JPH01123145A

JPH01123145A - カラム用充填剤及びその製造方法

Info

Publication number: JPH01123145A
Application number: JP62281823A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Oginaka; 荻中　淳; Yukio Kimura; 行男木村; Akio Wada; 明生和田; Yoshihide Tanaka; 田中　善英
Original assignee: Japan Spectroscopic Co Ltd
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 1987-11-07
Filing date: 1987-11-07
Publication date: 1989-05-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はボア内表面とボア外表面が本質的に異なる機能
を有するクロマトグラのカラム用充填剤及びその製造方
法に関する。

内外両表面が異なる機能を有する充填剤は、従来の単一
機能の充填剤ζこ比べて多様かつ高度な応用の可能性を
有しており、現在その一例として、血清などの生体試料
の直接分析あるいはその前処理としての除タンパク処理
に応用され、画期的な効果が得られている。本発明の方
法で製造される充填剤は、多様な可能性を有するが、簡
明を期するため、以下、除タンパク前処理に主眼をおい
て説明する。

［従来の技術］血清などのタンパク質を含む生体試料中の薬物などの分
析に、クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラ
フィー（以下、ＨＰＬＣという）は、非常に有効な手段
として汎用されている。このＨＰ　Ｌ　Ｃ分析では、通
常逆相系の充填剤が多く用いられているが、試料中のタ
ンパク質は、この充填剤に非可逆的に吸着し、カラムに
つまりを生じるなど重大な障害となるため、ＨＰＬＣ分
析を行う萌に、前処理によって除タンパク処理すること
が不可欠である。このような前処理は手作業で行うため
に非常に労力を要するものである。

しかし、最近になって、充填剤の内表面を疎水性とし、
かつ外表面を親水性にするなどして、タンパク質が吸着
され難くした新しいタイプの充填剤が開発され、これを
前処理用カラムとして、カラムスイッチングバルブとと
もに）（ＰＬＯに組み込み、オンラインで除タンパク処
理ができるようにし、前述のような生体試料を直接分析
に供することが可能となっている。例として、特開昭５
８−２２３０６２号公報及び特開昭６０−５６２５６号
公報に記載された発明があげばれる。特に、後者の発明
によれば、オクタデシル基を化学結合させたシラン（Ｏ
ＤＳ）にタンパク質をコーティングした充填剤が用いら
れている。このタンパク質コーティングＯＤＳは、ＯＤ
Ｓを充填したカラムに適当な不活性タンパク質溶液を注
入し、このタンパク質を積極的にカラムに吸着させるこ
とによって調製される。ＯＤＳの孔径に比べてタンパク
質はサイズが大きいため、孔の中には進入できず、した
がって孔の内表面には初めから導入されているオクタデ
シル基がそのまま残り、疎水性が保存される。一方、外
表面には吸着したタンパク質に覆われ、もはやタンパク
質を吸着する能力を持たない。

この充填剤のカラムを用いて除タンパク前処理を行うに
は、カラムに適当な緩衝液を送液した後、分析すべき血
清等の試料を注入する。このとき、低分子で比較的疎水
性の高い薬物等の成分は、孔内表面のオクタデシル基に
吸着されて保持されるが、一方、試料中のタンパク質等
はサイズが大きいため、孔の内部には進入できず、かつ
外表面にも吸着されないため、短時間でこのカラムより
溶出してしまう。その後、この前処理用カラムの出口側
流路を分離用カラムに接続し、移動相（溶出液）をより
強い条件に切り換えると、保持されていた薬物などの成
分がこの前処理カラムから離れて、分離カラムへ移動し
、ここで各成分ごとに分離されることになる。

このようにして調製されたタンパク質コートＯＤＳは短
期の使用に関してはほぼ満足すべき性質を有している。

しかしながら、使用が長期にわたると最初に吸着したタ
ンパク質が溶離をおこし、流れ出して分離カラムに吸着
し、その劣化の原因となったり、また、カラムの保持時
において、微生物などによる腐敗の原因となったりする
おそれがあり、充分な注意が必要であるなどの問題が残
されている。

除タンパク質前処理の別の方法に、特開昭６１−６５１
５９号公報に記載されたピンカートンらの方法もある。

この方法は充填剤の製法に特徴があり、充填剤の出発物
質としてグリセロイルプロピル基が導入されたシリカゲ
ル（例えば、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社から市販されて、
いるＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｄｉｏｌが使用可能であり
、或はシリカゲルに即知の方法でグリセロイルプロピル
基を導入してもよい）あるいは多孔性ガラスを用いる。

