JPH01117786A

JPH01117786A - 酵素安定化剤

Info

Publication number: JPH01117786A
Application number: JP62272769A
Authority: JP
Inventors: Makoto Sugiyama; 信杉山; Yoji Ezure; 洋治江連; Shigeaki Maruo; 丸尾　重昭; Masahiko Kojima; 政彦小島; Hiroshi Yamashita; 博司山下
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-10-28
Filing date: 1987-10-28
Publication date: 1989-05-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、Ｗ類加水分解酵素を安定化する技術に関する
。

本発明物質は、糖類を加水分解する酵素に耐熱性を与え
、Ｉ！類を有用物質とするための酵素の作用を活発化す
るため、医薬品創生上や食品加工上極めて有用である。

（従来の技術）一般に糖類の加水分解酵素は、基質の存在下でその耐熱
性を増すことが知られているが、その効果を期待するに
は、相当濃い基質濃度が必要である（千畑一部「固定化
酵素」２６２頁、１９７５゜講談社）。

しかもこれらの酵素も基質が存在しない状態では、熱に
弱い性質があった。

例えば、［１加水分解酵素の一種であるグルコアミラー
ゼ（ＥＣ，３，２，１，３，）は、澱粉等をその非還元
末端から加水分解してβ−グルコースを遊離する酵素で
あるが、シクロデキストリン類を加水分解しないことが
知られている。この酵素は一般にｐＨ５，０付近、室温
以下の温度では比較的安定である（４°Ｃでは１ケ月以
上安定）。しかし、５０℃を越えると非藪に不安定にな
り、変性し失活することが知られていた。

（発明が解決しようとする問題点）医薬品や食品を大量に生産する過程においては、工業的
規模での反応工程や精製処理が必須であり、そのような
長時間の過酷な条件下におかれた場合にも上記酵素が失
活しない工夫が必要であった。

また、工業的規模においては雑菌の混入や生育を防ぐ工
夫も必須であり、このような場合は高温を保つという簡
便な方法をとることができれば非常に有利であることが
判っていた。

従って、本発明の目的は、熱に安定な酵素を見出すこと
にあった。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、種々のＰｌ類加水分解酵素の耐熱性を増
強させるため、鋭意研究を重ねたところ、意外にもシク
ロデキストリン類がＷ類別水分解酵素の耐熱性を著しく
増強することを見出し、本発明を完成することができた
。

シクロデキストリン類が、種々の薬物を安定化すること
は、これまでにも知られている。しかしながら、ｖＮＮ
類本水分解酵素耐熱性との関係を見出したのは本発明者
らが初めてであり、ここに本発明の重要な要旨がある。

本発明で用いられるシクロデキストリン類としては、α
（重合度６）、β（重合度７）、γ（重合度８）等を挙
げることができるが、とりわけα−シクロデキストリン
が好ましい。

￥１１１加水分解酵素としては、グルコアミラーゼ、シ
クロデキストリングリコシルトランフフェラーゼ（ＣＧ
Ｔａｓｅ）等を挙げることができる。

これらの酵素は、種々の糸状菌や酵母さらに細菌から得
られるが、本発明は酵素の起源により限定されるもので
はない。

糖類加水分解酵素を耐熱化するに際し、ｔｉ類加水分解
酵素を適当な緩衝剤（例、酢酸緩衝液、炭酸ソーダ、ホ
ウ酸緩衝液）に溶解又は懸濁させた後、シクロデキスト
リン類を、通常０．１〜１．０％となるように添加する
。場合によってはこれ以下で足りるし、また逆にこれ以
上の用量を必要とすることもある。また、ｔｉｎ加水分
解酵素とシクロデキストリン類とを同時に混和してもよ
い。

耐熱性の測定は、以下のようにして行うことができる。

基質のない状態では、適当な緩衝液中で糖類加水分解酵
素をシクロデキストリン類と共存させたものと、共存さ
せないものを、一定の温度に保存する。対照として、低
温（例えば、４°Ｃ）で保存したものを用意し、それぞ
れの酵素活性を測定する。残存活性は、次の式により算
出することができる。

酵素活性（例、グルコアミラーゼ活性）の測定は、種々
の温度で保存した酵素液１００μ２と１．４％可溶性澱
粉を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５，７）４００
ｕｌｌを混ぜ、４０″Ｃで１５分間反応させ、遊離した
グルコースを新プラッドシュガーテスト（登録商標、ベ
ーリンガーマンハイム社製）で測定して、酵素反応中の
グルコースｉ　（ｍｇ／ｄｉ）として表す。

ＣＧＴａｓｅの活性測定は以下のようにしてすることが
できる。１％可溶性澱粉液（ｐＨ５，５）　９５０μｌ
に酵素液５０ｍ１を加え、４０°Ｃで１５分間反応させ
る。

０．５Ｍの酢酸溶液５００μｌを加えて反応を停止させ
、この１００ｕｌをとり、ヨード発色液（０，２５Ｍ−
ヨウ化カリウム、０．ＯＩＭ−ヨード溶液）８００μｌ
を加え、更に水３ｍｌを加えて充分に攪拌した後、６６
０ｎｌ１１で吸光度（０，０，）を測定する。ｌユニッ
ト／ｒＩｄｌは１、酵素溶液１ｍが４０°Ｃ，１分間で
１％の０．０．を減少させる活性、と定義する。

