JPH0112474B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な特徴を有するホスホリパーゼＤ
−Ｐおよびその製造法に関する。 ホスホリパーゼＤはリン脂質に作用してアルコ
ールを遊離せしめる酵素作用を有しているためコ
リンオキシダーゼと組み合せてコリンリン脂質の
定量に用いることができることが知られている。
従来のホスホリパーゼＤは、種々のリン脂質に作
用するため、特定のリン脂質の定量は不可能であ
つた。 本発明者らは、リン脂質のうち、レシチンに高
い基質特異性を示し、レシチンに作用してホスフ
アチジン酸およびコリンを生成する反応を触媒す
るホスホリパーゼＤ活性を有する新規な酵素を見
い出した。本酵素をホスホリパーゼＤ−Ｐと命名
した。また本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐのスト
レプトミセス属に属する微生物の培養による製造
法を確立した。 ホスホリパーゼＤ−Ｐは、下記の理化学的性質
を有するものである。 基質特異性としてレシチンに作用し、リゾレ
シチンおよびスフインゴミエリンに対して、相
対活性がレシチンを基質とした場合の５％以下
である。 酵素作用は、反応式〔〕で示す通り。 レシチン＋H₂O→ホスフアチジン酸＋コリ
ン 〔１〕 本酵素はまた、下記の性質を有するものであ
る。 分子量：約46000（バイオゲル・ゲル過法に
よる） 至適PH：5.5付近 PH安定性：PH4.2−8.5付近 等電点：PH4.2付近 熱安定性：PH6.0で60℃、10分間の加熱まで
安定 本発明者らは、宮崎県えびの市の土壌より分離
したストレプトミセス（Streptomyces）属に属
する細菌AA586株が、主にその菌体外にホスホ
リパーゼＤ−Ｐを生産することを見い出し、該酵
素を単一までに精製した。 上記の細菌AA586株の菌学的性状は、以下の
通りである。 (a) 形態的性状 イーストエキス・麦芽エキス寒天培地上で、
26℃、10〜15日間培養し観察した所見は次の通
りである。 気菌糸；直径0.6−0.8μ、曲線状で、単純
分岐をなして伸長し、多数の連鎖した胞子を
形成する。胞子の連鎖は螺旋を呈し、ゆるく
２−４回巻いたものが多い。 胞子；短桿状ないし卵形で、大きさ0.6〜
0.8×1.0〜1.5μ、表面は平滑。 基生菌糸；分岐をなして曲線状に伸長し、
直径0.7〜0.7μ、菌糸の分裂や着生はみられ
ない。 勒毛胞子、胞子のう；形成しない。 (b) ジアミノピメリン酸形成 全細胞による分析で、Ｌ−型のジアミノピメ
リン酸が検出された。 (c) 各培地における生育状態 各種培地上で26℃、14日間培養し、観察した
所見は以下の通りである。 シユクロース・硝酸塩寒天培地 生育；僅少ないし不良。 基生菌糸の色；ライト・アイボリー〔Light
Ivory（2ca）〕 気菌糸；生じない。 可溶性色素；生じない。 グルコース・アスパラギン寒天培地 生育；不良 基生菌糸の色；ライト・ビート〔Light
Wheat（2ea）〕ないしバンブー〔Bamboo
（2gc）〕。 気菌糸；生じない。 可溶性色素；生じない。 グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育；中程度。 基生菌糸の色；バンブー（2gc）。 気菌糸；不良。 気菌糸の色；ナチユラル〔Natural（3dc）〕
ないしシルバー・グレイ〔SilverGray
（3fe）〕。 可溶性色素；ライト・イエロー〔Iight
Yellow（2ea）〕。 スターチ・無機塩寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；ライト・ビート（2ea）。 気菌糸；僅少ないし不良。 気菌糸の色；ホワイト〔White(a)〕ないしビ
スク〔Bisque（3ea）〕。 可溶性色素；生じない。 チロシン寒天培地 生育；中程度ないし良好。 基生菌糸の色；クロウブ・ブラウン〔Clove
Brown（3pl）〕。 気菌糸；不良ないし中程度。 気菌糸の色；シルバー・グレイ（3fe）ない
