JPH01124768A - 検定装置および検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は検定物の歿良法および検定実施のために使用さ
れるキットに関する。さらに詳しくは、本発明は同相検
定法に関する。

（従来の技術） 医療機関で使用され、または家庭で未熟練者により使用
される検定法が必要とされている。このような使用に適
する検定法は、ｌ）迅速であること、２）実施が容易で
正確な手段からの変動を許容すること、３）高価な装置
を使わずに読み取り可能なことである。多くの会社は、
医療機関で連鎖球菌Ａ群をスクリーニングするための試
験キットを提唱している。家庭用の妊娠検知キットや排
卵検知キットを紹介した会社もある。

これらのキットのうち、いくつかは酵素免疫検定法であ
り、これは着色した成分の形成が検定物の存在または不
存在を示すものである。熟練した実験技術者の手による
場合には、これらの試験はうま（い＜、シかしながら、
医療機関の従業員（訓練された人もされていない人でも
、仕事をしばしば中断されることがある）および未訓練
の家庭使用者はこれらのキットを使用することに困難を
感じる。酵素免疫検定法は正確に計測された時間複数回
のインキュベートが必要であり、そして非常に少量の試
薬をピペットでとる精密さが要求される。これらの要求
はしばしば満足されない。

現在人手か°画π巨÷な他のキットは、凝集免疫検定法
、−１Ｑには支持体としてラテックスまたは赤血球を用
いたものであり。ここでもまた熟練の実験技術者が使用
する場合には検定が正しく行われるが、一方医療機関の
従業員および家庭での使用者は困難を感じる。凝集検定
法は低い検定物濃度で読み取ることが困難であり、これ
らはしばしば非特異的凝集を許すことがある。操作がよ
り少なくて、高価な装置を使うことなく読み取ることの
できる検定法を見出す努力が行われてきた。キャンベル
（Ｃａｍｐ　ｂｅ　ｌ　ｌ）らの南アフリカ特許第８４
／９３９７号（１９８５年７月３１日に出願され、許可
された米国出願第５７９，６６７号に相当する）には目
視読み取りのできる固相検定法について記載している。

この特許および本明細書で使用される用語“目視”また
は“可視”とは、高価な装置を用いることなく、目で標
識物を検知できる事を意味する。キャンベルらが記載し
たシステ１２は、試験区域上に支持されたバインダーを
有する固相支持体を含む、これはまた可視標識物を有す
るトレーサーを備える。バインダーは、トレーサーが（
バインダーを介してまたはバインダーと結合した検定物
を介して）検定条件下で支持体と結合したとき、可視化
されるような濃度で支持体に存在する。固相支持体に好
ましい材料はニトロセルロースである。この特許は、特
に結合した時トレーサーが支持体の表面に残るような孔
径を有する材料を選択することを推奨している。

孔径０．２〜０．４５μのニトロセルロース支持体を用
いると良好な結果を得ることが記載されている。この特
許はさらに進んで、支持体中のバインダーの濃度を増加
しうるように大きな表面積を有する支持体を用いること
を推奨している。好ましいトレーサーは粒状標識物と結
合するリガンドである。好ましい得標識物は、マーカー
として染料または他の着色物質を存するリポソーム小袋
状物である。実施例には、いくつかの検定法を記載して
いる。一つは、それぞれ１時間のインキュベートを２回
と複数回のピペット操作およびリンス操作からなる妊娠
試験である。別のものは１時間のインキュベートが１回
の破傷風試験である。

第三はジゴキシン検定法で、これは１回目が１０分で２
回目が１５分の２回のインキュベートで行われる。ジゴ
キシン検定法は、複数回のピペット操作とリンス操作を
行う。

筒素化した手段と目視読み取りを備えた検定法を提供す
る別の試みがリオフタ（Ｌｉｏｔｔａ）の米国特許第４
，４４６．２３２号に記載されている。この特許には潅
状サンプルの使用による抗原測定の為の装置が記載され
ている。装置は三層を有し、これらは２つのゾーンから
なる。第一のゾーンは固定化抗原を含む層と吸着した酵
素結合抗体を含む層を有する。第二のゾーンは酵素と反
応して着色化するのに必要な材料を含む、これらの三層
は、酵素結合抗体層と色彩形成試薬層の間に固定化抗原
層を挟むようにして積層されている。

酵素結合抗体層へ抗原含有液状サンプルを施すと、存在
するいかなる抗原も抗体と反応する。液体はまた酵素結
合抗体を固定化抗原層へ洗い流す、サンプルからの抗原
で飽和された抗体は０ずれも固定化抗原と反応すること
なく、それゆえ第二のゾーンへ自由に流れ、ここで酵素
は第二ゾーンの材料と反応して色彩を生じる。リオッタ
が提案した装置は技巧的操作の数を減らすが、しかしそ
れにも係わらず掻作上の変化に対して敏感に左右される
。サンプルからの抗原が抗体結合部位を満たすために充
分な時間が経なければならず、そして満たされない抗体
は固定化抗原と反応するのに充分長い間固定化抗原層に
のこらなければならない。

サンプル量における変化は、酵素結合抗体が第二ゾーン
へ流される速度に変化を起こしうる。さらに、試験サン
プルと停止溶液を加える間の時間が変化すると、問題と
なる値の対照溶液との如何なる定量的比較をも行う発色
の濃さが変化する。

さらに別のタイプの装置はバルキルス（Ｖａｔｋｉｒｓ
）の米国特許第４．６３３．９０１号に示されている。

この装置において抗原は第一の多孔性ａｐ＋％＜−枚ま
たは二枚以上）に固定化される。

液状試薬は第一の膜の一表面に施される。装置はまた、
試薬を施す表面と反対の第一の膜の表面と毛管で連絡す
る第二の吸収膜を含む、第二の吸収膜は通常その上面お
よび下面に対し、横断するように並んだ毛管通路を有す
る０毛管の孔径は、第一の膜を通して液体の流れを導入
するように選択される。この特許では、第二の吸着膜用
の材料の選択が重要でないことを示している。タバコの
フィルターのように配列した酢酸セルロース繊維の使用
が言及されている。この特許はまた、非特異的に抗体と
結合せず、第一と第二の膜の間に挿入される第三の多孔
質膜について記載している。

