JPH0134035B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0134035B2 JPH0134035B2 JP60001989A JP198985A JPH0134035B2 JP H0134035 B2 JPH0134035 B2 JP H0134035B2 JP 60001989 A JP60001989 A JP 60001989A JP 198985 A JP198985 A JP 198985A JP H0134035 B2 JPH0134035 B2 JP H0134035B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sarcosine
- enzyme
- range
- thermostable
- glycine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規な耐熱性ザルコシン・オキシダー
ゼＮ及びその製造法に関する。 〔従来の技術〕 ザルコシン・オキシダーゼは、 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 の反応を触媒する酵素で、例えば特開昭54−
52789号公報、ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー第89巻、第599頁、1981年ジヤパン〔J.
Biochem.89、599（1981）JAPAN〕に記載され、
知られている。 一方、現在、臨床医学分野において血清、尿中
のクレアチニンあるいはクレアチンを定量して腎
臓機能の疾患、筋肉疾患等の診断をおこなつてい
るが、その定量法としては、アルカリ性ピクリン
酸とクレアチニンとの反応により生ずる橙色を測
定する、いわゆるヤツフエ法が知られている。し
かしその発色反応は血清、尿中にある各種物質に
より影響を受ける非特異的反応である。そのた
め、ヤツフエ法で測定した値は信頼性が乏しく、
またこの方法では除蛋白操作を必要することが多
く、操作が煩雑になる欠点がある。 そこで、最近になつて、クレアチニンあるいは
クレアチンを酵素的に定量する方法が報告され
〔臨床化学シンポジウム第19集、第196頁
（1979）〕、その定量法は下記の通りであつて、こ
れにザルコシン・オキシダーゼが使用されてい
る。なお、下記の式中、括弧内は使用酵素であ
る。 クレアチニン＋H2Oクレアチン （クレアチニン・アミドヒドロラーゼ） クレアチン＋H2O→ザルコシン＋尿素 （クレアチン・アミジノヒドロラーゼ） ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 （ザルコシン・オキシダーゼ） 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記したように、最近クレアチニンあるいはク
レアチンを酵素的に定量する方法が開発された
が、血清、尿中に含まれるクレアチニン量あるい
はクレアチン量は非常に少ないので、その定量に
際しては、高感度の酵素的測定法が期待されてい
た。 最近になつて、過酸化水素（H2O2）をパーオ
キシダーゼ（西洋ワサビ由来のPeroxidase）と
中性〜微酸性で高感度に発色する発色剤が開発さ
れ、その際の発色剤による発色は青色あるいは緑
色で、血清成分由来の黄色、赤色とは全く異なる
ので、血清ブランク値を個別に測定する必要がな
い点で有利である。しかしながら、これ等の発色
剤は、PH7.5以上では発色した色素が不安定で脱
色するので、酵素反応―発色反応を中性ないし微
酸性で行ない、安定な発色反応を行なわせる必要
があり、しかも、パーオキシダーゼの至適PHな微
酸性（PH6.5付近）にあるので、共役酵素も微酸
性で充分酵素作用を有する酵素の開発が要求され
る。 また、定量に用いられる酵素としては、夾雑酵
素を含まない純度の高い酵素が要求され、それを
得るために酵素の大量精製工程において夾雑酵素
（例えばカタラーゼ、ウリカーゼ等）を加熱処理
で完全に失活させた、比活性の高い高純度の酵素
の出現が期待されている。 さらに、血清、尿中に含まれるクレアチニンあ
るいはクレアチンの量が小さいので、クレアチニ
ンあるいはクレアチンが酵素的に分解されて生成
されるザルコシンの量も当然微量となり、このよ
うな微量のザルコシンにも作用するKm値（ミカ
エリス定数）の小さい酵素の開発が業界では強く
要望されている。 このような問題点を解決したのが本発明であ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 上記した事情に鑑み、本発明者は、クレアチニ
ンあるいはクレアチンの高感度な酵素的測定法に
好適な、微酸性でも充分に酵素作用し、熱に安定
で、ザルコシンに対するKm値の低い酵素的性質
を同時に所有する新規なザルコシン・オキシダー
ゼを提供すべく鋭意検討を重ねた結果、新たに土