これにカルボニルジイミダゾールを介してオリゴペプチ
ド、典型的にはグリシルフェニルアラニンあるいはグリ
シルフェニルアラニル−フェニルアラニンを結合させる
。この結果、充填剤の内外表面はフェニルアラニンのフ
ェニル基によって疎水性となる。これにタンパク質分解
酵素であるカルボキシペプチダーゼＡもしくはキモトリ
プシンを作用させると、外表面のペプチド結合は切断さ
れ、最初から導入されているグリセロイルプロピル基が
露出し、親水性が回復し、タンパク質に対して非吸着性
となる。

しかしながら、酵素は充填剤の孔径より太きいため、こ
の内部には進入できず、従って内表面のペプチドは分解
されずに残り疎水性が保存され、目的にあった性質を有
する充填剤が得られる。

しかしながら、ピンカートンの方法で得られる充填剤は
、内表面の疎水性が充分満足できるものではないという
間層点がある。すなわち、この製造方法の主眼は、タン
パク質分解酵素によって外表面の疎水性基を分解除去す
る点にあり、したがって、疎水性はペプチドの形で導入
される必要がある。このため、疎水性基が実質的に、フ
ェニルアラニンに限定されるという問題がある。実際、
このカラムを用いて、例えば抗ケイレン剤として使用さ
れるフェノバルビタールを含む血清試料などを前処理す
ると、フェノバルビクールの疎水性はあまり高くないた
め、血清タンパク質が充分に除去される前に、フェノバ
ルビタールが前処理カラムから流失されるおそれがある
。このような問題を解決するためには、疎水性の強さを
種々選択できる充填剤の製造方法が望まれていた。

さらに、多孔性充填剤の内表面と外表面の性質が異なる
充填剤の他の応用例として、例えば、内表面に疎水性基
、外表面にイオン交換基を導入して、試料中の無機イオ
ンと有機物を同時に分析する方法も可能であるが、上記
の従来技術ではこのような性質をもつ充填剤の製造は不
可能であった。

［発明が解決しようとする問題点］血清等のタンパク質を含む生体試料中の薬物等の分析に
使用する充填剤としては、孔の内表面が疎水性であり、
外表面が親水性であって、タンパク質を吸着しないとい
う性質が必要である。

本発明の目的は、内表面と外表面の性質が異なる多孔性
充填剤及びその製造方法を提供することにある。より詳
しくは、本発明は疎水性の内表面及び好ましくは親水性
の外表面を有する充填剤の製造にあたり、内表面の疎水
性及び外表面の親水性をともに化学的に導入された官能
基で形成できるため、内外両表面の性質、特に内表面の
疎水性をもたらす官能基を幅広くデザインすることがで
き、その疎水性を容易に調節することができる製造方法
を提供することにある。

本発明の他の目的は、血清中の成分を分析するための充
填剤として使用されるとき、血清タンパク質を実質的に
吸着せずに、カラムから速やかに流出せしめ、これによ
り、分析の精度を向上させることのできる充填剤及びそ
の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、クロマトグラフィーのタン
パク前処理用カラムの充填剤として使用した時、タンパ
ク質の流出により分離カラムを劣化させるおそれがなく
、あるいはカラム保持時の腐敗の問題がない充填剤及び
その製造方法を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］本発明に係るカラム用充填剤の製造方法では、実質的に
タンパク質を浸透させない孔径をもつ、多孔性材料から
なる充填剤原料の内表面及び外表面の両面に、アミド結
合を有する疎水性基を結合させ、次いで該アミド結合に
ポリミキシン・アシラーゼを作用させて、前記外表面に
結合した疎水性基についてのみアミド結合を切断してア
ミノ基を生ぜしめ、必要に応じて該アミノ基をさらに別
の基に化学修飾することよりなることを特徴としている
。