さらに、装置を介した流れを記載している別の特許は、
トム（Ｔ　ｏ　ｍ）らの米国特許第４，３６６．２４１
号である。この特許に記載されている装置は、免疫吸着
ゾーンとこの免疫吸着ゾーンと関係する液体受器中の液
体吸収ゾーンを有する。

免疫吸着ゾーンは、これと非−拡散的に結合する免疫的
ベアの一員を有する。この特許はＩ５憫５〜２６行で、
免疫吸着ゾーンとして使用されるのに通ずる材料を記載
している；　［使用できる材ｒ１には、例えばセルロー
ス材料例えば、紙および酢酸セルロース；シリカ、無機
材料例えば不活性化アルミナ、珪そう土、ＭｇＳＯ４ま
たは多孔性ポリマーのマトリックス中に都合よくそして
殆ど均一に分散した他の微細無機材料であり、ポリマー
は例えば、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリ
マーおよび塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー；クロス
、天然産生の例えば綿および合成の例えばナイロンクロ
ス；多孔性ゲル例えばシリカゲル、寒天、デキストラン
およびゼラチン；重合性フィルム例えばポリアクリルア
ミド等である。

検定装置材料の重要な特徴は、これらが検定で使用され
る溶質の移動を実質的に妨げることなく、液体、特に水
溶液を吸収できることである。事実、材料は吸水性であ
る；これらは多孔性であり、溶液の流れを許す；免疫吸
着居用の材料は、好ましくは非クロマトグラフ性である
：これらは適度な強さを有しまたは強さは支持体により
与えられることができる。そしてこれらは信号発生部に
よる信号の発生を妨害しない、」 トムらの特許には多くの異なる検定古式および記録並び
に異なる構成について記載している。その１６６１１〜
１６行に次のことが示されている；「一つ以上の層をさ
らに含んでも良く、特にｍｉｐを支持した共役Ｎ（ここ
で、ｍｉｐとは免疫学的ベアの構成員Ｈｍｅｍｂｅｒ　
　ｏｒ　　ａｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　ｐａｉ
ｒと定義している）と、それより低い層の間に含む、こ
れらの層はバリヤーとして働き、低層から高層への信号
発生システムの成分の移行を阻止する；充填材として：
流れ調節のため；等」、三層の免疫吸着ゾーン構成は、
１６欄３０〜３８行に記載されている。この構成におい
てｍｌｐ含有層は、液体の流れに対し比較的低い抵抗を
有する。これは実質的に液体流れに対しより抵抗性の第
二の層で裏打ちされている。第二層の後に流れに抵抗し
ない多孔性の装置が続く。

トムらの特許はまた、クロモゲン（特殊な範囲で光を吸
収し、そして照射されると特定の波長の光を出す化合物
）を含む様々な信号発生システムを記載している。この
特許では、吸収染料を使用する場合、濃い色を有する吸
収染料を用い、そして免疫結合信号の適度な強さを得る
のに充分な厚みを有する実質的に透明な免疫吸着ゾーン
を用いて、ｎｉｐへ多機能を結合する事を勧めている。

しかしながら、大抵は、信号１ｍとして光吸収により測
定される染料を使用することは、所望の感度を与えない
であろうと認められている。

（発明が解決しようとする課題） 上記の各装置は、未訓練者の使用に適する装置を開発す
ることにおいて、前進をもたらしたとは言え、これらの
装置には限界がある。！！：、者が医療機関で待ってい
る間にサンプルのスクリーニングにあまりに長時間の手
間を要するものもある。低い検定物濃度では、装置の助
けなしに読み取ることができないものもある。そして成
るものは習熟していない使用者にとって複雑すぎる検定
掻作が必要なものもある。

（課題を解決するだめの手段） ５−＜べきことに、装；ξを通る流れにおける試験区域
の材質を充分に注意深く選択し、そして装置の各層を通
過する試薬の流速を注意深く調節することにより、実質
的に向上した特性を有する試験装置を作成することがで
きる０本発明によれば、全検定時間を、時間の単位から
分の単位へ短縮する装置が形成される。また、各試薬の
添加にかんする厳密性が相当欠如してもよい装置を作る
ことができる。そして、本発明装置は、トムらにより開
示されたクロモゲンの使用に伴う問題点を克服しながら
、吸着クロモゲンを含む粒状標識物を有を用いた、検定
物の存在を検知するための検定法に使用される。この装
置は、上面および下面を存する多孔性支持体とその上面
上の試験区域とを有する。バインダーは試験区域にしっ
かりと付着もしくは結合している。当業者は、バインダ
ーは検定条件下で支持体上に止まるのに充分確実に付着
することが必要であることは、容易に理解するであろう
、さらに、本装置は、多孔性支持体と液体が連絡状態に
ある吸収層を含む０本発明において、多孔性支持体は未
結合検定物およびトレーサーが試験区域から吸収層へ流
れるのに充分大きな孔径を有する。支持体はトレーサー
と特異的に結合しない材料からなるか、または支持体材
料はトレーサーを特異的に結合しないように処理される
。試験区域は検定条件下で試験区域へ特異的に結合した
ときトレーサーが目に見えるような濃度でバインダーを
支持するのに充分な大きさの表面積を有する。多孔性支
持体および吸収層は共働して多孔性支持体を通過する試
薬の流れをＵｊＪｗｉシ、そして吸収層で液体および試
験区域で特異的に結合しないいかなる検定物およびトレ
ーサーをも受け入れる。

本発明の好ましい態様において、装置はさらに多孔性支
持体の下面と吸収層の間に：＃１立３する流れ調節層を
含む、この態様において、多孔性支持体は試験区域で特
異的に結合しない検定物およびトレーサーを通過させる
のに充分な孔径を有する。

流れ調ｌ！ｆＩ層は多孔性支持体のものより孔径が小さ
く、そして試験区域で特異的に結合しない検定物および
トレーサーのｆｆ１ｆｌｆＩ速度にて通過を許すのに充
分な大きさの孔径である。流れ調節層の孔径および厚さ
を注意深（選択することにより、試薬の流れ速度を調節
して所望の感度および便利で迅速な検定法を得ることが
できる。