壌より分離したパチルス属に属する菌株を培養し
たものより、微酸性でも充分酵素活性を示し、耐
熱性で、ザルコシンに対するKm値の低い新規な
ザルコシン・オキシダーゼが得られることを知
り、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、以下の理化学的性質を有
する耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮである。 (a) 作用： ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホル
ムアルデヒド及び過酸化水素を生成する下記の
酵素反応を触媒する酵素である。 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 (b) 基質特異性： ザルコシンに対するKm値（ミカエリス定
数）は37℃、PH7.7（リン酸緩衝液）で4.7ミリ
モルである。 (c) 至適PH及び安定PH範囲： 至適PHは、ザルコシンを基質とした場合、PH
6.7〜10.0である。 安定PH範囲はPH6.5〜11.5である。 (d) 作用適温の範囲： 45〜60℃の範囲にある。 (e) 熱安定性： 55℃、10分間の処理で98％の酵素活性を保持
し、60℃、10分間の処理でも75％の残存活性を
示す。 (f) 分子量： セフアデツクスＧ―150を用いたカラムゲル
過法で測定した結果、約49000である。 (g) フラビン酵素蛋白： フラビン・アデニン・ジヌクレオチド
（FAD）が酵素蛋白に共有結合し、結合比は
１：１である。 又、本発明は耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎを生産するバチルス属に属する微生物を培地に
培養し、培養物より該耐熱性ザルコシン・オキシ
ダーゼＮを採取することを特徴とする耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮの製造法である。 以下、本発明を詳細に説明する。 先ず、本発明の精製酵素（耐熱性ザルコシン・
オキシダーゼＮ）の理化学的性について詳細に説
明すると、以下のとおりである。 (1) 作用 本酵素は、ザルコシンを酸化分解して、グリ
シン、ホルムアルデヒドと過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素である。 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 (2) 基質特異性 本酵素の基質特異性を調べるために以下の反
応条件で調べた。 各基質（0.2M）を0.5ml、0.3Mリン酸緩衝液
PH7.7を0.1ml、0.2％、２，４―ジクロロフエノ
ール・サルフオネートを0.1ml、70mg／dlの４
―アミノアンチピリンを0.1ml、70単位／mlの
パーオキシダーゼを0.1mlに、17単位／ml（希
釈を必要とする場合、適当に0.3Mリン酸緩衝
液PH7.7で希釈する）の本酵素液（耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮ）を0.1ml加え、37℃
で10分間反応させ、0.5Nの酢酸を２ml添加し
反応を停止させ、次に反応時間ゼロ時間の反応
液を対照として波長510nmでの吸光度値を測定
した。なお、相対活性（％）は、Ｎ―メチル―
グリシン（ザルコシン）を基質として酵素反応
させて得られる波長510nmの吸光度値を100
（％）とし、他の物質を基質とした場合の比較
値（％）で示した。 基 質 相対活性（％） Ｎ―メチル―グリシン（ザルコシン） 100 Ｎ―メチル―Ｌ―アラニン 31.3 Ｎ―メチル―Ｌ―バリン 7.3 Ｎ―メチル―Ｌ―イソロイシン 5.3 Ｎ―メチル―Ｌ―セリン ０ Ｎ―メチル―Ｌ―グルタミン酸 ０ Ｎ―メチル―Ｌ―リジン ０ ザルコシル―グリシン ０ グリシン 0.09 Ｌ―アラニン ０ Ｌ―バリン ０ Ｌ―イソロイシン ０ Ｌ―スレオニン ０ Ｌ―セリン ０ Ｄ―グルタミン酸 ０ Ｄ―アスパラギン酸 ０ チラミン ０ ヒスタミン ０ Ｎ，Ｎ―ジメチルグリシン ０ ペタイン ０ コリン ０ １，３―ジメチル尿素 ０ １―メチルグアニジン ０ 本酵素のザルコシンに対するKm値〔ミカエ
リス（Michaelis）定数〕は37℃、PH7.7（リン
酸緩衝液）では4.7ミリモルである。 (3) 至適PH 本酵素の至適PHは、ザルコシンを基質とした
場合、第１図に示す如くPH6.7〜10.0である。
なお、第１図中、○―○はPIPESグツト・バツ
フアー（PH6.0―6.7）；●―●は２，２―ジメチ
ルグルタレート・バツフアー（PH6.0―7.0）；
▲―▲は燐酸バツフア―（PH7.0―8.5）；△―△は
トリス―HClバツフアー（PH7.5―9.0）；□―□
はグリシン―NaOHバツフアー（PH9.0―
10.0）；×―×はグリシン―NaCl―NaOHバツ
