JPH01117784A - マルトテトラオ−ス生成アミラ−ゼ活性を有するポリペプチドとその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 本発明は、マルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有
するポリペプチドとその用途に関する。

詳細には、特定のアミノ酸配列を有し、且つマルトテト
ラオース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチドと、
そのポリペプチドを用いて澱粉質を加水分解しマルトテ
トラオース高含有物を製造する方法、並びに、そのマル
トテトラオース高含有物を水素添加してマルトテトライ
トール高含有物を製造する方法、更に、それ゛らマルト
テトラオース高含有物またはマルトテトライトール高含
有物を使用して飲食物を製造する方法に関する。

〈従来の技術〉 澱粉からマルトテトラオース生成する酵素すなわち、マ
ルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，６
０）は、例えば、米国特許第３，６５４，０８２号明細
書、アーカイブスオブ　バイオケミストリ　アンド　バ
イオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｏｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃｓ）　
　第１４５巻、第１０５乃至１１４頁（１９７１年）、
ビオキミカ　エト　ビオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ　Ａｃｔａ）
第５６６巻、第８８乃至９９頁（１９７９年）、アグリ
カルチエラル　アンド　バイオロジカルケミストリー（
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ）　　第４６巻、第３号、
第６３９乃至６４６頁（１９８２年）および同誌、第４
７巻。

第８号、第１７６１乃至１７６８頁（１９８３年）など
にも記載されているように、シュードモナス　スツッツ
ェリ（ＰｓｅｕＪｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ）か
ら産生されることが知られている。

しかしながら、これらの記載から明らかなように、マル
トテトラオース生成アミラーゼは、一部の酵素的性質し
か知らｈておらず、工業上、安定して供給し、安心して
利用する上にはなお不充分であり、より解明されたマル
トチートラオース生成アミラーゼの確立が望まれている
。

〈発明の解決しようとする問題点〉 本発明者等は、より詳細に解明されたマルトテトラオー
ス生成アミラーゼ、とりわけ、アミノ酸配列まで解明さ
れたマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポ
リペプチド（以下１本明細書では、単に、ポリペプチド
と略称する。）と、その用途について鋭意研究した。

その結果、ポリペプチドは１部分アミノ酸配列として。

（ａ　）　Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−Ｍｅｔ（ｂ　）　Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｃ　）　Ｐｈ
ｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙおよび （ｄ　）　’ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒから選ばれる１：だ以上の配列
を有していることが判明し、更に詳細には、前記の部分
配列がＮ末端側から近い順に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）の部分配列を有していることか判明した。

そして、その特徴的性質としては、澱粉に作用して、主
にマルトテトラオースを生成し、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で５０．０００±１０，０００の
分子量を示すポリペプチドである。

以下１本発明の内容を詳述し、併せて、本発明の詳細な
説明する。

本明細書の記載において、アミノ酸、ペプチド、その他
に関し、略号で表記する場合、それらは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものである。それらの例を以下に列
記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場合に
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　：リポ核酸 Ａ　：アデニン Ｔ　：チミン Ｇ　ニゲアニン Ｃ：シトシン ｄ　ＮＴＰ　：デオキシヌクレオチド三すン酸ｄｄＮＴ
Ｐ　ニジデオキシヌクレオチド三リン酸ｄｃＴＰ：デオ
キシシチジン三すン酸 ＳＤＳニドデシル硫酸ナトリウム Ａｌａ　：アラニン Ａｒｇ　：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａ　ｓ　ｐ　：アスパラギン酸 Ｃｙｓ　ニジスティン Ｇｉｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｇｌｙニゲリシン Ｈｉｓ　：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ　：リジン Ｍ　ｅ　ｔ　：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏニブロリン Ｓｅｔ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐニトリブトファン Ｔｙｒ　：チロシン Ｖａｌ：バリン 本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、マル
トテトラオース生成アミラーゼ産生菌からポリペプチド
遺伝子をクローニングした後、その塩基配列を解読して
決定した。

一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部分のアミノ酸
配列は、ポリペプチドを高純度に精製した後、気相プロ
ティン　シークエンサーを用いて調べた。

ポリペプチド遺伝子のクローニング ポリペプチド産生能を有する供与体微生物より、その微
生物のＤＮＡを分離精製した後、例えば、超音波、制限
酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同様にして
ベクターを切断して得られたベクター断片とを、例えば
、ＤＮＡリガーゼなどにより結合させ、ポリペプチド遺
伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。

この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能を
有する微生物、例えば、米国特許第３．６５４，０８２
号明細書に記載されているシュードモナス　スツッツェ
リ　ＮＲＲＬ　　Ｂ−３３８９、本発明者等が土壌より
新たに分離したシュードモナス　スツッツェリ　ＭＯ−
１９、または、これらの変異株など、更には、ポリペプ
チド産生能を遺伝子組換えにより導入した形質転換微生
物などが有利に用いられる。

シュードモナス　スツッツェリ　ＭＯ−１９は、岡山県
上房郡賀陽町の土壌から発見１分離されたものであり、
昭和６２年２月１７日、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請され、微生物受託番号ＦＥＢＭ　　Ｐ−９
２０３で寄託されており、菌学的性質は次の通りである
。

Ａ、形態的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌、０．５乃至０．６Ｘ１．Ｏ乃至１．２ルｍ 第１図に電子顕微鏡写真（ｘｌｏ、ｏｏｏ）を示す。

（ｂ）細胞の多形性の有無 無 （Ｃ）運動性の有無 有 （ｄ）鞭毛の着性状悪 極毛で１本 （ｅ）胞子及び胞子のう 胞子、胞子のうは形成せず （ｆ）ダラム染色性 陰性 （ｇ）抗酸性 陰性 Ｂ、培養的性質 （ａ）肉汁寒天平板培養（２８°Ｃ１２日）菌の生育は
速く、ｌ乃至３ｍｍのコロニーを形成する。コロニーは
、不透明で混光なもち、褐色がかった黄色の円形で１表
面は平滑である。

（ｂ）肉汁寒天斜面培養（２８°Ｃ１２日）菌の生育は
中程度である。コロニーは、不透明で混光をもち、褐色
がかった黄色の羽毛状で、扁平状の隆起を持つ、可溶性
色素は生成しない。

（Ｃ）肉汁液体培養（２８℃、２日） 培養１日では、やや濁る程度だが、培養２日では強く濁
り、よく生育する。

表面は膜状のものを形成し、ガス、色素は生成しない。

（ｄ）肉汁穿刺培養（２８℃、２日） 穿刺部に連鎖状の生育をする。

（ｅ）肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンは液化しない。

（ｆ）リトマスミＪレク（２８℃、５日）培養５日まで
にアルカリ性となり、ミルクは凝固する。

Ｃ０生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元　　　　陽性 （ｂ）脱窒反応　　　　　　陽性 （ｃ　）　Ｍ　Ｒテスト　　　　　陰性（ｄ）ＶＲテス
ト　　　　　陰性 （ｅ）インドールの生成　　陰性 （ｆ）硫化水素の生成　　　陽性 （ｇ）デンプンの分解　　　分解す８ （ｈ）クエン酸の利用　　　利用する （ｉ）無機態窒素の利用法　アンモニウム塩。

硝酸塩共に利用する （ｊ）色素の生成　　　　　可溶性色素は生成しない （ｋ）オキシダーゼ　　　　陽性 （ｌカタラーゼ　　　　　陽性 （ｍ　）生育の範囲 ｐＨ４乃至７でよく生育し、ｐＨ２以下またはＰＨ８以
上では生育せず、温度１６乃至３５°Ｃでよく生育し、
２℃以下または４２°Ｃ以上では生育せず。

（ｎ）酸素に対する態度　　好気性 （０）Ｏ−Ｆテスト　　　　酸化型（０）（ｐ）糖類か
らの酸及びガス生成の有無Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノ
ース、乳糖、マルトース、デンプンから酸が生成される
が、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクト
ース、ショ糖、グリセロールからは酸が生成されない、
Ｄ−マンノースからガスの生成がみられるが、他の前記
の糖類からはガスが生成されない。

（ｑ）生育ｐＨ ｐＨ７，７（プロテオース　ペプトン　グルコース培地
） （ｒ）セルロースの分解　　　陰性 以上の菌学的性質について、バーシーズ　マニュアル　
オブ　デターミネイティブ　バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第７版（１９５
７年）および第８版（１９７４年）を参照して分類すれ
ば、シュードモナス　スツッツェリと同定され、本国を
シュードモナス　スツッツェリ　ＭＯ−１９と命名した
。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、得られる培
養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させるこ
とによって調製することかできる。溶菌方法は、例えば
、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素
による処理や超音波処理などが用いられる。また、必要
によりプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナ
トリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に凍結
融解処理を施すことも自由である。