本発明の方法の好ましい態様の要点を第１図に示す。こ
の図かられかるとおり、本発明の方法は大まかに３つの
ステップからなる。

最初のステップは、実質的にタンパク質を浸透させない
孔径をもつ、多孔性材料からなる充填剤原料を用意し、
この原料にアミド結合を有する疎水性基を導入する。こ
のような原料としては、アミド結合を有する疎水性の基
が導入可能であり、かつ該原料の孔が内部に該疎水性の
基を導入できる大きさであること等が必要とされるが、
これらの条件を満たすものであれば、実質的に任意の充
填剤原料が利用可能である。例えば、原料がシリカゲル
タイプのものであるときは、その表面に官能基として第
１図に示すように、が存在するから、この末端の水酸基に対してγ−アミノ
プロピル・トリエトキシシランのような試薬を反応させ
て、末端アミノ基を形成し、次にこのアミノ基にＲ，Ｃ
ＯＣｌ２（式中、Ｒ８は疎水性を付与する基、例えば炭
素原子数２ないし２０のアルキル基またはフェニル基そ
の他である）を好ましくはトリエチルアミンのような塩
基性触媒の存在下で反応させて、アミド結合を有する疎
水性基を充填剤の内外両表面に２ステツプで導入するこ
とができる。その際、市販品として入手可能な、Ｓ　ｐ
ｈｅｒｉｓｏｒｂ　５　Ｎ　Ｈ＊　（フェーズ・セバレ
ーシッン社製）　、Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　Ｎ　Ｈ＊　
（メルク社製）、などのアミノ樹脂を使用すれば、上記
末端アミノ基の形成ステップが省略できるから都合がよ
い。

あるいはシリカゲルから！ステップで疎水性基を都合よ
く導入することも出来る。

本発明の方法における、次のステップは、前記充填剤の
外表面のアミド結合を選択的に切断する工程である。本
発明においてこの切断工程をポリミキンアシラーゼで行
うことが、特に重要である。

この酵素は、一般の酵素に比べて極めて基質特異性が小
さく、極めて多様なアミド結合を切断する能力を有する
。そして、酵素としては例外的ともいえるこの特異性の
低さが、本発明の方法を可能ならしめたのである。すな
わち、ポリミキンアシラーゼは、その特異性の低さの故
に、疎水性を導入する官能基（第１図のＲ，）を自由に
デザインすることが可能となり、充填剤に要求される疎
水性の強さに応じてＣ１からＣ２゜程度までの直鎖また
は枝別れアルキン基（フェニル基、ハロゲン原子、ニト
ロ基その他の疎水性成分で置換されていてもよい）から
選択が可能である。また％Ｒ１としてフェニル基、置換
フェニル基その他のアリール基等の種々の性質・性能の
ものから自由にデザインすることが可能である。

この点は、前記ピンカートンの方法に比べて、本発明の
著しい利点である。何故ならピンカートンの方法では、
用いている酵素がタンパク質分解酵素であるカルボキシ
ペプチダーゼＡもしくはキモトリプシンであり、その高
い特異性のために、導入する疎水性基はアミノ酸によら
なければならないという重大な制約が生じ、結局のとこ
ろフェニルアラニンによるフェニル基という不十分な疎
水性しか実現できず、これが前述の問題を生じているた
めである。

本発明の方法における、最後のステップは、上記ステッ
プにより充填剤の外表面に生じたアミノ基（−Ｎ　ｉ−
ｔ　、）を、所望によりさらに別の基に変換することよ
りなる（例えば、第１図中の−ＮＨＲｆに変換する：但
しＲ１は所望の性質、好ましくはより良好な親水性を付
与する基である。）外表面の親水性を高め、タンパク質
に対する吸着能力を失わせるために、グリシドールを用
いてアミノ基にグリコール等のアルコール性の基を導入
したり（ｒｔ、＝−ＣＨｆＣＩ（（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）
　、酢酸のような低級脂肪酸によりアシル化することが
できる（　Ｒｔ　＝　　ＣＯＣＨｓ　）。このような基
の導入は、従来知られている化学反応を応用して行うこ
とができる。さらに、充填剤の外表面にイオン交換基、
例えば４級アンモニウム基に誘導すれば、本発明の方法
で製造された充填剤は、無機イオンと有機化合物を同時
に分析することが可能となる、そのような応用例として
、食品や医薬品などの分析が挙げられる。

また、本発明に係るカラム用充填剤では、実質的にタン
パク質を浸透させない孔径を有するガラスもしくはシリ
カゲルの多孔性材料の内表面に、を介して結合した疎水
性基−（ＣＨｙ）。−ＮＨＣＯ−Ｒ、（式中、Ｒ８は疎
水性を与える成分であり、ｎは１ないし３の数である）
を有し、モして核材を介して結合した−（ＣＨ＊）−Ｎ
　Ｈを基もしくは談話より誘導された基を有してなる、
内表面が疎水性を有し、外表面が前記内表面とは異なる
性質を有することを特徴としている。

