JPS6165159A - 液体クロマトグラフ・カラムの内面逆状相充填材料及びその製造方法 - Google Patents

液体クロマトグラフ・カラムの内面逆状相充填材料及びその製造方法

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JPS6165159A
JPS6165159A JP60190980A JP19098085A JPS6165159A JP S6165159 A JPS6165159 A JP S6165159A JP 60190980 A JP60190980 A JP 60190980A JP 19098085 A JP19098085 A JP 19098085A JP S6165159 A JPS6165159 A JP S6165159A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフに関し、より詳細には選択性
を改良し長寿命とした液体クロマトグラフ・カラムの新
規な充填サポートに関する。
（従来の技術） 血液、血清あるいは面禁中における疎水性交物の存在を
確認するとともに、これの濃度を測定することがしばし
ば必要である。このためには、液体クロマトグラフが有
効的な手段であり、これはいわゆる逆状相（疎水性）充
屓月を使用する。そのような充填材は試料から疎水性薬
物を吸着するが、試料に含まれる池の疎水性物質から薬
物を連続的に分別するのに妨げとなり易いタンパク質物
質も吸着ヅ−る。従って、予備的な試料の前処理操作を
実施する必要がある。−例として、人の血清の場合、試
料の前処理は現在幾つかの方法で行なわれている。
最も普通の方法では、タンパク質が沈澱され、上澄み液
は水と混合しない打（幾溶剤で油出され、有量溶剤は蒸
発により抽出物から除去され、そして被分析１カ（ａｎ
ａｌｙｔｅ　）の残留物は高圧液体クロマトグラフ（Ｈ
ＰＬＣ）による分析面に移動状相に戻される（　　ｒｅ
ｃｏｎｓｔｒｔｕｔｏｄ＞　。この方法は非常に時間が
かかり、費用的に不能率である。
現在採用されている第２の方法は、小さな使い后てカラ
ムにおいて、シリカに結合したオクタデシルシラン（Ｏ
ＤＳ）の逆状相充填材に被分析物を吸着させるものであ
る。この技法は自動化できるが、タンパク質が充填材に
残るため、カラムは１つの試料だけしか使用できず、結
果的にこの技法も多数の試料では費用的に不能率ひある
。
第３の方法では、シリカに結合されたオクタデシルシラ
ンの逆状相充填材が予備カラムに導入される。この予備
カラムは分析カラムから分離されているが、切換弁機構
により分析カラムに接続可能でおる。血清の試料は直接
予備カラムに注入され、この子偏カラムではタンパク質
が変性されるとともに蓄積され、除タンパクされた被分
析溶液は分別のために分析カラムに通過される。（Ｊぼ
こ３回の注入操作後、予［１ｉＩｉカラムはタンパク質
のＴｆ５留物を除去するために逆洗しむけれに［ならな
い。この間欠的な逆ｉ・λは多数の試４３１の場合、ｌ
Ｌｉ　Ｉ：：Ｉ的に不能率である。史には、タンパク質
はオクタデシルシラン・バッキングから完全に除去り゛
ることができないため、このバッキングは結果的には劣
化する。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、充填材料の内面の疎水性と外面の親水性と被
分析物の試料との各々箕なる相互作用に基づき、被分析
物の試料を識別−りる）１タ体クロマトグラフ充填材料
を設（プるという点で新しい概念である。
内面逆状相（Ｉｓ−ＲＰ）液体クロマトグラフ充填材料
を称呼しｌこ本発明の新規な充填材料は、多孔サポート
であり、（１）多孔サポートの内面は疎水性分配状相を
結合し、（２）多孔サポートの外面は（例えば）人の血
漿に見られるタンパク質物質に対し非吸着性となる。よ
うに現水性となし、（３）多孔サポートの孔径はタンパ
ク質物質が疎水性分配状相を帯びる内面に立ち入らない
ようにサイズを制限しである。
本発明のｌ５−ＲＰ充Ｊ？７リボー１〜は、タンパク質
含有の生物学的風質（例えば人の血清または血漿）中の
疎水性低分子（例えば交換）を分離し、６逆状相高性能
クロマトグラフにより定量化す、る□前に従来必要とさ
れていた試料の前凱理操作の必要性を排除するように設
計されている。本発明の１Ｓ−ＲＰ充填材料は、市販の
孔径調整済み粒状シリカ（平均孔径は凡そ１００オング
ストローム付近）から簡便に製造され、そのｌ５−ＲＰ
充填材料は親水性を帯びるとともにグリセロイルプロピ
によりタンパク質に対し非吸着性となし、それとともに
孔径を約８０オングストローム以下、好すしくは４０オ
ングストローム以下に縮小されている。
疎水性ポリペプチドの分配部分く例えば、アミノ酸フェ
ニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、
インロイシン、バリン、リジンおよび／またはアルギニ
ンを含む）は酵素分解を受は易い化学結合を含み、当業
者にとって周知の多種多様の反応を用いることにより、
水酸官能基を介してナボートの充＠面にある幾分ｍのグ
リセロイルプロピル基に共有結合される。この誘導は多
孔微粒子へ浸透できる分子で実施されるため、微粒子の