しグレイ〔Gray(g)〕。 可溶性色素；生じない。 オート・ミール寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；ライト・アイボリー（2ca）
ないしライト・ビート（2ea）。 気菌糸；僅少。 気菌糸の色；ホワイト(a)。 可溶性色素；生じない。 イーストエキス・麦芽エキス寒天培地 生育；良好。 基生菌糸の色；マスタード・ゴールド
〔Mustard Gold（2pg）〕ないしマスタード・
ブラウン〔Mustard Brown（2pi）〕。 気菌糸；中程度ないし良好。 気菌糸の色；グレイ(g)ないしシルバー・グレ
イ（3fe）。 可溶性色素；マスタード・ゴールド（2pg）。 ベネツト氏寒天培地 生育；中程度 基生菌糸の色；マスタード・ブラウン
（2pi）。 気菌糸；中程度。 気菌糸の色；グレイ(g)。 可溶性色素；マスタード・ゴールド（2pg）。 エマソン氏寒天培地 生育；中程度。 基生菌糸の色；マスタード・ゴールド
（2pg）。 気菌糸；生じない 可溶性色素；マスタード・ゴールド（2pg）。 栄養寒天培地 生育；僅少。 基生菌糸の色；無色 気菌糸；生じない。 可溶性色素；生じない。 ペプトン・イーストエキス・鈴寒天培地 生育；僅少。 基生菌糸の色；無色 気菌糸；生じない。 可溶性色素；生じない。 (d) 生理的諸性質 生育温度範囲；13〜35℃（至適温度22〜28
℃）。 ゼラチンの液化；液化しない。 スターチの加水分解；加水分解する。 脱脂牛乳のペプトン化、凝固；ペプトン化
および凝固しない。 メラニン様色素の生成；チロシン寒天培地
上では生成するが、ペプトン・イーストエキ
ス・鉄寒天培地上では生成しない。 炭素源の利用性； Ｌ−アラビノース − Ｄ−フラクトース − イノシトール − Ｄ−マンニトール − ラフイノース − Ｌ−ラムノース − シユクロース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ （ただし、プリドハム・ゴドリーブの基礎培地に
グルコースを添加しても、生育がみられなかつた
ので、スターチ・無機塩寒天培地のスターチを除
いたものを基礎培地として用いて試験した。）以
上の菌学的性状を総括すると、本菌AA586株は、
真性の気菌糸より多数の胞子の連鎖を有する気菌
糸を形成し、ジアミノピメリン酸がＬ−型であ
り、鞭毛胞子や胞子のうを形成しないことなどの
性状を有しており、このような性状を有する菌株
を、バージーズ・マニユアル・オブ・ザ・デタミ
ネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey′s
Manul of the Determinative Bacteriology）
第８版（1974年）で検索すると、ストレプトミセ
ス属に属するものであると同定された。よつて
AA586株を、ストレプトミセス・エス・ピー・
AA586（Streptomyces sp・AA586）と命名し
た。 また、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に、微生物受託番号「微工研菌寄第6100号、
FERM Ｐ−6100」として寄託されている。 さらに、本菌に限らず、本発明の新規なホスホ
リパーゼＤ−Ｐを生産する菌はすべて、本発明に
使用することができる。また簡単には、ストレプ
トミセス属に属するホスホリパーゼＤ−Ｐ生産菌
が使用される。 本発明を実施するにあたつては、該ホスホリパ
ーゼＤ−Ｐ生産菌を酸素を生産する通常の方法で
培養する。培養の形態は通常は液体培養で行なう
が、工業的には深部通気撹拌培養を行なうのが有
利である。培養の栄養源としては、微生物の培養
に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素
源としては資化可能な炭素化合物であればよく、
例えば、グルコース、シユクロース、乳糖、麦芽
糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリン
などが使用される。窒素源としては、利用可能な
窒素化合物であれば良く、特に有機化合物が好ま
しい。例えば、コーン・スチープ・リカー、大豆