別の態様において、本発明の装置は、多孔性支持体と吸
収層の間に位置する多孔性スペーサー層を有する。多孔
性スペーサー層は液体および試験区域で特異的に結合し
ない如何なる検定物およびトレーサーをも試験区域から
吸収層へ流れさせる。

好ましい態様において、装置は多孔性スペーサー層と流
れ調節層の両方を含む、流れｔＡ節層は多孔性支持体の
下面に接して位置し、そして多孔性スペーサー層は流れ
調節層と吸収層の間に位置する。

バインダーは少な（とも１０ｐｇ／ｃｍ２の濃度で試験
区域にしっかりと付着するのが好ましい、好ましい多孔
性支持体は、２μ〜１２μの孔径を有するニトロセルロ
ース膜である。多孔性支持体が３〜５μの孔径を有する
ニトロセルロースであり、流れ調ｗＦｆＪが非繊維状の
一方向流れ調節膜であることが最も好ましい。

本発明の試験キットは、上述したフロースルー装置と検
定条件下で試験区域へ結合したとき目に見える粒状の標
識物を有するトレーサーからなる。

粒状標識物は直接観察されうる（例えば、着色物質を含
む、もしくは着色物質で被覆された半透明小袋状物もし
くはマイクロカプセル）ものでもよい、これに代えて、
観察できるようにするための何らかの現象を必要とする
粒状標識物（例えば、小袋状物やマイクロカプセルの壁
が溶解または破壊すると見えるようになる着色物質を含
む不透明小袋状物若しくはマイクロカプセル）を選択す
ることができる。トレーサーはこれに結合した粒状標識
物を有する特定の結合種であり、粒状標識物は着色物質
を含む半透明もしくは透明の小袋状物であることが好ま
しい、最も好ましくは、粒状標識物はリポソームである
。最も好ましい着色物質はスルホローダミンＢである。

本発明の検定法において、液状サンプル中の検定物およ
びトレーサーを表面に非拡散的に結合したバインダーを
有する装置と接触する。トレーサーは検定条件下でバイ
ンダーと結合した時可視化される粒状標識物を有する。

支持体と結合したトレーサーの存在（または不存在）は
検定物の存在の指標である。改善された方法において、
上述の装置を通る流れが提供される。サンプルおよびト
レーサーを装置の試験区域と接触させる。試験区域で特
異的に結合しないいかなる検定物もトレーサーも試験区
域から吸収層へ流れる。

驚くべきことに、試験装置の構造を上記のように調節す
ると、試験区域で特異的に結合しないトレーサーおよび
検定物が、層を通って吸収層へ流れる。孔径および表面
積の調節を上記のようにすると、充分なバインダーが試
験区域に拡散不能的に結合して、トレーサーが検定条件
下で試験区域に結合したとき目視読み取りが達成できる
ようになる。

本発明の試験装置および手段は、はとんどいずれの特異
的結合検定形式および記録における使用にも適合する。

装置および手段は定性的および定量的方法の使用に適す
る。

第１図は本発明により製造された試験装置の容器へ組み
込まれた状態の平面図であり；第２図は第１図で示した
装置の正面図であり；第３図は第１図の３−３ｖＡに沿
った断面図である。

本発明での使用のための多孔性支持体は、当業者によく
知られているものから任意に選択されるが、但し、装置
へ施す液体を多孔性支持体を通して吸収層へ通過させる
のに充分に多孔性であるものを用いる。さらに、多孔性
支持体はサンプルおよび試薬中の成分および化学薬品を
非特異的に結合しない材料で構成される必要がある。

多孔性支持体にはバインダーがしっかりと付着する試験
区域が含まれる。試験区域は多孔性支持体の全表面から
なってもよ（または多孔性支持体の一部だけでもよい、
好ましくは、試験区域は多孔性支持体の一部だけからな
り、そしてバインダーを含まないバックグラウンド区域
により囲まれている。多孔性支持体および試験区域は同
じ材料で構成されてもよく、または異なった材料でもよ
い、好ましくは、多孔性支持体はニトロセルロース膜で
あり、試験区域はこの膜の一部である。

用語“ニトロセルロース”は、セルロースの硝酸エステ
ルのことであり、これはニトロセルロース単独または硝
酸と他の酸の混合エステルであってもよ（、酸としては
、特に炭素原子数１〜７の脂肪族カルボン酸、好ましく
は酢酸である。硝酸単独または硝酸と他の酸例えば酢酸
の混合物でエステル化したｔ、　ＩｖＯ−／、、から形
成される多孔性支持体は、しばしばニトロセルロース紙
として知られる。多孔性支持体は、トレーサー中に使用
される粒状標識物の径より大きな平均孔径を有し、これ
により検定条件下で結合しないトレーサーはトラップさ
れたりまたは試験区域において非特異的に結合されたり
することなく、多孔性支持体を通って吸収層へ流れる。

一般に平均孔径は少なくとも２ｔＩ、好ましくは少なく
とも５μである。−般に孔径は１２μを越えることはな
い。

試験区域においてバインダーとして使用される材料は、
関連する特定の検定化学により選択され特異的結合種で
ある。適当なバインダーの選択は当業者の範囲内である
。同様に、バインダーの固相支持体への確実な付着方法
も当業者に良く知られている。即ち、バインダーは共有
結合または非共有結合を介して、直接または間接的に結
合される。好ましくはバインダーは試験区域に吸着して
付着させる。

好ましい態様によれば、バインダーは少なくとも１７１
１？　／　＞　２の濃度で、吸着により試験区域へ確実
に結合した抗体である。バインダーは少なくとも１０　
ｐｇ／ｃｍ　２好ましくは、少なくとも４０μｇ／ｃｌ
Ｉ２の濃度で吸着させる。ある場合、ポリヒドロキシ化
合物（例えば、グリセロール、エリスリトールまたはソ
ルビトール）または糖（例えばグルコースまたはサッカ
ロース）を、バインダーコーティング溶液に含ま−１、
検定の間の非特異的結合を防止する。同様に、試験区域
および多孔性支持体の残存結合能力は、例えばウシ血清
アルブミンのような検定に使用されるべき物質を特異的
に結合しない蛋白質１種以上で、試験区域および多孔性
支持体をブロックしてもよい、湿潤剤を用いて試験区域
を通る検定試薬の適当な流れを確保することもできる。