このようにして得られる溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出、除蛋
白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せるこ
とによって行うことができる。

ＤＮＡを切断する方法は１例えば、超音波処理、制限酵
素処理などにより行うことができるが、得られるＤＮＡ
断片とベクター断片との結合を容易にするためには、制
限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する０例
えば、５ａｕ３Ａ　　　Ｉ、ＥｃｏＲ１，Ｈｉｎｄ　　
　１１、　Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ■、　Ｓａｌ　　　１．Ｓ１
ａ　　　１．Ｘｍａ　　　Ｉ　　　、Ｘｂａ　　Ｉ、Ｓ
ａｃ　　１．Ｐｓｔ　　Ｉなどの■型制限酵素が適して
いる。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しつるフ
ァージ又はプラスミドが適している。

ファージとしては、例えば、エッシェリヒアコソ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場
合には、入ｇｔ・入Ｃ１入ｇｔ・λＢなどが、バチルス
　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）
を宿主微生物とする場合には、ρ１１、φ１、φ１０５
などが使用できる。

また、プラスミドとしては１例えば、エツシェリヒア　
コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５などが、バチルスズブチリスを宿主微生物とす
る場合には、ｐＵ８１１０、ｐＴＺ４　（ＰｒＦ３）、
ｐｃ１９４などが使用でき、更に、例えば、エッシェリ
ヒア　コリ、バチルス　ズブチリスなどの二種以上の宿
主微生物て自律的増殖の可能な、例えば、ｐＨＶ１４、
ＴＲｐ７．ＹＥｐ７．ｐＢＳ７などのベクターを利用す
ることも可能である。このようなベクターを、先きに述
べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断し、ベクター断
片を得る。

ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤＮＡリガーゼを用いる方法てあればよく、例えば、
ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーングの後、生体外
で適当なりＮＡリガーゼの作用により組み換えＤＮＡを
作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物
に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組み換
えＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
増殖が可能でその形質発現のできるものであればよい、
なかでも、α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）産生
能を欠いている微生物は、ポリペプチド産生量の測定が
容易であるだけでなく産生されるポリペブチｉの夕離、
精製も容易であり宥利に利用できる。

宿主微生物に組み換えＤＮＡを導入する方法は、公知の
方法１例えば、宿主微生物がエッシェリヒア属に属する
微生物の場合にはカルシュラムイオン存在下で行ない、
バチルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル
法又はプロトプラスト法などを採用することができる。

組み換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法
は、澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からマ
ルトテトラオースを生成するものを選択すればよい。

このようにして−度選択されたポリペプチド遺伝子を含
む組み換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出して、
他の宿主微生物に導入することも容易に実施できること
が判明した。またポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤ
ＮＡを制限酵素などにより切断してポリペプチド遺伝子
を含むＤＮＡ断片とし、これと同様にプラスミドなとの
ベクターを切断して得られるベクター断片とを結合させ
ることも容易に実施できることが判明した。

また、ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡは、制
限酵素ＳｍａＩ（東洋紡績株式会社製造）による切断部
位を有しており、制限酵素Ｓｍａ　　Ｉの作用を受はポ
リペプチド遺伝子が切断され、その形質発現能を失うこ
とが判明した。

ポリペプチド遺伝子の塩基配列 ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、シーン（Ｇｅｎｅ）
、第９巻、第２５９乃至２６８頁（１９８２年）に示さ
れているジデオキシチェーンターミネータ−法で解読す
ればよい。

この方法は、クローニングにより得られたポリペプチド
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵｃ１８など
のプラスミドに制限酵素を利用して、そのクローニング
部位に挿入する。得られた組み換えプラスミドは、形質
転換によってエッシェリヒア　コリ　ＪＭ８３などに移
入し、次いで組み換えプラスミドを有する微生物を選択
する。

この微生物を増殖させたものを用いて組み換えプラスミ
ドを調製する。

得られた組み換えプラスミドを合成プライマーとアニー
リングし、これにフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）　Ｉｌｒ片
を働かせてプライマーを伸長させ相補ＤＮＡを生成させ
る。

この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いて
、ラジオオートグラフィー法を行った後、ポリペプチド
遺伝子の塩基配列を決定する。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。

ポリペプチドのアミノ酸配列 ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列より決定する
。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。

ポリペプチドのＮ　端を含有　る部　アミノ酸Ｂ ポリペプチド産生能を有するシュードモナススツッツェ
リを栄養培地で培養してポリペプチド　・を産生させる
。培養終了後、遠心分離して上清を採取し、これを硫安
分画、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィーにより精製し高純度ポリペプチドとする。

この試料を用いてジャーナル　オブ　バイオロジカル　
ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　（：ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５６巻、第７９
９０乃至７９９７頁（１９８１年）の記載に準じて、気
相プロティン　シークエンサーにより分解し、高速液体
クロマトグラフィーで同定して、ポリペプチドのＮ末端
を含有する部分アミノ酸配列を決定する。

形　転換機　物によるポリペプチドの調製上述のように
して得られた形質転換微生物を栄養培地で培養すること
により多量のポリペプチドを安定して産生じうることを
見いだした。

栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、更
に必要ならば、アミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養
素などを含有させればよい。

この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解物、
グルコース、フラクトース、スクロースなどの糖質が有
利に用いられる。窒素源とじては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素源
、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステイープ
リカー、肉エキスなどの有機窒素源が適宜用いられる。

培養方法は、例えば、液体培地をｐＨ４〜１０、温度２
５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌などの好気的
条件下で約１〜４日培養し。

ポリペプチドを生成蓄積せしめればよい。

培養物中のポリペプチドは、そのまま採取し利用するこ
ともできるが、一般には常法に従って。

濾過、遠心分離などによ？ポリペプチド溶液と微生物菌
体とに分離した後に利用される。

ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音
波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し１次いで
濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。

このようにして得られるポリペプチド溶液を、例えば、
減圧濃縮、ｇ濃縮、澱粉吸着、溶出し。

更に、硫安、硫酸ソーダなどによる塩析、メタノール、
エタノール、アセトンなどによる分別沈耐性などを適宜
組み合せて精製し、より高純度のポリペプチドを採取し
て利用することも、更に、これらペプチドを常法に従っ
て、担体結合法、架橋法、包括法などによって固定化し
て利用することも有利に実施できる。

本発明で利用するポリペプチドは、特定するアミノ酸配
列まで解明され、安心して利用しうるものであればよく
、先に述べた遺伝子組み換えによる形質転換微生物から
のもののみに限定されるものではない。

本発明のポリペプチドを利用してマルトテトラオース高
含有物を製造するに際しては、工業的には、澱粉、アミ
ロペクチン、アミロース、澱粉部分加水分解物などの澱
粉質を基質として反応させるのが好ましい、　また、必
要ならば、澱粉質含有飲食物の製造に際して、飲食物に
ポリペプチドを作用させ、飲食物にマルトテトラオース
を生成含有せしめ、澱粉質の老化を防止し、飲食物の日
持ちを延長することもできる。

一般的には、５乃至４５　ｗ／ｗ！程度の澱粉質溶液に
１本発明のポリペプチドを澱粉質グラム当り約１乃至２
０単位の割合で加え、ｐＨ５乃至９１反反応度約４０乃
至７０°Ｃで０．５乃至３日間反応させる。

この際、反応液に塩化カルシウムなどのカルシウム塩を
濃度ｏ、ｏｏｏｓ乃至０．０５モル程度共存させること
によって、ポリペプチドの耐熱性を向上させ、反応をよ
り容易に進めることも有利に実施できる。

また１反応物中のマルトテトラオース含量をできるだけ
高めるためには、澱粉質の酸またはα−アミラーゼによ
る液化の程度をできるだけ低く、ＤＥ１５未満、望まし
くはＤＥ６未満にとどめたものに、ポリペプチドを作用
させるのが好ましい。

また、反応に際して、ポリペプチドとともに、他の澱粉
質関連酵素、例えば、シクロマルトデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼ（ＥＣ２゜４．１．１９）、　　
α−アミラーゼ（ＥＣ３，２゜１．１）、β−アミラー
ゼ（ＥＣ３，２，１゜２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３
，２，１゜３）、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１
゜２０）、プルラナーゼ（ＥＣ３，２，１゜４１）、イ
ソアミラーゼ（ＥＣ３，２，１゜６８）などを併用して
、得られるマルトテトラオース高含有物の組成を変えた
り、マルトテトラオース含量を高めたりすることも自由
である。

