に冷却した。カップリング終了ま
でこの温度を保った。

−を調節しながら同様に冷却されたジアゾニウム塩をビ
リジノール溶液に滴下して加えた。

１０Ｍ水酸化す）　ＩＪウム溶液を滴下しながら加える
ことによりカップリング中の−を−７〜−１０に保った
。

単　離： カップリング終了後、その溶液を濃塩酸で−３とし、そ
して形成された沈殿を吸引濾過しそして五酸化燐を用い
てデシケータ中で真空乾燥した。

精　製： 粉砕後に、乾燥粗生成物をソックスレー装置中、１１の
トルエンを用いて抽出した。フラスコ中に晶析したｔａ
ｐを吸引戸去し、そして適切な場合には、トルエンおよ
び／または水から数回再結晶する。徐冷すると赤褐色針
状晶が形成された。

精製後の収量はｔａｐ約１．５ｆであった。

確認： 得られた生成物を薄層クロマトグラフィ、融点測定およ
びＮＭＲ分光法により確認した。

Ａ：薄層クロマトグラフィ：移動相クロロホルム／メタ
ノール（９０／１０）、メルク社製シリカゲルプレート
；Ｒｆ値０．３８゜Ｂ：融点測定は分解を伴つ１７０℃
を超える融点を示した。

Ｃ：ＮＭＲ分光法：ｍＥスペクトルは次のピークを有す
る。

１、　８．４　ｐｐｍに５とカップルしたダブレット。

２、　８．２　ｐｐｍに４とカップルしたダブレット。

３、　８．１　／８．２　ｐｐｍに５とカップルしたダ
シレット。

４、　７．９　ｐｐｍに２とカップルしたダブレット。

５、　７．５／７．６　ｐｐｍに１および３とカップル
したクアドラプレット。

６、　　１．５〜５．５ｐｐｍにいくつかの個々のピー
ク。

積分曲線によれば、各位置は水素原子を表わす。

実施例　２ ５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フェノ−／ｌ
／　（ｎｉｔｒｏｔａｐｈ）の製造ジアゾ化： ３、（Ｈ’（２０ミリモル）の２−アミノ−５−ニトロ
チアゾールをゆるやかに加温しながら、４０ｄの５０チ
強度硫酸に溶解した。暗褐色溶液を温度制御可能な二重
壁反応容器中で一２０′ＣＫ冷却した。この温度はりア
ゾ化の間係たれ、また、約２０分間を要する７　ｆ　（
２０ミＩＪモル）のニトロ硫酸の添加中、−１５℃より
高くなってはならない。ニトロソ硫酸添加後、その反応
混合物を更に２時間−２０℃で攪拌した。

カップリング： １、８９　（２０ミリモル）のフェノールを温度調節可
能な二重壁反応容器中、約２００−の０．１Ｍ　ＮａＯ
Ｈに溶解し、そしてその溶液な０℃に冷却した。

そのジアゾニウム塩をこの温度を保ちながら、その温度
制御された反応容器からフェノール溶液に滴下して加え
た。

単　　離： 沈殿した塩を吸引テ去しそして酢酸エチルで洗浄した。

その水性母液を８００−の酢酸エチルと共に振盪するこ
とにより抽出した。酢酸エチル相を合体し、硫酸ナトリ
ウムを用いて予め乾燥させ、そして回転蒸発器で蒸発乾
固した。

精　製： 乾燥粗生成物を還流下に２回、３０分間の間、各５０ｒ
！Ｌｌのトルエンと共に煮沸した。冷却し濾過した後に
、１．６１の赤褐色生成物が残った。

この生成物を加熱しながら、１５０ｍＪの酢酸エチルに
溶解し、そしてその溶液な濾過した。その炉液をシリカ
ゲルを有する１１カラム（直径６ｄ）に移し、そして酢
酸エチル／氷酢酸（９９／１）で溶出した。