内外面共疎水性分配状相を保有することになる。微粒子
の外面にある疎水性分子がタンパク質に対し吸着性を帯
びるようになるため、充填材はキモトリプシンやカルボ
キシペブチダーピなどのような酵素で処理される。これ
らの酵素は、微粒子の外面悲りから分子分配状相の疎水
性部分を分解するが、内面からは分解しない。これは多
孔微粒子の孔径が小さくてそのような大きな酵素が多孔
微粒子に浸入できないことによる。醇累氾理後に外面の
グリセロイルプロピルＭに残留する化学的な官能性は、
最初のグリセロイルア１コビル結合物と同じくタンパク
質に対して非吸着性である。
その生成物がｌ５−ＲＰ充填サポートである。
本発明のｌ　Ｓ　−ＲＰ充填（Ａを１皆造１する際の基
礎として、シリカやガラスなどを含む多数の出発物質が
利用できる。このような物質は以下に例示する表の通り
、数多く市販されている。
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　（Ｍａｃｈｅｒｅｙ　−Ｎａｏｅ
ｌ　　Ｃｏ　、　）ｐｏｌｙｇｏｓｉｌ　（＞ Ｕｌｔｒａｐｈｅｒｅ　Ｓｉ　　（Ａｌｔｅｘ　　Ｃｏ
　、　）ＬＪＩｔｒａｓｉｌ　　Ｓｉ　　（） Ｖｙｄａｃ　　　Ｈ３５ｉｌｉｃａ　　　（Ｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ） μＰｏｒａｓｉｌ　　（Ｗａｔｅｒｓ　　Ａ　５ｓｏｃ
ｉａｔｅｓ　）７ｏｒｂａｘ　　５ｉｌ（Ｄｕｐｏｎｔ
）Ｂａｋｅｒ　　５ｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　　（３ａｋｅ
ｒ　　Ｃｈｃｍ　、　Ｇｏ、）３　ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ
　　（Ｐ　ｈａｓｅ　　３　ｅＤａｒａｔｉＯｎｓ　　
ｌ　ｔｄ、　）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　−Ｐａｒｅ　　
Ｇ　１ａｓｓ（Ｅ　１ｅｃｔｒｏ−Ｊｌｕｃｌｅｏｎｉ
ｃｓ　、　　（ｎｃ、　　）Ｂｉｏ３ｉｌ（Ｂｉｏ　　
Ｒａｄ　　Ｌａｂｓ）Ｌ　ｉ　Ｃ１＋ｒｏｓｏｅｂ　Ｓ
　ｉ　６０　（Ｅ　、　Ｍｅｒｃｋ）ｌｖｌｉｃｒｏｐ
ａｃｋ　　　３ｉ　　　（Ｖａｒｉａｎ　　　　Ａ　５
ｓｏｃｉａｔｃｓ　　）Ｐａｒｔｉｓｉｌ　　（Ａｌｌ
ｔｅｃｌ）Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　）Ｓ　ｕｐｅｒ　　
ｆｖｌ　１ｃｒｏｂｅａｃｌ　　３　ｉ　　（Ｆ　ｕｊ
ｉ−１）　ａｖｉｓｏｎＣｈｃｍｉｃａｌ　　　　ｌ　
ｌｄ、　　）Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　　（３ｃｐａｒａｔｉ
ｏｎｓ　　Ｑｒｏｕｐ）、Ｌ　ｉ　　Ｃｌ＋ｒｏｓｐｈ
ｅｒ　（Ｅ　、Ｍ　ｃｒｃｋ）Ｃｈｒｏｍｅｇａｓｏｒ
ｂ　　　（Ｅ　　、　　Ｓ　　、　　　Ｉ　　ｎｄｕｓ
ｊｒｉｅｓ　　）Ｃｈｒｏｍ　　Ｓｅｐ　ＳＬ　　（Ｔ
ｒａｃｏｒ　　）ト１　　ｉ　　　Ｅ’ｆｆ　　　　Ｍ
　　１ｃｒｏｐａｒｔ（Ａｐｐｌｉｅｃｌ　　３ｃｉ、
　　Ｌａｈｓ　　、　　）Ｉ　ＣＮ　’３’：１ｉｃａ
　　（Ｉ　ＣＮ　　　Ｉ　ｎｃ、　　）Ｒ３Ｌ　　　５
ｉｌｉｃａ　　（Ｒ３Ｌ、　　［３ａ１ｇｉｕｍ）３１
ｌｉｃａ　　　Ａ　　（Ｐｅｒｋｉｎ　　−Ｅ　１ｍｃ
ｒ）Ｓｉｌ　　　６０　　（Ｃｈｒｏｍｐａｋ　　、　
　ｌ−１ｏ１１ａ＋＋ｄ）このような４質から、本発明
のサポートを製造するのに使用する「ジオール法相」　
（グリセロイルプロピル結合シリカなど）が１１１られ
る。ｒ１１′■述したジオ法相状相は多種多様の−ｂの
が市販されており、例えば以下のものがある。
ＣＰ　Ｇ　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅ　。
ｐｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　、　　（調整孔
ガラス）Ａ　ｑ、ｕａｐｏｒｅ　−Ｏｉｔ　、　Ｂ　ｒ
ｏｗｎｌｅｅ　　ｌ　ａｂｓ　。
（球状シリカ） Ｌ　１ｃｈｒｏｓｏｒｂ　　　Ｄｉｏｌ　　、　　Ｅ、
Ｍｅｒｃｋ（不定形シリカ） １１ｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　　［）　ｉｏｌ　、　Ｅ　、
　Ｍｅｒｃｋ（球状シリカ） ＴＳＫ　　ＳＷ、　Ｔｏｙｏ　５ｏｃｌａ　　（球状シ
リカ）Ｂａｋｅｒ　　［）ｉｏｌ　、　３ａｋｅｒ　　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　。
（球状ｄ３よび不定形シリカ〉 ５ｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ、　Ａｎｓｐｅｃ　　Ｃｏ　、
　　（球状シリカ）ジオール法相は、例えば以下に公表
された方法により容易に作られる。
ｌ　ａｒｓｓｏｎ　　Ｉ也、△ｄＶａｒｌｃｅｓ　　：
ｎ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ但！ｌ、　２１　、第２
章（１９８３）　：Ｒｃｇｎｉｃｒａｎｄ　Ｎｏｅｌ　