このようにして得られるマルトテトラオース含量が固形
物当り４０乃至８０ｗ八２へ度のマルトテトラオース高
含有物を原料として、分画法などにより夾雑する糖類、
デキストリンなどを除去し。

マルトテトラオースの含量を更に高めることも自由であ
る。

分画法としては１例えば、特開昭４８−４６４７号公報
に記載される半透膜の利用、特開昭４９−１０２８５４
号公報に記載される有機沈澱剤の利用、特開昭５９−１
４８７９４号公報に記載される強酸性カチオン交換樹脂
の利用などが適宜選択され、必要ならば、９８　’／ｗ
Ｘ以上の最高純度のマルトテトラオース高含有物を採取
することも容易に実施できる。

次いで、これらのマルトテトラオース高含有物は１通常
、ｉ！！過し、活性炭による脱色およびＨ型、ＯＨ型イ
オン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮
し、シラツブ状製品にする。

必要ならば、更に乾燥し、粉末状製品にすることも自由
である。

このようにして得られるマルトテトラオース高含有物に
は１通常、マルトテトラオースを固形物当り４０’八２
以上含有する。

更に、マルトテトラオース高含有物を還元して、化学的
により安定なマルトテトライトール高含有物を製造する
ことも有利に実施できる。

例えば、マルトテトラオース高含有物を、濃度約４０乃
至６０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒とし
てラネーニッケルを約８乃至１０％添加し、攪拌しなが
ら温度を９０乃至１４０°Ｃに上げ、水素圧を２０乃至
１５０　”Ｍｌ、−に上げて水素添加を完了させた後、
ラネーニッケルを除去し１次いで、マルトテトラオース
高含有物製造の場合と同様に、活性炭、イオン交換樹脂
で精製し、濃縮してシラツブ状製品とするが、更に乾燥
して粉末状製品とする。

このようにして製造されるマルトテトライトール高含有
物には、通常、マルトテトライトールを固形物当り４０
’八２以上含有する。

以上述べた方法で製造されるマルトテトラオース高含有
物またはマルトテトライトール高含有物は、低甘味の甘
味剤として、また、・ボディー付与剤、粘度調節剤、保
湿剤、照付与剤、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャン
デイ−のダレ防止剤、澱粉老化防止剤などとして、更に
は、栄養補給用剤などとして広く飲食物に利用される。

例えば、マルトテトラオース高含有物またはマルトテト
ライトール高含有物のシラツブ品を加熱し１食品表面に
塗布するなどの利用方法では、他の糖質甘味料と比較し
て、その硬化、乾きが速く、たれが少ない特徴を有する
。しかも、その表面の照、艶は良好である。

また、甘味剤としての利用は、単品で利用されるばかり
でなく、必要ならば、他の甘味剤１例えば、グルコース
、マルトース、異性化糖、砂糖、蜂蜜、メープルシュガ
ー、ソルビトール、マルチトール、パラチノース、ジヒ
ドロカルコン、ステビオシト、α−グリコジルステビオ
シト、ラカン力せ味物、グリチルリチン、α−グリコジ
ルグリチルリチン、Ｌ−アスパラチル、Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニ
ンなどと配合して使用することも自由である。

マルトテトラオース高含有物またはマルトテトライトー
ル高含有物は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味など
他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐熱性も大き
いので、広く飲食物の甘味性に、呈味改善に、調味に自
由に利用できる。

例えば、’ｌ油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、
ひしお、フリカケ、マヨネーズ、トレッシング、食酢、
三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソー
ス、ケチャツプ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの
素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新み
りん、テーブルシラツブ、コーヒーシュガーなど各種調
味料として自由に使用できる。

躯 また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まん
じゅう、ついろう、あん類、羊奨、水羊奨、錦玉、ゼリ
ー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケッ
ト、クラッカー、クツキー、パイ、プリン、バタークリ
ーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワツフル
、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューイ
ンガム、キャラメル、キャンデイ−などの各種洋菓子、
アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓。

果実のシロップ漬、水蜜などのシロップ類、麺類、米飯
類、人造肉などの穀類加工品類、フラワーペースト、ビ
ーナツツペースト、フラーペースト、スプレッドなどの
ペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果
などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、
千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、
白菜漬の素などの漬物の索類、ハム、ソーセージなどの
畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チ
クワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酸コ
ンブ、さきするめ、ふぐのみりん干しなどの各種珍味類
、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつく
だ魚類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などのそう菜類
、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、
合成酒、果実酒、洋酒などの酒類、コーヒー、ココア、
ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼
飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席
ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなど
即席飲食品などの各種飲食品への甘味剤、呈味改良剤、
物性改良剤などとして自由に利用できる。

また、これら飲食品を正常に摂取することの困難な病人
や病後の虚弱者などに対しては１本発明のマルトテトラ
オース高含有物やマルトテトライトール高含有物を経管
流動食や透析用栄養剤などの栄養補給用剤として利用す
ることも有利に実施できる。

その際、液状の栄養補給用剤を製造し、そのままの形状
で利用することも、また、固状の栄養補給用剤を製造し
、水、塩類溶液、果汁、牛乳などに溶解して利用するこ
とも自由である。

また、マルトテトラオース高含有物または、マルトテト
ライトール高含有物を例えば、家畜、家禽、その他、蜜
蜂、蚕、魚など飼育動物のための飼料、餌料なとの嗜好
性を向上させる目的に利用することもできる。

その他、タバコ、線画みがき、口紅、リップクリーム、
内服薬、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香
錠、うがい薬などの味覚を味わうことのできる嗜好物、
化粧品、医薬品などへの甘味剤、呈味改良剤、品質改良
剤などとしても利用することができる。

以上述べたように、本発明でいう飲食物とは、味覚を味
わうことのできる経口摂取物のみならず、経管流動食な
どの栄養補強用剤をも意味する。

また、これら飲食物に、本発明のマルトテトラオース高
含有物または、マルトテトライトール高含有物を含有せ
しめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せ
しめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬
、浸透、散布、塗布、噴霧、注入などの公知の方法が適
宜選ばれる。

以下、実験で本発明の詳細な説明する。

実験ｌ　シュードモナス　スツツツエリ　ポリペプチド
遺伝子のエッシエリヒア　コリへのクローニング （１）シュードモナス　スツッツエリのポリペプチド遺
伝子を含む染色体ＤＮＡの調製 シュードモナス　スツツツエリのポリペプチド遺伝子を
含む染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法［ビオキミカ
　エト　ビオフイジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ　Ａｃｔａ）　、第７２巻
、第６１９乃至・６２９頁（１９６３年）］に準じて調
製した。即ち、シュードモナス　スツツツエリＭＯ−１
９ＦＥＲＭ−Ｐ　　９２０３をプレインへ−ト　インフ
ュージョン培地で３０℃、−夜通気攪拌培養した。培養
液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体をＹＥＳ緩衝液
（ｐＨ８，０、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ、
塩化ナトリウム含有）に懸濁し１次にリゾチームをｍｌ
当り２ｍｇの割合で加え、３７℃で３０分間保持した。

これを、−２０℃で一夜結凍した後、ＴＳＳ緩衝液（ｐ
Ｈ９，、ｏ、トリスアミノメタン、塩酸、ラウリル硫酸
ナトリウム、塩化ナトリウム含有）を加え、６０℃に加
温した後、ＴＥＳフェノール混掖（液ＥＳＩＩ衝液（ｐ
樹液、５）ｌ容とフェノール４容との混合液）を加え、
氷水中で冷却後、遠心分離し上清を得た。この上清に２
倍容の冷エタノールを加え粗染色体ＤＮＡを回収し、こ
れを５ＳＣＩｌ衝液（ｐＨ７，１、塩化ナトリウム、ク
エン酸３ナトリウム含有）に溶解し、リボヌクレアーゼ
（シグマ社製造、商品名　ＲＮａｓｅＡ）およびプロテ
アーゼ（科研製薬株式会社製造、商品名Ｐｒｏｎａｓｅ
Ｅ）を作用させ１次いで、ＴＥＳフェノール混液な加え
、冷却し遠心分離して、得られる上清に２倍容の冷エタ
ノールを加え精製染色体ＤＮＡを回収し、＃樹液（ｐＨ
７，５、トリスアミノメタン、塩酸、ＥＤＴＡ含有）に
溶解して一２０°Ｃに保存した。