紛、綿実紛、小麦グルテン、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物
などが使用される。その他、リン酸塩、マグネシ
ウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜
鉛などの塩類が必要に応じて使用される。培養温
度はホスホリパーゼＤ−Ｐを生産する範囲内で適
宜変更し得るが、好ましくは25〜30℃、特に好ま
しくは26℃程度である。培養時間は条件によつて
異なるが、ホスホリパーゼＤ−Ｐが最高収量に達
する時期を見計つて適当な時期に培養を終了すれ
ばよく、通常は40〜90時間である。 このようにして得られた培養物からホスホリパ
ーゼＤ−Ｐを採取するのであるが、本酵素は水に
易溶性であつて、主として培養液中に存在す
る。培養液中に存在するホスホリパーゼＤ−Ｐは
培養液を濃縮するかもしくは濃縮することなく
可溶性塩類例えば硫安、食塩などで飽和沈澱させ
るか、または親水性有機溶媒、例えばメタノー
ル、エタノール、アセトンなどを添加することに
より沈澱させることができる。沈殿物は水に溶解
し、半透膜で透析することにより低分子の不純物
を除去することができる。また、例えばジエチル
アミノエチル−セルロース、ジエチルアミノエチ
ル−セフアロース、パルミトイル化ガーゼ（特公
昭55−48791号に基いて調製したもの）などの吸
着剤に対する吸着親和力の差を利用してイオン交
換クロマトグラフイーまたは吸着クロマトグラフ
イー、あるいはデキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲル、セフアロースなどのゲル過剤を用
いるゲル過などの通常の手段を利用して培養液
中の低分子の不純物、有色物質などを有効に分離
することができる。これらの手段により得られる
酵素溶液から減圧濃縮、凍結乾燥などの操作によ
り、粗製ホスホリパーゼＤ−Ｐを得ることができ
る。 上記の処理により得られる粗製ホスホリパーゼ
Ｄ−Ｐの溶液あるいは固形物は、さらに蛋白質、
酵素などの精製に通常用いられる手段、例えば吸
着剤、ゲル過などを使用することにより、ホス
ホリパーゼＤ−Ｐを精製することができる。 次に本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐの活性の測
定法、性質などについて述べる。 酸素活性測定法 10ｍＭ CaCl₂50μl、３％トリトンＸ−
100Triton Ｘ−100）50μl、0.2Mジメチルグル
タル酸−NaOH緩衝液（PH5.5）100μl、10ｍＭ
レシチンエマルジヨン100μl、水150μlの組成を
有する反応液0.45mlを37℃で３分間プレインキ
ユベーシヨン後、50μlのホスホリパーゼＤ−Ｐ
を含む酵素液を加え、反応を開始する。正確に
10分後に10ｍMEDTA−1Mトリス−HCl緩衝
液（PH８）に溶解した１％セチルトリメチルア
ンモニウムクロリド0.5mlを添加して反応を停
止せしめた。次いで生成したコリンを、コリン
オキシダーゼ2.5単位、ペルオキシダーゼ2.5単
位、0.2％フエノール50μl、0.3％４−アミノア
ンチピリン50μl、1Mトリス−HCl緩衝液（PH
8.0）50μlの組成を有する反応液0.5mlを加えて
20分間反応せしめて発色させた。さらにこれ
に、1.5mlの１％トリトンＸ−100を加えた後、
500nｍで比色定量を行なつた。酵素活性は下
記の計算式により求めた。１単位（1Unit）は
上記反応条件下、１分間に1μmoleのコリンを
遊離させる活性とした。 酵素活性（Unit／ml） ＝△A500nｍ×１／４×1000／50×１／10 （ただし△A500nｍ：上記方法で酵素液を加え
ないで同様の操作を行ない、酵素液を添加した
値から差し引いた500nｍの吸光度の値） 基質特異性 上記の酵素活性測定法における反応液中のレ
シチンの代わりに下記の種々の物質を用いて、
ホスホリパーゼＤ−Ｐの基質特異性を検討し
た。その結果をレシチンに対する相対活性で示
す。基 質 相対活性（％） レシチン 100 リゾレシチン 3.4 スフインゴミエリン 0.03 上記の結果より、本酵素は少なくともレシチ