適当な湿潤剤には、サッカロース、グリシロール、グル
コース、ソルビトールおよび通常に入手可能な界面活性
剤例えば非イオン性トウィーン２０（シグマケミカル社
）が含まれる。

装置の吸収層は任意の吸収材料から構成することもでき
る。吸収層は検定の間試験装置へ施す液体を吸収するの
に充分な吸収能力を有することが必要である。吸収材料
はまた、試験区域へ施す試薬を吸収層へ流入させる推進
力を提供すべきである。ｆｉ当な吸収材料には、吸収パ
ッドＩｇにつき液体３〜５ｍｌを吸収する能力を有する
セルロース吸収パッドが含まれる。

試験装置の任意の流れ調Ｓ層は、多孔性材料から形成さ
れ、これを使用して試験区域を通過し吸収層へ入る液体
の流速をｉｔ！ｆｆｆ＋する。流れｍ節層を使用する態
様において、核層は試験区域を形成するために使用する
材料の孔径より小さい孔径を有する。従って、実際上、
流れ調節層は試験区域を通じて液体の流速を減少させる
機能を有する。

流れ！１１節層の孔径ならびにその厚さは、液体の試験
区域を通過する流れが、必要とされる感度ならびに迅速
で正確な検定を提供するように調節されるのが好ましい
、流れｔｇｍ層に選択される孔径および相当する流速は
、検定物濃度の予測される範囲に依存する。検定物濃度
の予測範囲が増加すると孔径および流速も増加する。

特定の好ましい態様においては、流れｔｌｉ１節層は試
験層を通過する物質の流速が少なくとも０．５ｍ１７分
、一般に２ｍ１／分を越えないような径の寸法に作られ
る。特に好ましい流速は１ｍ１１分である。最も好まし
い流れ調節層は非繊維軟材料から形成され、そして試験
区域から吸収層へ一方向の流れをもたらす孔または溝を
有する。最も好ましい流れ調節層は、層を通る一方向流
れを可能とする平均孔径０．６μでのポリカーボネート
膜である。

場合により使用される多孔性スペーサー層は、主に試験
区域と流れ調節層を通過した物質が、試験区域へ逆流す
る現象が万−生じた時、これを防止する機能を有する。

多孔性スペーサー層の材料選択は非限定的であるが、但
し、トレーサーおよび検定物を含む試験区域へ施した液
体中の成分を核層を通して吸収層へ流すのに充分な径の
孔を有する。多孔性スペーサー層は、ラングｌ、に眉己
向した繊維を有する不繊布ウェブ、例えば酢酸セルロー
ス不織布ウェブまたはレーヨン不繊布ウェブから作られ
るのが都合が良い。

試験装置は適当なホルダー、例えばカードまたは容器中
または上に支持される。好ましい木ルゲーはサンプルお
よび試薬を試験区域へ施すだめの開口部を備えた蓋を有
する容器である。好ましくは、容器は適当な開口部を除
いて試験装置を完全に被い、これにより全ての試薬およ
びサンプルが装置内に含まれ、該装置を使い捨て式にす
ることができる。

装置およびこれを保持するための容器の特に好ましい構
成を図面に示す、試験装置１０は、上面および下面を有
する多孔性支持体１１を有し、その上面に試験区域１８
を有する。多孔性支持体ｌｌの下面に隣接するのは、流
れｔ［＃Ｎ１２である。

流れ調ｆｌｆｆＪ！！１２の直ぐ下に多孔性スペーサー
層１３が存在する。多孔性スペーサー層１３の直ぐ下が
吸収層１４である。

試験装置のＮ１１，１２．１３および１４は、いずれか
都合のよい方法で例えば、互いに層を縫いあわせること
により、互いに接着されている。

積層された装置は、基部１５と蓋１６からなる容器内に
置くのが都合が良い、多孔性支持体１１を覆う蓋１６は
、試験区域１８を覆う適当な開口部１７を有する突起部
を含む。図面に示すように試験区域１８は、該区域を支
持する多孔性支持体とともに（；９１０部１７で画成さ
れた三角形の区域内に完全に取り囲まれている。

′ｉ！：ｉ１６は基部１５の側方から上方に伸びる歯の
ような突出部Ｉ９により多孔性支持体１１の上方に支持
されている。突出部Ｉ９は試験装置１０の側方の換気を
もたらすためのエアスペース２０を提供するのに充分な
高さである。開口部１７を囲む蓋１Ｇの突起部は着色域
２Ｉを含み、この色は１１６の色および試験区域で発生
する色と反対とし、一般に色彩で測定される試験結果の
良好な読み取りに備えるようにしてもよい。好ましい態
様において、基部【５と着色部２１を有するＭＩＧとか
らなる容器はプラスチック材料で作られる。

本発明のキットは、好ましくは容器に収納された試験装
置ととトレーサーとからなる。好ましくは、トレーサー
は粒状標識物に結合した特異的結合部からなる。Ｉ！Ｉ
Ｉちトレーサーが競合型抗体／抗原検定法で使用される
べきものである場合、特異的結合部は検定物またはそれ
の適当な類似物である。検定がサンドインチ型抗原／抗
体検定法の場合、特異的結合部は特シ゛シ的に検定物に
結合する。

当業者はまた、トレーサーシステムがさらに増幅システ
ムを含んでも良いことを容易に理解するであろう、即ち
、検定条件下でトレーサーは直接ではなく間接的に検定
物と結合してもよい、好ましいトレーサーは、目に見え
る粒状標識物と結合する特異的結合部である。好ましい
粒状標識物は着色物質を含む小袋状物であり、これによ
り検定に使用されたときトレーサーは小袋状物を破るこ
となく可視化される０粒状標識物として使用される小袋
状物は、非限定的にリポソーム（単層または多居ラメラ
）ポリマーマイクロカプセル（例えばコアセルベーシヨ
ンまたは界面重合により作られるもの）を含む広い種類
の小袋状物を包含する。