薄層クロマトグラフィコントロールの結果に従って合し
た画分な回転蒸発器で蒸発乾固した後の収量は、ｉ、２
＄’の５−二トロチアゾール−２−アゾ−４′−フェノ
ールでちった。

確　認： 得られた生成物は、薄層クロマトグラフィおよび融点測
定により確認した。

Ａ、薄層クロマトグラフィ：三つの異なる系を用いた薄
層クロマトグラフィ分析は得られた生成物が均質である
ことを示した。薄層クロマトグラフィは、 １、　　クロロホルム／メタノール（９０／１０）２、
　酢酸エチル／氷酢酸（９９／１）五　　メチレンクロ
ライド／氷酢酸（９０／１０）を用いて行った。

Ｒｆ値はクロロホルム／メタノール系についてのみ測定
したところＲｆ＝　０．４９であった。

Ｂ、融点測定は２００℃を超える融点を示した。

第　　１　　表 一オール ルー２−アゾ−２′−ピリジン −３１−オール ール ノール） ジピリジン） 一３′−ヒドロキシピリジン） ン） エノール） −（４′−メチルフェノール） 一３′−ヒドロキシピリジン〕 前記の例のほかに１ナフトール類およびヒドロキシイン
ドール類といった物質群のとｆａキシル基を含有するそ
の他の誘導体もカップリング成分として用いた。ジアゾ
化に用いられるアミン成分は、次のリストにみることが
できるニアミノチアゾール類（特にアルキル、ハロゲン
（またはニトロ）フェニル基により置換されたもの）、
アミノベンゾチアゾール誘導体、アミノピリジン誘導体
、アミノチアジアゾール誘導体、アミノインチアゾール
誘導体、アミノオキサゾールおよびアミノイソオキサゾ
ール誘導体、アニリン誘導体およびアミノナフタレン誘
導体。

実施例　５ ヒドロキシアゾ色素のコンプレックス形成様々な化合物
のコンプレックス形成特性を次のようにして検討した： 次のものを示された屓序でセル内にピペットで移し、そ
して直ちに攪拌した： ２．９６０１Ｅｌの０．１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ
７＞、３０μｌのアゾ色素の１０μＭメタノール溶液、
および１０μｌのコンプレックス形成金属イオンの０．
１Ｍ水性溶液。

次のような定性的情報が得られた： 検討された化合物のメタノール溶液を０．１　Ｍホスフ
ェート緩衝液（ｐＨ７）で予め含浸した指示紙に添加し
そして乾燥した。乾燥後、コンプレックス形成金属イオ
ンの０．５　ｍＭ浴溶液その紙上にドリップした。

第１図はコンプレックス形成による色シフトの例を示す
。

ほかの例を第２表にまとめる。

第　　２　　表 ヒＰロキシアゾ色素のコ ンプレックス形成 アゾ−２′−ピリジン−５′−オール −２′−ピリジン−３′−オール ４−シアノピラゾール−３−アゾ　　　　Ｃｕ　　　　
　　１ス０００／６２０−２’−（４−メトキシフェノ
ール） ５−ブｆｆｉモチアゾールー２−アゾ　　　　Ｃｕ　　
　　　　２９，０００１５５０−２７−ピリジン−３１
−オール トロキシピリジン） 実施例　４ グリコジル化反応 Ａ、チアゾール−２−アゾ−２−ピリジン−５′−オー
ル（ｔａｐ）のがラクトシル化 ２．０６ｆ（０，０１モル）のｔａｐ、４．１？（０，
０１モル）のアセトプロそガラクトース、ｔ１ｓ？（５
ミリーｖ−ル）ＯＡｇ２０および１．４５Ｐ（０，０１
モル）の硫酸カルシウム・１ＡＨ２ｏを乾燥装置中１０
０ｄの乾燥トルエン中で還流下に加熱した。

