JPH01137977A - ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド - Google Patents
ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミドInfo
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- JPH01137977A JPH01137977A JP29273987A JP29273987A JPH01137977A JP H01137977 A JPH01137977 A JP H01137977A JP 29273987 A JP29273987 A JP 29273987A JP 29273987 A JP29273987 A JP 29273987A JP H01137977 A JPH01137977 A JP H01137977A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/545—IL-1
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子組み換え法により大腸菌を用いてヒト
インターロイキン１ポリペプチドを生産するための高
度形質発現プラスミド及びそれを用いたヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
インターロイキン１ポリペプチドを生産するための高
度形質発現プラスミド及びそれを用いたヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
本発明は、更に詳しくはヒトインターロイキン１ポリペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列の上流に下記式［
Ａ］で示される塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡが組
み込まれた形質発現プラスミド及び該形質発現プラスミ
ドにより形質転換された形質転換体を用いるヒトインタ
ーロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列の上流に下記式［
Ａ］で示される塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡが組
み込まれた形質発現プラスミド及び該形質発現プラスミ
ドにより形質転換された形質転換体を用いるヒトインタ
ーロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
５’−ＸＧＧＡＧＧＴＴＴＹＡＴＴＡＴＧ−３’式［Ａ
］ ［式中、Ｘは（Ａ）ｘを意味し、Ｘは１〜５を表わす。
］ ［式中、Ｘは（Ａ）ｘを意味し、Ｘは１〜５を表わす。
Ｙは（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙはＯ〜３を、２は０
又は１を表わす。３′側のＡＴＧは翻訳開始コドンを意
味する。］ 本発明者らは、ヒトインターロイキン１ポリベブチドを
遺伝子組み換え技術を応用して、微生物菌体内で生産す
る製造系を、既に確立している（ヨーロッパ公開特許第
０１８８９２０号）。
又は１を表わす。３′側のＡＴＧは翻訳開始コドンを意
味する。］ 本発明者らは、ヒトインターロイキン１ポリベブチドを
遺伝子組み換え技術を応用して、微生物菌体内で生産す
る製造系を、既に確立している（ヨーロッパ公開特許第
０１８８９２０号）。
本発明者らは、大腸菌中で、ヒト インターロイキン１
ポリペプチドを効率的に生産させるための形質発現プラ
スミドの改良を試み、目的にかなう高度形質発現プラス
ミドの構築に成功し、本発明を完成した。
ポリペプチドを効率的に生産させるための形質発現プラ
スミドの改良を試み、目的にかなう高度形質発現プラス
ミドの構築に成功し、本発明を完成した。
本発明によれば、適当なプロモーター、例えばトリプト
ファンオペロンのプロモーター（以下、ｔｒρプロモー
ターと記す）の下流に順次、上記式［Ａ］で示された塩
基配列を有するＳＤ配列領域から翻訳開始コドンまでの
塩基配列、更にヒトインターロイキン１ポリペプチドを
コードする塩基配列及び翻訳終止コドンを結合し、この
ＤＮＡを、例えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２又はそ
の複製開始点近傍のコピー数制御領域等を欠失させた変
異プラスミドの適当な位置に挿入することにより、本発
明のヒト インターロイキン１ポリペプチド生産用の形
質発現プラスミドを作製することができる。
ファンオペロンのプロモーター（以下、ｔｒρプロモー
ターと記す）の下流に順次、上記式［Ａ］で示された塩
基配列を有するＳＤ配列領域から翻訳開始コドンまでの
塩基配列、更にヒトインターロイキン１ポリペプチドを
コードする塩基配列及び翻訳終止コドンを結合し、この
ＤＮＡを、例えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２又はそ
の複製開始点近傍のコピー数制御領域等を欠失させた変
異プラスミドの適当な位置に挿入することにより、本発
明のヒト インターロイキン１ポリペプチド生産用の形
質発現プラスミドを作製することができる。
そして該形質発現プラスミドを、常法に従い大腸菌に導
入し、形質転換させた大腸菌を培養することにより、目
的とするヒトインターロイキン１ポリペプチドを効率よ
く産生せしめることができる。
入し、形質転換させた大腸菌を培養することにより、目
的とするヒトインターロイキン１ポリペプチドを効率よ
く産生せしめることができる。
本発明に用いられるヒトインターロイキン１ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、第１表に掲げた式［Ｉ
］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ、例えば第２表で掲げた
式［Ｂ］で示される塩基配列を有するＤＮＡ及びその縮
重が最も好ましいものとして挙げられるが、この他に式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を部分的に変換したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡが挙げられる。ここにおける部分的に変換
したアミノ酸配列としては、例えばＮ末端側の１〜１４
個のアミノ酸残基を欠失させたもの、Ｎ末端側を除く構
成アミノ酸の１〜数個のアミノ酸を欠失させたもの及び
構成アミノ酸の１〜数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置
換したものが挙げられる。
ドをコードするＤＮＡとしては、第１表に掲げた式［Ｉ
］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡ、例えば第２表で掲げた
式［Ｂ］で示される塩基配列を有するＤＮＡ及びその縮
重が最も好ましいものとして挙げられるが、この他に式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を部分的に変換したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡが挙げられる。ここにおける部分的に変換
したアミノ酸配列としては、例えばＮ末端側の１〜１４
個のアミノ酸残基を欠失させたもの、Ｎ末端側を除く構
成アミノ酸の１〜数個のアミノ酸を欠失させたもの及び
構成アミノ酸の１〜数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置
換したものが挙げられる。
第１表 ヒト インターロイキン１のアミノ酸配列Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｌＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐ
ｈｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｉｌｅ ＩＩｓ Ｌｙｓ Ｔｙ
ｒＧｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ
ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈ
ｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｔｙｒ ＬｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓ
ｐ Ａｌａ Ｌｙｓ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ｌｅｕ ＴｙｒＶａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｉｎ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ＬｙｓＴｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｈｌｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓ
ｎ ＬｅｕＰｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ ＴｈｒＡｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｌａ式［■コ 第２表 ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコード
する塩基配列 式［Ｂ］ 以下に、本発明の形質発現プラスミドの効果について説
明する。
ｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｌＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐ
ｈｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｉｌｅ ＩＩｓ Ｌｙｓ Ｔｙ
ｒＧｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ
ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈ
ｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｔｙｒ ＬｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓ
ｐ Ａｌａ Ｌｙｓ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ｌｅｕ ＴｙｒＶａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｉｎ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ＬｙｓＴｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｈｌｓ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓ
ｎ ＬｅｕＰｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ ＴｈｒＡｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｌａ式［■コ 第２表 ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコード
する塩基配列 式［Ｂ］ 以下に、本発明の形質発現プラスミドの効果について説
明する。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒトインター
ロイキン１ポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込ま
れた各種形質発現プラスミドを、大腸菌ＨＢ １０１株
に導入して作製した形質転換体のヒト インターロイキ
ン１ポリペプチドの生産効率について検討を行った。
ロイキン１ポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込ま
れた各種形質発現プラスミドを、大腸菌ＨＢ １０１株
に導入して作製した形質転換体のヒト インターロイキ
ン１ポリペプチドの生産効率について検討を行った。
以下の実験例で示す形質発現プラスミドは、いずれもプ
ロモーターとしては、 ｍプロモーターを用い、 プ
ラスミドベクターには、ｐＢＲ３２２のコピー数制御領
域を欠失させた変異プラスミドｐＢＲ８６（参考側参照
）を用いた。
ロモーターとしては、 ｍプロモーターを用い、 プ
ラスミドベクターには、ｐＢＲ３２２のコピー数制御領
域を欠失させた変異プラスミドｐＢＲ８６（参考側参照
）を用いた。
ヒトインターロイキン１ポリペプチドの生産量比は、一
定の生産菌数（波長６００ｎｍにおける吸光度値が１の
生産菌懸濁液の１ｍｌ中に含まれる菌数）当りのヒトイ
ンターロイキン１ポリペプチド生産量に基づく比率で示
す。
定の生産菌数（波長６００ｎｍにおける吸光度値が１の
生産菌懸濁液の１ｍｌ中に含まれる菌数）当りのヒトイ
ンターロイキン１ポリペプチド生産量に基づく比率で示
す。
ヒト インターロイキン１ポリペプチド量は、特開昭６
２−９１１９７号に開示された２種類の抗ヒト イ′ン
ターロイキン１モノクローナル抗体＃０３７４と＃０９
６４を用いた酵素標識イムノアッセイ法［砂原ら、第４
５回日本癌学会総会記事、３４３頁（１９８６）コにて
、特開昭６１−２７１２２２号記載の方法に従って製造
されたヒトインターロイキン１ポリペプチドを標準品と
して用いて定量した。
２−９１１９７号に開示された２種類の抗ヒト イ′ン
ターロイキン１モノクローナル抗体＃０３７４と＃０９
６４を用いた酵素標識イムノアッセイ法［砂原ら、第４
５回日本癌学会総会記事、３４３頁（１９８６）コにて
、特開昭６１−２７１２２２号記載の方法に従って製造
されたヒトインターロイキン１ポリペプチドを標準品と
して用いて定量した。
ヒト インターロイキン１生産菌の作製方法、培養条件
及び菌体からの該ポリペプチドの抽出条件は、次の通り
である。
及び菌体からの該ポリペプチドの抽出条件は、次の通り
である。
即ち、ヒトインターロイキン１生産用形質発現プラスミ
ドを、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ。
ドを、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、 ６９
巻、２１１０頁（１９７２） ］に準じて大腸菌Ｈ８１
０１株に導入して作製した生産菌を、ＬＢブロス［組成
：１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１
，ｐＨ７，５］中、３７℃で一夜振盪培養した。その菌
体懸濁液を改良Ｍ９培地［組成＝１・５％Ｎａ２ＨＰＯ
４・１２Ｈ２０，０，３％ ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％
ＮａＣ１，０，１％ＮＨ４Ｃｌ、２ｍｇ／ｌビタミンＢ
１．０．５％カザミノ酸、２ｍＭ Ｍｇ５Ｏ６，１ｍＭ
ＣａＣｌ２．０．５％４・ ブドウ糖］中に、 １％濃度に接種し３７℃で１時間培
養後、インドール−３−アクリル酸を最終濃度２０μｇ
／ ｍ １になるように添加し、更に一夜培養した。
巻、２１１０頁（１９７２） ］に準じて大腸菌Ｈ８１
０１株に導入して作製した生産菌を、ＬＢブロス［組成
：１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１
，ｐＨ７，５］中、３７℃で一夜振盪培養した。その菌
体懸濁液を改良Ｍ９培地［組成＝１・５％Ｎａ２ＨＰＯ
４・１２Ｈ２０，０，３％ ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％
ＮａＣ１，０，１％ＮＨ４Ｃｌ、２ｍｇ／ｌビタミンＢ
１．０．５％カザミノ酸、２ｍＭ Ｍｇ５Ｏ６，１ｍＭ
ＣａＣｌ２．０．５％４・ ブドウ糖］中に、 １％濃度に接種し３７℃で１時間培
養後、インドール−３−アクリル酸を最終濃度２０μｇ
／ ｍ １になるように添加し、更に一夜培養した。
培養終了後、その菌体懸濁液の波長６００ｎｍの濁度を
測定し、遠心分離にて菌体を採取した。得られた菌体を
酵素消化液［組成：０．１％リゾチーム及び ３０ｍＭ
ＮａＣ１を含む５０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ緩衝液（
ｐＨ８，０） ］中に懸濁させ、０℃で３０分間静置し
た後、 ドライアイス／エタノール浴での凍結及び３７
℃での融解を繰り返すことにより、菌体を破壊した。遠
心分離により、菌体残査等を除去してヒトインターロイ
キン１ポリペプチド抽出液を得た。この抽出液中のヒト
インターロイキン１ポリペプチド量を、上記の酵素標識
イムノアッセイ法により定量した。
測定し、遠心分離にて菌体を採取した。得られた菌体を
酵素消化液［組成：０．１％リゾチーム及び ３０ｍＭ
ＮａＣ１を含む５０ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ緩衝液（
ｐＨ８，０） ］中に懸濁させ、０℃で３０分間静置し
た後、 ドライアイス／エタノール浴での凍結及び３７
℃での融解を繰り返すことにより、菌体を破壊した。遠
心分離により、菌体残査等を除去してヒトインターロイ
キン１ポリペプチド抽出液を得た。この抽出液中のヒト
インターロイキン１ポリペプチド量を、上記の酵素標識
イムノアッセイ法により定量した。
（以下余白）
実験例１
自然界に存在するｍプロモーター・オペレーター領域に
続＜ｍＬタンパクをコードする塩基配列の上流にあるＳ
Ｄ配列（ｆＬのＳＤ配列と記す）を利用して、参考例に
記載したヒト インターロイキン１生産用の形質発現プ
ラスミド（プラスミド番号ｐＨＩＬＴ３８３） を作
製した。更に、ｍＬのＳＤ配列の代わりに、蛋白翻訳に
必要なりボゾームの結合がより効率的なＳＤ配列、ＳＤ
配列から翻訳開始コドン間の距離及び塩基配列の変換及