ポリマーマイクロカプセルは、当該技術で公知の手段に
より作られうるが、但しマイクロカプセルが生成される
溶液には着色物質も含ませ、これによりマイクロカプセ
ルの内部に着色物質が含まれるようにする。このような
マイクロカプセルの調製は、例えばマイクロエンカブシ
ュレーション・プロセス・アンド・アプリケーションズ
（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　　　Ｐｒｏ
ｃｅｓｓｅｓ　　　ａｎｄ　　　ＡａａｐｌｉｃａＬｉ
ｏｎｓ）、ジャン・イー、ベンゾツガ−（Ｊａｎ　　Ｅ
。

Ｖｅｎｄｅｇｇｅｒ）編、プレナムプレス、１９７４年
に記載されている。

リポソームは種々な脂質から作られ、これには例えばホ
スホリピッド、グリコリピッド、ステロイド、比較的長
鎖のアルキルエステル、例えばアルキルホスフェート、
脂肪酸エステル、例えばレシチン、脂肪アミン等が含ま
れる。脂肪物質の混合物を使用してもよ（、例えば中性
ステロイド、帯電した両親媒性物質およびホスホリピッ
ドの組合せである。ホスホリピッドの代表例には、レシ
チン、スフィンゴミエリンおよびジパルミトイルがふく
まれる０代表的ステロイドには、コレステロール、クロ
レスタノール、ラネステロール等カ含まれる０代表的帯
電両親媒性物質は、一般に炭素原子数１２〜１３を有す
る。モノ−またはジアルキルホスフェートエステルまた
はアルキルアミン、例えばジセチルホスフエート、ステ
アリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウリルホスフ
ェートが代表例である。リポソーム小袋状物は、着色物
質を含む水溶液中で作られ、これにより小袋状物はその
内部に着色物質を含む、リポソーム小袋状物は、溶液中
で激しく攪拌し続いてその外部から着色物質を除（こと
により作られる。リポソーム調製についてのさらに詳細
は米国特許第４゜３４２．８２６号およびＰＣＴ国際公
開第ＷＯ３０７０１５１５号に開示されている。

粒状標識物と結合した特異的結合成分からなるトレーサ
ーは、特定の結合部を疎水性染料または顔料の分散水溶
液で標識化するか、または染料もしくは含量でコートさ
れたポリマー核で標識化することにより調製できる。こ
のような標識物は、米国特許第４．３７３，９３２号に
さらに詳細に記載されている。この米国特許に示されて
いるように、粒状標識物として使用される着色された有
機化合物は、疎水性ゾルの形であり、これは水に不溶で
あるかまたは非常に僅かしか溶けない疎水性有機染料も
しくは顔料である。疎水性染料もしくは顔料またはこの
ような染料もしくは顔料でコートされたポリマー核の水
性分散液における粒子は少なくとも５ｎｍ、好ましくは
ｌＯ〜５００ｎｍの径であるのが好ましい。

可視性粒状標識物は、例えば好ましくは球形の着色ポリ
スチレン粒子のような可視性ポリマー粒子である。使用
されうる他の粒状標識物の代表例は、フェリチン、フィ
コエリスリンまたは他のフィコビリープロティン；沈澱
もしくは不溶性の金属または合金；真菌類、部類、また
は細菌性の顔料もしくは誘導体例えば細菌性クロロフィ
ル；植物性材料または誘導体；等が含まれる。

特異的結合部位と粒状標識物との結合方法は、当該技術
分野でよく知られている。このような技術は、吸収、共
有結合、誘導化、不活性化糖である。特異的結合部位が
小袋状物でＩ！ｇ化されたトレーサーを作るさい、小袋
状物は特異的結合部位で誘導化された成分から作られ、
これにより作られた時、小袋状物は特異的結合部位で感
作される。

別の方法において、着色物質を含む小袋状物を最初に作
り、続いて小袋仕初を当該技術で公知の手段により特異
的結合種で怒作してもよい。

再び図面を参照すると、試験装置は未訓練者による使用
に非常に適する０例えば試験区域に確実に結合したバイ
ンダーとして抗体を有するサンドインチ型検定法におい
て、液体サンプルは開口部１７を通して試験区域１８へ
施される。サンプル中に含まれるいかなる抗原検定物も
試験区域において抗体バインダーと結合するであろう、
液体および未結合成分は試験区域１８および多孔性支持
体１１を通って吸収層１４へ流れる。検定物抗原に対す
る抗体および可視性粒状標識物からなるトレーサーを次
いで開口部！７を通して試験区域１８へ施す、トレーサ
ーは試験区域に結合したいかなる抗原とも結合し、過剰
のトレーサーと液体は試験区３ｊｉ１Ｂを通って吸収層
１４へ流れる。所望により洗浄液を試験区域に施してか
らさらにトレーサーを加えてもよい、同様に、トレーサ
ーの添加ののち、洗浄液を施して全ての未結合トレーサ
ーを吸収層１４へ洗浄してもよい、試験区域１８におけ
る色彩の存在が検定物の存在を示す、検定が定量的であ
る場合、色彩の濃さがサンプル中に存在する検定物の量
を示す。

以下に非限定的実施例によりさらに本発明の詳細な説明
する。

シュライヒャー＆シュエルのニトロセルロース膜（孔径
５μ）をｎ−アセチル−グルコサミン−アガロースカラ
ムにより精製されそして２０表０グリセロールを含むリ
ン酸緩衝食塩水（０，０１Ｍ５ｐＨ７，４）中で４００
ｐｇ／ｍｌまで希釈された連鎖球菌Ａ群に対するウサギ
抗体０．５１１でコートする。乾燥後、膜を５（１＋Ｍ
トリス−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨｓ、ｏ：ｔｏ％サッカロ
ースを含む）中の３％ウシ血ｔ？！アルブミンでブロッ
クする０次いで膜を乾燥する。

層状複合材の上にニトロセルロース膜をおくことにより
、試験装；ξを積層する。最下層は、１収性セルロース
紙（１／／Ｉ’の厚さ）である、最下層の上はポリアセ
テートの不織布ウェブ（シュライヒ中−＆シュエル、カ
タログ番号Ｎｏ、５３）からなる多孔性スペーサー層で
ある。多孔性スペーサー層の上は平均孔径０．６μを有
する一方向多孔性ポリカーボネート膜からなる流れ調節
層であり（ヌクレオボア社：ＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅＣｏ
ｒｐ、　　プレサントン、カリホルニア）。