反応は、光および水分を排除しく凝縮器には塩化カルシ
ウム乾燥管を取り付ける）攪拌しながら行った。

２時間の反応時間後、反応を薄層クロマトグラフィによ
りコントロールした。形成されたｔａｐミルアセラクト
ンＰはｔａｐのスポットの上に黄色スポットとして現わ
れた。移動相：クロロホルム／酢酸エチル（４／１）お
よヒクロロホルム／アセトン（４／１）。

反応が十分でないときは、アセトブロモガラクトースお
よびＡｇ２Ｏを再び添加し、そしてその混合物を再び還
流下に加熱した。

反応が生じたら、そのパッチ溶液な濾過し、フィルタを
トルエンで洗浄し、そして洗浄トルエンと母液を合体し
、そして約７０ミリバール下に４０℃の最高浴温で回転
蒸発器で濃縮した。

残分を真空乾燥キャビネット中２００ミリバール下に室
温で乾燥した。汚染された生成物をカラムクロマトグラ
フィにより精製した。（分離剤シリカゲル４０．０．０
６〜０．２　ｍ　、　移動相クロロホルム／酢酸エチル
（４／１）　）。精製されたｔａｐテトラアセチルガ２
クトシＰを乾燥しそしてその純度を薄層クロマトグラフ
ィによりチエツクした。

Ｂ、形成されたアセチルグリコシドの脱アセチル脱アセ
チルは、無水メタノール中、ナトリウムメチラートを用
いて行った。このために、そのアセチルグリコシドなメ
タノールに２■／ｄ濃度となるよう溶解し、そして少量
のナトリウムメチラートを添加した。（５〜１０μｌの
６０係強度メタノール溶液）。脱アセチルの過程は薄層
クロマトグラフィによりモニターした。

移動相：クロロホルム／酢酸エチル（４／１）オｊびク
ロロホルム／メタノール（３／１）。

反応完了後、その溶液をイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０
×８を用いて中性〜弱酸性にした。

次にその溶液を濃縮しそして残部を乾燥する。

ｔａｐｌ−ガラクトシドの収量は１８０ダであった。

Ｃ，３，５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピ
リジン−３′−オール（ｄｉｍｅｔａｐ）のグリコジル
化 ２．６１（０，０１モル）のブリグル無水物（Ｂｒｉｇ
ｌ°５ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）および２．３６Ｐ（０，０
１モル）のｄｉｍｅｔａｐを攪拌しながらかつ水分を排
除しながら１００　ｄのトルエン中で還流下に加熱した
。

反応時間：２４〜４８時間。

反応は薄層クロマトグラフィによりチエツクした。

移ａ相：クロロホルム／酢酸エチル（４／１）。

脱アセチルはＢに記載されたとおりに行った。

収量は２００■のｄｉｎｅ　ｔａｐｌ−グルコシドであ
った。

実施例　５ 色素原ガラクトシドとβ−ガラクトシダーゼとの反応 チアゾール−２′−アゾ−２′−ピリジン−３′−β−
ガラクトシ）’　（ｔａｐ−ｇａｌ）を大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）からのβ−がラクトシダーゼ（ＥＣ３，２，
１，２２、至適−約７．２）およびアスペルギルス・オ
リゼ（Ａｓｐ。

ｏｒｙｚａｅ）からのβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３，
２，１，２３、至適２約４．５　）　（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ　ＧｍｂＨ社製）を用いて分解した。その分解を
視覚的におよび光度測定的にモニターした。比較のため
に、既知のβ−ガラクトシダーゼ基質であるレゾルフィ
ン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）β−ガラクトシド（ｒｅｓｇ
ａｌ）およびクロロフェノールレッドβ−ガラクトシド
（ＣＰＲ−ｇａｌ）の分解速度も並行的に測定した。

