JP2957246B2 - 微生物起源カルボキシペプチダーゼｂ様酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な微生物起源カルボキシペプチダーゼＢ
様酵素に関する。

（従来の技術） カルボキシペプチダーゼＢ（以下、CPase Bとする）
はすでに知られており〔J.E.Folk,The Enzymes（3rd e
d.）３ 57〜79（1971）〕、このCPase Bは、ペプチドの
Ｃ末端のアルギニンまたはリシンを切断するため、タン
パクの一次構造解析用の生化学試薬として汎用されてい
る。さらに、このCPase Bは、例えばキニン（Kinin）の
不活化作用を有するため、医薬品としての用途などが期
待される。

CPase Bはヒト、ウシ、ブタ、ラットの膵臓、サメ、
ヒトデなどに存在し、ブタ膵臓抽出物を原料としたもの
が市販されている。しかし膵臓抽出物は他の酵素、例え
ば、カクレインおよびトリプシンを含んでいるため、工
業的なスケールでこの両方の酵素とCPase Bとを分離す
るには、非常に大きな経費を必要とする。さらに、動物
臓器は酸素製造原料として資源的に工業規模の生産には
適していないという欠点がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、そ
の目的とするところは、動物臓器由来のCPase Bにかわ
る微生物起源のCPase B様酵素を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の目的を達成すべく、種々の微生
物を検索した結果、大阪府富田林市の土壌中から採取さ
れたChaetomium（ケトミウム）に属するChaetomium sp.
F−33が目的とするカルボキシペプチダーゼの性質を有
する酸素を生産することを見い出した。そして、この酵
素を精製し、その性質を詳細に検討した結果、新しいタ
イプのCPase B様酵素であることを確認し、本発明を完
成するに至った。

本発明のCPase B様酵素は、次の性質を有する。

（１）作用:C末端がアルギニンまたはリシンであるペプ
チドの該末端のアルギニンまたはリシンを、加水分解に
より遊離させる。

（２）基質特異性：グリシル−グリシル−チロシル−ア
ルギニン、ブラジキニン、ニューロテンシン断片１−８
に作用し、Ｃ末端のアルギニンを加水分解により遊離さ
せる。

（３）至適pH:約8.5（トリス−塩酸緩衝液中）。

（４）至適温度:55℃ （５）pH安定性:25℃にて９時間保持した場合に、pH7〜
10において安定である。

（６）熱安定性:4℃、pH7.5にて保持すると、少なくと
も１年間は100％の活性を示す。

55℃で５時間加熱した場合に、90％の残存活性を示
す。

（７）分子量：ゲル濾過法により測定した場合の分子量
は約45万である。

（８）等電点:5.49 本発明のCPase B様酵素はChaetomium属菌、特にChaet
omium sp.F−33株により生産される。この菌株は、発明
者らにより大阪府富田林市より採取された土壌中から単
離された新菌株である。この菌株の菌学的性質を次に示
す。

（Ａ）培地における生育状態 肉汁寒天培地 肉汁寒天倍値での生育は５％では全く起こらない。30
℃では７日間でコロニーの直径が4.7〜5.7cmに達する。
性状は白い綿状である。14日間の培養でコロニーの直径
は７〜8cmに達する。21日間の溶媒で表面は密になり湿
った状態の羊毛状となるが、着色は見られず子のう殻も
形成されない。37℃では生育が悪く熟練に至らない。

ツァペック寒天培地 ツァペック寒天培地での生育は５℃では全く起こらな
い。30℃では７日間でコロニーの直径が４〜5cmに達す
る。性状は白い綿状であり、肉汁寒天培地上のコロニー
に比べて湿状態となる。14日間の培養ではコロニーの直
径が７〜8cmに達し、部分的に黒緑色となる。30日の培
養でほぼ全体的に黒緑色となる。子のう殻の形成は見ら
れない。

オートミール寒天培地 オートミール寒天培地での生育は５℃では起こらな
い。30℃では７日間でコロニーの直径は５〜6cmに達
し、性状は羊毛状となる。14日間でコロニーの直径は７
〜8cmに達し裏面が暗オリーブ緑色〜緑黄色となる。

ポテト・グルコース寒天培地 ポテト・グルコース寒天培地での生育は５℃では起こ
らない。23℃では９日間でコロニーの直径は４〜5cmに
達し、性状は白い綿状である。14日間ではコロニーの直
径は6.5〜7.5cmに達する。中心部と円周部を残し、中間
部の内部は黒緑色となり、中心部の裏面は黒かっ色とな
る。それにともなって全体が湿った状態となり、着色部
に油球を生じる。子のうは多く認められるが子のう胞子
は少ない。黒緑色の部分に子のう殻の形成が認められ
る。