びＳＤ配列領域の５°末端のＡ残基数の生庫効率に及ぼ
す効果を検討した。形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８
３ａ−ｐＨＩＰＨ３８３ｈの構築方法は、実施例１に示
す。形質発現プラスミドｐＨＩＰ８３８３の構築方法は
、参考例に示す、尚、ＳＤ配列から上流部分の制限酵素
ｉＰ！ｉＩの切断認識部位までの塩基配列は、すべての
形質発現プラスミドについて同一であり次の配列を有す
る： ５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴ−
３’本発明のヒト インターロイキン１生産用形質発現
プラスミドを用いて作製した生産菌によるヒトインター
ロイキン１ポリペプチドの生産効率を、第３表に示す。
続＜ｍＬタンパクをコードする塩基配列の上流にあるＳ
Ｄ配列（ｆＬのＳＤ配列と記す）を利用して、参考例に
記載したヒト インターロイキン１生産用の形質発現プ
ラスミド（プラスミド番号ｐＨＩＬＴ３８３） を作
製した。更に、ｍＬのＳＤ配列の代わりに、蛋白翻訳に
必要なりボゾームの結合がより効率的なＳＤ配列、ＳＤ
配列から翻訳開始コドン間の距離及び塩基配列の変換及
びＳＤ配列領域の５°末端のＡ残基数の生庫効率に及ぼ
す効果を検討した。形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８
３ａ−ｐＨＩＰＨ３８３ｈの構築方法は、実施例１に示
す。形質発現プラスミドｐＨＩＰ８３８３の構築方法は
、参考例に示す、尚、ＳＤ配列から上流部分の制限酵素
ｉＰ！ｉＩの切断認識部位までの塩基配列は、すべての
形質発現プラスミドについて同一であり次の配列を有す
る： ５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴ−
３’本発明のヒト インターロイキン１生産用形質発現
プラスミドを用いて作製した生産菌によるヒトインター
ロイキン１ポリペプチドの生産効率を、第３表に示す。
第３表
形質発現 ＳＤ配列領域 生産量比ｂ
プラスミド 〜開始コドン間配列ａｐＨＩＬＴ３
８３ ５’−ＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴ（
ＡＴＧ）−３’ １．０ｐＨＩＰ）＋３８３
５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴ（ＡＴＧ）−
３’ １．９ｐＨＩＰ８３８３ａ ５’−ＡＡ
ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’
４．４ＰＨＩＰ８３８３ｂ ５’−ＡＡＡＧＧＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．４ｐ
ＨＩＰＨ３８３ｃ ５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴ
ＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．５ｐＨＩＰ８３
８３ｄ ５’−ＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴ
Ｔ（ＡＴＧ）−３’ ３．２ｐＨＩＰＨ３８３ｅ
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＴＴ（ＡＴＧ
）−３’ ５．１ｐｌ（ＩＰＨ３８３ｆ ５
’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’
５．４ｐＨＩＰＨ３８３１５’−ＡＡＡＡＧＧＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．６
ｐＨＩＰＨ３８３ｈ ５’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴ
ＴＡＡＡＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．９ヒト
インターロイキン１の生産効率は、形質発現プラスミド
のＳＤ配列、 ＳＤ配列がら翻訳開始コドン間の塩基配
列及びＳＤ配列の５′末端のＡ残基数により影響され、
これらの配列の変換により、生産量を有意に増加させる
ことができた。
プラスミド 〜開始コドン間配列ａｐＨＩＬＴ３
８３ ５’−ＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴ（
ＡＴＧ）−３’ １．０ｐＨＩＰ）＋３８３
５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴ（ＡＴＧ）−
３’ １．９ｐＨＩＰ８３８３ａ ５’−ＡＡ
ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’
４．４ＰＨＩＰ８３８３ｂ ５’−ＡＡＡＧＧＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．４ｐ
ＨＩＰＨ３８３ｃ ５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴ
ＡＡＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．５ｐＨＩＰ８３
８３ｄ ５’−ＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴ
Ｔ（ＡＴＧ）−３’ ３．２ｐＨＩＰＨ３８３ｅ
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＴＴ（ＡＴＧ
）−３’ ５．１ｐｌ（ＩＰＨ３８３ｆ ５
’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’
５．４ｐＨＩＰＨ３８３１５’−ＡＡＡＡＧＧＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．６
ｐＨＩＰＨ３８３ｈ ５’−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴ
ＴＡＡＡＴＡＴＴ（ＡＴＧ）−３’ ４．９ヒト
インターロイキン１の生産効率は、形質発現プラスミド
のＳＤ配列、 ＳＤ配列がら翻訳開始コドン間の塩基配
列及びＳＤ配列の５′末端のＡ残基数により影響され、
これらの配列の変換により、生産量を有意に増加させる
ことができた。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列のＮ末端側の５個のア
ミノ酸を欠失させたアミノ酸配列を有するポリペプチド
生産用形質発現プラスミドについても、上記とほぼ同様
な結果が得られた。
ミノ酸を欠失させたアミノ酸配列を有するポリペプチド
生産用形質発現プラスミドについても、上記とほぼ同様
な結果が得られた。
実験例２
ヒトインターロイキン１生産用形質発現プラスミドの生
産効率に及ぼす蛋白翻訳領域の塩基配列の部分的変換、
即ちコードするアミノ酸の種類を変えることなく他の塩
基へ変換すること（縮重コドンの使用）の効果に゛つい
て検討した。
産効率に及ぼす蛋白翻訳領域の塩基配列の部分的変換、
即ちコードするアミノ酸の種類を変えることなく他の塩
基へ変換すること（縮重コドンの使用）の効果に゛つい
て検討した。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒトインター
ロイキン１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸から５番目ま
でのアミノ酸配列、それをコードするｃＤＮＡの塩基配
列（以下、天然の塩基配列と記す）及び縮重コドンによ
る変換例を、第４表に示す。
ロイキン１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸から５番目ま
でのアミノ酸配列、それをコードするｃＤＮＡの塩基配
列（以下、天然の塩基配列と記す）及び縮重コドンによ
る変換例を、第４表に示す。
（以下余白）
第４表
Ｎ末端アミノ酸配列 ５ｅｒＳｅｒＰｒｏＰｈｅＳｅｒ
縮重コドン変換例（２） ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣ
ＡＧＣ縮重コドン変換例（３）ＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＴ
立ＡＧＣ注：変換箇所に、下線を付した。
縮重コドン変換例（２） ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣ
ＡＧＣ縮重コドン変換例（３）ＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＴ
立ＡＧＣ注：変換箇所に、下線を付した。
縮重コドンを用いて作製した形質発現プラスミドを用い
た場合の生産効率は、天然の塩基配列を用いて作製した
ものに比べて、勝っていた。
た場合の生産効率は、天然の塩基配列を用いて作製した
ものに比べて、勝っていた。
以上の実験例に示すごとく、ヒト インターロイキン１
ポリペプチド生産用形質発現プラスミドの構築にあたり
、 ＳＤ配列機能を有する塩基配列、ＳＤ配列から翻訳