光度測定方法 １ｄのα１Ｍ緩衝液（ホスフェ−）　緩衝ｆｉ　（ｐＨ
７）またはアセテート緩衝液（ｐＨ４，５））を０．１
−の特定の基質溶液（２，５１モル／ｌまたは１０Ｐリ
モル／ｌ）を１倒の光路な持つセル内で混合し、そして
１０μｌのβ−ガラクトシダーぜ溶液（８４ｏ　Ｕ／ｌ
　）の添加により開始した。分解反応を約１０分間モニ
ターした。ｐＨ４，５においてｔａｐ溶液はなおもＱ、
３３ミリモル／ｌの硝酸鋼を含有し、そして他の二つの
基質は−７に再緩衝後測定し第　　３　　表 光度測定試験結果 各種基質濃度における分解速度（マイクロモル贋）ｔａ
ｐ−ｇａｌ　　　Ｏ，３５０，７０，６１，５ｒｅｓ−
ｇａｌ　　α４　　１．１　　　　α２　＊　　　、／
、＊ＣＰＲ−ｇａｌ　　　Ｏ，２７０，１５Ｑ、５７　
　　　０．４９視覚法 指示紙を０．１　Ｍ緩衝液（ホスフェート緩衝液（ｐＨ
６、ｐＨ７またはｐＨ７，８）またはシトレート緩衝液
（ｐＨ４，５））で予め含浸し、乾燥した後、特定の基
質の１　？／ｌメタノール溶液で含浸し、そして乾燥し
た。ｔａｐ−ｇａｌ用の紙は付加的に緩衝液（ｐＨ４，
５、Ｐ）Ｉ６および−７）中にｏ、３ミリモ〜４の硝酸
鋼を含有した。

このようにして得られたガラクトシダーゼ試験紙を漸減
ガラクトシダーゼ濃度の諸溶液に浸漬し、そして発色を
ブランク値に対して比較した。第４表は、なおも検出可
能な酵素の最小濃度を含んでおり、前の反応がＰＩ″１
４．５またはｐＪ−１６で行われるｒｅｓ−ｇａｌおよ
びＣＰＲ−ｇａｌについては系を−７に再緩衝してから
読みを行った。

第　　４　　表 漬試験における最大感度（Ｖ）） ガラクトシダーゼ　　　　　　　　　　　４　　　２１
０　２１０　２ｊＯ、／。

４８０　　　、／、　　　４８０ ４　　８００　１２０　　　　　　１２［］ホスフェー
ト　７　　１　　　　／、　　　９６０　　　　　９６
０４　　２．０００　２４０　　　　　２４０実施例　
６ ４．５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−一リジ
ンー３′−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｄｉｍｅｔａｐ
−ｇｌｕｅ）とβ−グルフシダーゼ（ＥＣ３，２，１，
２１）との反応 ２．９−の０．１Ｍホスフェート緩衝液ＣＰ１（７）を
ｄｉｍｅ　ｔａｐ−ｇｌｕｃの１．Ｃ１／ｌ水性溶液お
よび０．１　ｄの１０ｍＭ硝酸ナトリウム溶液と１３の
光路を有するセル内で混合し、そして０．１−のβ−グ
ルコシダーゼ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　ＣｋｎｂＨ
）を添加することにより反応を開始した。１５分間の反
応時間後、基質は完全に遊離色素原とグルコースに分解
した。（光度計によるコントロール）。

実施例　７ ５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フェニルホス
フェート（ｎｉ　ｔｒｏ　ｔａｐｈ−ホスフェート）の
製造および反応 製　造： １５０ｍ！（０，６ミリモル）のｎｉ　ｔｒｏ　ｔａｐ
ｈを２．５ゴの乾燥ピリジンに溶解し、そしてその溶液
を氷冷した。２００μｌ（２，２ミリモル）のオキシ塩
化燐を添加後、その混合物を６時間氷冷しながら攪拌し
、次いで冷蔵庫内に１８時間貯蔵した。

単離： ピリジンを４０℃の水浴中、回転蒸発器で留去した。５
ｔの氷を残部に添加した。氷が解けた後その溶液を２Ｍ
水酸化カリウム溶液でｐＨ７とし、そして蒸発乾固した
。