［実施例］（実施例１　充填剤の製造）本実施例の充填剤は、第２図に示す工程に従って、次の
ように製造した。

（１）アミド結合を有する疎水性基の導入５ｐｈｅｒｉ
ｓｏｒｂ　５　Ｎ　）Ｉ　ｔ　　１　ｇにベンゼン２０
ＩＩｌｃを加え、撹拌しながら、ｎ−塩化カプリリル０
．３９ｇ及びトリエチルアミン０．０６ｇを徐々に加え
る。その後、室温で５時間撹拌を続ける。４０ｔａＱの
ベンゼン及び４０＠Ｑのメタノールで洗浄し、５ｐｈｅ
ｒｉｓｏｒｂ　５　Ｎ　ＨｔのＮ−カプリル誘導体を得
る。

（２）アミド結合の切断上記で得られた５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ　５　Ｎ　Ｈｚの
Ｎ−カプリル誘導体１．８９に０．２Ｍりん酸緩衝液（
Ｐ１１７゜５）９０ｍｉ２を加える。これに、シュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）　ｓｐ、　Ｍ　−６
−３株菌体よりトリメンＸ−１００で可溶化したポリミ
キシン・アシラーゼの水溶液３　（１ｍ（！（３００単
位、基質：コリスチン）を加え撹拌すると脂肪酸基の導
入された５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂは次第に水になじみ均一
化する。これを５０℃の水浴中で軽く振りながら４０時
間反応させる。遠心分離（７０００Ｇ、３０分間）で酵
素液を除去したシリカを０．１Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ７
，５）でよく洗浄し、次いで５０％エチレングリコール
含有０．０１Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ７，５）、０．０１
Ｍりん酸緩衝液（ＰＩ（７，５）、水、メタノールの順
序に洗浄し、乾燥する。これにより、外表面にアミノ基
を有する本発明の充填剤を得る。

（３）充填剤外表面のアミノ基の修飾前記で得られた充填剤の外表面のアミノ基を修飾するた
めの、この充填剤１９に対して、３ｓ１２のグリシドー
ルを加え、室温で２４時間撹拌する。４０ＩＩＩ２の水
及び４０ｍ（ｌのメタノールで洗浄し、親水性の大きい
グリコール基が外表面に導入された、本発明の充填剤を
得る。

（実施例２　充填剤の使用例）実施例１で調製した充填剤を、内径４．６■、長す５ｃ
ｌＩのＨＰＬＣ用ステシステンレスカラムした。このカ
ラムに、下記の条件でサンプルＡ及びサンプルＢを注入
し、フエノバルビタール（１）及びプロプラノロール（
２）の分離を調べた。

サンプルＡ：ヒトコントロール血清に５０μ９／　ｖａ
Ｑのフェノバルビタール及び１００ μＷ／ｌａＱのプロプラノロールを標準物質として添加
したものサンプルＢ：ヒトコントロール血清移動相：　　　１００ｍＭ　Ｎ、Ｈ＊Ｐ　Ｏａ　−１０
（ｌａＭＮ、、ＨＰＯ，−ＣＨ＋ＣＮ　（４：４：２）
流速：　　　　０．６ｍ１２／分検出波長：　　２４５ｎｍ感度：　　　　０．０４ａｕｆｓカラム温度：室温注入量：　　夏Ｏｕｌ得られたクロマトグラムを第３図に示す。サンプル八で
は、ヒト血清タンパク質の溶出ピークに続いて、フェノ
バルビタール（同図（Ａ）中のピークり及びプロプラノ
ロール（同図（Ａ）中のピーク２）が良好に分離され、
相次いで溶出された。

サンプルＢでは、ヒト血清タンパク質の鋭い溶出ピーク
のみが観察された（同図（Ｂ））。

［発明の効果］以上のようにして製造された本発明のカラム用充填剤は
、その外表面に充分な親水性を有することができ、血清
中のタンパク質を殆ど吸着することがないから、ＨＰＬ
Ｃカラムに充填して血清などの生体試料中に含まれてい
る薬物の分析に特に有用である。タンパク質は、速やか
にカラムから流出し、薬物はその性質に応じて充填剤内
表面の疎水性基に吸着され、吸着の強さに従ってカラム
中で分離される。従って、本発明の充填剤を用いて直接
試料を分析することもでき、あるいはこの充填剤を前処
理カラムに詰めて除タンパク処理に使用することもでき
る。