ンに対し、非常に高い特異性を示すものと認め
られ、リゾレシチンに対してはわずかながら作
用し、またスフイゴミエリンに対してはほとん
ど作用せず、レシチンを基質とする相対活性に
おいて、レゾレシチン、スフインゴミエリンに
対する活性は５％以下であると認められるもの
である。 酵素作用 １モルのレシチンおよび１モルの水から、１
モルのホスフアチジン酸およびコリンを生成す
る反応を触媒する作用を有する。 至適PH 前記の酵素活性測定法における0.2Mジメチ
ルグルタル酸−NaOH緩衝液の代りに、0.2M
ジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液（PH４−
7.5）（第１図中、〇――〇で示す）、リン酸緩衝
液（PH6.5−８）（第１図中、△――△で示す）、
トリス−HCl緩衝液（PH８−９）（第１図中、
□――□で示す）を用いて、本発明のホスホリ
パーゼＤ−Ｐのレシチンに対する酵素活性を測
定した結果第１図に示す通りであつて、至適PH
は5.5付近と認められる。 熱安定性 0.05％牛血清アルブミンを含む10ｍＭジメチ
ルグルタル酸−NaOH緩衝液（PH6.0）に溶解
した酵素液（25U／ml）を45〜75℃の各温度で
10分間処理し、その後水冷し、前記の酵素活性
の測定法に従つてホスホリパーゼＤ−Ｐのレシ
チンに対する酵素活性（残存活性）を測定し
た。その結果、第２図に示す通りであつて、そ
の熱安定性において本酵素は、60℃まで安定で
あつた。 PH安定性 0.05％牛血清アルブミンを含むジメチルグル
タル酸−NaOH緩衝液（PH４−7.5）（第３図
中、〇で示す）、トリス−HCl緩衝液（PH８−
8.5）（第３図中、△で示す）、グリシン−
NaOH緩衝液（PH9.5）（第３図中、□で示す）
およびリン酸緩衝液（PH6.5〜７）（第３図中、
●で示す）に48U／mlになるよう酵素液を調製
し、37℃、60分間放置後、ホスホリパーゼＤ−
Ｐのレシチンに対する酵素活性（残存活性）を
測定した。その結果は第３図に示す通りであつ
て、そのPH安定性は、4.2−8.5付近と認められ
る。 等電点 PH4.2付近（キヤリアアンフオライトを用い
る電気泳動法により測定した。） 分子量 約46000（バイオゲルＰ−200を用いるゲル
過去において測定した。） 種々の金属イオンおよびEDTAの影響 前記の酵素活性の測定法において種々の添加
物を加えてホスホリパーゼＤ−Ｐのレシチンに
対する酵素活性を測定した結果は次の通りであ
る。

【表】 上に示す通り、CuCl₂、NH₄Clのイオンにより
少し阻害されるが、他のイオンはほとんど影響
を及ぼさない。 各種界面活性剤の影響 前記の酵素活性の測定法において種々の界面
活性剤を加えてホスホリパーゼＤ−Ｐのレシチ
ンに対する酵素活性を測定した結果は次の通り
である。

【表】

【表】 ロライド
以上の通り、本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐは
レシチンに強く作用し、かつリゾレシチンおよび
スフインゴエミリンに対して相対活性が５％以下
と認められる特徴を有し、かつレシチンに作用し
て、ホスフアチジン酸とコリンを生じせしめ、ま
たその等電点が4.2、その分子量が46000であるこ
となどの理化学的性質により、公知のホスホリパ
ーゼＤとは異なるものと認められ、本発明の酵素
ホスホリパーゼＤ−Ｐは新規な酵素と認められ
る。 さらに本酵素は臨床検査試薬として、リン脂質
中レシチンの特異的定量に用いることができ得る
有用なものである。 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
が、本発明は何らこの実施例によつて限定される
ものではない。 実施例 １ 脱脂大豆紛２％、グルコース２％、
K₂HPO₄0.05％、MgSO₄0.01％、NaCl0.2％、ジ
スフオームCC−222 0.1％の組成を有する培地
100ml（PH6.5）を500ml容三角フラスコに入れ、
120℃、20分間滅菌後、ストレプトミセス・エ