Ａ、は、ブランクの０．０．を、またＡ、はサンプルの
０．０．を、それぞれ表す。

基質と連続的に反応させる場合、酵素液と基質の混合液
にシクロデキストリン類を共存させたものと、存在させ
ないものを一定の温度で反応させ、グルコースの蓄積量
を測定する。グルコースの定量は、前記のグルコアミラ
ーゼの活性の測定時のグルコースの定量と同様にするこ
とができる。

後述する実施例から明らかなように、グルコアミラーゼ
は、高温で基質のない状態で保存するときにも高温で基
質と連続的に反応させるときにも、α−シクロデキスト
リンを共存させておくことにより、失活することなく酵
素活性が保持されているのを明確に認めることができる
。

同様に、ＣＧＴａｓｅを用いて測定した場合にも、シク
ロデキストリン類に同様の効果を認めた。

これらのことから、シクロデキストリン類が、非常に優
れた耐熱性増強作用を有することがわかる。

また、前述のようにＩｉ類類本水分解酵素シクロデキス
トリン類とを反応させた結果、加水分解酵素とシクロデ
キストリン類の複合体が形成されていることが、差吸収
スペクトルかられかる。グルコアミラーゼの例を第１図
に示した。

（実施例）以下に、本発明物質の利用に係る実施例を掲げて本発明
を更に詳しく説明する。

実施例１５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）　　１　ｍｌに、９
０ｍＭのα−シクロデキストリンを溶解させ、この溶液
にクモノスカビ属（ＲｈＬｚｏｐｕｓ）由来のグルコア
ミラーゼ１００μｌを加え、５０°Ｃで保存する。対照
として、α−シクロデキストリンを加えていない緩衝液
にグルコアミラーゼを加えただけのものを用意して経日
的に酵素活性を測定し、４°Ｃのものに対する比率から
残存活性を求めた。同時に他のいくつかの糖類の効果と
比較した。結果を第２図に示す。

さらにこのα−シクロデキストリンの詳細な効果を、５
０°Ｃで検討して第１表に示した。

第１表上記の結果から、α−シクロデキストリンは、０．１％
の濃度でもかなり有効であることがわかった。

実施例２５０ａＭ炭酸ソーダ・ホウ酸（ｐＨ８，０）　　２ｔｎ
ｌに、５％の濃度になるように、α−シクロデキストリ
ン、マルトースをそれぞれ加えて、バチルス・マセラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のＣＧ
Ｔａｓｅを２００　ｕｌずつ加えて５０°Ｃで保存し、
酵素活性（ユニット／−）の減少を経口的に測定した。

結果を第３図に示す、無添加のものと比較して、α−シ
クロデキストリン（５％）を加えたものは、明らかに安
定化された。

実施例３５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）　　５　ｍｌに基質
としてマルトース５００ｍｇを溶解させ、更にこれに１
０ｍＭのα−シクロデキストリンを添加したものと添加
しないものとを調製して、これらに１０μｇのグルコア
ミラーゼを加え、６０°Ｃで反応させ経日的に蓄積され
るグルコース量をブラッドシュゴーテスト法で測定した
。その結果を、第４図に示す。

（効果）本発明の安定化剤は、微生物の混入、生育を防ぐことが
できるような高温で、Ｉｉ類類本水分解酵素耐熱性を増
強する。従って、本発明安定化剤の添加により、５０°
Ｃ以上の高温で酵素反応を行うことができ、さらには、
酵素を安定な状態で回収、反復使用することができるの
で、工業上（例、澱粉工業等）非常に有用である。

また、本発明安定化剤により、Ｉｉ類類本水分解酵素安
定に保存することができるので、固定化酵素など連続反
応時に酵素寿命を延長することができるほか、臨床検査
薬中の酵素（例、アミラーゼ活性測定用臨床検査薬中の
グルコアミラーゼ等）の安定化剤として診断用に用いる
ことができる。

酵素は高温であるほど活性が高いので、高虐で安定化さ
れることにより、活性増強するので、活性増強剤として
も有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明複合体の差吸収スペクトルを表す。縦
軸は吸光度を、横軸は波長を表す。第２図は、実施例１における結果を表す。縦軸はグルコ
アミ・ラーゼ残存活性（％）を、横軸は日数を表す。各
記号は、それぞれの糖類の効果を示す。第３図は、実施例２における結果を表す。縦軸はＣＧＴ
ａｓｅ活性（ユニット／ｍ１）を、横軸は日数を表す。各記号は、それぞれの＄Ｊ！［の効果を示す。第４図は、実施例３における結果を表す。縦軸は累積グ
ルコース量（ＩＩＩｇ／ｒｄ）を、横軸は日数を表す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）シクロデキストリン類を含有することを特徴とす
る糖類加水分解酵素の安定化剤。（２）シクロデキスト
リン類が、α−シクロデキストリンである特許請求の範
囲第１項記載の安定化剤。（３）シクロデキストリン類と糖類加水分解酵素とから
なる複合体。（４）シクロデキストリン類がα−シクロデキストリン
類である特許請求の範囲第３項記載の複合体。（５）糖類加水分解酵素がグルコアミラーゼである特許
請求の範囲第３項記載の複合体。