次に、１０ゴずつの分析級エタノールを更に２回、粗生
成物に添加し、そしてその混合物を濃縮乾固した。

精　製： ４０〜の粗生成物を１ｄの水／メタノール混合物に溶解
し、そして調製用シリカゲルプレー）　（Ｍｅｒｃｋ社
）（移動相：酢酸エチル／メタノール／水（２０１５１
５）　）上で精製した。

アルカリ性ホス７アターセ（ＥＣ，３，１，３，Ｌ）と
の反応： 基質であるインｒキシルホスフェートおよびｎｉ　ｔｒ
ｏ　ｔａｐｈホスフェートをアルカリ性ボスファターゼ
測定のための至適化された光度測定法に用いた。第５表
には試験条件およびこの方法の結果が含まれる。

第　　５　　表 試験条件： 実施例　８ ５−ニトロチアゾール−２−ア、／　−４１−フェニル
サルフェート（ｎｉ　ｔｒｏ　ｔａｐｈサルフェート）
の製造および反応 製　造： ０．８４ａ＃（１２，５ミＩＪモル）のクロロスルホン
酸ヲ攪拌しなから５ｄのピリジンに徐々に滴下して加え
、そしてその際混合物を氷−塩化す）　ＩＪウム混合物
で冷却した。５００１９のｎｉ　ｔｒｏ　ｔａｐｈを形
成された懸濁液に導入し、そしてその混合物を水浴中で
４０℃で攪拌した。２５時間後、２０ＷＬｌの水を反応
混合物に添加し、そしてその混合物を２Ｍ水酸化カリウ
ム溶液で中和し、そして回転蒸発器で濃縮乾固した。

精　製： １５０■の粗生成物を水／メタノール混合物に溶解し、
そして調製用シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ社）上で
分離した。

移動相：酢酸エチル／水／メタノール（１００／２５／
３０）（Ｒｆ＝約０．４）。

アリールスルファターゼ（ＥＣ，３，１，６，１，）と
の反応： ｎｉちｒｏｔａｐｈ−サルフェートをメタノール（溶出
液）を用いてシリカゲルから溶出した。戸紙を０．１Ｍ
アセテート緩衝液（ｐＨ６，２）で含浸しそして乾燥し
た。溶出液の様々な希釈液をその戸紙上に滴下し、そし
てアリールスルファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ
ａｎｎｈａｉｍ社）と共にインキュベートした。黄色か
ら緑色への容易に目に見える色変化が８０　Ｕ／ｌに対
して１分間以内に生じた。

【図面の簡単な説明】

第１図は色素原基質チアゾール−２−アゾ−２′−ピリ
ジン−６′−オール（ｔａｐ）の吸収極大の変化を示す
。 特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクテエンゲゼル
シャフト 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（ＯＲ） （ここで上記式中、 Ａは、Ｎ、ＳおよびＯより成る群よりの３個までのヘテ
   ロ原子を有する環状で、５−または６−員の所望により
   ベンゾ縮合したラジカルを表わし、そして該ラジカルは
   所望によりハロゲン、ニトロ、アルキル、アルコキシま
   たはスルホネート基により置換されていてもよく： Ｂは、所望によりハロゲン、アルキル、アルコキシ、ジ
   アルキルアミノまたはモルホリノ基により置換されてい
   てもよい芳香族または複素環系例えばフェニル、ピリジ
   ニル、ナフチルまたはキノリニルなどであり、 Ｒはカルボニルラジカルを除く酵素加水分解により遊離
   され得るラジカルである） で示されるアゾ色素化合物である加水分解酵素検出用色
   素原基質。 ２）Ｒが修飾されたまたは未修飾の糖ラジカルまたはホ
   スフェートラジカルまたはサルフェートラジカルである
   請求項１記載の色素原基質。 ３）色素原基質の加水分解生成物が金属イオンとのコン
   プレックス形成に適している請求項１または２記載の色
   素原基質。 ４）Ａ−が▲数式、化学式、表等があります▼構造（こ
   こで式中、示された炭素原子はジアゾ基に結合したＡの
   構成分である）を含み、そして −Ｂ（ＯＲ）が▲数式、化学式、表等があります▼構造
   （ここで式中示された炭素原子Ｃ＾１はジアゾ基に結合
   したＢの構成分である）を含み、そしてＡＮＢおよびＲ
   が請求項１または２のいずれかに記載の意味を有する請
   求項５記載の色素原基質。 ５）以下のアゾ色素： ５−エトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエノールベ
   ンゾチアゾール−２−アゾ−４′−フェノール６−エト
   ロベンゾチアゾール−２−アゾー４′−フエノールチア
   ゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オール４、
   ５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−
   ３′−オール６−エトキシベンゾチアゾール−２−アゾ
   −２′−ピリジン−３′−オールベンゾチアゾール−２
   −アゾ−２′−ピリジン−３′−オール５−ブロモチア
   ゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オール５−
   クロロチアゾール−２−アゾ−２′−（４′−メチルフ
   ェノール）チアゾール−２−アゾ−６′−（２′−プロ
   モ−３′−ヒドロキシピリジン）４、５−ジメチルチア
   ゾール−２−アゾ−６′−（２′−プロモ−３′−ヒド
   ロキシピリジン）６−エトキシベンゾチアゾール−２−
   アゾ−６′−（２′−ブロモ−３′−ヒドロキシピリジ
   ン）４−シアノピラゾール−３−アゾ−２′−（４′−
   メトキシフェノール）５−エトロフエリルスルホニルチ
   アゾール−２−アゾ−２′−（４′−メチルフェノール
   ）４、５−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−（５
   ′−クロロ−３′−ヒドロキシピリジン）チアゾール−
   ２−アゾ−２′−（４′−モルホリノフェノール）のう
   ちの一つから選ばれたもののグリコシド、燐酸エステル
   またはサルフェートエステルである請求項１〜４のいず
   れかに記載の色素原基質。 ６）次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（ＯＨ） で示されるアゾ色素を酸ハライドと反応させることより
   成る請求項１〜５のいずれかに記載の色素原基質の製造
   方法。 ７）酸ハライドがオキシ塩化燐である請求項６記載の色
   素原基質の製造方法。 ８）酸ハライドがクロロスルホン酸である請求項６記載
   の色素原基質の製造方法。 ９）次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（ＯＨ） で示されるアゾ色素をアセトブロモガラクトース、次い
   でナトリウムメチラートと反応させることより成る請求
   項１〜５のいずれか一つに記載の色素原基質の製造方法
   。 １０）Ｒがホスフェートラジカルである請求項１〜５の
   いずれか一つに記載の色素原基質のホスファターゼ検出
   のための使用。 １１）Ｒがサルフェートラジカルである請求項１〜５の
   いずれか一つに記載の色素原基質のスルフアターゼ検出
   のための使用。 １２）Ｒが修飾されたまたは未修飾の糖ラジカルである
   、請求項１〜５のいずれか一つに記載の色素原基質のグ
   リコシダーゼ検出のための使用。 １３）請求項１〜５のいずれかに記載の一つまたはそれ
   以上の色素原基質、および適切な場合には次の物質： 緩衝物質、 安定剤、 活性化剤、 可溶化剤、 補助酵素、 他の補助薬品 のうちの少くとも一つを含有する加水分解酵素検出用試
   薬混合物。 １４）適切な場合には、試験に必要な、付加的試薬とと
   もに、試薬錠剤として、緩衝混合物としてまたは凍結乾
   燥物として溶液中で利用可能とした色素原基質の請求項
   １３に記載の試薬混合物。 １５）色素原基質を、適切な場合には試験に必要な付加
   的試薬と組合せて吸収剤担体上に吸収させるかまたは親
   水性フィルム中に取り込む、請求項１３記載の試薬混合
   物。