、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、　３ｃｉ、、１４，３　’１．５
（１９７６）　　：　　ｌ−１１−１ｅｒ　　他、　　
Ｊ　、　　Ｃｈｒｏｍ、　　Ｓｃｉ、。
１９　４７０　（１９８１）：０ｈｌｓｏｎ　ｊｌ、Ｆ
ＥＢｉＩＬ匹虹Ｓ　　９３　　（１）、５　　（１９７
８）。
グリセロイルプロピル結合シリカは、内面逆法相充填材
の製造において、使用に適するジオール法相の一例であ
る。原則的には、充分な数の以下に示す有機水酸官能基
を含むものであれば、どのような多孔親水性基質（ｍａ
［ｒ！Ｘ）も使用でさる。
−Ｃ−ＯＨ。
薯 有量水酸官能基において、非結合の炭素鎖は、公知の方
法でサポートまたは他の部分に結合される。別のり“ボ
ートの例としては、ヒドロキシルアルキル・メタクリレ
ートゲル（”　３　ｐｈｅｒｏｎ”　Ｌ　ａｃｈｅｍａ
　　ｌ　ｎｃ、、　　３ｒｎｏ　、　Ｃｚｅｃｈｏｓｌ
ｏｖａｋｉａ　）　、ヒドロキシル化ポリエーテルゲル
（”ＴＳＫ−ＰＷ。
”　Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ　Ｍａｎｕｒａｃｔｕｒｉｎｇ
　　Ｃｏ、、　Ｌｊｄ、、ＴＯｎｒｌａ、　５ｈｉｎｎ
ａｎｙｏ、　ＹａｍａｇｕＣｈｌ、　Ｊａｐａｌｌ）　
、デキストリンゲル（”　３　ｅｐｈａｄｅｘ、”　ｐ
　ｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕ　Ｉ）Ｉ）ｓａｌａ、　３ｗ
ｅｄｅｎ　）　、　ａｊＪａｒＯ３ｅゲル（”　Ｓ　ａ
ｐｈａｒｏｓｅ、　”　ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、およ
びＮ、Ｎ”−メチレン−ビス−アクリルアミドを具備す
る架橋デキストリンがある。
多種多様の疎水性状相がうまく使用でさ、原則的にはポ
リペプチドに上記の疎水性のＪ、Ｌを含むアミノ酸のい
かなる組合Ｖも含まれ、このポリペプチドは太さすぎて
内面に浸入できない酵素によって分解することができる
。予想される組合ぼにも殆ど制限がない。有用なポリペ
プチドには、ジペプチド、トリペプチド、さらにはく調
整が困難になるものの）テトラペプチド、およびペンタ
ペプチドを含む。実例のポリペプチドはグリシン・フェ
ニルアラニン・フェニルアラニン、グリシン・フェニル
アラニン・イソロイシン、グリシン・イソロイシン・イ
ソロイシン、グリシン・フェニルアラニン・トリプトフ
ァンなどを含む。ざらに有用なものとしては、Ｎ−ター
−ブトオキシカルボニルフェニルアラニン、Ｎ−カルポ
ベンズノｔキシフＴニルアラニン、アセデルフェニルア
ラニンおよびベンズオキシフェニルアラニンがあり、こ
れらはポリペプチドではないが、ポリペプチド同様に空
間的条件によって支配される。後者は好ましくはスペー
サとしてのテトラメヂレンジアミンを介してグリｔ？［
」イルプロピル基に結合される。
秤々の酵素が疎水性状相の分解に使用でさ゛る。
ペプチドが末端カルボン酸を介して支持基質（ＳＵｐｐ
ｏｒｔｉｎｇ　　ｍａｊｒｉｘ）に付着されると、キモ
トリブシンはアミノ酸フェニルアラニン　ｌ−１ノブ１
〜フアン、Ｊ夕よびブーロジンに使用でき、一方トリブ
シンはリジンとアルギニンに使用できる。もしペプチド
が末端のアミンを介して支持風質に１」霜されると、ペ
プシンは隣接するアミノ酸フェニルアラニン、トップト
ノ１ン、ヂロシン、またはロイシンを介してペプチド仝
体を分解するのに使用でさる。
あるいは、好ましくはカルボキシペプチダーゼ△は、末
端カルボキシルペブヂド連ｇＪを具１希するアミノ酸の
全てを連続的に（即ら順次）分解するのに使用’Ｃ＆る
。たＩどしリジンおよびアルギニンを除く、これらはカ
ルボキシペプチダーゼＢにより分解される。
ｌ５−ＲＰサポートは液体クロマトグラフ・カラム内に
充填される。タンパク質と小さい疎水性被分析分子の両
方を含む試料が動的な液状非変性移動法相としてｌ５−
ＲＰクロマトグラフ・カラムに流入さけると、タンパク
質はカラムの空隙部分で溶離する。これはタンパク質の
全体サイズが多孔ｌ５−ＲＰ充填材の孔より人き（、ま
たｌ５−ＲＰサポートの外面かタンパク１′１を吸着し
ないからである。小さな内因性の親水性分子（よｌ５−
ＲＰ多孔充填月に浸透できるが、内部疎水性法相で分配
されず、これも保持されない。しかしながら、ｌ５−Ｒ
Ｐ多孔充填材に浸透できる小さな疎水性被分析分子は内
面逆法相で分配され、タンパク質と親水性の小さな分子
基質部分からの分離にＱｆ＋　ｌ、、た時間で保持され
る。装置は、１ステツプで小さな疎水性被分析分子を複
錐なタンパク貿合有混合物から動的に分別することが可
能である。小さな疎水性被分析物は、それからさらに、
切換弁の手段により通常のオクタデシルシラン分析カラ
ムに尋人されて分離することができる。もしＴＳ−ＲＰ
　１５填材が高性能微粒子（≦１０μｍ）でできている
ならば、タンパク質の分離と分析的な被分析物の分解を
同じｌ５−ＲＰカラムで同時に行なうことができる。
従って、ｌ５−ＲＰサポート材を液体クロマトグラフ・
カラムに充填したとき、このサポート材は２つの機能を
果すことができる。第１に、ｌ５−ＲＰ予備カラム（サ
ポートの粒径が凡そ３０〜７０ｔＩＪ）は、タンパク質
含有基質（即ち、血清と血漿）から疎水性の小さい分子