開始コドン間の塩基の種類及び距離、更にヒト インタ
ーロイキン１をコードする塩基配列中の塩基の種類など
を変換することにより、その生産効率を上昇させること
ができた。
ポリペプチド生産用形質発現プラスミドの構築にあたり
、 ＳＤ配列機能を有する塩基配列、ＳＤ配列から翻訳
開始コドン間の塩基の種類及び距離、更にヒト インタ
ーロイキン１をコードする塩基配列中の塩基の種類など
を変換することにより、その生産効率を上昇させること
ができた。
尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使
用する。
用する。
Ａ アデニン
Ｃシトシン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ 相補ｃＤＮＡ
ＲＮＡ リボ核酸
ｍＲＮＡ 伝令ＲＮＡ
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ
デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ デオキシ
グアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオキシチミジン三
リン酸ｂｐ 塩基対 ｋｂｐ キロ塩基対 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ デオキシ
グアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオキシチミジン三
リン酸ｂｐ 塩基対 ｋｂｐ キロ塩基対 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（以下余白）
実施例１
第１表の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。
参考例に記載したヒト インターロイキン１前駆体ポリ
ペプチドをコードするクローン化ｃＤＮＡが組み込まれ
た組み換え体プラスミドｐＨＬ４がら、 制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化し、第５表に示した塩基
配列の第３９８〜８０８番目までに相当するＤＮＡ断片
を単離した。
ペプチドをコードするクローン化ｃＤＮＡが組み込まれ
た組み換え体プラスミドｐＨＬ４がら、 制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化し、第５表に示した塩基
配列の第３９８〜８０８番目までに相当するＤＮＡ断片
を単離した。
このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｃ］及び［Ｄ］で示され
る２種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
り、ＮＡ断片を、５Ｄ−ＩＬ１断片という、但し、式［
Ｃ］の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、
下記式［ａ］〜［ｅｌで示される５種類のＤＮＡ断片を
、順次結合させて作製したＤＮＡアダプターである（以
下化学合成りＮＡ ［Ｃ］と記す）。
る２種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
り、ＮＡ断片を、５Ｄ−ＩＬ１断片という、但し、式［
Ｃ］の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、
下記式［ａ］〜［ｅｌで示される５種類のＤＮＡ断片を
、順次結合させて作製したＤＮＡアダプターである（以
下化学合成りＮＡ ［Ｃ］と記す）。
３’ −ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ式［Ｄ
］の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。
］の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。
別途に、古谷らの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 。
Ｒｅｓ、 。
１３巻、５８６９頁（１９８５） ］に従って作製した
形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、制限酵素旦り土工と
旦ａｍＨＩにて消化し、ｍプロモーター領域部分及びア
ンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮＡ断片（以下、
ベクター断片という）を単離した。
形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、制限酵素旦り土工と
旦ａｍＨＩにて消化し、ｍプロモーター領域部分及びア
ンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮＡ断片（以下、
ベクター断片という）を単離した。
このベクター断片と上述の５Ｄ−ＩＬＬ断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、新規形質
発現プラスミドを構築した。この形質発現プラスミドを
ｐＨＩＰＨ３８３ａと名づけな（第り図参照）。
ＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、新規形質
発現プラスミドを構築した。この形質発現プラスミドを
ｐＨＩＰＨ３８３ａと名づけな（第り図参照）。
また、上記の方法に従い、ただし化学合成りＮＡ ［Ｃ
］を構成する断片［ｂｌの代わりに、下記式で示される
ＤＮＡ断片、 ［１］〜［７コのいずれかを用いること
により、それぞれ形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３
ｂ、 ｐＨＩＰＨ３８３ｃ、ｐＨＩＰＨ３８３ｄ、
ｐＨＩＰＨ３８３ｅ、ｐＨＩＰＨ３８３ｆ、ｐＨＩＰＨ
３８３ｇ及びｐＨＩＰＨ３８３ｈを構築することができ
る。
］を構成する断片［ｂｌの代わりに、下記式で示される
ＤＮＡ断片、 ［１］〜［７コのいずれかを用いること
により、それぞれ形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３
ｂ、 ｐＨＩＰＨ３８３ｃ、ｐＨＩＰＨ３８３ｄ、
ｐＨＩＰＨ３８３ｅ、ｐＨＩＰＨ３８３ｆ、ｐＨＩＰＨ
３８３ｇ及びｐＨＩＰＨ３８３ｈを構築することができ
る。
以下に、形質発現プラスミドの名称と、その構築に用い
る上記のＤＮＡ断片［ｂｌに代わる各々のＤＮＡ断片（
［１コ〜［７コ） の塩基配列を示す。
る上記のＤＮＡ断片［ｂｌに代わる各々のＤＮＡ断片（
［１コ〜［７コ） の塩基配列を示す。
ｐＨＩＰＨ３８３ｂ構築用ＤＮＡ断片：５’−ＧＴＡＡ
ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡ ［１］３°
−ＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣｐＨＩＰＨ３８
３ｃ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩＰＨ３８３ｄ構築用ＤＮ
Ａ断片：ｐＨＩＰＨ３８３ｅ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩ
ＰＨ３８３ｆ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩＰ）Ｉ３８３ｇ
構築用ＤＮＡ断片：ｐ）（ＩＰ８３８３ｈＰＨ３８３ａ
断片：５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＡ
［７］３’−ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＡＴＡＣ実施例２ ヒトインターロイキン１の 造 実施例１で得た形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３ａ
を、次の方法に従って大腸菌８８１０１株に導入し形質
転換体を作製した。
ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡ ［１］３°
−ＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣｐＨＩＰＨ３８
３ｃ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩＰＨ３８３ｄ構築用ＤＮ
Ａ断片：ｐＨＩＰＨ３８３ｅ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩ
ＰＨ３８３ｆ構築用ＤＮＡ断片：ｐＨＩＰ）Ｉ３８３ｇ
構築用ＤＮＡ断片：ｐ）（ＩＰ８３８３ｈＰＨ３８３ａ
断片：５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＴＡ
［７］３’−ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴ
ＡＴＡＡＴＡＣ実施例２ ヒトインターロイキン１の 造 実施例１で得た形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３ａ
を、次の方法に従って大腸菌８８１０１株に導入し形質
転換体を作製した。
即ち、大腸菌８８１０１株をＬＢブロスに接種し、 ３
０℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の１ｍｌを１００
ｍ１のＬＢブロスに接種し、濁度（波長６００ｎｍの吸
光度）が約０．６になるまで、３０℃で培養した。この
培養液を、氷水中で３０分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取した。この菌体を５０ｍ１の５０ ｍ Ｍ
Ｃａ Ｃ１２４；＝再懸濁させ、氷水中で６０分間静
置したのち、遠心分離にて菌体を採取し２０％グリセリ
ンを含む５０ｍＭ ＣａＣｌ２の１０ｍ１Ｇ：：Ｍｆｆ
ｉさせた。
０℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の１ｍｌを１００
ｍ１のＬＢブロスに接種し、濁度（波長６００ｎｍの吸
光度）が約０．６になるまで、３０℃で培養した。この
培養液を、氷水中で３０分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取した。この菌体を５０ｍ１の５０ ｍ Ｍ
Ｃａ Ｃ１２４；＝再懸濁させ、氷水中で６０分間静
置したのち、遠心分離にて菌体を採取し２０％グリセリ
ンを含む５０ｍＭ ＣａＣｌ２の１０ｍ１Ｇ：：Ｍｆｆ
ｉさせた。
この懸濁液に、上記の形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３
８３ａを添加し、氷水中で２０分間、室温で１０分間処
理したのち、ＬＢブロスを加え、３７℃で６０分間振盪
培養した。その菌体懸濁液の一定量を、 ２５μｇ ／
ｍ ］濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天平板（寒天
濃度１．５％）に播き、３７℃で一夜培養したのちアン
ピシリン耐性クローンを得た。この形質転換体を、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産菌（ＨＢ １０
１／ｐＨＩＰＨ３８３ａと名づける）とした。
８３ａを添加し、氷水中で２０分間、室温で１０分間処
理したのち、ＬＢブロスを加え、３７℃で６０分間振盪
培養した。その菌体懸濁液の一定量を、 ２５μｇ ／
ｍ ］濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天平板（寒天
濃度１．５％）に播き、３７℃で一夜培養したのちアン
ピシリン耐性クローンを得た。この形質転換体を、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産菌（ＨＢ １０
１／ｐＨＩＰＨ３８３ａと名づける）とした。
ヒト インターロイキン１ポリペプチド生産菌ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＨＩＰＨ３８３ａを、ＬＢグロス中中子７℃一夜
培養したのち、その菌体懸濁液を約１００倍量の改良Ｍ
９培地に接種し、３７°Ｃで１時間培養した。更に、イ
ンドール−３−アクリル酸を最終濃度２０μｇ ／ ｍ
１になるように添加したのち、２４時間培養した。培
養終了後、遠心分離により菌体を採取し、０．１％リゾ
チーム及び３０ｍＭ ＮａＣ１を含む５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０＞に懸濁させ、氷水中
で３０分間静置したのちドライアイス／エタノール浴で
の凍結と３７°Ｃでの融解を繰り返して菌体を破壊した
。これに、１１５０容量の１０％ポリエチレンイミンを
加えて静置ののち、遠心分離にて菌体残金等を除いた抽
出液を得た。
Ｉ／ｐＨＩＰＨ３８３ａを、ＬＢグロス中中子７℃一夜
培養したのち、その菌体懸濁液を約１００倍量の改良Ｍ
９培地に接種し、３７°Ｃで１時間培養した。更に、イ
ンドール−３−アクリル酸を最終濃度２０μｇ ／ ｍ
１になるように添加したのち、２４時間培養した。培
養終了後、遠心分離により菌体を採取し、０．１％リゾ
チーム及び３０ｍＭ ＮａＣ１を含む５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０＞に懸濁させ、氷水中
で３０分間静置したのちドライアイス／エタノール浴で
の凍結と３７°Ｃでの融解を繰り返して菌体を破壊した
。これに、１１５０容量の１０％ポリエチレンイミンを
加えて静置ののち、遠心分離にて菌体残金等を除いた抽
出液を得た。
この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を添
加し、静置ののち遠心分離により沈澱画分を採取した。
加し、静置ののち遠心分離により沈澱画分を採取した。
この沈澱を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８
，０）にて溶解し、同Ｍ衝液に対して十分透析した。こ
れを、同＊＊液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラムに負荷し、 同緩衝液にてカラムを
洗浄したのち、カラムに吸着したヒトインターロイキン
１ポリペプチドを、０〜０．５ＭのＮａＣ１濃度勾配に
て溶出した。インターロイキン１活性を有する画分を集
め、限外濾過にて濃縮したのち、セファクリルＳ−２０
０カラムを用いるゲル濾過により精製した。更に、この
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム及びセファク
リルＳ−２００カラムを用いた精製を繰り返すことによ
り、高度に精製した。
，０）にて溶解し、同Ｍ衝液に対して十分透析した。こ
れを、同＊＊液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラムに負荷し、 同緩衝液にてカラムを
洗浄したのち、カラムに吸着したヒトインターロイキン
１ポリペプチドを、０〜０．５ＭのＮａＣ１濃度勾配に
て溶出した。インターロイキン１活性を有する画分を集
め、限外濾過にて濃縮したのち、セファクリルＳ−２０
０カラムを用いるゲル濾過により精製した。更に、この
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム及びセファク
リルＳ−２００カラムを用いた精製を繰り返すことによ
り、高度に精製した。
１リツトルの培養により採取した菌体から、最終的に約
８５ｍｇの高度精製ヒトインターロイキン１ポリペプチ
ドが得られた。ここで得たヒトインターロイキン１ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を、蛋白分解酵素による断片化
と自動エドマン分解法により分析し、第１表の式［Ｉ］
に示されるアミノ酸配列と完全に一致することを確認し
た。
８５ｍｇの高度精製ヒトインターロイキン１ポリペプチ
ドが得られた。ここで得たヒトインターロイキン１ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を、蛋白分解酵素による断片化
と自動エドマン分解法により分析し、第１表の式［Ｉ］
に示されるアミノ酸配列と完全に一致することを確認し
た。
（以下余白）
参考例
特開昭６１−１４９０９２号に記載の方法で得たヒト
インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするク
ローン化ｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミド
ｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消化にて、
ｃＤＮＡ領域を切り出した。このｃＤＮＡがコードする
ヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドのアミノ
酸配列及びその塩基配列を第５表に示す。このクローン
化ｃＤＮＡを、制限酵素Ａ１ｕＩにて消化し、第５表に
示した塩基配列の第３５１番目から下流の約５３３ｂｐ
のＤＮＡ断片を単離し、得られたこの断片に更に制限酵
素ＢｓｔＮＩを作用させ、第５表の第３５１〜８０８番
目までに相当するＤＮＡ断片を単離した。
インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするク
ローン化ｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミド
ｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消化にて、
ｃＤＮＡ領域を切り出した。このｃＤＮＡがコードする
ヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドのアミノ
酸配列及びその塩基配列を第５表に示す。このクローン
化ｃＤＮＡを、制限酵素Ａ１ｕＩにて消化し、第５表に
示した塩基配列の第３５１番目から下流の約５３３ｂｐ
のＤＮＡ断片を単離し、得られたこの断片に更に制限酵
素ＢｓｔＮＩを作用させ、第５表の第３５１〜８０８番