フアー（PH10.0―12.0）である。 (4) 力価の測定法 第１法：ザルコシンを酸化分解して生成され
てくるホルムアルデヒドを発色定量する方法 0.2モルのザルコシン溶液0.3mlに0.3モルのリ
ン酸緩衝液（PH7.7）0.1mlおよび適当な濃度の
本酵素液0.1mlを加えて37℃、10分間反応させ
た後、1.0N酢酸液0.5mlを添加して反応を停止
させ、次にこれにアセチル・アセトン呈色液
（アセチル・アセトン0.2％、Ｖ／Ｖ；リン酸２
アンモニウム10％、Ｗ／Ｖ、PH6.5）を３ml添
加し、37℃で40分間発色させて、光電比色計に
より波長410nmにおける吸光度値を測定した。 そして、予じめ作成したホルムアルデヒドの
検量曲線より、その生成量を調べておき、37
℃、１分間当たり１マイクロモルのホルムアル
デヒドを生産する酵素量を１単位とした。 第２法：酵素反応で生成する過酸化水素
（H2O2）を定量する方法 0.2モルのザルコシン溶液0.5ml、0.3モルのリ
ン酸緩衝液（PH7.7）0.1ml、0.2％２，４―ジク
ロロフエノールサルフオネート液0.1ml、70
mg／100mlの４―アミノアンチピリン液0.1ml、
70単位／mlのパーオキシダーゼ0.1mlの混液に
適当な濃度の本酵素液0.1mlを加えて、37℃、
10分間反応させ、次にこれに0.2N酢酸液２ml
を添加して反応を停止させ、光電比色計により
波長510nmにおける吸光度を測定した。 そして、予じめ測定したH2O2の検量曲線よ
り、その生成量を調べておき、37℃、１分間当
たり１マイクロモルのH2O2を生成する酵素量
を１単位とした。 (5) 作用適温の範囲 第２図に示す如く本酵素の作用適温の範囲は
45〜60℃にある。 (6) 熱安定性 精製した本酵素を0.1単位含有する酵素液0.1
ml（リン酸緩衝液、0.3モル、PH7.7）を各温度
に10分間放置して、残存する酵素活性量を調べ
た結果、第３図に示す如く60℃においても75％
の残存活性を示した。また、50℃、30分間処理
しても全く活性は低下せず、55℃、10分間処理
で98％の活性を保持した。 (7) PH安定性 0.19単位の本酵素を含有する各緩衝液0.5ml
を５℃で48時間放置後、残存する酵素活性を調
べた。その結果は第４図に示す如くであつて、
PH6.5―11.5まで安定であつた。なお、第４図
中、○―○はPIPESグツト・バツフアー（PH6.0
―6.7）；●―●は燐酸バツフアー（PH6.0―
8.5）；△―△はトリス―HClバツフアー（PH7.0
―9.0）；▲―▲はグリシン―NaOHバツフアー
（PH9.0―10.0）；□―□はグリシン―NaCl―
NaOHバツフアー（PH10.0―12.0）である。 (8) 阻害、活性化及び安定化 本酵素はCu2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、モノヨ
ード酢酸、シアン化カリ、Ｎ―エチルマレイミ
ド（各２ミリモル濃度）により強く阻害され
る。 活性化剤、安定化剤は特にない。 (9) 精製方法 本酵素は後記する精製方法により精製するこ
とができる。 (10) 分子量 本酵素の分子量は、アンドリウスの方法〔P.
Andrews、Biochem.J.、96、595（1965）〕に基
づき、セフアデツクスＧ―150（Sephadex Ｇ―
150）（スウエーデン国、フアーマシア社製）を
用いたカラムゲル過法で測定した結果、0.1
モル食塩含有0.01モル燐酸緩衝液中で49000で
あつた。 (11) 等電点 デイスク焦点電気泳動法により測定した結
果、pI＝5.30であつた。 (12) デイスク電気泳動 デーヴイス〔B.J.Davis、Ann.New York
Acad.Sci.、121、404（1964）〕のPH9.4のゲルを
用いて3mA／ゲルで５℃、64分（分離用ゲル
の泳動時間）泳動を行ない、酵素蛋白質をクマ
ジ―ブリリアントブルーＧ―250（Coomassie
Brilliant Blue Ｇ―250）で染色した。その結
果、ゲルのアクリルアミドゲル濃度7.5％の時
には原点より陽極側に3.9cm（ブロム・フエノ
ール・ブルー、色素の泳動は4.0cm）、15％の時
には陽極側に1.3cmのところに単一なバンドを
認めた。 (13) フラビン酵素 本酵素は黄色の酵素で、酵素蛋白１分子当た
り１分子のフラビン・アデニン・ジヌクレオチ
ド（FAD）を共有結合している酵素である。 以上の本発明酵素を従来のザルコシン・オキシ
ダーゼと比較すると、第１表の如くである。
ゼＮ及びその製造法に関する。 〔従来の技術〕 ザルコシン・オキシダーゼは、 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 の反応を触媒する酵素で、例えば特開昭54−
52789号公報、ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー第89巻、第599頁、1981年ジヤパン〔J.