を抽出することにより１ステツプの動的な試料前処理技
法として使用できる。第２に、ｌ５−ＲＰ分析カラム（
サポートの粒径が≦１０〃）は、基質中のタンパク質か
ら疎水性の小さい分子を直接分離するのに使用でき、そ
れと共に小さい分子の被分析物を互いに分離することも
可能である。新規なナポート材のこれら２つの薇能性に
より、タンパク質含有の被分析混合物（例えば、血清や
血漿ンを、試料の前処理なしで、液体クロマトグラフ系
に直接注入することが可能である。小さい疎水性被分析
分子からのタンパク質高分子部分の分離は、サイズによ
る完全な除外と、１ｓ−ＲＰサポート充填材のもつタン
パク質の非吸着性の結果とし−（’　Ｊ５　＠、その際
タンパク質をカラム外側空隙部分の中に分離し、疎水ｉ
り内面での吸着により小ざい被分析分子を分離し、この
疎水性内面に小さい被分析分子が保持され、それによっ
てタンパク質部分から分Ｎ［される。
切換弁機構を介して典型的なオクタデシルシラン逆法相
ＨＰｔｙＣ分析カラムに接続した小さい予備カラムにｌ
５−ＲＰ充填材を入れ、疎水性薬物を含む人の血漿の試
料を直接ｌ５−ＲＰ予備カラムに注入すると、タンパク
買部分は完全に排除されて予備カラムの空隙部分に現わ
れ、それに対し疎水性薬物は内部充填領域への浸透およ
び疎水性コーティングへの吸着によってｌ５−ＲＰカラ
ムに保持される。タンパク質部分は廃物として除去され
、動的に抽出された薬物部分は、問題の貼物被分析物を
さらに分離するために（切換弁を介して）ＨＰＬＣ分析
カラムに差し向けられる。
充填材を予備カラムに使用したときの利点は、（１）試
料の面処理操作がなくなること（即ち、タンパク質の沈
澱がない、仙１１１がないなど）、（２）ｌ−ＩＰＬＣ
分析カラムを内因ｔｒ［（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　）タ
ンパク質による汚染から保護すること、Ｊ５よび安全性
（航速充填材料は、被分析物としてノエニトインを抽出
する能力上の性能低下を示すことなく、はぼ１００個の
人の血漿試ｒ１に使用された）である。
ｌ５−ＲＰ充填材が小さい微粒子サポート（即ち、Ｏ径
が≦１０ｕ）で作られ、カラムにかなりの長さく１５〜
２５ｃｍ）充填寸れば、血ｕＵ試料を直接７１人した際
、タンパク質の蓄積によるカラム劣化を招くことなく、
タンパク質の除去と被分析物の高訃能な分析的分離の両
方を同時に行なうことが可能となる。
Ｉ　Ｓ　−ＲＰ　払では、＊１青タンパク質がカラム充
填材に保持されないため、充填されたカラム（予備カラ
ムや分析カラム）は多種多様の試別について反復して沈
用できる。クロマトグラフ系の一部としてｌ５−ＲＰ充
填材を含ませることにより、血清や血漿の試料の直接注
入をｒ４′う完全自動化が可能となる。この技法は完全
に新規且つ独特の方法で血清や血漿試料の前処理の問題
を解決する。
本発明の↑要な商業的適用は、製薬業界で行なわれてい
る血清および血漿中のトＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ祭物検査にある
であろう。−例として、−製薬会社では、年に約３０．
０００の血清試料についてＨＰ　Ｌ　Ｃ分析を行なって
いるそうである。そのような操ｒ１三を改良することの
重要性が明らかである。。
以下の操作実施例で本発明を説明する。実施例は説明に
役立つのみで、これに限定されるものではない。
（実　施　例） サポート 本発明のｌ５−ＲＰ充填材にりＹ都合の出発物質は、グ
リセロイルブＤビル結合で調整孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ　　ａｌａｓｓ　）サポーテイング
材ｎ（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　　ｍａｔｅｒｉａｌ）Ｃ
ＰＧ／４０　　ｃｄｙｃｏｐｈａｓｅ　　（商標）であ
り、これはｐ　１ｏｒｃ（！　ＣＩｌｏｍＣｌｌｏ　　
Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｒｏｒｄ　、　　）ｌｌｉ
ｎｏｉｓ　　６１１０５゜カタログｙ　２４８２７から
供給され、公称孔径は４０オングストローム、粒度は３
７〜７４ｔｔｔｘである。
疎水性分配状相 ２種類の充填材を作った。これらの充填材における疎水
性分配状相は、端末グリシン部分（ｇｌｙ　）と１個ま
たは２個のし一フェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅ）部分を
含むそれぞれジペプチドどトリペプチドである。周知の
カルボキシルジイミダゾール（ＣＤ　Ｉ　）結合法を用
いた場合、ペプチドは既にＣＰ　Ｇ　／　４０　　Ｇ　
１ｙｃｏｐｈａｓｃサボー１−に存するグリセロイルプ
ロピル官能基を介して該ＣＰ　Ｇ　／　４０　Ｇ　１ｙ
ｃｏｐｈａｓｃサポートに付着された。反応の概略を添
附図面の第１図に示す。
ジペプチド（Ｇ４０−ｏｐｈ　＋　”　）約１９のＣＰ
　Ｇ　、／　４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅ　ハ、マ
ス２０ｍ１のジメチルホルムアミドで洗浄し、溶剤をジ