ス・ピー・AA586株をスラントより−白金耳移
植し、26℃でロータリー・シエーカーにより通気
撹拌を行なつた。経時的に菌体外に分泌されたホ
スホリパーゼＤ−Ｐ活性を測定したところ、70時
間目に最大活性を示した（6.3U／ml）。 実施例 ２ 脱脂大豆紛２％、グルコース1.5％、マルトデ
キストリン１％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄0.01
％、NaCl0.2％、ジスフオームCC−222 0.2％の
組成を有する培地20（PH6.5）を30容ジヤー
フアーメンターに入れ、加圧滅菌後、実施例１に
記載の条件で培養したストレプトミセス・エス・
ピーAA586株の培養液200mlを移植し、26℃、20
／分の通気条件、300r.p.m.の撹拌条件下で培
養を行なつた。64.5時間後に活性の最大値が得ら
れた（4.7U／ml）。 実施例 ３ 実施例２で得られた培養液を、5000r.p.m.、10
分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清
28を４まで減圧濃縮した。この濃縮液に12
の冷アセトンを加え、４℃で60分間静置し、上清
をデカンテーシヨンにより除去した。沈澱に２
の冷アセトンを加え、静置後上清を除去した。沈
澱物を５の精製水に溶解し、これを１Kgのパル
ミトイル化ガーゼを充てんしたカラムに通し、酵
素を吸着させた。次いでこのカラムを10ｍＭ酢酸
緩衝液で充分洗浄後、0.1％トリトンＸ−100を含
10ｍＭ酢酸緩衝液で溶出を行なつた。得られた溶
出液21を１まで減圧濃縮し、1N酢酸でPHを
4.4に調製した。 その後、１の冷アセトンを加え、生じた沈澱
を5000r.p.m、10分間の遠心分離で除去し、上清
液を得た。次いで上清液に２の冷アセトンを加
え、生じた沈澱を110mlの10ｍＭ酢酸緩衝液（PH
6.0）に溶解し、セフアデツクスＧ−25で脱塩後
凍結乾燥し、350U／mgの比活性を有する精製ホ
スホリパーゼＤ−Ｐの紛末113mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のホスホリパーゼＤ−Ｐの至適
PH曲線を示し、第２図は本発明のホスホリパーゼ
Ｄ−Ｐの熱安定性曲線を示し、第３図は本発明の
ホスホリパーゼＤ−ＰのPH安定性曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記の理化学的性質を有すること
   を特徴とするホスホリパーゼＤ−Ｐ。 基質特異性としてレシチンに作用し、リゾレ
   シチンおよびスフインゴミエリンに対して、レ
   シチンにを基質とする相対活性が５％以下であ
   る。 酵素作用は、反応式〔〕で示す通り。 レシチン＋H₂O→ホスフアチジン酸＋コリン 分子量：約46000（バイオゲル・ゲル濾過法に
   よる）。 至適PH：5.5付近。 PH安定性：PH4.2−8.5付近。 等電点：PH4.2付近。 熱安定性：PH6.0で60℃、10分間の加熱まで
   安定。 ２ 少なくとも下記の理化学的性質を有するホス
   ホリパーゼＤ−Ｐの製造において、ストレプトミ
   セス属に属するホスホリパーゼＤ−Ｐを生産する
   ホスホリパーゼＤ−Ｐ生産菌を培地に培養し、培
   養物からホスホリパーゼＤ−Ｐを採取することを
   特徴とするホスホリパーゼＤ−Ｐの製造法。 基質特異性としてレシチンに作用し、リゾレ
   シチンおよびスフインゴミエリンに対して、レ
   シチンにを基質とする相対活性が５％以下であ
   る。 酵素作用は、反応式〔〕で示す通り。 レシチン＋H₂O→ホスフアチジン酸＋コリン 分子量：約46000（バイオゲル・ゲル濾過法に
   よる）。 至適PH：5.5付近。 PH安定性：PH4.2−8.5付近。 等電点：PH4.2付近。 熱安定性：PH6.0で60℃、10分間の加熱まで
   安定。 ３ ストレプトミセス属に属するホスホリパーゼ
   Ｄ−Ｐ生産菌が、ストレプトミセス・エス・ピー
   AA586株（FERM Ｐ−6100）である特許請求の
   範囲第２項記載のホスホリパーゼＤ−Ｐの製造
   法。