Biochem.89、599（1981）JAPAN〕に記載され、
知られている。 一方、現在、臨床医学分野において血清、尿中
のクレアチニンあるいはクレアチンを定量して腎
臓機能の疾患、筋肉疾患等の診断をおこなつてい
るが、その定量法としては、アルカリ性ピクリン
酸とクレアチニンとの反応により生ずる橙色を測
定する、いわゆるヤツフエ法が知られている。し
かしその発色反応は血清、尿中にある各種物質に
より影響を受ける非特異的反応である。そのた
め、ヤツフエ法で測定した値は信頼性が乏しく、
またこの方法では除蛋白操作を必要することが多
く、操作が煩雑になる欠点がある。 そこで、最近になつて、クレアチニンあるいは
クレアチンを酵素的に定量する方法が報告され
〔臨床化学シンポジウム第19集、第196頁
（1979）〕、その定量法は下記の通りであつて、こ
れにザルコシン・オキシダーゼが使用されてい
る。なお、下記の式中、括弧内は使用酵素であ
る。 クレアチニン＋H2Oクレアチン （クレアチニン・アミドヒドロラーゼ） クレアチン＋H2O→ザルコシン＋尿素 （クレアチン・アミジノヒドロラーゼ） ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 （ザルコシン・オキシダーゼ） 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記したように、最近クレアチニンあるいはク
レアチンを酵素的に定量する方法が開発された
が、血清、尿中に含まれるクレアチニン量あるい
はクレアチン量は非常に少ないので、その定量に
際しては、高感度の酵素的測定法が期待されてい
た。 最近になつて、過酸化水素（H2O2）をパーオ
キシダーゼ（西洋ワサビ由来のPeroxidase）と
中性〜微酸性で高感度に発色する発色剤が開発さ
れ、その際の発色剤による発色は青色あるいは緑
色で、血清成分由来の黄色、赤色とは全く異なる
ので、血清ブランク値を個別に測定する必要がな
い点で有利である。しかしながら、これ等の発色
剤は、PH7.5以上では発色した色素が不安定で脱
色するので、酵素反応―発色反応を中性ないし微
酸性で行ない、安定な発色反応を行なわせる必要
があり、しかも、パーオキシダーゼの至適PHな微
酸性（PH6.5付近）にあるので、共役酵素も微酸
性で充分酵素作用を有する酵素の開発が要求され
る。 また、定量に用いられる酵素としては、夾雑酵
素を含まない純度の高い酵素が要求され、それを
得るために酵素の大量精製工程において夾雑酵素
（例えばカタラーゼ、ウリカーゼ等）を加熱処理
で完全に失活させた、比活性の高い高純度の酵素
の出現が期待されている。 さらに、血清、尿中に含まれるクレアチニンあ
るいはクレアチンの量が小さいので、クレアチニ
ンあるいはクレアチンが酵素的に分解されて生成
されるザルコシンの量も当然微量となり、このよ
うな微量のザルコシンにも作用するKm値（ミカ
エリス定数）の小さい酵素の開発が業界では強く
要望されている。 このような問題点を解決したのが本発明であ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 上記した事情に鑑み、本発明者は、クレアチニ
ンあるいはクレアチンの高感度な酵素的測定法に
好適な、微酸性でも充分に酵素作用し、熱に安定
で、ザルコシンに対するKm値の低い酵素的性質
を同時に所有する新規なザルコシン・オキシダー
ゼを提供すべく鋭意検討を重ねた結果、新たに土
壌より分離したパチルス属に属する菌株を培養し
たものより、微酸性でも充分酵素活性を示し、耐
熱性で、ザルコシンに対するKm値の低い新規な
ザルコシン・オキシダーゼが得られることを知
り、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、以下の理化学的性質を有
する耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮである。 (a) 作用： ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホル
ムアルデヒド及び過酸化水素を生成する下記の
酵素反応を触媒する酵素である。 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 (b) 基質特異性： ザルコシンに対するKm値（ミカエリス定
数）は37℃、PH7.7（リン酸緩衝液）で4.7ミリ
モルである。 (c) 至適PH及び安定PH範囲： 至適PHは、ザルコシンを基質とした場合、PH
6.7〜10.0である。 安定PH範囲はPH6.5〜11.5である。 (d) 作用適温の範囲： 45〜60℃の範囲にある。 (e) 熱安定性： 55℃、10分間の処理で98％の酵素活性を保持
し、60℃、10分間の処理でも75％の残存活性を
示す。 (f) 分子量： セフアデツクスＧ―150を用いたカラムゲル
過法で測定した結果、約49000である。 (g) フラビン酵素蛋白： フラビン・アデニン・ジヌクレオチド
（FAD）が酵素蛋白に共有結合し、結合比は
１：１である。 又、本発明は耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎを生産するバチルス属に属する微生物を培地に
培養し、培養物より該耐熱性ザルコシン・オキシ
ダーゼＮを採取することを特徴とする耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮの製造法である。 以下、本発明を詳細に説明する。 先ず、本発明の精製酵素（耐熱性ザルコシン・
オキシダーゼＮ）の理化学的性について詳細に説
明すると、以下のとおりである。 (1) 作用 本酵素は、ザルコシンを酸化分解して、グリ