三層を一緒に縫い、ニトロセルロース多孔性支持体層を
一番上に置く、四層からなる複合材は、１Ｃｓ２で厚さ
０．５ｃｍである。ニトロセルロース膜上の抗体スポッ
トは直径はぼ２輩讃である。

パル１１０１ｊ礼製 連鎖球菌Ａ群微生物を計、知の濃度で含む試験懸濁液は
、マクファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）の手段を用
いて、貯蔵Ｍ濁液の集団個数を数え、懸濁液のアリコー
トを亜硝酸で消化し、消化された懸濁液を所望濃度に希
釈することにより調製される。

上古：己υ二Δ汎公 Ａ、　ユ」３輩−に作状標鷹Ｕ１ｉ外盟１、　　１００
ｍｆ丸底回転蒸発フラスコへ次のものを加える。

ａ、５０ｍｇコレステロール（シグマ社、＃ＣＩｆ　−
Ｓ　） ｂ、９４■ジ１−ｒアロイルホスファチジルコリン（ア
バンチ・ポーラ−・リピッド：ＡｖａｎＬｉ　　Ｐｏ１
ａｒ　　Ｌｉｐｉｄｓ　　＃８５０３６ｃ、１０ｍｇジ
スアアロイルホスファチジルグリセロール（アバンチ・
ポーラ−・リピッド）ｄ、３．７５■架橋剤（ジ入ｔア
ロイルホスファチジルエタノールアミン−ρ−マレイミ
ドフェニル）カプリル（ベクトン・ディッキンソン・イ
ムノダイアグノスティック：ＢｅｃＬｏｎＤｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎ。

ｓＬ＋ｃ：オレンジバーブ、ニューヨーク）、および ｅ、５０ｍｆｆ１クロロホルム（フィッシャー：Ｆｉｓ
ｈｃｒ） ２、　かき混ぜる。

３、　次の条件下に回転医発器へ入れる。

水浴温度−４４℃ 回転速度−４ ４、発泡が止まるまで（はぼ３０〜４０分）徐々に減圧
度を上げる。

５、　圧力を減少し、４４°Ｃで３０分間リボソートを
アニールする。

６、−夜凍結乾燥する。

７、　回転Ｖ発器中に５０ｍ１の医留水を加え、そして
リビッド膜が溶けるまで減圧することなく６０℃で攪拌
する。

８、　　ドライアイスとメタノール中で凍結する。

９、　凍結乾燥して乾燥粉末リポソームにする。

１０、別にスルホローダミンＢの着色溶液（０，１Ｍ酢
酸ナトリウム食塩緩衝液；ｐＨ４，５中の０．１Ｍ液）
を作る。

１１、着色溶液５０ｍ１をリボソー１、粉末へ加えそし
て１５分間６０°Ｃまで温める。

＋２．温めたリポソーム調製物を、１．０μ、０．４μ
次いで０．２μのバイオラド・ユニポア・ポリカーボネ
ート膜（バイオラド社）に通して抽出する。

１３、セファロースＣＬ６Ｂクロマトグラフィーカラム
（ファルマシア社）にて１ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭ
ＮａＣｌを用いて５０−ｈ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，５）中で平衡化することにより、リポソーム懸濁液
から着色物質を分離する。

１４、リポソームを工程１３のものと同じ緩衝液中で貯
蔵する。

１、　連鎖球菌Ａ群に対するアフィニティー精製（ｎ−
アセチル−グルコサミン−アガロースカラムによる）ウ
サギ抗体６■を、リン酸塩で緩衝化した食塩水（１００
＠Ｍ、　ｐＨ８）に対し透析する。

２、　　３１１）Ｐ’（シグマ社）を用いて、３０分間
室温で攪拌しながらＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　　３　Ｍ　：抗体
１Ｍのモル比で反応させる。

３、　３０秒間ｐＨ４，５で攪拌しながら１Ｍ酢酸ナト
リウム１容量を加える。

４、　酢酸ナトリウム食塩緩衝液（０，０１Ｍ、ｐ）１
４．５）中の１Ｍジチオスレイトール１／１００容量を
加える。

５、　　トリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０−■酢酸
ナトリウム、５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ。

ＰＨ８，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５中型
カラムに反応物を通ずことにより、ジチオスレイトール
を除く。

６、　　０Ｄ２８０で低蛋白質含有フラクションをモニ
ターする。

７、　調製したばかりのリポソーム１０ｍ１とこの溶液
を混合する。

８、　窒素をフラッシュして密封する。

９、　室温で一晩反応させる。

ｌＯ８標準トリス緩衝液（ＰＨ８）で平衡化したセファ
ロースＣＬ　６１３クロマトグラフイーカラム（ファル
マシア社）中で結合生成物を分離する。

１１、ボイド部分のフラクションを集めてプールする。

１２．４°Ｃで貯蔵する。

検定去広 既知濃度の連鎖球菌Ａ群微生物を含む試験懸濁液（２０
０ｐりを試験区域に置き吸収層へ流す。

その後トレーサー３滴（約１５０μりを加え吸収層へ流
す。

次いで洗浄緩衝液（ＩＭグアニジンＩ　ＣＩ　）１衝液
、ｐＨ７、コダック社）３滴を加えることにより、試験
区域を洗う。

次いで試験区域上で顕著なピンク色の存在を視覚的に観
察することにより、結果を読み取る。

各検定を行う全時間は、抗原抽出後１〜２分間でよい、
第１表において、記号子は試験区域において顕著なピン
ク色が存在すること意味し、記号−は色が認められない
ことを意味する。この方法を は実施例２の方法より−に４迅速で、実施例５（比較例
）の方法より’Ｘ見、”早い。

第１表 連鎖球菌Ａ群数（１０６個／−） １０　１　０．５　０．２　０．１　　　陰性対照結果
　　＋　＋＋＋−一 実施例２　単層膜試験装置を用いた連鎖球菌Ａ群の検定
法 跋駿ｌ霞夏Ｈ監 ニトロセルロースｒｙ２（シュライヒャー＆ジェニル：
平均孔径０．４５μ）に、連鎖球菌Ａ群に対するウサギ
抗体（精製されたプロティンＡ）の水性Ｍ濁液（２７〜
／−）３，１をスポットする。各スポットは直径２−で
ある、膜をウシ血清アルブミン（ｐＨ９，６の５０！Ｉ
Ｍ炭酸塩緩衝液中５％）でブロックする０次いで膜をリ
ン酸緩衝食塩液（０゜０１Ｍ、ｐＨ７，４）でリンスし
乾燥する。