（２）プラスミド　ｐＢＲ３２２の調製プラスミド　ｐ
　Ｂ　Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）は、ゼイ　メイ
ヤーズ（Ｊ、Ｍｅｙｅｒｓ）等の方法［ジャーナル　オ
ブ　バクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ［１ａｃ
ｔｅｒｉｏ１ｏｇｙ）、第１２７巻、第１５２４乃至１
５３７頁（１９７６年）］に準じてエッシェリヒア　コ
リから分離、調製した。

（３）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡの作製 実験１−　（１）で調製したポリペプチド遺伝子を含む
精製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素５ａｕ３ＡＩ（株
式会社ニッポンジーン製造）を作用させ、ＤＮＡ断片が
１〜２０ＫｂＰになるよう染色体ＤＮＡを部分的に切断
した。一方、実験１−（２）で調製したプラスミド　ｐ
ＢＲ３２２に対して、制限酵素ＢａｍＨＩ（株式会社ニ
ッポンジーン製造）を作用させ、完全に切断し、次いで
、プラスミド断片のセルフライゲーションを防止するた
め、エッシェリヒア　コリ由来のアルカリフォスファタ
ーゼ（宝酒造株式会社製造）を作用させ、ｐＢＲ３２２
断片の５′末端を脱リン酸化した。

両断面の結合は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（株式会社ニッポ
ンジーン製造）を４℃で一夜反応させて行ない１組み換
えＤＮＡを作製した。

（４）組み換えＤＮＡのエッシェリヒア　コリへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生爺を欠いているエッ
シェリヒア　コリ　ＨＢ　Ｉ　Ｏ１（ＡＴＣＣ３３６９
４）を用いた。

本微生物をＬ−ブロスで３７℃、４時間培養し集菌した
後、１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ塩化マンガンを
含有する１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，６）に懸濁し
、遠心分離にて集菌し、続いて２５ｍＭ塩化カルシウム
、１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０ｍＭ酢酸塩緩
衝液（ｐＨ５，６）に懸濁したものに、実験１−（３）
で得た組み換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間静置し
た。更に、３７°Ｃに加温し、Ｌ−ブロスを加え３７℃
で３０分間保ち、これを抗生物質アンピシリン５０ＩＬ
ｇ７ｍｌを含有し、かつ澱粉２ｍｇ／ｍｌを含有するし
一アガー平板培養地上に拡げ。

３７°Ｃで２４時間保ち、コロニーを形成させた。

本平板から、ヨード呈色法により、澱粉を分解し、マル
トテトラオースを生成しているコロニーを選択し、ポリ
ペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡが導入されている
形質転換微生物を選択した。本微生物を増殖させ、実験
１−　（２）のプラスミドの調製方法に準じて組み換え
ＤＮＡを取り出し、これｄ各種制限酵素を作用させ、そ
の切断部位を決定した後、制限酵素５ａｕＩ（株式会社
ニッポンジーン製造）で部分分解し、次いで。

実験１−（３）と同様に７４ＤＮＡリガーゼを作用させ
１組み換えＤＮＡを作製し、実験１−（４）の方法に準
じてポリペプチド遺伝子を含む小型の組み換えＤＮＡを
保有する形質転換微生物を選択した。

本微生物の一菌株をエッシエリヒア　コリ　ＴＰＳ６１
８　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２０２）と命名し、これが保
有する組み換えＤＮＡをｐＴＰ３６１Ｂと命名した。

組み換えＤＮＡ　　ｐＴＰｓ６１８について、シュード
モナス　スツツツエリ由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地
図を第２図に示す。

第２図から明らかなように、制限酵素Ｓｍａ工（東洋紡
績株式会社製造）、ＥｃｏＲ１，Ｓａｎ　　Ｉ、Ｋｐｎ
Ｉ（株式会社ニッポンジーン製造）で切断を受けること
が判明した。

一方、制限酵素ＢａｍＨ１，Ｂｂａ　　Ｉ、Ｘｈｏ　　
１．Ｂｇｌ　　Ｕ、ＸｂａＩ（以上、株式会社ニッポン
ジーン製造）では切断されなかワた。

実験２　シュードモナス　スツツツエリ由来ポリペプチ
ドのＮ末端を含有した部分アミノ酸配列（１）ポリペプ
チドの調製 シュードモナス　スツッツエリ　ＭＯ−１９ＦＥＲＭ−
Ｐ９２０３を、実験４に示す方法と同様にして液体培養
し、培地中にポリペプチドを産生させた。遠心分離にて
上清を採取し、硫安塩析によりポリペプチド画分を得、
次いで、陰イオン交換体カラムクロマトグラフィー（東
洋曹達株式会社製造、商品名・、ＤＥＡＥ・°トヨパー
ル　６５０ｓ使用し、更に、スウェーデン国、ファルマ
シア社製造、商品名　ＭｏｎｏＱ使用）により精製して
、高度に精製されたポリペプチドを採取した。

水晶は、ケイ　ウェーバ−アンド　エム　オズボーン（
Ｋ、Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、０ｓｂｏｒｎ）、ジャー
ナルオブ　バイオロジカル　ケミストリイ（Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａｍｉｓｔｒｙ
　）　、第２４４巻、第４４０６頁（１９６９年）の記
載に準じて行ったＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法でｓｏ、ｏｏｏ±ｔｏ、ｏｏｏの分子量を示した
。

また、比活性は、６００±１５０単位／ｍｇ蛋白質を示
した。

本発明でいうマルトテトラオース生成アミラーラゼ活性
１単位とは、１．０’八２可溶性澱粉（ｐＨ７，０）５
ｍｌに酵素液０．２ｍｊＬを加え、４０″Ｃで２０分間
反応させ、生成した還元糖をネルソンーソモジー（Ｎｅ
１ｓｏｎ−３ｏ＋ｉｏｇｙｉ）法で測定することにより
、１分間に１マイクロモルのグルコシド結合を切断する
酵素量をいう。

（２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実験２−（１
）の方法で調製したポリペプチドを、気相プロティン　
シークエンサー（アプライドバイオシステム社製造、商
品名　４７０　Ａｆｉ）にかけ１次いで、高速液体クロ
マトグラフィーにより分析して、Ｎ末端を含有する部分
アミノ酸配列を決定した。

結果は、 Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕの配列を有していることか判明した。

実験３ シュードモナス　スツッツェリ由来ポリペプチド遺伝子
の塩基配列およびポリペプチドのアミノ酸配列 （１）プラスミド　ｐＵｃ１８の調製 プラスミド　ｐＵｃ１８は、これを導入したエッシェリ
ヒア　コリ　ＪＭ８３　（ＡＴＣＣ３５６０７）から、
実験１−（２）の方法に準じて調製した。

（２）ポリペプチド遺伝子を含む組み換えＤＮＡの作製 実験１−（３）の方法に準じて組み換えＤＮＡを作製し
た。

即ち、実験１−（２）の方法で調製したポリペプチド遺
伝子を含むプラスミドに、各種制限酵素を作用させて切
断し、ポリペプチド遺伝子を含む断片を得、また、実験
４−（１）の方法て調製したプラスミド　ｐｔｒｃ　　
１８を同様に各種制限酵素で切断し、これら両断片にＴ
４ＤＮＡリガーゼを作用させて組み換えＤＮＡを作製し
た。

（３）組み換えＤＮＡのエッシエリヒア　コリへの導入 宿主微生物として、エッシェリヒア　コリＪＭ８３を用
いた。

この微生物に、実験１−　（４）の方法に準じて、組み
換えＤＮＡを移入し、形質転換させた。

次いで、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−ガラクトシド（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−
３−ｉｎｄｏｌｙ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　　ｏ
ｒ　　Ｘｇａｌ）を含有する培地に生育させ、無色のプ
ラークを形成した微生物を形質転換微生物として選択し
た。

（４）形質転換微生物からの組み換えＤＮＡの調製 形質転換微生物を、抗生物質アンピシリン５０ｐ、　ｇ
　／　ｍ　ｌを含むＬ−ブロスで培養し、得られる菌体
からアルカリ溶菌法により組み換えＤＮＡを調製した。