シン、ホルムアルデヒドと過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素である。 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 (2) 基質特異性 本酵素の基質特異性を調べるために以下の反
応条件で調べた。 各基質（0.2M）を0.5ml、0.3Mリン酸緩衝液
PH7.7を0.1ml、0.2％、２，４―ジクロロフエノ
ール・サルフオネートを0.1ml、70mg／dlの４
―アミノアンチピリンを0.1ml、70単位／mlの
パーオキシダーゼを0.1mlに、17単位／ml（希
釈を必要とする場合、適当に0.3Mリン酸緩衝
液PH7.7で希釈する）の本酵素液（耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮ）を0.1ml加え、37℃
で10分間反応させ、0.5Nの酢酸を２ml添加し
反応を停止させ、次に反応時間ゼロ時間の反応
液を対照として波長510nmでの吸光度値を測定
した。なお、相対活性（％）は、Ｎ―メチル―
グリシン（ザルコシン）を基質として酵素反応
させて得られる波長510nmの吸光度値を100
（％）とし、他の物質を基質とした場合の比較
値（％）で示した。 基 質 相対活性（％） Ｎ―メチル―グリシン（ザルコシン） 100 Ｎ―メチル―Ｌ―アラニン 31.3 Ｎ―メチル―Ｌ―バリン 7.3 Ｎ―メチル―Ｌ―イソロイシン 5.3 Ｎ―メチル―Ｌ―セリン ０ Ｎ―メチル―Ｌ―グルタミン酸 ０ Ｎ―メチル―Ｌ―リジン ０ ザルコシル―グリシン ０ グリシン 0.09 Ｌ―アラニン ０ Ｌ―バリン ０ Ｌ―イソロイシン ０ Ｌ―スレオニン ０ Ｌ―セリン ０ Ｄ―グルタミン酸 ０ Ｄ―アスパラギン酸 ０ チラミン ０ ヒスタミン ０ Ｎ，Ｎ―ジメチルグリシン ０ ペタイン ０ コリン ０ １，３―ジメチル尿素 ０ １―メチルグアニジン ０ 本酵素のザルコシンに対するKm値〔ミカエ
リス（Michaelis）定数〕は37℃、PH7.7（リン
酸緩衝液）では4.7ミリモルである。 (3) 至適PH 本酵素の至適PHは、ザルコシンを基質とした
場合、第１図に示す如くPH6.7〜10.0である。
なお、第１図中、○―○はPIPESグツト・バツ
フアー（PH6.0―6.7）；●―●は２，２―ジメチ
ルグルタレート・バツフアー（PH6.0―7.0）；
▲―▲は燐酸バツフア―（PH7.0―8.5）；△―△は
トリス―HClバツフアー（PH7.5―9.0）；□―□
はグリシン―NaOHバツフアー（PH9.0―
10.0）；×―×はグリシン―NaCl―NaOHバツ
フアー（PH10.0―12.0）である。 (4) 力価の測定法 第１法：ザルコシンを酸化分解して生成され
てくるホルムアルデヒドを発色定量する方法 0.2モルのザルコシン溶液0.3mlに0.3モルのリ
ン酸緩衝液（PH7.7）0.1mlおよび適当な濃度の
本酵素液0.1mlを加えて37℃、10分間反応させ
た後、1.0N酢酸液0.5mlを添加して反応を停止
させ、次にこれにアセチル・アセトン呈色液
（アセチル・アセトン0.2％、Ｖ／Ｖ；リン酸２
アンモニウム10％、Ｗ／Ｖ、PH6.5）を３ml添
加し、37℃で40分間発色させて、光電比色計に
より波長410nmにおける吸光度値を測定した。 そして、予じめ作成したホルムアルデヒドの
検量曲線より、その生成量を調べておき、37
℃、１分間当たり１マイクロモルのホルムアル
デヒドを生産する酵素量を１単位とした。 第２法：酵素反応で生成する過酸化水素
（H2O2）を定量する方法 0.2モルのザルコシン溶液0.5ml、0.3モルのリ
ン酸緩衝液（PH7.7）0.1ml、0.2％２，４―ジク
ロロフエノールサルフオネート液0.1ml、70
mg／100mlの４―アミノアンチピリン液0.1ml、
70単位／mlのパーオキシダーゼ0.1mlの混液に
適当な濃度の本酵素液0.1mlを加えて、37℃、
10分間反応させ、次にこれに0.2N酢酸液２ml
を添加して反応を停止させ、光電比色計により
波長510nmにおける吸光度を測定した。 そして、予じめ測定したH2O2の検量曲線よ
り、その生成量を調べておき、37℃、１分間当
たり１マイクロモルのH2O2を生成する酵素量
を１単位とした。 (5) 作用適温の範囲 第２図に示す如く本酵素の作用適温の範囲は
45〜60℃にある。 (6) 熱安定性 精製した本酵素を0.1単位含有する酵素液0.1
ml（リン酸緩衝液、0.3モル、PH7.7）を各温度
に10分間放置して、残存する酵素活性量を調べ
た結果、第３図に示す如く60℃においても75％
の残存活性を示した。また、50℃、30分間処理
しても全く活性は低下せず、55℃、10分間処理
で98％の活性を保持した。 (7) PH安定性 0.19単位の本酵素を含有する各緩衝液0.5ml
を５℃で48時間放置後、残存する酵素活性を調
べた。その結果は第４図に示す如くであつて、
PH6.5―11.5まで安定であつた。なお、第４図
中、○―○はPIPESグツト・バツフアー（PH6.0
―6.7）；●―●は燐酸バツフアー（PH6.0―
8.5）；△―△はトリス―HClバツフアー（PH7.0
―9.0）；▲―▲はグリシン―NaOHバツフアー
（PH9.0―10.0）；□―□はグリシン―NaCl―
NaOHバツフアー（PH10.0―12.0）である。 (8) 阻害、活性化及び安定化 本酵素はCu2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、モノヨ
ード酢酸、シアン化カリ、Ｎ―エチルマレイミ
ド（各２ミリモル濃度）により強く阻害され
る。 活性化剤、安定化剤は特にない。 (9) 精製方法 本酵素は後記する精製方法により精製するこ
とができる。 (10) 分子量 本酵素の分子量は、アンドリウスの方法〔P.