目までに相当するＤＮＡ断片を単離した。
このＤＮＡ断片に、常法により化学合成した次式［Ｅ］
及び［Ｆ］で示されるオリゴヌクレオチドアダプターを
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。
及び［Ｆ］で示されるオリゴヌクレオチドアダプターを
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。
及び
５ ’−ＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡ
［Ｆコ３”−ＣＣＧＣＡＣＴ
ＡＣＴＴＣＧＡ ここで得たＤＮＡ断片は、ヒトインターロイキン１をコ
ードする塩基配列の両端に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
と終止コドン（ＴＧＡ）が付加された構造を有してい
る。このＤＮＡ断片を、ＨＩＬ−１断片という。
［Ｆコ３”−ＣＣＧＣＡＣＴ
ＡＣＴＴＣＧＡ ここで得たＤＮＡ断片は、ヒトインターロイキン１をコ
ードする塩基配列の両端に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
と終止コドン（ＴＧＡ）が付加された構造を有してい
る。このＤＮＡ断片を、ＨＩＬ−１断片という。
別途に、形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、制限酵素Ｃ
１ａＩ及びＨｉｎｄｍにて消化し、アンピシリン耐性遺
伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きなりＮ
Ａ断片を単離した。このＤＮＡ断片に、前述のＨＩＬ−
１断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。この形質発現プラスミドをｐＨＩ Ｐ
Ｈ３８３と名づけたく第２図参照）。
１ａＩ及びＨｉｎｄｍにて消化し、アンピシリン耐性遺
伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きなりＮ
Ａ断片を単離した。このＤＮＡ断片に、前述のＨＩＬ−
１断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。この形質発現プラスミドをｐＨＩ Ｐ
Ｈ３８３と名づけたく第２図参照）。
一方、プラスミドｐ ＣＴ−１［Ｉｋｅｈａｒａら、Ｐ
ｒｏｃ。
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ｔｌｓＡ、 ８
１巻、５９５６頁（１９８４） ］を制限酵素ＡａｔＩ
［とＣ１ａＩで消化して、ｍプロモーター領域からエエ
ｚＬのＳＤ配列領域に ゛わたる約４２０ｂｐのＤＮＡ
断片を切り出して、単離した。
１巻、５９５６頁（１９８４） ］を制限酵素ＡａｔＩ
［とＣ１ａＩで消化して、ｍプロモーター領域からエエ
ｚＬのＳＤ配列領域に ゛わたる約４２０ｂｐのＤＮＡ
断片を切り出して、単離した。
このＤＮＡ断片に、前述のＨＩＬ−１断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させた。得られたこのＤＮＡ断片
を、プロモーターＨＩＬ断片という。
リガーゼを用いて結合させた。得られたこのＤＮＡ断片
を、プロモーターＨＩＬ断片という。
別途に、プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素人ｖａＬと
Ｐｖｕｌｌにて消化し、得られた大きなりＮＡ断片（約
３．７ｋｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、
ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント）及
びｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰを用いて
平滑末端とした後、その両端をＴ４ＤＮＡリガーゼにて
結合させ、ｐＢＲ３２２の複製開始点近傍のコピー数制
御領域を欠失させたプラスミドベクター（ｐＢＲ３６と
いう）を作製した。
Ｐｖｕｌｌにて消化し、得られた大きなりＮＡ断片（約
３．７ｋｂｐ）を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、
ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント）及
びｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰを用いて
平滑末端とした後、その両端をＴ４ＤＮＡリガーゼにて
結合させ、ｐＢＲ３２２の複製開始点近傍のコピー数制
御領域を欠失させたプラスミドベクター（ｐＢＲ３６と
いう）を作製した。
このプラスミドベクターｐＢＲ８６を制限酵素ＡａｔＩ
［とＨｉｎｄｍにて消化し、得られた大きなりＮＡ断片
（約３．６ｋｂｐ）を単離し、このＤＮＡ断片に前述の
プロモーターＨＩＬ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させることにより、ヒトインターロイキン１ポリペ
プチド生産用形質発現プラスミドを構築した。この形質
発現プラスミドをｐＨＩＬ７３８３と名づけな。
［とＨｉｎｄｍにて消化し、得られた大きなりＮＡ断片
（約３．６ｋｂｐ）を単離し、このＤＮＡ断片に前述の
プロモーターＨＩＬ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させることにより、ヒトインターロイキン１ポリペ
プチド生産用形質発現プラスミドを構築した。この形質
発現プラスミドをｐＨＩＬ７３８３と名づけな。
（以下余白）
第５表
ヒト インターロイキン１前駆体をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列及びアミノ酸配列ＭｅｔＡｌａＬｙｓＶａｌ
ＰｒｏＡｓｐＭｅｔＰｈｅＧｌｕＡｓｐＡＴＧＧＣＣＡ
ＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣ（３
０）ＬｅｕＬｙｓＡｓｎＣｙｓＴｙｒＳｅ ｒＧｌｕＡ
ｓｎＧｌｕＧｌｕＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧ
ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡ （６０）ＡｓｐＳｅ ｒ
ｓｅ ｒｓｅ ｒ Ｉ １ ｅＡｓｐＨｉ ５ＬｅｕＳ
ｅ ｒＬｅｕＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＣ
ＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧ （９０）ＡｓｎＧｌｎＬｙｓ
ＳｅｒＰｈｅＴｙｒＨｉｓＶａｌＳｅｒＴｙｒＡＡＴＣ
ＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＴＡＡＧＣＴＡ
Ｔ （１２０）ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＨｉ ｓＧｌｕＧｌ
ｙｃｙｓＭｅ ｔＡｓｐＧｌｎＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡ
ＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡ （１５０）
ＳｅｒＶａｌＳｅｒＬｅｕＳｅｒｌｌｅＳｅｒＧｌｕＴ
ｈｒＳｅｒＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣ
ＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴ（１８０）ＬｙｓＴｈｒＳｅｒＬ
ｙｓＬｅｕＴｈｒＰｈｅＬｙｓＧｌｕＳｅｒＡＡＡＡＣ
ＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣ
（２１０）ＡＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＡＡ
ＣＧＧＧＡＡＧＧＴＴ （２４０）ＬｅｕＬｙｓＬｙｓ
ＡｒｇＡｒｇＬｅｕＳｅ ｒＬｅｕＳｅ ｒＧｌ ｎＣ
ＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴ（１，ＡＧＴ’ＴＴ
ＡＡＧＣＣＡＡ（２７０）ＳｅｒｌｌｅＴｈｒＡｓｐＡ
ｓｐＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｌａｌｌｅＴＣＣＡＴＣＡＣ
ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣ（３０
０）ＡｌａＡｓｎＡｓｐＳｅｒＧｌｕＧｌｕＧｌｕＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡ
ＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧ（３３０）ＰｒｏＡｒｇＳｅ
ｒＳｅｒＰｒｏＰｂｅｓｅｒＰｈｅＬｅｕｓｅｒＣＣＴ
ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡ
ＧＣ（３６０）ＡｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅ
ＭｅｔＡｒｇｌｌｅｌｌｅＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＡ
ＡＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣ（３９０）Ｌｙｓ
ＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＬ
ｅｕＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡ
ＣＧＣＣＣＴＣ（４２０）ＡｓｎＧｌｎＳｅｒｌｌｅＩ
ｌｅＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｓｐＧｌｎＡＡＴＣＡＡＡＧ
ＴＡＴＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧ（４５
０）ＴｙｒＬｅｕＴｈｒＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＨｉ
ｓＡｓｎＬｅｕＴＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡ
ＴＴＡＣＡＴＡＡＴＣＴＧ（４８０）ＡｓｐＧｌｕＡｌ
ａＶａＩＬｙｓＰｈｅＡｓｐＭｅｔＧｌｙＡｌａＧＡＴ
ＧＡＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧ
ＣＴ（５１０）ＴｙｒＬｙｓＳｅｒＳｅｒＬｙｓＡｓｐ
ＡｓｐＡｌａＬｙｓＩｌｅＴＡＴＡＡＧＴＣＡＴＣＡＡ
ＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＴＴ（５４０）Ｔｈｒ
ＶａｌＩｌｅＬｅｕＡｒｇｌｌｅＳｅｒＬｙｓＴｈｒＧ
ｌｎＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡ
ＡＡＣＴＣＡＡ（５７０）ＬｅｕＴｙｒＶａｌＴｈｒＡ
ｌａＧｌｎＡｓｐＧｌｕＡｓｐＧｌｎＴＴＧＴＡＴＧＴ
ＧＡＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡ（６０
０）ＰｒｏＶａｌＬｅｕＬｅｕＬｙｓＧｌｕＭｅｔＰｒ
ｏＧｌｕＩｌｅＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡ（６３０）ＰｒｏＬｙｓＴｈ
ｒｌｌｅＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｓｎＣＣＣ
ＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡ
ＡＣ（６６０）ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕ
ＴｈｒＨｉｓＧｌｙＴｈｒＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴ
ＧＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴ（６９０）Ｌｙｓ
ＡｓｎＴｙｒＰｈｅＴｈｒＳｅｒＶａｌＡｌａＨｌｓＰ
ｒ。
の塩基配列及びアミノ酸配列ＭｅｔＡｌａＬｙｓＶａｌ
ＰｒｏＡｓｐＭｅｔＰｈｅＧｌｕＡｓｐＡＴＧＧＣＣＡ
ＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡＧＡＣ（３
０）ＬｅｕＬｙｓＡｓｎＣｙｓＴｙｒＳｅ ｒＧｌｕＡ
ｓｎＧｌｕＧｌｕＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧ
ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡ （６０）ＡｓｐＳｅ ｒ
ｓｅ ｒｓｅ ｒ Ｉ １ ｅＡｓｐＨｉ ５ＬｅｕＳ
ｅ ｒＬｅｕＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＣ
ＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧ （９０）ＡｓｎＧｌｎＬｙｓ
ＳｅｒＰｈｅＴｙｒＨｉｓＶａｌＳｅｒＴｙｒＡＡＴＣ
ＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＴＡＡＧＣＴＡ
Ｔ （１２０）ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＨｉ ｓＧｌｕＧｌ
ｙｃｙｓＭｅ ｔＡｓｐＧｌｎＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡ
ＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡ （１５０）
ＳｅｒＶａｌＳｅｒＬｅｕＳｅｒｌｌｅＳｅｒＧｌｕＴ
ｈｒＳｅｒＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣ
ＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴ（１８０）ＬｙｓＴｈｒＳｅｒＬ
ｙｓＬｅｕＴｈｒＰｈｅＬｙｓＧｌｕＳｅｒＡＡＡＡＣ
ＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣ
（２１０）ＡＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＡＡ
ＣＧＧＧＡＡＧＧＴＴ （２４０）ＬｅｕＬｙｓＬｙｓ
ＡｒｇＡｒｇＬｅｕＳｅ ｒＬｅｕＳｅ ｒＧｌ ｎＣ
ＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴ（１，ＡＧＴ’ＴＴ
ＡＡＧＣＣＡＡ（２７０）ＳｅｒｌｌｅＴｈｒＡｓｐＡ
ｓｐＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｌａｌｌｅＴＣＣＡＴＣＡＣ
ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣ（３０
０）ＡｌａＡｓｎＡｓｐＳｅｒＧｌｕＧｌｕＧｌｕＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡ
ＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧ（３３０）ＰｒｏＡｒｇＳｅ
ｒＳｅｒＰｒｏＰｂｅｓｅｒＰｈｅＬｅｕｓｅｒＣＣＴ
ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡ
ＧＣ（３６０）ＡｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅ
ＭｅｔＡｒｇｌｌｅｌｌｅＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＡ
ＡＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣ（３９０）Ｌｙｓ
ＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｌａＬ
ｅｕＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡ
ＣＧＣＣＣＴＣ（４２０）ＡｓｎＧｌｎＳｅｒｌｌｅＩ
ｌｅＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｓｐＧｌｎＡＡＴＣＡＡＡＧ
ＴＡＴＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧ（４５
０）ＴｙｒＬｅｕＴｈｒＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＨｉ
ｓＡｓｎＬｅｕＴＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡ
ＴＴＡＣＡＴＡＡＴＣＴＧ（４８０）ＡｓｐＧｌｕＡｌ
ａＶａＩＬｙｓＰｈｅＡｓｐＭｅｔＧｌｙＡｌａＧＡＴ
ＧＡＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧ
ＣＴ（５１０）ＴｙｒＬｙｓＳｅｒＳｅｒＬｙｓＡｓｐ
ＡｓｐＡｌａＬｙｓＩｌｅＴＡＴＡＡＧＴＣＡＴＣＡＡ
ＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＴＴ（５４０）Ｔｈｒ
ＶａｌＩｌｅＬｅｕＡｒｇｌｌｅＳｅｒＬｙｓＴｈｒＧ
ｌｎＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡ
ＡＡＣＴＣＡＡ（５７０）ＬｅｕＴｙｒＶａｌＴｈｒＡ
ｌａＧｌｎＡｓｐＧｌｕＡｓｐＧｌｎＴＴＧＴＡＴＧＴ
ＧＡＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡ（６０
０）ＰｒｏＶａｌＬｅｕＬｅｕＬｙｓＧｌｕＭｅｔＰｒ
ｏＧｌｕＩｌｅＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧ
ＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡ（６３０）ＰｒｏＬｙｓＴｈ
ｒｌｌｅＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｓｎＣＣＣ
ＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡ
ＡＣ（６６０）ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕ
ＴｈｒＨｉｓＧｌｙＴｈｒＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴ
ＧＧＧＡＡＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴ（６９０）Ｌｙｓ
ＡｓｎＴｙｒＰｈｅＴｈｒＳｅｒＶａｌＡｌａＨｌｓＰ
ｒ。
ＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣ，ＡＧＴＴＧＣＣ
ＣＡＴＣＣＡ（７２０）ＡｓｎＬｅｕＰｈｅｌｌｅＡｌ
ａＴｈｒＬｙｓＧｌｎＡｓｐＴｙｒＡＡＣＴＴＧＴＴＴ
ＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣ（７５０
）ＴｒｐＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＧｌｙＰｒｏ
ＰｒｏＳｅｒＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴ（７８０）ＩｌｅＴｈｒＡｓｐ
ＰｈｅＧｌｎＩｌｅＬｅｕＧｌｕＡｓｎＧｌｎＡＴＣＡ
ＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡ
Ｇ（８１０）Ａ１ａ＊＊＊ ＣＧＴＡＧ （以下余白）
ＣＡＴＣＣＡ（７２０）ＡｓｎＬｅｕＰｈｅｌｌｅＡｌ
ａＴｈｒＬｙｓＧｌｎＡｓｐＴｙｒＡＡＣＴＴＧＴＴＴ
ＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣ（７５０
）ＴｒｐＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＧｌｙＰｒｏ
ＰｒｏＳｅｒＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴ（７８０）ＩｌｅＴｈｒＡｓｐ
ＰｈｅＧｌｎＩｌｅＬｅｕＧｌｕＡｓｎＧｌｎＡＴＣＡ
ＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡ
Ｇ（８１０）Ａ１ａ＊＊＊ ＣＧＴＡＧ （以下余白）
第１図は、形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３ａの構
築工程を示す。図中の合成りＮＡアダプター［Ｃ］と［
Ｄ］は、実施例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチ
ド アダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３の構築
工程を示す。 図中の合成りＮＡアダプター［Ｅ］と
［Ｆ］は、参考例に記載した化学合成オリゴヌクレオチ
ドアダプターである。 特許出願人 大日本製薬株式会社
築工程を示す。図中の合成りＮＡアダプター［Ｃ］と［
Ｄ］は、実施例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチ
ド アダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドｐＨＩＰＨ３８３の構築
工程を示す。 図中の合成りＮＡアダプター［Ｅ］と
［Ｆ］は、参考例に記載した化学合成オリゴヌクレオチ
ドアダプターである。 特許出願人 大日本製薬株式会社
Claims (13)
- （１）ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列の上流に、 下記式［Ａ］で示される塩基配列を有する ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 式［Ａ］ ［式中、Ｘは（Ａ）ｘを意味し、ｘは１〜５を表わす。 Ｙは（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０
又は１を表わす。 ３’側のＡＴＧは翻訳開始コドンを意味す る。］ - （２）ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列の上流に、下記式の塩基配列を有す
るＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 - （３）特許請求の範囲第１項又は２項記載のＤＮＡの上
流に、大腸菌菌体内で転写を制御 するプロモーター活性を有するＤＮＡが付 加されたＤＮＡ。 - （４）プロモーターが、トリプトファンオペロンのプロ
モーターである特許請求の範囲 第３項記載のＤＮＡ。 - （５）ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコードす
るＤＮＡが、下記式［ I ］で示さ れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであ る特許請求の範囲第１〜４項記載のＤＮ Ａ。 【遺伝子配列があります。】式［ I ］ - （６）特許請求の範囲第１〜５項記載のＤＮＡが、大腸
菌菌体内で自律増殖可能なプラス ミドに組み込まれた組み換え体プラスミ ド。 - （７）プラスミドが、ｐＢＲ３２２又は、少なくともそ
の自己複製を司る塩基配列領域を 含むプラスミドである特許請求の範囲第６ 項記載の組み換え体プラスミド。 - （８）組み換え体プラスミドが、ｐＨＩＰＨ３８３ａで
ある特許請求の範囲第７項記載の 組み換え体プラスミド。 - （９）組み換え体プラスミドが、ｐＨＩＰＨ３８３ｂ、
ｐＨＩＰＨ３８３ｃ、ｐＨＩＰＨ ３８３ｄ、ｐＨＩＰＨ３８３ｅ、ｐＨＩＰ Ｈ３８３ｆ、ｐＨＩＰＨ３８３ｇ又はｐＨ ＩＰＨ３８３ｈである特許請求の範囲第７ 項記載の組み換え体プラスミド。 - （１０）特許請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載の
組み換え体プラスミドにより形質転 換された大腸菌。 - （１１）特許請求の範囲第１０項記載の大腸菌を培養す
ることを特徴とするヒトインターロ イキン１ポリペプチドの製造法。 - （１２）特許請求の範囲第１１項記載のヒトインターロ
イキン１ポリペプチドが特許請求の 範囲第５項記載の式［ I ］で示されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドの製造法。 - （１３）ヒトインターロイキン１ポリペプチドを大腸菌
菌体内で発現させるに際し、リ ボゾーム結合部位として特許請求の範囲第 １項の式［Ａ］からなる塩基配列を利用す ることを特徴とするヒトインターロイキン １ポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292739A JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292739A JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01137977A true JPH01137977A (ja) | 1989-05-30 |
| JP2616784B2 JP2616784B2 (ja) | 1997-06-04 |
Family
ID=17785699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62292739A Expired - Lifetime JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2616784B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5756675A (en) * | 1988-07-29 | 1998-05-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives |
-
1987
- 1987-11-19 JP JP62292739A patent/JP2616784B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J,BIOTECHNOL=1985 * |
| NUCLEIC,ACIDS,RES=1986 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5756675A (en) * | 1988-07-29 | 1998-05-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2616784B2 (ja) | 1997-06-04 |
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