（５）組み換えＤＮＡの塩基配列 ジデオキシ　チェーンターミネータ法に従って解読した
。

すなわち、実験３−　（４）で調製した組み換えＤＮＡ
と合成プライマー（１７塩基）を加え、６０℃で２０分
間アニーリングした後。

ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、［α−”Ｐ］ｄＣＴＰおよびク
レノー断片を加え、３７℃で３０分間反応させ、プライ
マーを５′側から３′方向へ伸長させて相補ＤＮＡを生
成させた。これに過剰のｄＮＴＰを加えて、さらに３７
℃で３０分間反応させた後、ホルムアミド色素溶液を加
えて反応を停止させた０次いで、３分間煮沸し、これを
６％ポリアクリルアミドゲルを用いて、約２５ｍＡで電
気泳動し、伸長した相補ＤＮＡを分離した。電気泳動し
た後、ゲルを固定し乾燥させた。

本ゲルを用いて、オートラジオグラフィーを行ない、オ
ートラジオグラム上の塩基断片のシーフェンス解析を行
ってポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。

その結果は、第１−１表に示した。

また、それの５′側の上流に続くシグナルペプチド遺伝
子の塩基配列も同様にして調べた。

その結果は、第１−２表に示した。

（６）ポリペプチドのアミノ酸配列 第１−１表の塩基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ
酸配列を決定し、その結果を第２−１表に示した。

また、それのＮ末端側の上流に続くシグナルペプチドの
アミノ酸配列を決定し、その結果を第２−２表に示した
。

以上の結果から、シュードモナス　スッッツェリ由来ポ
リペプチドのアミノ酸配列は、第２−１表の配列を有し
ていることか明らかになった。

第１−１表 ＧＣＧＧＡＣＣＴＣＡ　　ＡＣＡＣＣＧＧｒＣ八　ＣＣ
ＣＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴ　　ＴＣＣＧＣ
ＧＡＴＧＡ　　ＡＴＴＣ八ＣＣへＡＣ５５０５ＧＯ５７
０５８０５９０６００ＣＴＧＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＡＣ
ＧＧ丁ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴ
ＴＴＧＴＴＣＧＧＧＧＣＴＡＴＧＣＧＣＣＧ第１−２表 第２−１表 Ｄ　Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１６＞　Ａｓｐ−Ｇ　１ｕ−
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ
−Ｈ１ｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−Ａｒ
ｇ−Ｇ　Ｉｕ−３Ｄ　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−／ｈ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−１−４６＞　ｌ１ｅ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＧＩｙ：Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Δ
Ｉａ−Ｉ　１ｅ−Ｔｒｐ−）１ｓｔ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１
−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−９Ｄ　Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ｉｌｎ−ＡＩａ−Ａ　１ａ−Ｓ
ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ（ｉ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ａ　１
ａ−１（Ｘ３＞　Ｇ　１ｙ−Ｖａ　１−ｕｙｓ−Ｖａ　
１−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−）４ｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−１
２Ｄ　Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｉｌｅ−／’、５ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−１６６＞　Ｇｌｙ−！
ｌ１ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−動
ｔ−Ｐｈｅ−〜−ｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−罫１−
Ａ５ｎ−１８Ｄ　Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＩＳＩＸ３＞　
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−２１１＞　Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（ｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（ｉｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−２
２６＞　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａ
ｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｒｐ（ｉｌｎ−Ｇｌｎ−２４Ｄ　Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ（ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｐ−２５６＞　Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ａｒｇ−）４ｅｔ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Δｌａ−Ａｒ
ｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（ｉ　１ｙ−２８６＞　Ｖ
ａｌ−計−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈ１ｓ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−３０１＞　Ａｓｎ−Ｇ　１ｙ−
Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−Ｈ１ｓ−Ｈ１ｓ−Ｔｒｐ−Ａ　１
ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｉ
　ｌｅ−Ａｒｇ−３１６＞　Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−３３
１）　Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−１（ｉｓ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｉ−３４６）　Ｇｉｎ−Ｌｅｕ
−Ｉｌｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−〜ｚ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ｓ
ｅｒ−３６１＞　Ａｌａ−Ｉ　１ｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
Ｈ１ｓ−Ｓｅｒ−Ｇ　ｌｙ”Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇ　１ｙ
−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ−３
７６＞　５ｅｒ（ｉｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３９Ｄ　Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ｉｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖ
ａｌ−４０６＞　Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｎ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−πｕ−Ｇｌｙ−４２１＞　５ｅｒ−
Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ
　１ｙ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｖａ　
ｌ−Ｓｅｒｌ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒ＞　Ｃｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−）４ｅ
ｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−４５Ｄ　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（
ｉｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−４９６＞　Ａ
ｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｎ−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｒｐ（ｉ　
１ｎ−（２１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ａｌａ−５１１＞　Ａｓｎ
−ＡＡｓｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒ＞しＵ 第２−２表 ）１ｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−）
４ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓａ
ｒ−）４ｅｔ−Ａｌａ実験４　形質転換微生物によるポ
リペプチドの調（製 シュードモナス　スツッツェリ由来のポリペプチド遺伝
子を含む組み換えＤＮＡを導入した形質転換微生物エツ
シェリヒア　コリ　ＴＰＳ６１８（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９
２０２）およびシュードモナス　スツッツェリ　ＭＯ−
１９（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２０３）を用いてポリペプチ
ドを調製した。

また、これら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供与
体微生物シュードモナス　スッッツェリの産生ずるポリ
ペプチド産生量をその活性で比較した。

液体培地は、液化澱粉４ｗ八へ、コーンステイープリカ
ー１　、０　’／Ｊ、ボリヘプ）　ン０　、５　’／Ｊ
、硝酸アンモニウム０゜２　’／ｖ％、リン酸二カリウ
ム０．２’／Ｊ、塩化カルシウム・２水塩０．０５’／
ｖｌおよび水からなり、ＰＨ７，２に調整して１２０℃
で゛２０分間減菌し、冷却して調製した。

エツシェリヒア　コリ　ＴＰＳ６１８の場合には、この
培地に、抗生物質アンピシリンをｍｌ当り５０ｐｇの割
合で加えて植菌し、またエッシェリヒア　コリ　ＨＢＩ
ＯＩの場合には抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ３
７℃、２４時間通気攪拌培養した。

また、シュードモナス　スッッツェリ　ＭＯ−１９ＦＥ
ＲＭ−Ｐ　　９２０３の場合には、前記液体培地に抗生
物質を加えることなく、２８°Ｃて２４時間および９６
時間培養した。各培養液を、遠心分離し、上清と菌体と
に分離し、上清はそのまま活性測定し、菌体は超音波処
理にて破壊した後活性測定し、培養液量に換算して活性
を求めた。結果は、第３表に示す。

第３表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており。

工業的生産方法として好都合である。

また、これら上清を硫安０．４飽和で塩析して粗ポリペ
プチド剤を調製、採取した。このポリペプチド剤を用い
て澱粉からのマルトテトラオース生成量、至適温度、至
適ＰＨ，安定温度、安定ＰＨなどの酵素的性質について
比較したところ、形質転換微生物のポリペプチドは、供
与体微生物シュードモナス　スツッツェリの培養２４時
間のそれとよく一致した。

しかしながら、シュードモナス　スツッツェリの培養９
６時間のポリペプチド剤は、培養２４時間のそれとは、
至適温度、至適ＰＨ１安定温度、安定ＰＨなどの点で異
なっており、＊粉質に作用させる上でより優れているこ
とが判明した。

そこで、次に述べるように、シュードモナススツッツェ
リ　ＭＯ−１９の培養９６時間の培養液を用いてポリペ
プチドを高度に精製し、詳細に調べた。すなわち、培養
液を膜濾過し、得られる濾液を硫安で塩析し、０．２乃
至０．４飽和沈澱画分を採取して透析し、次いで、陰イ
オン交換クロマトグラフィー（東洋曹達株式会社製造、
商品名、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ−１６５０Ｓを使
用し、更に、スウェーデン国ファルマシア社製造、商品
名ＭｏｎｏＱを使用）を行ってポリアクリルアミドゲル
電気泳動で単一バンドを示す高純度ポリペプチド溶液を
採取した、 この精製工程によって比活性は、約４．３倍に増加し、
ポリペプチドの回収率は約４８％であった。

なお、得られたポリペプチドは、比活性６８０±６０（
単位／ｍｇ蛋白質）を示し、次のような理化学的性質を
有する。

（ａ）作　用 澱粉に作用して、主にマルトテトラオースを生成する。

（ｂ）基質特異性 澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよ
びβ−リミットデキストリンに作用し、シクロデキスト
リン、デキストラン、プルランおよびエルシナンには、
実質的に作用しない。

（ｃ）至適ＰＨ ４０℃、２０分間て、ｐＨ７，０乃至７．５附近。

（ｄ）安定ＰＨ ４０℃、１時間て、ＰＨ６，５乃至９．５附近。

（ｅ）至適温度 ＰＨ７，０，２０分間で、５０℃附近。

（ｆ）安定温度 ｐ）Ｉ７．０１１時間で、４５℃附近まで、但し、カル
シウムイオン共存下では、５０°Ｃ附近まて活性を完全
に残存し、５５℃附近で約７０％の活性を残存する。。