また、本発明の充填剤は、内表面の官能基が自由に設計
できるので、その疎水性を自由に！１！節することがで
き、前記ピンカートンの充填剤におけ−る問題点を解決
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のカラム用充填剤を製造する好ましい態
様を説明する工程図であり、第２図は実施例１における
充填剤の製造工程図であ、す、第３図（Ａ）、（Ｂ）は
実施例！で製造された充填剤を、ヒト血清中に含まれる
薬物の分析に使用したときのクロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）実質的にタンパク質を浸透させない孔径をもつ多
孔性材料からなる充填剤原料の内表面及び外表面の両面
に、アミド結合を有する疎水性基を結合させ、次いで該
アミド結合にポリミキシン・アシラーゼを作用させて、
前記外表面に結合した疎水性基についてのみアミド結合
を切断してアミノ基を生ぜしめ、必要に応じて該アミノ
基をさらに別の基に化学修飾することによりなる、内表
面が疎水性を有し、外表面が内表面とは異なる性質を有
する多孔性のカラム用充填剤の製造方法。
（２）充填剤原料が多孔性シリカゲルもしくは多孔性ガ
ラスであり、該原料の表面にアミド結合を有する疎水性
基を結合させるに際して、該原料表面上の▲数式、化学
式、表等があります▼ の水酸基に炭素原子数２〜２０のアミノアルキル基を導
入し、次にこのアミノ基をアシル化剤でアシル化する、
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（３）アミド結合を有する疎水性基が、前記原料表面の ▲数式、化学式、表等があります▼ 基のＯＨに置換した−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨＣＯ−Ｒ
＿１（式中、Ｒ＿１は疎水性を与える成分であり、ｎは
１ないし３の数である）である、特許請求の範囲第２項
に記載の方法。
（４）Ｒ＿１が炭素原子数２〜２０のアルキル基である
、特許請求の範囲第３項に記載の方法。
（５）Ｒ＿１が、フェニル基または置換フェニル基を含
む基である、特許請求の範囲第３項に記載の方法。
（６）外表面に生ぜしめたアミノ基をグリシドールで化
学修飾して、アルコール性水酸基を導入することにより
外表面が親水性の充填剤を製造する、特許請求の範囲第
１項乃至第５項のいずれか１項に記載の方法。
（７）外表面に生ぜしめたアミノ基をアセチル化して、
外表面が親水性の充填剤を製造する特許請求の範囲第１
項乃至第５項のいずれか１項に記載の方法。
（８）外表面に生ぜしめたアミノ基をイオン交換基で化
学修飾して、外表面にイオン交換基が導入された充填剤
を製造する、特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれ
か１項に記載の方法。
（９）充填剤の原料がスフェリソルブ（Ｓｐｈｅｒｉｓ
ｏｒｂ）５ＮＨ＿２である、特許請求の範囲第１項乃至
第８項のいずれか１項に記載の方法。
（１０）実質的にタンパク質を浸透させない孔径を有す
るガラスもしくはシリカゲルの多孔性材料の内表面に、 ▲数式、化学式、表等があります▼ を介して結合した疎水性基−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨＣ
Ｏ−Ｒ＿１（式中、Ｒ＿１は疎水性を与える成分であり
、ｎは１ないし３の数である）を有し、そして該材料の
外表面には▲数式、化学式、表等があります▼ を介して結合した−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨ＿２基もし
くは該基より誘導された基を有してなる、内表面が疎水
性を有し、外表面が前記内表面とは異なる性質を有する
ことを特徴とする多孔性のカラム用充填剤。
（１１）Ｒ＿１が、炭素原子数２〜２０のアルキル基で
ある、特許請求の範囲第１０項に記載の充填剤。
（１２）Ｒ＿１が、フェニル基または置換フェニル基を
含む基である、特許請求の範囲第１０項に記載の充填剤
。
（１３）−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨ＿２基から誘導され
た外表面の基が、 ▲数式、化学式、表等があります▼（炭素原子数１また
は２のアルキル基）である、特許請求の範囲第１０項に記載
の充填剤。
（１４）−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨ＿２基から誘導され
た外表面の基が、 −（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ＿２ＯＨ
である、特許請求の範囲第１０項に記載の充填剤。
（１５）充填剤の原料がスフェリソルブ５ＮＨ＿２であ
る、特許請求の範囲第１０項乃至第１４項のいずれか１
項に記載の充填剤。