成層１１■Ｉ店料製 既知濃度の連鎖球菌Ａ群微生物を含む？Ａ濁液を、米国
特許節４．６１８，５７６号に記載の酵素抽出法を用い
て調製する。

検定法 既知濃度の連鎖球菌Ａ群を含む試験懸濁液（３００ｐｊ
）を試験トレー（フアシヨン・ティッシュ−・カルチュ
ア、２４ウェルトレー：Ｆａｌｃｏｎ　　Ｔｉ５ｓｕｅ
　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　２４　　Ｗｅｌｌ　　ｔｒａｙ
）の凹部に入れる。試験装置を各凹部に入れ、３０分間
で３７℃にてインキユベートする。その後凹部を吸引し
、そして各試験膜をリン酸塩級化食塩水（０，ＯＬＭ、
　ｐＨ１゜４）で洗う、洗浄緩衝液を吸引し、そしてト
レーサー（実施例１で記載したように調製した）（３０
０１１ｊ）を各凹部へ加え、３０分間インキエベートす
る。その後トレーサー溶液を吸引し、そして膜をリン酸
塩緩衝化食塩水で再度洗う、膜における顕著なピンク色
の存在は、連鎖球菌Ａ群微生物の陽性測定結果を意味す
る。トレーを処理する全時間は１時間を越える。結果を
第２表に示す。

第２表 サンプル濃度（微生物１０６個／　ｍｌ　）１０　１　
０．５　０．２　０．１　　　陰性対照結果　　十　＋
＋＋＋　　　　− ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュエル、５．
０μ）に米国特許節４，６７０，３８２号に記載の真菌
、カンジダ　アルビカンスの細胞質抗原（４Ｂ−５２Ｋ
Ｄ）に対するモノクローナル抗体（ストレイン１１０２
３１）（６６０ｐ／ｍｌ）を含む溶液５．０１１１をス
ポットする。Ｆ！を１％脱脂ドライミルク（カーネーシ
ョン印：Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　　ｂｒａｎｄ）の懸濁液
でブＣ１７りする。スポットした膜を実施例１に記載し
たように試験装置へ重ねる。

米国特許節４，６７０，３８２号の記載に従って、抽出
され、精製され、そして同定されたカンジダ　アルビカ
ンスに対する細胞質抗原（４８−５２ＫＤ）を含むＭ濁
液を水で希釈して、種々な濃度で細胞質抗原を含む液体
サンプルを調製する。

レーサーシスームの４−１１ カンジダ　アルビカンスからの４８−５２ＫＤ細胞質抗
原に対するウサギ抗体を、米国特許節４゜６７０．３８
２号の記載に従って調製する。

スルホローダミンＢを含むリポソーム小袋状物を、実施
例１に記載した様にして調製する。連鎖球菌Ａ群に対す
るプロティンＡ抗体に代えて、ウサギＩｇＧに対するヤ
ギ抗体を用いて実施例１に記載した様にして抗体へリポ
ソームを結合することによりトレーサーを調製する。

枚足抜 試験装置をリン酸緩衝化食塩水（０，ＯＩＭ、ｐ１７．
４）で予備洗浄する。その後、液体サンプルの３００ｐ
ｌアリコートを試験区域と接触させ、吸収層に流通させ
る０次いで試験装置をカンジダアルビカンスからの４８
−５２ＫＤ細胞質抗原に対するウサギ抗体（４００ｐｆ
／ｍｌ）　３００ｐｌと接触させる。液体を吸収層に流
し通した後、装置を２００ｐｆ）リス−食塩水緩衝液（
ＰＨ７，２）で洗う、トレーサー（ウサギ［ｇＧに対す
るヤギ抗体と結合したリポソーム）を加え（２００ｙｆ
）そして吸収層に流し通す、最後に、試験区域で特異的
に結合しない成分のいずれも１ＯＯ１１１リン酸塩緩衝
化食塩水（０，０１Ｍ、　ｐＨ７，４）を用いて吸収層
へ流し込む、試験区域でのピンク色の存在が陽性の液体
サンプルを示す、全方法は１０分間で終了することがで
きる。結果を第３表に示す。

第３表 抗原濃度（ｎｇ／ｒｆ） ５００　　１００　５０　　１０　　５　　陰性対照結
果　　＋　　＋十＋−− ニトロセルロース膜（シュライヒ中−＆シュエル、孔径
０．　４５　ＩＩｎ）にカンジダ　アルビカンスからの
４８−５２ＫＤ細胞質抗原に対するモノクローナル抗体
（細胞系１０２３１）を含むｇ＜液（５ａｆ）米国特許
第４．６７０，３８２号に記載）をスポットする０次い
で膜を脱脂ドライミルク（カーネーシ町ン印）の１％懸
濁液を用いてブロックする。

°　°サンプルと看−５のｉ′１ カンジダ　アルビカンスからの４８−５２ＫＤ細胞質抗
原の既知量を含む液体サンプルを実施例３に記載したよ
うに調製する。４８−５２ＫＤ抗原に対するウサギ抗体
を米国特許４，６７０，３８２号に記載したように調製
する。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗−
ウサギ抗体は、シグマケミカルズ社から入手できる。基
質溶液は、メタノール中に４−クロロ−！−ナフトール
基質（シグマ）を溶解しクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５
゜５）で容量を調節して最終濃度０．６ｇ／−にするこ
とにより調節する。

援定抜 液体サンプルのアリコート（５００ａｆ）をプラスチッ
クトレー（ファルコン、２４ウェル）の試験凹部へ入れ
る。モノクローナル抗体をスポットした膜を各凹部へ入
れ、トレーを室温で４５分間試験カード回転器中で回転
する（１００ｒｐｍ）。