（ｇ）阻害、安定化 水銀イオンにより活性が阻害される。

カルシウムイオンにより熱安定性が向上する。

（ｈ）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、４
６，０ＯＯｆｌ、０００゜ 超遠心分析法により、偏比容×密度＝０．７５としたと
き、４７．ＯＯＯ±２，０００゜（ｉ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、ｐＩ
　　４．８附近。

（ｊ）紫外部吸収 ２７５乃至２８０ｎｍ附近。

また、この高純度ポリペプチドを約１．０’八２含有す
る１０ｍＭトリス塩＃緩衝液（ｐＨ８，０）を４℃で１
ケ月間放置したところ、結晶が析出した０本結晶のＪＩ
ｌ微鏡写真（ｘ２２０）を第３図に示す。

更に、この高純度ポリペプチドを用いて、ジャーナル　
才ブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）、　第２５６巻、第７９９０乃至７９９７頁（１
９８１年）の記載に準じて、気相プロティン　シークエ
ンサーによりエドマン分解し、その分解物を高速液体ク
ロマトグラフィーで同定した。

その結果１本ポリペプチドのＮ末端アミノ酸から２０個
まてのアミノ酸配列は、 Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕの順であった。

また、本ポリペプチドを用いて、ザ　ジャーナル　オブ
　バイオロジカル　ケミストリ（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
第２４８巻、第７号、第２２９６乃至２３ｅ２頁（１９
７３年）の記載に準じてＣ末端鎖のアミノ酸配列を調べ
た。

その結果、Ｃ末端側から順に、Ａｌａ。

Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕであった。

以上の実験結果から、培養９６時間のポリペプチドは、
第４表に示されるアミノ酸配列を有しているものと判断
される。

第２−１表と第４表のアミノ酸配列を比較することによ
り、培養初期に産生された第２−１表に示されるポリペ
プチドは、培養期間中にそのＣ末端側が切断されて第４
表に示されるポリペプチドに低分子化するものと判断さ
れる。

第４表 Ｄ　Ａｓｐ（ｉｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｎ＜−Ｔｙｒ−
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１６＞　Ａｓｐ（ｉ　Ｉｕ−
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ（ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｈｅ−
Ｈ１ｓ−Ｔｒ’ｐ−Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　１−Ａ
ｒｙ−Ｇ　１ｕ−３Ｄ　　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−八ｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−八１ａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−９１＞
　Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ（ｉｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−１０６＞　Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−）１ｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−１２Ｄ　Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−１６６＞　Ｇｌｙ
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
）％ｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｚ７Ｄ　Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−２８６
＞　Ｖａｌ−計−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｈ１ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−３０１＞　Ａｓｎ−Ｇ　
１ｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−ＩＩ　１ｓ−ｔ（１ｓ−Ｔ
ｒｐ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｙ
−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−３１６＞　Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ−八１ａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−３３Ｄ　Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−３４６＞　Ｇｉ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Δｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−３６１＞　Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−３７
６＞　５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ａｓｐ叱ｅｕ−３９Ｄ　　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−八Ｉａ−Ｖａ
ｌ−４０６＞　Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−４２Ｄ　５ｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ
ｌａなお、これらアミノ酸配列を、アプライド　マイク
ロバイオロジー　アンド　バイオテクノロジー（Ａｐｐ
目ｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　８ｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第２３巻、第３５５乃至３６０頁
（１９８６年）に記載されている各種α−アミラーゼの
アミノ酸配列と比較してみた。

意外なことに、エンド型澱粉分解酵素であるα−アミラ
ーゼのアミノ酸配列において、第１領域乃至第４領域と
して特定されている部分アミノ酸配列が、エキソ型澱粉
分解酵素である本ポリペプチドにも存在していることが
判明した。

結果を、第５表に示す。

第５表の結果から明らかなように、本ポリペプチドは、
α−アミラーゼの特定償域のアミノ酸配列と近似した部
分アミノ酸配列を有しており、この部分アミノ酸配列が
澱粉に作用するに際して大きく関与しているものと判断
される。

すなわち、本ポリペプチドの特定された部分アミノ酸配
列として、 （ａ　）　Ａｓｐ−Ｖａｌ−シａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−Ｍｅｔ（ｂ　）　Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｃ　）　Ｐｈ
ｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙおよび （ｄ　）　Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
旧５−Ａ５ｐ−Ｔｈｒの配列を有していることが判明し
、しかも、これら部分アミノ酸配列は、Ｎ末端側から近
い順に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の部分配列を有
していることか判明した。

以下１本発明の実施例と優れた効果を述べる。

実施例１．ポリペプチド 溶性澱粉３ｗ八へ、コーン　ステイープ　リカー０．５
ｗ八へ、ポリペプトン　０．２ｗ八へ、リン酸二カリウ
ム　０．２’八２、塩化カルシウム・２水塩ｏ、ｏｓ’
八２へよび水からなる液体培地をｐＨ７，２に調整し、
この１００ｍ文ずつを５００ｍＪＬ容振とうフラスコに
とり、１２０”Ｃで２０分間オートクレーブした後、シ
ュートモナススッッツェリ　ＭＯ−１９を１白金耳ずつ
植菌し、２７℃で９６時間振どう培養した。

培養液のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性は、ｍ
ｌ当り約２５０単位であった。

培養液を遠心分離し、得られる上清のポリペプチド含有
液は、澱粉質からのマルトテトラオース高含有物製造に
有利に利用できる。

実施例２．　ポリペプチド 液化澱粉４ｗ八へ、コーン　ステイープ　リカー１．０
’／Ｊ、ボリヘプ）：／　　０．５’／Ｊ、硝８７ンモ
ニウム０．２’／ｖ＄、リン酸二カリウム０゜２ｗ八へ
、塩化カルシウム・２水塩ｏ、ｏｓ’八Ｘへおよび水か
らなる液体培地を３０文容ジャーファーメンターに１５
ｉＬ入れ、ｐＨ７，０に調整し、１２０℃で２０分間減
菌し、冷却して調製した。この培地に抗生物質アンピシ
リンをｍ１当り５０ＪＬｇの割合で加えた後、形質転換
微生物エツジエリシア　コリ　ＴＰＳ６１８の種培養液
を１　ｖ／Ｊ植菌し、３７°Ｃで２４時間通気攪拌培養
した。培養液のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性
は、ｍｌ当り約３００単位であった。培養液からの菌体
を超音波処理し、遠心分離して得られる上清を、実験２
−　（１）の方法に準じて精製し、高度に精製されたポ
リペプチド含有液を得た。

本ポリペプチド含有液は、澱粉質からのマルトテトラオ
ース高含有物の製造に有利に利用できる。

実施例３．マルトテトラオース含有物 コーンスターチ１重量部を澱粉当り０．１’八２の割合
にα−アミラーゼ（デンマーク国、ノボ社、商品名ター
マミール６０Ｌ）を含む水３．０重量部に攪拌混合し、
ｐＨ６，５に調整後、この懸濁液を９５乃至１００°Ｃ
に保ち糊化と液化を同時に起させ、さらに反応を進めて
ＤＥ４．５になつだ時に、１２０℃に５分間加熱し、こ
れを６０℃にまて急速に冷却し、これに実施例１の方法
で得たポリペプチド含有液（上清）を澱粉ダラム当り４
単位の割合で加え、ｐ）１１３．５．５５°Ｃで４６時
間糖化した。

本糖化物を加熱し、酵素を失活させ、濾過し、活性炭に
て脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂にて脱塩し、濃
縮して水分２５ｗ八２のシラツブ状マルトテトラオース
高含有物を原料澱粉固形物当り９５％の収率で得た。

水晶は、マルトテトラオースを固形物当り、約５５％含
有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約２５％
であった。

水晶は、低甘味、低糖度甘味剤として、また。

ボディー付与剤、粘度ｆＪＲｔＭ剤、保湿剤、照付与剤
、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャンデイ−のダレ防
止剤などとして広く飲食物に利用される。