オキサンで置換し、３ｍｌのジΔキリーンに溶解した４
００ｍｇの１．１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤ　
Ｉ　）と化合さ゛せ、４時間ｆ↓やかに振訴して反応さ
けた（［３ｅｔｈｅｌｌ　　ｌｕ！、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｃｍ、。
２５４．２５ア２　（１９７９）　；Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ
、、２１９．３６１　（１９８１）、）。ＣｒＥＩ活ｆ
［化ＣＰＧ　／　４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａＳｅは、
５ＱＩｌ１１のジオキサン。
１００ｍ１の水Ｊ５よび２Ｑ、ｍｌのボラ−１〜緩衝液
て洗ン争し、それから〆１ちに約０．３ｍｍｏｌ　（６
７ｍｇ＞　（７）グリシン−Ｌ−フェニルアラニン・ジ
ペプチドを含む０．１Ｍボラート緩衝液（ｐＨ８，５）
２ｍｌに移した。ＣＤＩ活性化ＣＰ　Ｇ　／　４０　　
Ｇ　Ｉｙｃｏｐｈａｓｅとｇｌｙ　−Ｌ　−ｐｈｅジペ
プチドは、ボラ−１・緩衝液の中で穏やかに振盪させな
がら２〜３日反応させた。ｆｆ１ｉＪされたＣ　Ｐ　Ｇ
　／４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅ物質はそれから５
０１のボラート緩衝液、５Ｑｍｌの１Ｍ　　Ｎａ　Ｃｌ
　、および５０ｍ１のト１２０で洗浄した。
トリペプチド（Ｇ４０−ｆ７１１１１２　”　）　　　
Ｉ　５−Ｒ１〕トリペプヂド、グリシン−し−フ［ニル
アラニン−し−フェニルアラニンの場合、０　、２７　
ｍｍｏ、１（１００ｍｇ＞のトリペプチドは、ＣＤＩ活
性化ＣＰ　Ｇ　／　４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅと
化合’ａ　セルニ９ａ　Ｑ　ら、蒸気浴の下で４ｍｌの
Ｎ−メチルホルムアミドに溶解し、前記ＣＤＩ活性化Ｃ
ＰＧ／４０　　ＧｌｙｃｏｐｈａＳｅはＮ−メチルホル
ムアミド このＮ−メチルホルムアミドに分散させた。ＣＤＩ　２
ｂ性化Ｃ　Ｐ　Ｇ　、、’　４　０　　Ｇ　ｌｙｃｏｐ
ｌ＋ａｓｅ　とｏｌｙ　−Ｌ−ｐｌ）ｅ　−１−−ｐｈ
ｅ　ｌ−リペブチＩ−は、Ｎ−メチルホルムアミドにお
いて槌やかに搬面さＣながら２〜３日反応さじ、それか
らＮ−メチル／トルムアミドと水で最終的な洗浄を行な
った。
外部状用のｌ′Ｉグ索分解 １日れたＣ　Ｐ　Ｇ　／　４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａ
ｓｅの外面にあるポリペプチド部分は、カルボキシペプ
チダーゼへ（アミノ酸連鎖のカルボキシル末ψ本基を加
水分解するエキソベブチターＵ〉で分解して除去した。
カルボキシペプチダーピ八は、他のアミノ酸に比べ、芳
香族アミノ酸の分解にＪ５いて最も活性であり、従来よ
りアミノ酸のシーケンシング（５ｅｑｕｅｎｃ　ｉ　ｎ
ｏ　＞においてソリッドサポ−ト（ｓｏｌｉｄｓｕｐｐ
ｏｒｔ　）からアミノ酸を除去１ノることが実ＩすｎＴ
イ８　（Ｗ！１Ｉｉａｌｌｌｓ他、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　
Ｌ　ｅｔｔｅｒｓ、５４，３５３−３５７　（１９７５
））、未知のペプチドのアミノ酸のシーケンシングを目
的とした過去の研究では、タンパク質の浸透を許容する
ために、５００オングストローム程麿の大きな孔径のソ
リッドサポートが使用されていた。しかし、ここに述べ
た適用例でｉｔ、ペプチド結合ＣρＧ　／　４０　　Ｇ
　Ｉｙｃｏｐｌ＋ａｓｅサボー１−の孔芹ｔユ、約４０
オングストロームである。そのため、人さ゛なカルボキ
シペプチダーゼＡ（４よば３４，０００ダルトン）は充
填材の最外部分に留められ、微粒子のタト面からのみポ
リペプチドを分解する。
Ｍ索分解手順 ０．０１　ＮＩＩ　ＩＪ　ンａＦａｔｉＮ液（Ｄ）−１
７，８＞２ｍｌにおいて、約１ｇのペプチド結合ＣＰＧ
、／４０　　Ｇ＋ｙｃｏｐｈａｓｅナポートを１１１１
０のカルボキシペプチダーゼ八と化合させ、分解が本質
的に完了する３７℃でほぼ１２時間時々振盪しながら培
養させた。
それから、０．０１　Ｍオルトリン酸塩緩衝液５Ｑｍｌ
、次いで１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液５Ｑｍｌでｌ５
−ＲＰサポートから酵素を洗い出した。次に、サポート
は、分解したフェニルアラニンを除去するために、順次
５０１のＨ２Ｏ，５０ｍ１の蒸溜メタノール、および５
０ｍ１のＨ２Ｏで洗浄した。
の　ぜ率（ｐｅｒｃｅｎｔ　　ｃｏｖｅｒａｇｅ）の決
定酵素処理の前と後においてＣＰＧ／４０　　Ｇｌ）１
ｃｏｐｈａｓｃに結合したポリペプチドの屯を求めるた
めに、フェニルアラニン部分を溶液中に解離させるよう
に充填材を酸の加水分ｖｆ？、（６Ｎ　　ｌ−Ｉ　ＣＬ
、２４時間、１００℃）に晒した。その後、２５４ｎｎ
ｌの光学検知（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｊｅｃ目００）目
通法相ＨＰＬＣによるＷ１１フェニルアラニン部分を定
房化により、ＣＰ　Ｇ　／　４０　　Ｇ　１．ｙｃｏｐ
ｈａｓｅ　ｌナボートに結合したＯを求めた。典型的な
実例どして、単一合成をした充填材は、酵素処理の前に
はジペプチドを１グラム当たりＱ、　　１７ｍｍｏｌ、
トリペプチドを１グラム当たり０　、０４　ｍｍｏｌ含
み、また酵素処即後にはそれぞれ０．１０ｍｌ１ｌｏｌ
および０．０２ｍｍ０１含んでいた（第１表）。
反復合成 もし内面における疎水性状相の被覆率が、酵素分解後に
おいて、被分析物の充分な保持にとって必要な充分な疎
水性を表面にイ・」与するのに不充分であったら、同じ
材料について合成と酵素分解を繰り返した。
モ５ルｌ５−ＲＰオミの性ｌ評１「 ＜ａ　）試験被分析物 モデルｌ５−ＲＰ材料の性能を評価するのに使用した疎
水性被分析分子はフェニトイン（５，５−ジフェニルヒ
ダントイン）であった。
（ｂ　）試験高分子基質 タンパク質基質は純化した標準釣人の血清アルブミンと
人の面素を含んでいた。
（ｃ　）液体クロマトグラフ系 モデルｌ５−ＲＰ材料は、添附した第２図に示す通り、
普通のオクタデシルシラン分析カラムと共に予備カラム
抽出モードで試験した。１ｓ−ＲＰ材料は、内径３　ｍ
ｍｘ長さ１００ＩＩＩＩｌｌのガラス製予備カラム（Ａ
）の中に充頃した。前記予備カラム（Ａ）は、６ポート
・スライダー注入弁（Ｖｌ）と２５ｃｍの分析用オクタ
デシルシランカラム（Ｃ）に接続した６ボート切換弁（
Ｖ２）との間に配設した。分析用オクタデシルシランカ
ラムの短い５ａｍ部分は、分析用カラムへの移送に際し
、ｌ５−ＲＰ予備カラムから溶離フェニトインを捕捉づ
るために弁ｖ２と共に使用した。
（〔１）試験方法 フェニトイン被分析物をａ有覆るタンパクｒ′１試・　
料基質は、試料に溶は合う溶離剤液Ｓ１のポンプ（Ｐｌ
）連転（０，１Ｍ７１ルトリン酸塩１０．２１ＶｔＮａ
　　２　ｓ　　○　４　　、　１１　　Ｈ〜　６．　　
　Ｏ、１、５ｎｌｌ／ｎ１ｉｎの流化）で注入弁（ｖｌ
）を介してｌ５−ＲＰＰ備カラムに導入した。溶離剤Ｓ
１は、ｌ５−ＲＰＰ備カラム、弁（Ｖ２）（点線で示し
た位置にある）、および低圧抽出系を溝成する検出Ｚ（
Ｄｉ）を通過した。それと同時に、溶離剤Ｓ２　（２０
％アセトニトリル／３３％メタノール／４７％０゜１２
Ｍオルトリンｌｌ！２塩緩衝液、ｐト１〜６．Ｏ）を、
ポンプ（Ｐ２）により弁（Ｖ２＞（点線［）γ置）を介
して１　、０ｍｌ／ｍｉｎの流量でオクタデシルシラン
カラムＢ、Ｃを経て高圧分析分離系を溝成する検出器Ｄ
２に送出した。
試料を導入すると、タンパク質はｌ５−ＲＰ予予力カラ
ムＡ、）の空隙で澄離し、弁Ｖ２（点線位置）を介して
検出器Ｄ１に至る。タンパク質の溶離後、弁Ｖ２は切換
り（実線位置＞、ｒｓ−Ｒｐカラムに保持されていた疎
水ｉｉｌ波分１斤１勿はカラムＢに移し換えられる。全
ての被分析物かカラムＢに捕捉されると、切換弁Ｖ２は
元の状ｒぶ（点線位置）に復帰され、被分析物はオクタ
デシルシランカラムでの分析分離および検出器Ｄ２によ
る定ぢ１化のために右段性移動法相（＄２）でカラムＣ
に溶離される。
８Ｋ　Ｍ１及 ２つのモデルｌ５−ＲＰ充填祠の性能評師、共に酵素処
理した（Ｉｓ−ＲＰ）場合と共に酵素α理しない（ＥＳ
−ＴＲ−ＲＰ）場合のジペプチド（Ｇ４０−ｏｐｈ　、
　）およびトリペプチド（Ｇ　４０ｇｐｈ　２）のデー
タを第１表に示す。
第１表 モデル内面逆法相（Ｉｓ−ＩＲＰ）充填リボ−１への性
能評価１、ＥＳ−［５−ＲＰ、外面および内面逆法相。
２、カルボキシベブチダーぜＡで除去した外８１Ｘ状相
。
３、ペプチド法相のダラム当りのμＩ＋１０１で表わし
たサポートの分配状相被覆。
４、ｌ５−ＲＰカラム（内径３＃ＩｍＸ長さ１００ｓ）
にＪ５けるフェニトインの８伍ファクタ（ｋ−）、に＝
＝　（ｔＲ−ｔＨ）／１Ｍ　、ここでｔＭは移動状相の
保持時間で必り、ｔＲはフェニトインの保持時間である
。
した、充填材からの標準的人血清アルブミン（トｌ５Ａ
）の相対回収％。
人の血清タンパク質を吸着なしで系に通過さぼるｌ５−
ＲＰＰ填材の能力は、（ｉ　）サポート面におけるペプ
チド部分に対する残留クリセロイルプロピル基の相対比
、　　（ｉｉ）血清タンパク質に対するペプチドの準融
和性、（ｉｉｉ）酵素分解により外面から除去されるペ
プチドの有限Ｆ？ｑ、　　（ｉｖ）充填材の小ざな公称
孔径（≦４０オンゲス［・ローム）を含む特性および処
理の特異な組合ゼによって支配される。ＣＰ　Ｇ　／　
’４０　　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅ　Ｉ、：、おけるグ
リレロイルプロピル結合法相の初明表面被ｍＥｌが３３
９　μｍｏｌ　／＋１１の場合、Ｇ　４０−ｏｐｈ　。
はペプチド法相の総被覆笛（内外）として１６６μｍｏ
ｌ　７ｇ　　（４９％）を生じ、これの４２％は酵素分
解により除去された。Ｇ４０−ＩＪＩ）１１２は４２μ
ｍｏｌ　／ａ　　（，１２％）の総ペプチド被覆邑を産
出し、これの６１％は酵素分解によって除去された（第
１表）。疎水性ペプチドが外面に残ると、タンパク質の
吸着性が大きくなるとともに充屓月からのタンパク質の
回収が低くなることが観察される。血清タンパク質のカ
ラｌ＼に残る比率が最小であっても最高性能とならない
が、これはタンパク質の蓄積につれ被分析物を保持する
カラムの８退が次第に１員失づるためである。疎水性ペ
プチドを除去するためにｌｆｆ？索で処理しなかったサ
ボーｌ−からは、水性移動法相での溶離による標準釣人
の血ｔＸｉアルブミン（＋−Ｉ　Ｓ　Ａ　）の回収率は
約８０乃至９５％の範囲であった。酵素で処理したｌ５
−ＲＰザボートからのＨＳ　Ａの回収率は全ての場合、
１００％±２％であった。
ＵＦ−ａＡ導ＣＰＧ／４０　　Ｇｌｙｃｏｐｈａｓｃ　
（即ち、ポリペプチドを添加しない）からの人の血漿お
よびフェニトインの溶離を第３図に示す。
トリペプチドで誘導したＣＰＧ、／４０ＧＩｙｃｏＤｈ
ａｓｅからの血漿およびフェニトインの溶離を、酵素迅
理（ＥＳ−Ｉｓ−ＲＰ）により外面から疎水性法相を除
去しない場合につぎ、第４図に示す。
本発明のモデルｌ５−ＲＰカラムにおける人の血漿およ
びフェニトインの溶離を第５図に承り。
外面にペプチド法相を伴う充填材に残る極端なテーリン
グ（ｔａｉｌｉｎ（］　）　　（第４図）は、疎水性被
分析物の溶離をひどく不鮮明にする。従って、被分析物
は未処理ノコラムではタンパク質から分ｌ１ｉ１するこ
とができなかった。
ｌ５−ＲＰｆＪラムからのタンパク質の溶離はそのよう
なテーリングを示さず（第５図）、従って枝分＜ｌ’ｒ
物の分離が可能である。
ペプチドカラムからのフェニトイン被分析物の溶離を第
４．５図に示す。完全にペプチドで被覆されたサポート
の８但ファクタ（ｋ′）はｌ５−ＲＰカラムより大きく
（第１表）、またトリペプチド（Ｇ４０−（Ｉｔ）１１
２　＞　（１）容量フｙ’／夕ハ、予想通りジペプチド
（Ｇ４０−（］Ｉ）ｈ　ｌ　＞より大きかった。１ｓ−
ＲＰカラムにおけるフェニトインの保持は、カラムの切
換えで血漿タンパク質からフェニトインを分離するのに
十分であった。
ｌ５−ＲＰカラムの効率は、非酵素処理材料の効率より
潰れていることが判った（第１表）。これは外面からペ
プチド部分を除去して孔の入口領域への出入口が広くな
ったことによると思われる。
Ｉｓ　　ＲＰ　　Ｇ４０　０ｐｈｚにより人の血漿から
フェニトインを定量的に抽出することは、ｒＳ−ＲＰカ
ラムからの溶離後にオクタデシルシランカラムＢ（第２
図）にフェニトインを捕捉する事により実証された。続
いて、オクタデシルシランカラムＣ（第２図）に捕捉さ
れた被分析物をシャンティングづるが、これで２５４　
ｎｍの一定波長を検出してピーク高さを測定することに
よりフェニトインの）−ＩＰＬｃ定■化（第６図）が可
能となる。
この方法（より、発生した補正曲線は、メタノール中の
フェニトインの濃度範囲が５μｍし乃至２５μ（Ｊ／ｍ
Ｌであり、第７図に示す。
人の血漿中のフェニトインについて同じ濃度範囲に亘る
直線性が第８図に示される。
ｌ５−ＲＰ法による抽出で人の血漿からのフェニトイン
の回収は、フェニトインをメタノール中に溶解させ同じ
ｌ５−ＲＰ法で抽出した場合と比べると、タンパク質基
貿に付加されたフェニトインの約９７乃至１００％の範
囲にあった。〕にＩ〜インタンパク貿が９０％以上人の
血清アルブミンに結合することが知られているため、こ
れはタンパク質結合のフェニトインがｌ５−ＲＰカラム
への導入で解放されることを意味する。限外濾過の研究
によれば、この解放は水性移動法相における成分の置換
によらないこと、及び高率のフェニトインが本当にｌ５
−ＲＰカラムへの注入に先立らタンパク貿基質に結合さ
れたタンパク質であったことが判る。最初は、ｌ５−Ｒ
Ｐカラムはタンパク質風質から遊離非結合フェニトイン
のみを抽出するのであろうと予想されていた。しかしな
がら、モデルｌ５−ＲＰカラムは全濃度の非分析物が抽
出されることを示している。ｒＳ−ＲＰカラムがどうし
て人の血清アルブミンからのフェニトインの解放を亢進
するかという正確な理由は明らかではない。しかしなが
ら、これはモデルｌ５−ＲＰカラムの特異な特性である
ことが明白である。
Ｉ　５−Ｉｔ　Ｐ予備カラム抽出法により人の血漿試料
から全フェニトインｇ！瓜を定Ｉｈ化する相対的な精度
は平均で、存在する被分析物の♀の２，１％であること
が判っており、それに対し反復測定の精度（即ら「変動
係数」）は、平均で２，５％であることが判った（第２
表に示す〉。
Ｉｓ　　ＲＰ　　Ｇ４０　０Ｄｈ２モデルカラムは、約
１００個の人の血漿試料につきフェニトインの分析に使
用され、カラム性能の劣化または変化の兆候は何も観察
されなかった。
本発明のｌ５−ＲＰ充唄サポートは、液体クロマトグラ
フ材料において新しい概念を捉供する。
疎水性ペプチド結合状相を伴う小さい疎水性被分析物分
子の分配作用は、直径を≦８０オングストローム、好ま
しくは≦４０オンゲス１−ロームに調整した孔をもつ剛
性親水性サポートの内面に制限され、これにより大きな
高分子タンパク貿を含む基質から小さな疎水性被分析物
を動的に１ステツプで分離することが可能となる。ｌ５
−ＲＰ充充填車ボー１〜設計、及びサポートの外面から
疎水性分配状相を除去するのに酵素を利用するという基
本的な概念は、液体クロマトグラフ充填材の中で特異で
ある。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の一実施例に係る疎水性分配状相の反応
の概略を示す図、第２図はモデル＋５−ＲＰ材料の試験
に用いた子猫カラム抽出モード及び通常のオクタデシル
シラン分析カラムを承り概略図、第３図は非ＨＱ　ＣＰ
　Ｇ　／　４０　Ｇ　１ｙｃｏｐｈａｓｅからの人の血
漿およびフェニトインの溶離状態を示ず図、第４図はト
リペプチドで誘導したＣＰＧ／’　４　Ｑ　Ｑ　ｌ　ｙ
ｃｏｐｈａｓｅからの血漿およびフェニトインの溶離を
酵素処理（Ｅ　Ｓ　−Ｉ　Ｓ　、−ｒ’？、　Ｐ　）に
より外面から疎水性法相を除去しない場合にＪ３いて示
す図、第５図は本発明のモデルｌ５−ＲＰカラムにおけ
る人の血漿Ｊ５よびフェニトインの溶離を示す図、第６
図はフェニトインのＨＰＬＣ定吊化を示す図、第７図は
本発明に係る方法で得られたメタノール中のフに１〜イ
ン濃度を示すグラフ、第８図は人の血漿中のフェニトイ
ン濃度を示ずグラフである。 特許出Ｍ１人　　　　パーデユー・す１月−チ・ファウ
ンデーション 代　理　人　　　　弁理士　−色　叶　輔ｎａｌ　　　
　２ コブＩＣＩ Ｆ１″ｆ２ ♂１−Ｔ］ 「Ｔ１−ｒｌ １′間（励 ｒアコ−Ｔ１ 時　？Ｊ）　　（’／、≧）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）充填材料へのタンパク質物質の浸入を阻止するの
    に十分に小さい孔径をもつ多孔サポートと、該多孔サポ
    ートの内面にのみ結合した疎水性分配状相（ｐａｒｔｉ
    ｔｉｏｎｉｎｇ　ｐｈａｓｅ）と、該多孔サポートの外
    面に結合した親水性分配状相とからなり、被分析混合物
    中のタンパク質物質が該充填材料により拒絶されるもの
    の、該被分析混合物の疎水性成分が該充填材料に吸着さ
    れ保持されることを特徴とする液体クロマトグラフ・カ
    ラムの内面逆状相充填材料。
  2. （２）前記多孔サポートがシリカである特許請求の範囲
    第１項記載の充填材料。
  3. （３）前記多孔サポートがガラスである特許請求の範囲
    第１項記載の充填材料。
  4. （４）孔径が約８０オングストロームに等しいか、また
    はそれ以下である特許請求の範囲第１項記載の充填材料
    。
  5. （５）孔径が約４０μｍ以下である特許請求の範囲第１
    項記載の充填材料。
  6. （６）粒径が約１０μｍ以下である特許請求の範囲第１
    項記載の充填材料。
  7. （７）前記親水性分配状相がシリカに結合したグリセロ
    イルプロピル基からなる特許請求の範囲第１項記載の充
    填材料。
  8. （８）前記疎水性分配状相がグリセロイルプロピル基を
    介してシリカに結合したポリペプチド基からなる特許請
    求の範囲第１頃記載の充填材料。
  9. （９）前記ポリペプチド基がグリシン−Ｌ−フェニルア
    ラニンである特許請求の範囲第８項記載の充填材料。
  10. （１０）前記ポリペプチド基がグリシン−Ｌ−フェニル
    アラニン−Ｌ−フェニルアラニンである特許請求の範囲
    第８項記載の充填材料。
  11. （１１）多孔サポートの内外面に親水性分配状相を結合
    すること、それにより該多孔サポートの孔径が充填材料
    へのタンパク質物質の浸入を阻止するのに十分小さいサ
    イズに縮小されることと、該多孔サポートの内外面にあ
    る該親水性分配状相に疎水性分配状相を結合することと
    、該多孔サポートの外面から該疎水性分配状相を酵素で
    除去することとからなることを特徴とする液体クロマト
    グラフ・カラムの内面逆状相充填材料を製造する方法。
  12. （１２）前記親水性分配状相が結合有機水酸基からなる
    特許請求の範囲第１１項記載の方法。
  13. （１３）前記親水性分配状相がシリカに結合したグリセ
    ロイルプロピル基からなる特許請求の範囲第１１項記載
    の方法。
  14. （１４）前記疎水性分配状相がグリセロイルプロピル基
    を介してシリカに結合したポリペプチド基からなる特許
    請求の範囲第１１項記載の方法。
  15. （１５）前記ポリペプチド基がグリシン−Ｌ−フェニル
    アラニンである特許請求の範囲第１４項記載の方法。
  16. （１６）前記ポリペプチド基がグリシン−Ｌ−フェニル
    アラニン−Ｌ−フェニルアラニンである特許請求の範囲
    第１４項記載の方法。
  17. （１７）前記疎水性分配状相がカルボキシペプチダーゼ
    Ａでの処理により前記多孔サポートの外面から除去され
    る特許請求の範囲第１１項記載の方法。
  18. （１８）前記疎水性分配状相がキモトリプシンでの処理
    により前記多孔サポートの外面から除去される特許請求
    の範囲第１１項記載の方法。
  19. （１９）充填材料へのタンパク質物質の侵入を阻止する
    のに十分小さいサイズの孔径を有し、該充填材料の内外
    面に親水性分配状相を結合した多孔サポートで出発し、
    該多孔サポートの内外面にある該親水性分配状相に疎水
    性分配状相を結合することと、該多孔サポートの外面か
    ら該疎水性分配状相を酵素で除去することとからなるこ
    とを特徴とする液体クロマトグラフ・カラムの内面逆状
    相充填材料を製造する方法。
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