液体サンプルを吸引し、各膜を水で洗う、４８−５２Ｋ
Ｄ抗原に対するウサギ抗体（２０ｐｇ／ｍｆｆ１）のア
リコート（５００ｉＩｊ）を各凹部へ加え、そしてトレ
ーを４５分間室温で回転（１００ｒｐｍ）させる、抗体
懸濁液を吸引し、膜を水洗する。酵素抱合体（５００ａ
ｌシグマケミ力ルズ社から供給される抱合体の１　＝２
０００希釈液として調製）を各四部へ加え、トレーを室
温で４５分間回転させる。抱合体を吸引し、水洗した後
、基質を加え、そしてＩＯ分間インキエベートする。停
止？８液を加え、顕著な青色を目視観察することにより
結果を読み取る。検定法には３時間を要する。結果を第
４表に示す。

抗原濃度（ｎ１７ｍ１） ５００　　１００　５０　　１０　　５　　陰性対照結
果　　＋　　＋＋−−− 比較 実施例１に記載した試験キットおよび方法を連鎖球菌へ
群にたいする市販スクリーンと比較する。

市販品は説明書に従って使用する。レーヨン綿棒へ連鎖
球菌Ａ群を接種し、その後抽出することによりサンプル
を調製する０本発明の試験キットおよび方法に関し、０
．１ＭＨＣｌを用いて硝酸抽出し、４　ＭＮ　ａ　Ｎｏ
□とＩＭ）リス緩衝液（トリズマ（’ｒｒｉｚｍａ）”
塩基（シグマ社）オヨヒ４ＭＮａＣ＋）を用いた亜硝酸
抽出により微生物を抽出する。市販キットの各々につい
て抽出液を用いて微生物を抽出し、そして抽出方法は各
々について亜硝酸抽出である。各場合に二つの化学キッ
トを試験した。結果を第５表に示す。

第５表の注： ■、　　イリノイ州、シカゴ、アボットラボラトリーズ
から購入 ２、　　カリホルニア州、サンジエゴ、バイブ’Ｊ　チ
ック　インコーポレーションから購入 ３、　　メリーランド州、バルチモア、ＢＢＬ　　マ、
イクロバイオージー　システムズから購入４、　　ミズ
リー州、カンサスシティ、マリオンボラトリーズから購
入 ５、　　　ＥＩＡは酵素免疫検定法を意味し、ラテック
スは、ラテックス凝集検定法を意味する。

【図面の簡単な説明】

第１図は容器に組み込まれた本発明装置の平面図であり
、 第２図は第１図の装置の正面図であり、第３図は第１図
の３−３線矢視方向の断面図である。 図中、ＩＯ・・・試験装置 １１・・・多孔性支持体 １２・・・流れｔＡ＃層 １４・・・吸収層 １８・・・試験区域

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）上面および下面を有する多孔性支持体と該上面に
   おける試験区域； 試験区域にしっかりと付着したバインダー；多孔性支持
   体との間に液体の流通性を有する吸収層；および 多孔性支持体の下面と吸収層の間に位置する流れ調節層
   ； とからなる粒状標識を有するトレーサーを用いた検定物
   の存在を検出するための検定に用られる装置において、 多孔性支持体は液体および試験区域に特異的に結合しな
   いいかなる検定物およびトレーサーをも通過させるに充
   分な孔径を有し、且つ該支持体はトレーサーを特異的に
   結合せず、 試験区域は、検定条件下で該区域に特異的に結合したト
   レーサーが可視化される濃度でバインダーを支持するの
   に充分な大きさの表面積を有し；流れ調節層は、多孔性
   であってその孔径は多孔性支持体のものより小さく、そ
   して液体および試験区域に特異的に結合しないいかなる
   検定物およびトレーサーをも調節された速度で通過させ
   るのに充分な大きさであり、 多孔性支持体および吸収層は、多孔性支持体を通る試薬
   の流れを調節しそして液体および試験区域に特異的に結
   合しないいかなる検定物およびトレーサーをも吸収層に
   受け入れるために共働する、ことからなる検定装置。
2. （２）流れ調節層と吸収層の間に位置する多孔性スペー
   サー層をも有し、これが液体および試験区域に特異的に
   結合しないいかなる検定物およびトレーサーをも試験区
   域から吸収層へ流れさせることからなる特許請求の範囲
   第１項記載の装置。
3. （３）バインダーが少なくとも１０μｇ／ｃｍ＾２の濃
   度で試験区域にしっかりと付着し、多孔性支持体が３μ
   ｍ〜５μｍの間の孔径を有するニトロセルロースであり
   、流れ調節層が非繊維状の一方向流れ調節層であり、支
   持体上の流れ調節層および吸収層は検定条件下で試験区
   域を通して試薬を流れさせることからなる特許請求の範
   囲第１項記載の装置。
4. （４）特許請求の範囲第１項記載の装置と、検定条件下
   で試験区域に結合したとき可視化される粒状標識物を有
   するトレーサーとからなる試験キット。
5. （５）トレーサーが粒状標識物を結合して有する特異的
   結合種であり、粒状標識物が小袋状物であり、該小袋状
   物が着色物質を含む特許請求の範囲第４項記載の試験キ
   ット。
6. （６）粒状標識物がリポソームであり、着色物質がスル
   ホローダミンＢである特許請求の範囲第５項記載の試験
   キット。
7. （７）特許請求の範囲第１項記載の装置または特許請求
   の範囲第４項記載の試験キットを準備し、前記装置の試
   験区域に、液体サンプルおよび検定条件下で試験区域に
   結合したとき可視化される粒状標識物を有するトレーサ
   ーと接触させて、試験区域で特異的に結合しないいかな
   る検定物もトレ−サーも試験区域から吸収層へ流すよう
   にし、試験区域に特異的に結合したトレーサーの可視性
   を検定物の指標として測定することからなる、液体サン
   プル中の検定物の検定方法。
8. （８）検定物が特異的結合対の一員であり、バインダー
   が特異的結合対の残りの一員であり、そしてトレーサー
   が検定物とバインダーの間の特異的結合反応を妨害しな
   い部位で検定物と特異的に結合する、特許請求の範囲第
   ７項記載の検定方法。
9. （９）検定物とトレーサーの両者がバインダーと特異的
   に結合し、そして結合部位への結合を互いに妨害して競
   合することからなる特許請求の範囲第８項記載の検定方
   法。