実施例４．マルトテトラオース高含有物馬鈴薯澱粉１重
量部を澱粉当り０．０１’八２の割合にα−アミラーゼ
（ナガセ生化学工業株式会社、商品名、ネオスピターゼ
）を含む水６重量部に攪拌混合し、ｐＨ６，０に調整後
、この懸濁液を８５乃至９０に保ち、糊化と液化を同時
に起させ、直ちに１２０℃に５分間加熱してＤＥｌ、０
未満にとどめ、これを５５℃に急冷し、ＰＨ７，０に調
整し、これに株式会社林原生物化学研究所製造、商品名
プルラナーゼ（ＥＣ３，２゜１．４１）および実施例２
の方法で得た高度に精製されたポリペプチド含有液をそ
れぞれ澱粉ダラム当り１５０単位および８単位の割合で
加え、ｐＨ７，０，５０℃で３６時間糖化した。

本糖化物を、実施例３と同様に精製濃縮し、更に噴霧乾
燥して水分１　’／Ｊ未滴の粉末状マルトテトラオース
高含有物を原料澱粉固形物当り約９３％の収率で得た。

水晶は、マルトテラオースを固形物当り約７６％含有し
ており、また、その甘味度は砂糖のそれの２５％であっ
た。

水晶は、低甘味、低糖度甘味剤として、実施例３の場合
と同様に広く飲食物に利用てきる。

実施例５．マルトテトラオース高含有物実施例４の方法
で得たマルトテトラオース高含有物を強酸性カチオン交
換樹脂を用いて、そのマルトテトラオース含量を高めた
。

実施例４の方法て製造したマルトテトラオース高含有物
を濃度６０’／ｗＸにして原糖液とした。

樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京
有機化学工業株式会社製造、商品名ＸＴ−１００７、Ｎ
ａ”型、架橋度６％）を使用し、内径５．４ｃｍのジャ
ケット付ステンレス製カラム４木を連結して樹脂層全長
を２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に維持しつつ、
原糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖｚ加え、これに５５°Ｃ
の温水を５ｖＯ４１３で流して分画し、マルトテトラオ
ース含量９０％以上のマルトテトラオース高含有画分を
採取し、実施例３と同様に精製し、濃縮して、水分２５
’八２のシラツブ状マルトテトライール高含有物を原糖
固形物当り約６０％の収率で得た。

水晶は、マルトテトラオースを固形物当り約９３％含有
しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約２５％で
あった。

水晶は、低甘味、低糖度甘味剤として、実施例３の場合
と同様に広く飲食物に利用できる。

実施例６．マルトテトライトール高含有物実施例３の方
法で得たマルトテトラオース高含有物を７３縮５０％水
溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒としてラネーニ
ッケル１０％を添加し、攪拌しながら温度を９０乃至１
２５℃に上げ、水素圧を２０乃至１００　”／、、２に
上げて水素化を完了させた０次いで、ラネーニッケルを
除去した後、実施例３と同様に精製し濃縮して、水分２
５　’／Ｊのシラツブ状マルトテトライトール高含有物
を原料のマルトテトラオース高含有物固形物当り約９２
％の収率で得た。

水晶は、マルトテトライトールを固形物当り約５５％含
有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約３０％
であった０本品は、低甘味、非還元性甘味剤として、ま
た、ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤、
接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャンデイ−のダレ防止
剤などとして広く飲食物に利用される。

実施例７．マルトテトライトール高含有物実施例４の方
法で得たマルトテトラオース高含有物を実施例６の方法
で準じて水素化し、精製濃縮して水分２５　’／、ｌの
シラツブ状マルトテトライトール高含有物を原料のマル
トテトラオ−ス高含有物固形物当り約９２％の収率て得
た。

水晶は、マルトテトライトールを固形物当り約７６％含
有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約３０％
であった。

水晶は、低甘味、非還元性甘味剤として、実施例６の場
合と同様に広く飲食物に利用できる。

実施例８．　甘味料 実施例６の方法で得たシラツブ状マルトテトラオース高
含有物１重量部にα−グリコシルステビオシド（東洋精
糖株式会社製造、商品名α−Ｇスイー）−）０．０２重
量部を均一に混合して得たシラツブ状甘味料は、甘味の
質かすぐれ、砂糖の約２倍の甘味を有し、カロリーは甘
味度当り砂糖の約坏となる。従って、本甘味料は、低カ
ロリー甘味料として、カロリーの摂取を制限している人
、例えば、肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲
食物などに対する甘味付に好適である。

また１本甘味料は、虫歯誘発菌によって酸の生成も少な
く、不溶成グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑
制する飲食物などに対する甘味付にも好適である。

実施例９．　カスタードクリーム コーンスターチ５００重量部、実施例４の方法で得た粉
末状マルトテトラオース高含有物４００重量部、マルト
ース５００重量部および食塩５重量部を、篩を通して充
分に混合し、鶏卵１．４００重量部を加えて攪拌し、こ
れに情態した牛乳ｓ、ｏｏｏ重量部を徐々に加え、更に
これをとろ火にかけて、攪拌を続け、コーンスターチが
完全に糊化して全体が半透明になったとき火を止め、こ
れを冷却して少量のバニラ香料を加えることによりカス
タードクリームを製造した。

水墨は、なめらかで光沢を有し、甘味が強すぎず美味で
ある。

実施例１０．　　ういろう 米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、砂糖２
０重量部、抹茶粉末１重量部、実施例７の方法で得たシ
ラツブ状マルトテトライトール高含有物９０重量部およ
び水の適量を加えて混練した後、これを容器に入れて６
０分間蒸して抹茶ついろうを製造した。

水墨は、照り１口当りも良好で、風味もよかった。また
、Ｗｉ粉の老化も制御され、長期間安定であった。

実施例１１．　　ハードキャンデイ− 実施例５の方法で得たシラツブ状マルトテトラオース高
含有物７’Ｏ重量部に砂糖９０重量部を混合溶解し、減
圧下で水分的２ｗへ２未満になるまで加熱濃縮して、こ
れにクエン酸０．１５重量部および少量のレモン香料と
着香料とを混和し、次いで、常法に従って成形して八−
トキヤンデイ−を製造した。

水墨は、吸湿性少なく、ダレを起しにくい歯切れのよい
ハードキャンデイ−である。

実施例１２．　つくだ煮 常法に従って砂取り、酸処理して角切りした昆布２５０
重量部に、醤油２１２重量部、アミノ酸液３００重量部
、砂糖４０重量部および実施例３の方法で得たシラツブ
状マルトテトラオース高含有物２０重量部を加えて煮込
みつつ、更にグルタミン酸ソーダ１２重量部、カラメル
８重量部および味淋２１重量部を加えて煮き上げて昆布
の佃煮を製造した。・ 水墨は、味、香りだけでなく、色、艶も充分で食欲をそ
そる昆布のつくだにである。

実施例１３．　　べっ、たら漬 実施例８の方法で得たシラツブ状甘味料４重量部、甘草
製剤０．０５重量部、リンゴ酸０．００８重量部、グル
タミン酸ナトリウム０．０７重量部、ソルビン酸カリウ
ム０．０３重量部およびプルラン０．２重量部を均一に
混合してべったら漬の素を製造した。

大根３０にｇを常法に従って食塩により下漬けし、次い
で砂糖で中漬したものを、本ベウたら漬の素４Ｋｇで調
製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。

水墨は１色艶、香気共に良好で、適度の甘味を有し歯切
れもよかった。

実施例１４．　経管流動食 実施例４の方法で得た粉末状マルトテトラオース高含有
物５５０重量部、無水結晶マルトース（林原株式会社製
造、登録商標ファイントース）５０重量部、乾燥卵黄１
９０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４
．４重量部、塩化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネ
シウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビ
ン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０
．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からな
る配合物を調製する。

この配合物２５ｇずつをラミネートアルミ製小包に充填
し、ヒートシールして固状の栄養補給用剤を製造した。

水墨は、低温貯蔵の必要もなく、室温下で長期間安定で
あり、流動性、溶解分散性も良好である。

本山は、１袋分を約１５０乃至３００ｍＡの水に溶解し
て経管流動食とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃、
腸などへ投与して使用する。

実施例１５．　　　錠剤 アスピリン５０重量部に実施例４の方法で得た粉末状マ
ルトテトラオース高含有物６重量部およびコーンスター
チ８重量部を充分に混合した後、常法に従って、打錠機
により打錠して、厚さ５．２５ｍｍ、１錠６ｓｏｍｇの
錠剤を製造した。

本山は、吸湿性か低く、物理的強度も充分にあり、しか
も水中での期壊はきわめて良好であった。

〈発明の効果〉 上記したことから明らかなように、本発明は、ポリペプ
チドのアミノ酸配列を解明し、その解明されたポリペプ
チドを用いる澱粉質からのマルトテトラオース高台Ｉｖ
物の製造方法並びにそのマルトテトラオース高含有物か
らのマルトテトライトール高含有物の製造方法、更に、
それらマルトテトラオース高含有物またはマルトテトラ
イトール高含有物を使用した飲食物の製造方法に関する
。