Andrews、Biochem.J.、96、595（1965）〕に基
づき、セフアデツクスＧ―150（Sephadex Ｇ―
150）（スウエーデン国、フアーマシア社製）を
用いたカラムゲル過法で測定した結果、0.1
モル食塩含有0.01モル燐酸緩衝液中で49000で
あつた。 (11) 等電点 デイスク焦点電気泳動法により測定した結
果、pI＝5.30であつた。 (12) デイスク電気泳動 デーヴイス〔B.J.Davis、Ann.New York
Acad.Sci.、121、404（1964）〕のPH9.4のゲルを
用いて3mA／ゲルで５℃、64分（分離用ゲル
の泳動時間）泳動を行ない、酵素蛋白質をクマ
ジ―ブリリアントブルーＧ―250（Coomassie
Brilliant Blue Ｇ―250）で染色した。その結
果、ゲルのアクリルアミドゲル濃度7.5％の時
には原点より陽極側に3.9cm（ブロム・フエノ
ール・ブルー、色素の泳動は4.0cm）、15％の時
には陽極側に1.3cmのところに単一なバンドを
認めた。 (13) フラビン酵素 本酵素は黄色の酵素で、酵素蛋白１分子当た
り１分子のフラビン・アデニン・ジヌクレオチ
ド（FAD）を共有結合している酵素である。 以上の本発明酵素を従来のザルコシン・オキシ
ダーゼと比較すると、第１表の如くである。
本発明は、例えば腎臓機能の疾患、筋肉疾患等
の診断の際に用いられる定量用酵素として極めて
有用な耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを提供
するとともに、この酵素を効率良く得ることので
きる方法を提供するものであるので、本発明は産
業上極めて有意義である。 〔実施例〕 以下に本発明の実施例を示す。 バチルス・エスピー（Bacillus sp.）NS―129
（FERM BP―671）を500ml坂口フラスコ中でブ
イヨン培地100mlに植菌し、30℃で16時間培養し
た。この種培養物を30のジヤーフアーメンター
中のザルコシン0.8％、ポリペプトン20％、酵母
エキス0.8％、燐酸水素１カリウム0.05％、燐酸
水素２カリウム0.05％、硫酸マグネシウム0.01
％、硫酸鉄0.005％の組成を有する酵素生産培地
（PH6.5）20に接種し、通気量20／分、撹拌速
度350rpmの条件下で30℃で18時間培養し、培養
物を遠心分離機にて遠心分離して集菌した。 その培養菌体の一部（110ｇ）に0.01モル燐酸
緩衝液（PH8.0）1.5を加え、菌を良く分散さ
せ、次にこれに卵白リゾチーム100mgを加え、37
℃で１時間溶菌させ、引き続き50℃で２時間加熱
して夾雑蛋白を変性させ、次にこれにプロタミン
硫酸の飽和溶液（PH7.5）を沈澱が生成しなくな
るまで添加し、ついでセルロースパウダーを５ｇ
加え良く撹拌し、紙過を行なつた。この液
を、0.05モルNaCl含有0.01モル燐酸緩衝液PH8.0
で緩衝化したQAE―セフアデツクスＡ―50カラ
ム（フアーマシア社製、３×40cm）に通し、酵素
を吸着させ、0.1モルNaCl含有0.01モル燐酸緩衝
液PH8.0で良く洗浄し、続いてNaCl0.1〜0.6モル
の濃度勾配で溶出して活性区分を集めた。次に、
この酵素溶出液に、硫安を20ｇ／100mlの割合で
溶解させた後、予じめ20％硫安含有0.01モル燐酸
緩衝液（PH8.0）で緩衝化したTSK―GELブチル
―トーヨーパール650Cカラム（３×10cm）に吸
着させ、同硫安緩衝液で洗浄後、10％硫安含有
0.01モル燐酸緩衝液で溶出させた。活性区分をア
ミコン社製限外過装置（分画膜10000）にて濃
縮後、セフアデツクスＧ―150を充填したカラム
（1.2×100cm、0.1モルNaCl含有、0.01モル燐酸緩
衝液PH8.0で緩衝化しておく）にかけゲル過し
た。得られた活性区分を限外過装置で約３mlま
で濃縮後、凍結乾燥した。その結果、黄色の精製
酵素粉末90.9mgが得られ、比活性は30.1単位／mg
で、回収率は17.1％であつた。
の診断の際に用いられる定量用酵素として極めて
有用な耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを提供
するとともに、この酵素を効率良く得ることので
きる方法を提供するものであるので、本発明は産
業上極めて有意義である。 〔実施例〕 以下に本発明の実施例を示す。 バチルス・エスピー（Bacillus sp.）NS―129
（FERM BP―671）を500ml坂口フラスコ中でブ
イヨン培地100mlに植菌し、30℃で16時間培養し
た。この種培養物を30のジヤーフアーメンター
中のザルコシン0.8％、ポリペプトン20％、酵母
エキス0.8％、燐酸水素１カリウム0.05％、燐酸
水素２カリウム0.05％、硫酸マグネシウム0.01
％、硫酸鉄0.005％の組成を有する酵素生産培地
（PH6.5）20に接種し、通気量20／分、撹拌速
度350rpmの条件下で30℃で18時間培養し、培養
物を遠心分離機にて遠心分離して集菌した。 その培養菌体の一部（110ｇ）に0.01モル燐酸
緩衝液（PH8.0）1.5を加え、菌を良く分散さ
せ、次にこれに卵白リゾチーム100mgを加え、37
℃で１時間溶菌させ、引き続き50℃で２時間加熱
して夾雑蛋白を変性させ、次にこれにプロタミン
硫酸の飽和溶液（PH7.5）を沈澱が生成しなくな
るまで添加し、ついでセルロースパウダーを５ｇ
加え良く撹拌し、紙過を行なつた。この液
を、0.05モルNaCl含有0.01モル燐酸緩衝液PH8.0
で緩衝化したQAE―セフアデツクスＡ―50カラ
ム（フアーマシア社製、３×40cm）に通し、酵素
を吸着させ、0.1モルNaCl含有0.01モル燐酸緩衝
液PH8.0で良く洗浄し、続いてNaCl0.1〜0.6モル
の濃度勾配で溶出して活性区分を集めた。次に、
この酵素溶出液に、硫安を20ｇ／100mlの割合で
溶解させた後、予じめ20％硫安含有0.01モル燐酸
緩衝液（PH8.0）で緩衝化したTSK―GELブチル
―トーヨーパール650Cカラム（３×10cm）に吸
着させ、同硫安緩衝液で洗浄後、10％硫安含有