（Ｂ）生理的、生態的性質 最適生育条件 pH ５〜７ 温度 23℃〜27℃ 生育の範囲 pH ４〜８ 温度 15℃〜37℃ その他の顕著な特徴 ポテト・グルコース培地での培養により、カルボキシ
ペプチダーゼＢ様酵素を菌体内に生産する。

（Ｃ）顕微鏡的所見 子のう殻：若いうちは透明であり、成熟すると黒緑色
となる。卵形〜亜球形で大きさは200〜240×150〜200μ
ｍである。

頂毛：暗オリーブかっ色〜ほとんど黒色で隔壁があ
り、直毛である。ほぼ直角に分枝し、複雑な網目を形成
する。先細にならずぶっつりした先端におわる。基部で
の幅７〜7.5μｍ。

側毛：頂毛に類似するが幅は狭い。基部での幅５〜６
μｍ。

子のう：こん棒形 ８胞子 子のう胞子：最初は無色で、後に暗オリーブかっ色と
なる。幅広いだ円形〜円形。６〜７×４〜６μｍ。

上記菌学的性質に基づいて、「ア・モノグラフ・オブ
・ケトミウム（A monograph of the genus chaetomiu
m）」（1970）〔セス（H.K.Seth）〕、「ケトミアシエ
（Chaetomiaceae）」（1963）〔アメス（L.M.Ame
s）〕、および「菌類図鑑（下）」（1978）〔椿 啓介
他〕を参照し、これを検索したところ本菌株はケトミウ
ムに属すると判断された。本菌株はケトミウム・スピノ
スムに類似するがケトミウム・スピノスムは子のう胞子
が卵形であり（上記文献に記載）、本菌株では幅広いだ
円形〜円形であることが異なる。さらに、ケトミウム・
スピノスムは37℃では生育せず、オートミール寒天培地
上で灰黄かっ色になる（上記文献に記載）のに対して、
本菌株では裏面が暗オリーブ緑色〜緑黄色となり、37℃
で生育は悪いが生育可能である点で異なる。

従って、本発明者は本菌株をChaetomium（ケトミウ
ム）sp.F−33と命名した。本菌株は、工業技術院微生物
工業技術研究所に、微工研菌寄第11717号（FERM P−117
17）として寄託されている。

本明細書においてアミノ酸、ペプチド、保護基等の略
号による表示は当該分野における慣用記号に従うものと
する。

培養条件 本発明のCPase B様酵素を製造するために生産菌株を
培養するための培地は格別である必要はなく、通常の培
地が用いられる。炭素源としてグルコース、シュークロ
ース、グリセロール、デンプンなどが用いられる。窒素
源として肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ポリペプ
トン、カザミノ酸、各種アミノ酸、総合アミノ酸、ダイ
ズタンパク、魚粉などが用いられる。塩類としては、Na
Cl、KCl、酒石酸カリウム、硝酸ナトリウム、リン酸一
カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどが用
いられる。その他、ふすま、米糠、菜種粕、糖密、コー
ンスティープリカー、ポテトエキス、ビタミン類なども
有用である。

特に、本カルボキシペプチダーゼＢ様酵素（以下、CP
ase B様酵素とする）生産菌の培養（種培養および生産
用培養を含む）の培地として好適に用いられる培地とし
ては、ポテトエキス・シュークロース培地が好適である
（実施例で詳述する）。培養はpH5〜７、好ましくはpH6
付近で、25℃〜37℃、好ましくは30℃にて、振とうまた
は通気攪拌下にて行われる。培養時間は、例えば坂口フ
ラスコを用いた場合には、40〜100時間が適当であり、
ファーメンターを用いた場合には45〜50時間が適当であ
る。

酵素の採取法 本CPase B様酵素は主に菌体内に存在するので、培養
終了後、ろ過あるいは遠心分離などにより集菌した後、
菌体を破砕して酵素の抽出を行う。例えば、ガラスビー
ズ、海砂などの共存下で、菌体を乳鉢、ボールミルなど
を用いて磨砕する方法（市販装置としてダイノミルA,Ba
chofen社がある）、凍結融解法、酵素処理法などがあげ
られる。菌体の破砕法は特に限定されないが回収率の高
い方法が好ましい。菌体破砕後は緩衝液を加えた後ろ過
し、あるいは遠心分離を行うことにより粗酵素液が得ら
れる。

この粗酵素液から精製酵素を得るには、通常、酵素の
精製に用いられている方法が単独で、もしくは組合わせ
て用いられ得る。それには例えば、塩析、溶媒沈澱、各
種イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラ
フィー、遠心分離、電気泳動法などが挙げられる。例え
ば、粗酵素液を硫安分画し、次いで、エタノール分画を
行い、クロマトグラフィーにかけ、そしてゲル濾過を行
うことにより精製酵素が得られる。上記クロマトグラフ
ィー処理としては、例えば、まず、イオン交換カラム
（Ｑ−セファロース、DEAEトーヨーパールなど）にか
け、次いで、疎水カラム（ブチルトーヨーパールなど）
にかける方法が挙げられる。上記ゲル濾過担体としては
トーヨーパールHW55Sなどがある。

活性測定法 30mM Bz−Gly−Arg 0.1mlと100mMトリス−塩酸（pH8.
5）0.85mlの混液に酵素液0.05mlを加え、55℃で反応を
開始させる。15分間反応後、これを速やかに氷冷したの
ち、200mMクエン酸緩衝液（pH5.0）を1mlとニンヒドリ
ン試薬1mlとを順次加えて、すばやく攪拌し、反応を停
止させる。得られた反応液を沸騰水中で５分間加熱した
後、氷冷する。これに60％（v/v）エタノール2mlを加
え、十分に混合した後、570nmにおける吸収を測定す
る。本酵素の１単位（Ｕ）は、55℃で１分間当り１モル
の基質を分解する（１モルのArgを遊離する）ことので
きる酵素量とする。

本測定に用いるニンヒドリン試薬は、ニンヒドリン15
gをメチルセロソルブ300mlで溶解したＡ液、0.01M KCN
5mlにメチルセロソルブ250mlを溶解させたＢ液とを1:5
の比で混合して調製する。

酸素の性質 以下の酵素の性質のうち、基質特異性、阻害、各種イ
オンの影響、分子量、等電点、およびKm値については後
述の実施例により得られる精製標品を用いて測定を行っ
た。至適pH及び安定pH範囲、至適温度および熱安定性に
ついては、次のようにして得られる部分精製標品を用い
た。まず、菌体抽出液に硫安を80％飽和で加え、得られ
た沈澱を、100mMトリス−塩酸（pH7.5）に対し透析し
た。この透析内液を同緩衝液で平衡化したＱ−セファロ
ースに吸着させた後、溶出液のNaCl濃度を０〜1Mに直線
的に高めて溶出させ、部分精製標品を得た。

作用 Ｃ末端がアルギニンまたはリシンであるペプチドの該
末端のアルギニンまたはリシンを、加水分解により遊離
させる。末端がアルギニンのペプチドに最もよく作用す
る。

基質特異性 表１に示す合成ペプチドの分解性を調べた。まず、５
％エタノールを含む100mMトリス−塩酸（pH8.5）に各基
質（合成ペプチド）を1mMの割合で加え、55℃において
所定の時間反応させた。ニンヒドリン法（活性測定法に
準ずる）により生成した遊離アミノ酸を定量することに
より、基質分解速度を算出した。その結果を表１に示
す。

表１から、本発明CPase B様酵素は、Ｃ末端がArgのペ
プチドを最もよく分解することがわかる。Argと同様に
塩基性アミノ酸であるLysをＣ末端に有するペプチドも
比較的よく分解するが、その速度はArgの場合の約1/9で
あった。この点で、本酵素は、CPase B、例えば、The E
nzyme,3rd ed.,3,57−79（1971）に記載のCPase B（こ
の酵素は、末端がArgのペプチドおよび末端がLysのペプ
チドを同程度の割合で分解する）と異なる。Ｃ末端から
２番目のアミノ酸残基がPhe（芳香族アミノ酸）である
ペプチドの場合には、同程度の分解能が認められるが、
Gly,Ala,Ile,Leuなどの脂肪族アミノ酸の場合にはＣ末
端のアミノ酸の種類によりそれぞれ分解能が異なること
がわかる。

次に、本酵素による各種天然ペプチドの分解を調べ
た。1mMの基質を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.5）中、55
℃において所定の時間酵素を反応させた。遊離したアミ
ノ酸をアミノ酸分析計（日立高速アミノ酸分析計835
形）で測定した。その結果を表２に示す。

表１の結果と同様、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基
がTyr,Pheなど芳香族アミノ酸の場合には高い分解活性
が示された。これに対し、Alaでは1/3〜1/4に活性が低
下し、Leuではまったく分解が行こらなかった。さら
に、本CPase B様酵素はＣ末端から２番目のアミノ酸残
基がProの場合にも比較的良好に分解が行われた。これ
は、上記The Enzymeに記載のCPase Bが、Ｃ末端から２
番目がProであるペプチドをほとんど分解しないのとは
大きく異なる点である。

このように、本発明のCPase B様酵素は、Arg、Lysな
どの塩基性アミノ酸をＣ末端に有するペプチドをよく分
解するという点では従来のCPase Bと同様であるが、次
の点において異なることが明らかである。

（ｉ）ArgをＣ末端に有するペプチドの方がLysをＣ末端
に有するペプチドの場合より10倍近く分解が速い。

（ii）Ｃ末端から２番目のアミノ酸がProであるペプチ
ドについても比較的良好に分解が行なわれる。

（iii）Ｃ末端から２番目のアミノ酸が芳香族アミノ酸
の場合には、比較的良好に分解が行われる。

至適pHおよび安定pH 本酵素を用い、pH6〜10の範囲のpH条件下で活性測定
法に準じて酵素反応を行った。各pHにおける酵素の相対
活性を第１図に示す。第１図において、●はトリス−塩
酸、△はKH₂PO₄−Na₂HPO₄、□はホウ酸・KCl−Na₂CO₃、
そして○はNa₂HPO₄−クエン酸の各緩衝液を用いた結果
を示す。第１図から、至適pHは55℃において約8.5であ
ることがわかる。

本酵素を所定のpHのBritton−Robinson緩衝液に2.76
×10^-7U/mlの割合に溶解し、25℃で９時間保持した後に
残存活性を測定した。その結果を第２図に示す。第２図
から安定pH範囲は、pH7.0から10.0であることがわか
る。

作用適温の範囲 本酵素を用いBz−Gly−Argを基質とし、30〜70℃の範
囲の温度条件下で、活性測定法に準じて酵素反応を行っ
た。その相対活性を第３図に示す。第３図から本酵素の
至適温度は約55℃であることがわかる。

熱安定性 本酵素をpH7.5、４℃にて保持したところ少なくとも
１年間は失活しなかった。pH7.5、55℃にて４時間保持
した後にも90％の残存活性を示した。

本酵素を2.76×10^-7U/mlの濃度でpH7.5において、第
４図に示す温度（55℃〜100℃）にて15分間保持し、そ
の残存活性を求めた。その結果を第４図に示す。第４図
から本酵素は、pH7.5で15分間保持したときに55℃まで
安定であり、80℃以上において完全に失活することがわ
かる。

阻害 表３に示す化合物を0.7mMの割合で含む100mMトリス−
塩酸（pH8.5）中で、本酵素（3.8×10^-9U/ml）を10分間
インキュベートした後、残存活性を測定した。その結果
を表３に示す。

表３に示すように、本酵素はCPase Bと同様にEDTA,o
−フェナンスロリンなどの金属キレート剤で強く阻害さ
れた。このことから、本酵素はメタル酵素であることが
明らかである。しかし、本酵素はDTT,PCMBによっても阻
害されることから−Ｓ−Ｓ結合、−SH基も活性の発現に
必要であると考えられる。従って、同じくメタル酵素で
あるCPase Bとは異なる酵素であると考えられる。

各種イオンの影響 次に、本酵素の活性に与える各種イオンの影響につい
て検討した。まず、1mM EDTAを含む100mMトリス−塩酸
（pH7.5）に対し、酵素液を４℃で12時間透析し、次い
で再度100mMトリス−塩酸（pH7.5）に対し透析を行って
EDTAを除去した。これに表４に示す化合物を、所望のイ
オンが1mMとなるような濃度で添加し、該酵素の活性を
測定した。

表４に示すように、試験した範囲内のイオン種では活
性化は認められず、むしろ阻害された。特にCoCl₂を添
加した場合には活性化が著しく低下した。これは従来の
CPase Bと大きく異なる特徴である。

分子量 トーヨーパールHW55Sを用いた、ゲルろ過による分子
量は約45万である。

等電点 ファストゲルIEF3−９を用いたファストシステム（フ
ァルマシア社製）を用い、pIカブリレションキットpH2.
5〜6.5をスタンダードとして本酵素の等電点を測定し
た。その結果、本酵素の等電点は5.49であった。

Bz−Gly−Argに対するKm値 Bz−Gly−Argを基質として100mMトリス−塩酸（pH8.
5）中で反応を行ない、Km値を算出した。その結果、Km
値は0.59mMであった。

既知酵素との比較 本酵素と、これまでに報告されているCPase Bとの比
較を行なった結果、次の相違が明らかとなった。

両酵素とも、塩基性アミノ酸であるArgまたはLysをＣ
末端に対するペプチドの該末端のArgまたはLysを加水分
解により特異的に遊離させる。本発明のCPase B様酵素
は、Argを有する基質に対して、より遊離に働き、その
分解速度は、Argを有する基質に対する方がLysを有する
基質に対するよりも約10倍速い。これに対して、従来の
CPase Bは、ArgをＣ末端に有する基質およびLysをＣ末
端に有する基質に同程度に作用する。

本酵素は、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基がPheで
あるペプチド、およびProであるペプチドに作用して、
比較的良好にこれを分解する。これに対して、従来のCP
ase Bはこれらの分解性が低い。

両酵素とも金属酵素であるが、本酵素の場合にはCoCl
₂またはZnSO₄による活性化が認められない。さらにDTT
またはPCMBによっても阻害を受ける。これに対して、従
来のCPase Bは、CoCl₂またはZnSO₄による活性化が認め
られ、かつ、DTTまたはPCMBにより阻害を受けにくい。

このように、本発明の酵素はペプチドのＣ末端のArg
またはLysを特異的に遊離するという性質については、
従来のCPase Bと同じである。しかしながら、基質特異
性、阻害剤に対する感受性およびイオンの影響という点
で全く異なる新規酵素である。従って、本酵素はCPase
B様酵素と命名された。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（Ａ）菌体の培養 皮をむいて1cm角に切ったじゃがいも200gに対し水を5
00ml加え、加熱・沸騰させて１時間抽出を行った。冷却
後、さらしで濾過を行い、最後に、1000mlになるように
蒸留水を加えた。このようにして得られたポテトエキス
に２％（w/v）のシュークロースを添加し、ポテトエキ
ス・シュークロース培地とした。

このポテトエキス・シュークロース培地を滅菌し、Ch
aetomium sp.F−33株を植菌し、30℃にて３日間種培養
を行った。別に、上記ポテトエキス・シュークロース培
地3.5を５容のファーメンターに入れ、120℃にて15
分間殺菌を行った。これに上記種培養した培養物300ml
を加え、30℃、攪拌数100rpm、通気量１/minの条件下
で培養を行った。酵素活性が最大となる培養45時間後
に、さらしとろ紙を用いた吸引ろ過により集菌を行い、
菌体70gを得た。

（Ｂ）酵素の単離および精製 この菌体70gに対しほぼ同量の海砂を加え乳鉢中で菌
体を破砕した。これに、100mMトリス−塩酸（pH7.5）20
0mlを加えて、しばらく放置し、さらしとろ紙を用いた
吸引ろ過を行い、ろ液（粗酵素抽出液）200ml（全活性
7.73×10^-4U、比活性0.0232）を得た。以上の抽出操作
は氷冷下で行った。

この粗酵素抽出液を用い、以下に述べるように精製を
行った。まず、粗酵素抽出液を、40〜60％飽和で硫安分
画し、酵素を沈澱物として回収した。この沈澱物を100m
Mトリス−塩酸（pH7.5）に溶解した後、４℃で一晩透析
を行い、ひき続き、エタノール分画（40〜60％v/v）を
行い、再び酵素を沈澱物として回収した（全活性4.18×
10^-4U、比活性7.64;収率54％）。

この沈澱物を100mMトリス−塩酸（pH6.0）に溶解した
後、同緩衝液に対し透析した。透析内液を、あらかじめ
同緩衝液で平衡化しておいたＱ−セファロース（1.6×1
3cm;ファルマシア社製）に吸着させた後、100mMトリス
−塩酸（pH6.0;0.1M NaClを含む）で、充分にカラムを
洗浄し、NaCl濃度を0.1Mから0.4Mに直線的に高めること
により酵素を溶出させた。本酵素は溶離液のNaCL濃度が
0.3M付近から溶出された（全活性3.39×10^-4U、比活性4
0.8;収率44％）。

次に、活性画分を100mMトリス−塩酸（pH7.5）に対し
て透析した後、あらかじめ同緩衝液で平衡化したDEAEト
ーヨーパール650M（１×9cm;東ソー社製）カラムに吸着
させた。0.1m NaClを含む100mMトリス−塩酸（pH7.5）
で充分に洗浄した後、0.1M〜0.15M NaClの直線濃度勾配
により、フラクション当り2mlずつの溶出を行った。本C
Pase B様酵素はNaCl濃度が0.12M付近から溶出された
（全活性2.60×10^-4U、比活性144;収率34％）。

溶出された活性画分を100mMトリス−塩酸（pH7.5、3M
NaClを含む）に対して透析した後、あらかじめ同緩衝
液で平衡化しておいたブチルトーヨーパール650（１×9
cm;東ソー社製）に吸着させ，同緩衝液で洗浄した後、3
Mから0MにNaCl濃度を直線的に減少させることにより酵
素の溶出を行った。本CPase B様酵素は、NaCl濃度が約1
M付近で溶出された（全活性1.78×10^-4U、比活性278,収
率23％）。

溶出された活性画分を100mMトリス−塩酸（pH7.5）に
対して充分に透析し、その内液を、あらかじめ同緩衝液
で平衡化したＱ−セファロース（１×9cm;ファルマシア
社製）に吸着させた。これを、0.23MのNaClを含む同緩
衝液で洗浄した後、NaCl濃度を0.23Mから0.4Mに直線的
に高めた溶離液を用いて酵素の溶出を行った。酵素活性
はNaCl濃度が約0.4Mのときに完全に溶出された（全活性
0.618×10^-4U;比活性170,収率8.0％）。

さらに、溶出された活性画分を100mMトリス−塩酸（p
H9.0）に対して透析した後、この透析内液を同緩衝液で
平衡化したDEAEトーヨーパール650M（0.5×5cm、東ソー
社製）に吸着させ、0.18M NaClを含む同緩衝液で充分に
洗浄した。酵素の溶出は0.18Mから0.25MのNaClの直線濃
度勾配により行った。酵素活性はNaCl濃度が約0.2M付近
に溶出された（全活性0.274×10^-4U;比活性106;収率3.5
％）。

最後に、活性画分12mlを限外濾過（アミコン8050型）
を用いて2mlに濃縮した。この濃縮酵素液を、あらかじ
め100mMトリス−塩酸（pH7.5）で平衡化しておいたトー
ヨーパールHW55Sカラム（2.6×90cm、東ソー社製）にか
け、流速45.6ml/時間でフラクション当り2mlづつを分取
した（全活性0.027×10^-4U;比活性34.2;収率0.35％）。

以上の一連の操作により、収率0.35％で比活性が1470
の精製酵素が得られた。この精製標品の純度をpH7.5フ
ァストゲル（ファルマシア社製）を用い検討した結果、
単一であることが明らかとなった。

上記精製酵素、および部分精製酵素の性質を調べたと
ころ、「酵素の性質」の項に記載した各性質が確認され
た。

（発明の効果） 本発明によれば、このような、新規なカルボキシペプ
チダーゼＢ様酵素が得られる。この酵素は微生物起源で
あるため生産が容易である。さらに、既知のカルボキシ
ペプチダーゼとは基質特異性が異なるため、このような
性質のちがいを利用して、蛋白の一次構造決定用試薬な
ど、種々の用途に利用することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素の至適pHを示すグラフ；第２図は該
酵素の安定pH範囲を示すグラフ；第３図は該酵素至適温
度を示すグラフ；そして第４図は該酵素の安定性に及ぼ
す温度の影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村尾 澤夫 大阪府堺市堀上緑町２丁８番12号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の理化学的性質を有するカルボキシペ
   プチダーゼＢ様酵素。 （１）作用:C末端がアルギニンまたはリシンであるペプ
   チドの該末端のアルギニンまたはリシンを、加水分解に
   より遊離させる。 （２）基質特異性：グリシル−グリシル−チロシル−ア
   ルギニン、ブラジキニン、ニューロテンシン断片１−８
   に作用し、Ｃ末端のアルギニンを加水分解により遊離さ
   せる。 （３）至適pH:約8.5（トリス−塩酸緩衝液中）。 （４）至適温度:55℃ （５）pH安定性:25℃にて９時間保持した場合に、pH7〜
   10において安定である。 （６）熱安定性:4℃、pH7.5にて保持すると、少なくと
   も１年間は100％の活性を示す。 55℃で５時間加熱した場合に、90％の残存活性を示す。 （７）分子量：ゲル濾過法により測定した場合の分子量
   は約45万である。 （８）等電点:5.49
2. 【請求項２】Chaetomium属由来である、請求項１に記載
   の酵素。