本発明は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
用いることにより、安心して澱粉を加水分解できるのみ
ならず、この加水分解物およびその水素添加物を利用し
て風味良好な飲食物を容易に製造しつることが判明し、
その工業的意義は大きい。

更に、飲食物の製造に際して、澱粉質に含有せしめたポ
リペプチドが、飲食物の風味を損なうことなく、シかも
安心してそのまま食用に供しうることも大きな特徴であ
る。

その上、ポリペプチドの給源として、元来、ポリペプチ
ド産生量を有するシュードモナス　スツッツェリのみな
らず、その産生能を有するポリペプチド遺伝子を生体外
遺伝子組換え技術により導入した形質転換微生物も利用
しうることを解明したことは、より広ａ囲な給源を確保
するとともにポリペプチド産生量の向上を容易に達成す
ることとなり、その工業的意義は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は、電子顕微鏡で１０，０００倍に拡大したシュ
ードモナス　スツッツェリ　ＭＯ−１９（ＦＥＲＭ−Ｐ
９２０３）の細胞の形状の一例を示す写真である。 第２図は、組換えＤＮＡ　　ｐＴＰｓ６１８について、
シュードモナス　スツッツェリ由来ＤＮＡ部分の制限酵
素切断地図を示す。 第３図は、ｍ微鏡で２２０倍に拡大したポリペプチドの
結晶の一例を示す写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、 および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒから選ばれる１種以上の配列を有し
   ていることを特徴とするマルトテトラオース生成アミラ
   ーゼ活性を有するポリペプチド。 （２）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ末
   端側から近い順に、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒの配列を有していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１）項記載のマルトテトラオース
   生成アミラーゼ活性を有するポリペプチド。 （３）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
   ノ酸配列として、 Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐ
   ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉ
   ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
   −Ｌｅｕの配列を有していることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）項または第（２）項記載のマルトテトラ
   オース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチド。 （４）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法で、５０，０００±１０，０００の分子量
   を示すことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第
   （２）項または第（３）項記載のマルトテトラオース生
   成アミラーゼ活性を有するポリペプチド。 （５）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【遺伝子
   配列があります】 【遺伝子配列があります】 または、 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１）項、第（２）項、第（３）項または第（４）項記
   載のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポ
   リペプチド。 （６）ポリペプチドが、それが分泌されるためのシグナ
   ルペプチドとして、Ｎ末端側上流に、Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
   Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖ
   ａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｍｅｒ−Ａｌａ
   のアミノ酸配列を有していることを特徴とする特許請求
   の範囲第（５）項記載のマルトテトラオース生成アミラ
   ーゼ活性を有するポリペプチド。 （７）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミラ
   ーゼ産生能を有する微生物由来のポリペプチドであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第（２）項
   、第（３）項、第（４）項、第（５）項または第（６）
   項記載のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有す
   るポリペプチド。 （８）ポリペプチドが、シュードモナススツッツェリ由
   来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）項、第（２）項、第（３）項、第（４）項、
   第（５）項、第（６）項または第（７）項記載のマルト
   テトラオース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチド
   。 （９）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミラ
   ーゼ遺伝子を含むＤＮＡを導入した形質転換微生物由来
   のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲
   第（１）項、第（２）項、第（３）項、第（４）項、第
   （５）項、第（６）項、第（７）項または第（８）項記
   載のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポ
   リペプチド。 （１０）部分アミノ酸配列として、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、 および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒから選ばれる１種以上の配列を有し
   、且つマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有する
   ポリペプチドを澱粉質に作用せしめ、得られるマルトテ
   トラオース高含有物を採取することを特徴とするマルト
   テトラオース高含有物の製造方法。 （１１）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ
   末端側から近い順に、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒの配列を有していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１０）項記載のマルトテトラオー
   ス高含有物の製造方法。 （１２）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分ア
   ミノ酸配列として、 Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐ
   ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉ
   ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ
   −Ｌｅｕの配列を有していることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１０）項または第（１１）項記載のマルトテ
   トラオース高含有物の製造方法。 （１３）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動法で、５０，０００±１０，０００の分子
   量を示すことを特徴とする特許請求の範囲第（１０）項
   、第（１１）項または第（１２）項記載のマルトテトラ
   オース高含有物の製造方法。 （１４）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【遺伝
   子配列があります】 【遺伝子配列があります】 または、 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１０）項、第（１１）項、第（１２）項または第（１
   ３）項記載のマルトテトラオース高含有物の製造方法。 （１５）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミ
   ラーゼ産生能を有する微生物由来のポリペプチドである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（１０）項、第（１
   １）項、第（１２）項、第（１３）項、または第（１４
   ）項記載のマルトテトラオース高含有物の製造方法。 （１６）ポリペプチドが、シュードモナススツッツェリ
   由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の
   範囲第（１０）項、第（１１）項、第（１２）項、第（
   １３）項、第（１４）項または第（１５）項記載のマル
   トテトラオース高含有物の製造方法。 （１７）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミ
   ノラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを導入した形質転換微生物
   由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の
   範囲第（１０）項、第 （１１）項、第（１２）項、第（１３）項、第（１４）
   項、第（１５）項または第（１６）項記載のマルトテト
   ラオース高含有物の製造方法。 （１８）マルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有す
   るポリペプチドを、他の澱粉質関連酵素とともに作用せ
   しめることを特徴とする特許請求の範囲第（１０）項、
   第（１１）項、第（１２）項、第（１３）項、第（１４
   ）項、第（１５）項、第（１６）項または第（１７）項
   記載のマルトテトラオース高含有物の製造方法。 （１９）部分アミノ酸配列として、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、 および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒから選ばれる１種以上の配列を有し
   、且つマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有する
   ポリペプチドを澱粉質に作用せしめ、得られるマルトテ
   トラオース高含有物を水素添加することを特徴とするマ
   ルトテトライトール高含有物の製造方法。 （２０）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ
   末端側から近い順に、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒの配列を有していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１９）項記載のマルトテトライト
   ール高含有物の製造方法。 （２１）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分ア
   ミノ酸配列として、 【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１９）項または第（２０）項記載のマルトテトライト
   ール高含有物の製造方法。 （２２）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動法で、５０，０００±１０，０００の分子
   量を示すことを特徴とする特許請求の範囲第（１９）項
   、第（２０）項または第（２１）項記載のマルトテトラ
   イトール高含有物の製造方法。 （２３）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【遺伝
   子配列があります】 【遺伝子配列があります】 または、 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１９）項、第（２０）項、第（２１）項または第（２
   ２）項記載のマルトテトライトール高含有物の製造方法
   。 （２４）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミ
   ラーゼ産生能を有する微生物由来のポリペプチドである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（１９）項、第（２
   ０）項、第（２１）項、第（２２）項または第（２３）
   項記載のマルトテトライトール高含有物の製造方法。 （２Ｓ）ポリペプチドが、シュードモナススツッツェリ
   由来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の
   範囲第（１９）項、第（２０）項、第（２１）項、第（
   ２２）項、第（２３）項または第（２４）項記載のマル
   トテトライトール高含有物の製造方法。 （２６）ポリペプチドが、マルトテトラオース生成アミ
   ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを導入した形質転換微生物由
   来のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１９）項、第（２０）項、第（２１）項、第（２
   ２）項、第（２３）項、第（２４）項または第（２５）
   項記載のマルトテトライトール高含有物の製造方法。 （２７）飲食物の製造に際し、部分アミノ酸配列として
   、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、 および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒから選ばれる１種以上の配列を有し
   、且つマルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有する
   ポリペプチドを澱粉質に作用せしめて得られるマルトテ
   トラオース高含有物、または、それを水素添加して得ら
   れるマルトテトライトール高含有物を含有せしめること
   を特徴とする飲食物の製造方法。 （２８）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ
   末端側から近い順に、 （ａ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ｍｅｔ （ｂ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ （ｃ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
   ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ および （ｄ）Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒの配列を有していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（２７）項記載の飲食物の製造方法
   。 （２９）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動法、５０，０００±１０，０００の分子量
   を示すことを特徴とする特許請求の範囲第（２７）項ま
   たは第（２８）項記載の飲食物の製造方法。 （３０）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【遺伝
   子配列があります】 【遺伝子配列があります】 または、 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 の配列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第
   （２７）項、第（２８）項または第（２９）項記載の飲
   食物の製造方法。