0.01モル燐酸緩衝液で溶出させた。活性区分をア
ミコン社製限外過装置（分画膜10000）にて濃
縮後、セフアデツクスＧ―150を充填したカラム
（1.2×100cm、0.1モルNaCl含有、0.01モル燐酸緩
衝液PH8.0で緩衝化しておく）にかけゲル過し
た。得られた活性区分を限外過装置で約３mlま
で濃縮後、凍結乾燥した。その結果、黄色の精製
酵素粉末90.9mgが得られ、比活性は30.1単位／mg
で、回収率は17.1％であつた。
第１図は本酵素の至適PHを示す図であり、第２
図は本酵素の作用適温の範囲を示す図であり、第
３図は本酵素の熱安定性を示す図であり、第４図
は本酵素のPH安定性を示す図である。
図は本酵素の作用適温の範囲を示す図であり、第
３図は本酵素の熱安定性を示す図であり、第４図
は本酵素のPH安定性を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的性質を有する耐熱性ザルコシ
ン・オキシダーゼＮ。 (a) 作用： ザルコシンを酸化分解して、グリシン・ホル
ムアルデヒド、及び過酸化水素を生成する下記
の酵素反応を触媒する酵素である。 ザルコシン＋H2O＋O2→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 (b) 基質特異性： ザルコシンに対するKm値（ミカエリス定
数）は37℃、PH7.7（リン酸緩衝液）で4.7ミリ
モルである。 (c) 至適PH及び安定PH範囲： 至適PHは、ザルコシンを基質とした場合、PH
6.7〜10.0である。 安定PH範囲はPH6.5〜11.5である。 (d) 作用適温の範囲： 45〜60℃の範囲にある。 (e) 熱安定性： 55℃、10分間の処理で98％の酵素活性を保持
し、60℃、10分間の処理でも75％の残存活性を
示す。 (f) 分子量： セフアデツクスＧ―150を用いたカラムゲル
過法で測定した結果、約49000である。 (g) フラビン酵素蛋白： フラビン・アデニン・ジヌクレオチド
（FAD）が酵素蛋白に共有結合し、結合比は
１：１である。 ２ 耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを生産す
るバチルス属に属する微生物を培地に培養し、培
養物より該耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを
採取することを特徴とする耐熱性ザルコシン・オ
キシダーゼＮの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60001989A JPS61162174A (ja) | 1985-01-11 | 1985-01-11 | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
| US06/809,864 US4740465A (en) | 1985-01-11 | 1985-12-17 | Heat-resistant sarcosine oxidase N and process for producing the same |
| DE19863600563 DE3600563A1 (de) | 1985-01-11 | 1986-01-10 | Waermebestaendige sarcosinoxidase n und verfahren zu deren herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60001989A JPS61162174A (ja) | 1985-01-11 | 1985-01-11 | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61162174A JPS61162174A (ja) | 1986-07-22 |
| JPH0134035B2 true JPH0134035B2 (ja) | 1989-07-17 |
Family
ID=11516887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60001989A Granted JPS61162174A (ja) | 1985-01-11 | 1985-01-11 | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4740465A (ja) |
| JP (1) | JPS61162174A (ja) |
| DE (1) | DE3600563A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| JPH0632608B2 (ja) * | 1986-08-29 | 1994-05-02 | キッコーマン株式会社 | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎの製造法 |
| JPH0665303B2 (ja) * | 1986-08-29 | 1994-08-24 | キッコーマン株式会社 | 新規な組み換え体ｄｎａ |
| JP2593481B2 (ja) * | 1987-08-10 | 1997-03-26 | 旭化成工業株式会社 | サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
| US4826762A (en) * | 1987-10-23 | 1989-05-02 | Massachusetts Industry Of Technology | Enzymatic temperature change indicator |
| AU4677793A (en) * | 1992-07-14 | 1994-01-31 | Genzyme Corporation | A highly specific sarcosine oxidase |
| DE19514004A1 (de) * | 1995-04-13 | 1996-10-17 | Heike Dr Juergens | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von reversibel wirkenden Inhibitoren der Oxidoreduktasen |
| US7229812B2 (en) | 2002-11-13 | 2007-06-12 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same |
| CN109957553A (zh) * | 2019-04-04 | 2019-07-02 | 大连大学 | 一种产肌氨酸氧化酶的芽孢杆菌的发酵产酶方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6029473B2 (ja) * | 1977-10-04 | 1985-07-10 | 東洋醸造株式会社 | ザルコシン・オキシダ−ゼの製法 |
| JPS5692790A (en) * | 1979-12-26 | 1981-07-27 | Hideaki Yamada | Preparation of sarcosine oxidase |
| JPS61162174A (ja) * | 1985-01-11 | 1986-07-22 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 |
-
1985
- 1985-01-11 JP JP60001989A patent/JPS61162174A/ja active Granted
- 1985-12-17 US US06/809,864 patent/US4740465A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-10 DE DE19863600563 patent/DE3600563A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61162174A (ja) | 1986-07-22 |
| DE3600563C2 (ja) | 1987-07-23 |
| US4740465A (en) | 1988-04-26 |
| DE3600563A1 (de) | 1986-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Suzuki | Purification and some properties of sarcosine oxidase from Corynebacterium sp. U-96 | |
| Lord | Glycolate oxidoreductase in Escherichia coli | |
| JP2851021B2 (ja) | ７−アミノセファロスポラン酸及び誘導体の酵素調製法 | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| JPH031949B2 (ja) | ||
| JPH0134035B2 (ja) | ||
| Baich | The biosynthesis of proline in Escherichia coli phosphate-dependent glutamate γ-semialdehyde dehydrogenase (NADP), the second enzyme in the pathway | |
| JPS604716B2 (ja) | 新規なコリンオキシダーゼおよびその製法 | |
| US4605615A (en) | L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor | |
| EP0148950B1 (en) | Process for preparing bilirubin oxidase | |
| WO1997031103A1 (en) | Method for determining 1,5-anhydroglucitol | |
| NO762825L (ja) | ||
| JPS58152481A (ja) | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 | |
| JP2647689B2 (ja) | 新規アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ | |
| JP3904098B2 (ja) | 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 | |
| JPS6046953B2 (ja) | コリンオキシダ−ゼの改良製造法 | |
| JPH0272873A (ja) | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 | |
| JP4419044B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP3040228B2 (ja) | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、その製造方法及びｌ−フコースの定量法 | |
| JPS6053599B2 (ja) | コリンオキシダ−ゼを含有する分析用組成物 | |
| JPH0127714B2 (ja) | ||
| JP2009055919A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JP2009072196A (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ | |
| JPH0212557B2 (ja) | ||
| JPS6053600B2 (ja) | コリンオキシダ−ゼを用いる分析法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |