JPS5991887A - 改良発現ベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 ＲＮＡＩのブロモータ．ＤＮＡ＆製を開始するためのプ
ライマＲＮＡの１ロモータおよびその訪専体よりなる群
から選択される少なくとも／釉のプロモータを特徴とす
る発現制御配列と。

ＲＮＡＩおよびＤＮＡ複製を開始するためのプライマＲ
ＮＡならびにその制御領域を暗号化するベクターのレプ
リコン内の１）ＮＡ配列とからな９，前ｉｉｉＤＮＡ配
列は改変なしのベクターに比較して適当な宿主における
ベクターのコピー数を増大させかつ前記ベクターの発現
制御配列のｆｌＩＩＪ御下で遺伝子およびＬ）ＮＡ配列
の発現を増幅させる少なくとも／つの改変と，所望のポ
リペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を前記ベクター中に
挿入して前記発現制御配列に作用結合させうる少なくと
も７つの制限部位とを有することを特徴とする改良発現
ベクターにつき開示する。これらベクターを使用すれば
，有用な原始核および成熟核ポリペプチドを暗号化する
ＤＮＡ配列を発現させて、これらポリペプチドを適当な
宿主中にて高収率で生産させることができる。

本発明は，改良発現ベクターおよびこれらベクターの製
造方法ならびにベクターを使用するクローン化遺伝子の
発現方法に関するものである。この明細書中に開示され
るベクターおよび方法は、原始核宿主におけるクローン
化遺伝子、特に成熟核に由来する遺伝子の改良発現を勢
徴とする。以下の記載から判るように，これらベクター
および方法を使用して宿主細胞におけるｊ− 各柚のポリベプチド，蛋白質およびアミノ酸の生産を改
善することができる。

宿主細胞における蛋白質の生産レベルは３つの主要な因
子によｐ支配される；すなわち細胞内におけるその遺伝
子のコピー数、これら遺伝子コピーが転写ざれる効率，
および得られるメツセンジャーＲＮＡ　（　［ｍＲＮＡ
Ｊ　）が翻訳される効率である。転写および翻訳（こ扛
らは一緒になって発現を構成する）の効率は、一般に所
望の暗号化配列もしくは遺伝子の前方に位置するヌクレ
オチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列また
は発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互作用
して転写を開始する位置（プロモータ配列）と、リポソ
ームがｍＲＮＡ（転写の生産物）に結合しかつこれと相
互作用して翻訳を開始する位置とを規定する。

必らずしも全ての発現制御配列が同等の効率をもって機
能するとは限らない。たとえば、所望の蛋白質に対し％
異的な暗号化配列もしくは遺伝子を隣接ヌクレオチド配
列から分離して。

４　− これを他の発現制御配列に融合させ、よシ高度な発現レ
ベルｔ−得ることがしはしば有利である。

これが達成された後、新たに作成されたＤＮＡ断片會よ
υ多いコピー数のプラスミドまたはバクテリオファージ
誘導体に挿入して、細胞内における遺伝子コピーの個数
を増大式せかつそれにより発現蛋白質の収率を向上させ
ることができる。

通常、無毒な遺伝子生産物でさえその過度の生成は宿主
細胞に対し有害であシ、かつ特定宿主ベクター系の安定
性を低下させるので、発現制御配列はクローン化遺伝子
の転写および翻訳の効率を向上させる他、さらに細菌増
殖の際の発現を変調させるように制御することができる
。

たとえば、制御可能な発現制御配列は、遺伝子生成物の
過剰の蓄積なしに借主細胞を繁殖させうるように作用さ
せかつ次いで多量の所望蛋白質生産物の発現を促進する
よう作用させうるものであって、これらは発現制御配列
の制御下にある。

上ｄピの幾つかの＆準を満足させる数種の発現％Ｉｊ御
配タリを使用して、細菌宿主において蛋白質およびホリ
ベフチドを暗号化するＤＮＡ配列および遺伝子を発現さ
せている。たとえは、これらはイー・コリの乳糖オペロ
ンのオペレータ。

プロモータならびにリポソーム結合および相互作用配列
管包含し〔たとえば、ケー・イタクラ等、「大腸菌にお
けるホルモンソマトスタチンに対する化学合成遺伝子の
発現」、サイエンス誌、第１りを巻、第１０ｊぶ〜ｊｊ
Ｊｊ（／り７７）；ディー−グイ−・グデル等、「大腸
菌ｔこおけるひとインシュリンの化学合成遺伝子の発現
」。

プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン
ス・ロＳＡ、第７を巻、第１θｔ〜１０頁（／Ｐ７９）
Ｌさらにイー−コリのトリプトファン合成＃紮糸の対応
配列〔ジエー・ニス・エムターゲ等、「インフレンザ抗
涼決定子は大腸菌においてクローン化されたヘマグルチ
ニン遺伝子から発現される」、ネーチャー誌、第、２ｊ
３巻、第／７／〜７参負（／りｌＯ）；ジエーφニー・
マーシャル尋、「ひと成長ホルモン：補完的ＤＮＡクロ
ーン化および細菌における発現」。

サイエンス誌、第、２Ｑ！巻、第６６．２〜Ｏ４頁（ｌ
り７２）〕およびファージλの主要オペレータおよびプ
ロモータ領域〔エッチ・ベルナートｅ、ｒバクテリオフ
ァージλのＰムプＩ：Ｉ−Ｔ：一タからの遺伝子発現を
促進するプラスミドクローン化ベヒクルの作成」、ジー
ン誌、第！巻１Ｍ！２〜７を頁）；ヨーロッパ特許出願
第参７７６７号明細書〕を包含する。

コリシンＥＩゲノム（ＣｏｌＥＩ）からのプライマＲＮ
ＡおよびＲＮＡＩに対するプロモータも知られている〔
イー・エム・ウオング等。

「ｃｏｌＥＩＱ感温性コピー数突然変異種はプラスミド
ゲノムの未翻訳領域に位置する」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７２
巻、第３５７Ｑ〜７４！頁（ｉｙｒコ年を月）〕。本発
明の発現ベクターおよび方法に有用であるプロモータの
群のうちには、これら一種のプロモータ、すなわちプ２
− ライマＲＮ　Ａに対するプロモータ（以下［Ｐｍ　Ｊと
叶ぶ）およびＲＮＡＩに対するプロモータ（以下ｒＰｔ
Ｊと呼ぶ）が存在する。プロモータｐＩの感温性コピー
数突然変異種も知られている〔イー・エム・ウオング等
、上記〕。このプロモータも１本発明に、有用なもので
ある。

プロモータＰ「およびＰｉｎは構成的であると考えられ
、すなわちこれらはりプレノサの制御下になく、シたが
ってこれらに作用結合された遺伝子の発現を継続的に促
進する。さらに、プロモータＰｍは突然変異によって明
らかに強化される〔イー・エム・ウオング吟、上ｍｌ〕
。

本発明Ｆｉ、改良発現ベクターおよびクローン化遺伝子
の発現方法に関するものである。さらに詳細には１本発
明はＲＮＡＩのプロモータ、ＤＮＡ複製を開始するため
のプライマＲＮＡのプロモータおよびその誘導体よりな
る群から選択される少なくとも／ａｌのプロモータを％
徴とする発現制御配列と、ＲＮＡＩおよびＤＮＡ＠ｌｌ
１Ｉ′ｆｔ：開始するためのプライマＲＮＡならびにそ
の制御領域を暗号化するベクターのレプリコン内のＤＮ
Ａ配列とからなシ、前ＨピＤＮＡ配列は改変なしのベク
ターに比較して適当な宿主におけるベクターのコピー数
を増大させかつ前記ベクターの発現制御配列の制御下で
遺伝子およびＤＮＡ配列の発現を増幅きせうる少なくと
も１つの改変と、所望のポリペプチドを暗号化するＤＮ
Ａ配列を前記ベクター中に挿入して前記発現制御配列に
作用結合させうる少なくとも７つの制御部位とを有する
ことを特徴とする改良発現ベクターを提供する。

より好ましくは、本発明の発現ベクターはＲＮＡＩのプ
ロモータ、ＤＮＡ複製を開始するためのプライマＲＮＡ
のプロモータおよびその誘導体よりなる群から選択され
る少なくとも７種のプロモータを特徴とする発現制御配
列と。

ＲＮＡＩおよびＤＮＡａ製を開始するためのプライマＲ
ＮＡならびにその制御領域を暗号化するベクターのレプ
リコン内におけるａｏｌＥＩ−ｖ５導ＤＮＡ配列とから
なシ、前記ＤＮＡ配列はｐＢＲＪ、２．２の位ｔｒｉ　
３０λりにおける少なくとも１つの突然変異を特徴とし
、この突然変異は適当な宿主において突然変異のないベ
クターに比較してベクターのコピー数を約ｊ倍増加させ
ると共に、発現ｆｆ＋制御配列の制御下で遺伝子および
１）　Ｎ　Ａ配列の発現を壇幅させ、さらにＰＡ望ポリ
ペプチドを暗号化するＤＮＡ配列をＡｉｌ記ベクター中
に挿入してこれを前ｄピ発現制御配列へ作用結合させう
る少なくとも１つの制限部位を特徴とする。

本発明の詳細な説明から判かるように、本発明の発現ベ
クターおよび方法は５本発明の発現ベクターの制限部位
に挿入されかつこれを適当な宿主における前記ベクター
の発現制御配列に作用結合させたＤＮＡ配列により暗号
化される原始核および成熟核生産物の高レベルの発現を
可能にする。

本発明を一層良く理解するよう、　以下詳細に説明する
。

本明卸１書において次の用語を使用する：ヌクレオチド
：　糖部分（ペントース）と燐酸と含窒索被累環塩基と
よりなるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマ一単位。この塩基
はグリコシド炭素（ペントースの／′炭素）を介して糖
部分に結合され、塩基と糖との結合をヌクレオシドと呼
ぶ。塩基はヌクレオチドを特性化する。μ種のＤＮＡ塩
基はアデニン（ｒＡＪ）、グアニン（ｒＧＪ　）ｂ　シ
トシン（ｒｃＪ　）およびチミン（ＩＴＪ　）である。

≠種のＲＮＡ塩基はＡ。

Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵＪ　）である。

ＤＮＡ配列：　隣接ペントースの３′炭素と、ｔ’炭素
との間でホスホジエステル結合により互いに結合された
ヌクレオチドの線状列。

コドン：　雛型、すなわちメツセンジャーＲＮＡ（［ｍ
ＲＮＡＪ　）を介しテアミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（トリプレ
ット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌクレオチドトリプレ
ットＴＴＡ。

ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ
酸ロイシン（ｒＬ６ｕＪ　）を暗号化し、ＴＡＧ。

ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ま７ｃＡＴ
Ｇは翻訳開始信号である。

ポリペプチド：　隣接アミノ酸のα−アミノ基とカルボ
キシ基との間でペプチド結合によシ互いに結合されたア
ミノ酸の線状列。

遺伝子：　　ｍＲＮＡ　ｉ介して特定ポリペプチドに特
性的なアミノ酸の配列を暗号化する１）ＮＡ自己夕ＩＪ
。

転　写：　遺伝子またはＤＮＡ配列からｍＲＮＡを生成
する過程。

翻　訳：　　ｍＲＮＡからポリペプチドを生成する過程
。

発　現：　ポリペプチドを生産するためにＤＮＡ配列ま
たは遺伝子により行なわれる過程。

これは転写と翻訳との組合せである。

プラスミド：　宿主細胞において１ラスミドが複製され
るような完全「レプリコン」からなる非染色体二重鎖Ｄ
ＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物に挿入すると、この
生物の特性はプラスミドのＤＮＡの結果として変化し、
すなわち形質転換することができる。たとえば、テトラ
サイクリン耐性（Ｔａｔ”　）に関する遺伝子を有する
プラスミドは、テトラサイクリンに感受性である細胞を
テトラサイクリンに対し耐性である細胞へ形質転換させ
る。プラスミドま九はベクターにより形質転換された宿
主細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

７アージまたはバクテリオイアージ：　その多くが蛋白
質エンベロブまたはコート（「カプシド」）にカプセル
化されたＤＮＡ配列よシなる細菌性ウィルス。

クローン化ベヒクルまた鉱ベクター：　宿主細胞中で複
製することができるプラスミド、７アージＤＮＡまたは
その他のＤＮＡ配列であって、７個もしくは少数のエン
ドヌクレアーゼ認識部位または制限部位を特徴とし、こ
の部位においてこれらＤＮＡ配列を、ＤＮＡの本質的生
物学機能たとえばコート蛋白質の複製、生産の喪失を伴
わずに或いはプロモータもしくは結合部位の損失を伴わ
ずに、決定可能に切断することができかつ仁の部位は形
質転換細胞の同定に使用するのに適した標識、たとえば
テトラサイクリン耐性寸たはアンピシリン耐性を有する
。

クローン化：　ｌ拙の生物もしくは配列から無性繁殖に
より防専される生物もしくはＤＮＡ配列の集洛を得る過
程。

組換１）Ｎ大分子またはヒプリド１）ＮＡ　：　　生細
胞の外部で端部結合されており、かつ他の宿主細胞に感
染してそこに維持される能力を有する柚々異なるゲノム
（細胞もしくはウィルスの全ＤＮＡ）からのＤＮＡ断片
よシなる分子。

発現制御配列：　遺伝子またはＤＮＡ配列に作用結合さ
せた場合、これら遺伝子またはＤＮＡ配列の発現を制御
しかつ調整するヌクレオチドの配列。「作用結合」とい
う用語は、所望生産物を暗号化する遺伝子もしく１−ｉ
ＤＮＡ配列の前方に適当な開始信号を有しかつ正確な読
枠を維持して１発現制御配列の制御下で挿入ＤＮＡ配列
の発現を可能にすると共に、この遺伝子またはＤＮＡ配
列により暗号化されｆｃ所望生産物の生成を可能にする
ことを意味する。

説明の宿主−発現ベクターの組合せには。

多数の入手しうる周知の宿主細胞のいずれを使用しても
よい。特定宿主の選択は、当業界で周知された多くの因
子に依存する。これらは、たとえば選択発現ベクターと
の適合性、ヒプリドプラス建ドによシ暗号化される蛋白
質の毒性。

所望蛋白質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およ
びコストなどを包含する。これら因子のバランスは、必
ずしも全ての宿主が本発明の発現ベクターおよび方法に
おいて特定ＤＮＡ配列の発現に対し同等に有効である・
とは限らないという理解に一致する。　　　、 これらの一般的指針において、有用な宿主はイー・コリ
、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母
およびその他の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿・主
、たとえば培養物における動物（ひとを含む）もしくＦ
ｉ植物細胞。

或いは轟梨昇で知られたその他の宿主を包合す７７− る。

本発明の特に好適な宿主細胞はイー・コリＨＢ１０／で
ある。その他のイー・コリ菌体における所望蛋白質生産
の収率は、ＨＢ１０／ｊｆｃおけるよシも低い。たとえ
ば、イー・コリＭＣ１０６／はＨＢ１０／よすもＰｔｒ
望蛋白質のずっと低い収率を与え、その他のイー・コリ
菌株扛中間の収率ｆ：与える。この宿生細胞の特異的効
果は、所望のＤＮＡ配列の転写もしく扛翻訳レベルにお
ける実際の差によるのでなく２種々異なるイー・コリ菌
株におけるグロテアーゼ一度のレベル変化によシもたら
される。たとえば、プ四テアーゼの高濃度を令するよう
な菌株においては、本発明の方法により生産される蛋白
質は恐らくより容易に分解して、よｐ少ない生産レベル
をもたらすと思われる。

本発明の発現制御配列 本発明の発現制御配列は、ＲＮＡＩのプロモータ、ＤＮ
人複製のためのプライマＲＮムのプロモータおよびその
誘導体よりなる群から選択−／ｒ− される少なくとも／独のプロモータを％徴とする。最初
の−２８（のプロモータを以下ＰＩおよびＰｍとそれぞ
れ呼ぶ。

本発明の好適具体例においてＰ！もしくはＰｍはｃｏｌ
　ＥＩ　　ＤＮＡから誘導されるが、これらプロモータ
はｐＢＲＪ２．２．Ｒ＋、ｏｌｏ　ＯＦ／Ｊおよびその
他の同様に編成されたレプリコンならびにその誘導体よ
シなる群から選択されるプラスミドから誘導することも
できる。さらに、本発明のプロモータは、プロモータの
強度を増大する野性型プロモータからの突然変異を有す
ることもできる。この種の突然変異は公知である〔イー
・エム・ウオング等、上記〕。さらに、本発明のプロモ
ータは、たとえばｌａａ　、　ｔａａ　。

ｔｒｐ、ＰＬおよびそれらの組合せのようなその他公知
のプロモータと組合せることもできる。

さらに１本発明の発現制御配列は、たとえばシャインー
ダルガルノ配列のようなオペレータ、リボンーム結合お
よび相互作用配列ならびにこれら発現制御配列に作用結
合された遺伝子およびＤＮＡ配列の発現の制御に関連す
るその他のＤＮＡ配列配列像特徴る。たとえばこの釉の
配列ｉｊ、　Ｍ８．２　、　ｍｕ　、バクテリオファー
ジ゛ｒ７゜ファージλおよびその他の同様な系からの配
列を１有する。特に好１しくは、バクテリオファージＴ
７からの配列を本発明の発現ベクターに１史用する。

さらに、本発明の発現ベクターは、ＲＮＡＩお工びＤＮ
Ａ袂裂全開始させるためのプライマＲＮ　Ａならびにそ
の制御領域を暗号化するベクターのレンリコン内におけ
るＤＮＡ配列を特徴とする。さらに、本発明によれば、
このＤＮＡ配列は少なくとも１つの改変を特徴とし、こ
の改変はそのような改変のないベクターに比較してベク
ターのコピー数を適轟な宿主において増加させると共に
、ベクターの発現制御配列の制御下に遺伝子およびＩ）
ＮＡ配列の発’ｆｉｌｔね・幅し、すなわちその増幅以
上においてコピー数からの結果は増大する。本発明の特
に高いコピー数および増幅された発現配列は部外的でな
いが１本発明の好適ベクターにおいて改変はｐＢＲＪ−
２，２の位［Ｊ　Ｏコタにおける突然変異でちゃ、すな
わちその位置におけるＧＣ対とＡＴ対との交換である。

さらに、この改変は感温性突然変異もしくは改変でろっ
てもよい。最後に５本発明の他の具体例においてこの改
変はベクターのプライマＲＮ人に対する制御領域の削除
である。

本発明の発現ベクターにおいて、この改変を生ぜしめか
つ選択するには種々の方法がある。

これらは当業者に周知されている。特に一般的には、こ
れらの方法は、高コピー数改変を選択し１次いでこれら
改変を分析してそれらがさらに本発明のベクターの発現
制御配列の制御下で遺伝子およびＤＮＡ配列の発現を増
幅するかどうかを決定することに依存する。本発明の具
体例において、突然変異は自然の突然変異である。

これは、親ベクターによｐ形質転換させてアンピシリン
耐性にしたアンピシリン感受性のイー・コリ宿主におい
て、β−ラクタマーゼ生産レベルを監視することにより
選択された。

いかなる３！Ｕ論にも拘束されないが、本発明の改変は
、発現ベクターのコピー数を増幅させる他、さらにプロ
モータｐｘおよびＰｍからの遺伝子発現を増幅させるこ
とが可能である。したがって、これらプロモータを特徴
とする発現＄制御配列に作用結合された遺伝子およびＤ
ＮＡ配列の発現レベルを増大させ、これら配列を若干強
化させ、或いはこれらを宿主細胞中で抑制解除すること
ができる。

最後に１本発明の発現ベクターは、遺伝子もしくはＤＮ
Ａ配列をベクター中へ挿入してこれをベクターの発現制
御配列に作用結合させうる少なくとも１個の制限部位を
特徴とする。この種の制限部位は周知されている。これ
らはたとえば、桓目、り髪１．シ」■、垣ＲＩ。

Ｂａｎ　ＨＩ　、　Ｈｉｎｄ　［１およびＳａｕ　Ｊ　
ａを包含する。

本発明のベクターをこの制限部位で開裂させかつこの部
位へＤＮＡ配列を挿入し、この配列をベクターの発現制
御配列に作用結合させる方法も周知されている。

本発明のベクターの使用方法 本発明のベクターによシ発現させうるＤＮＡ配列は、原
始核もしくは成熟核ポリペプチドを暗号化する多種類の
ＤＮＡ配列から選択することができる。たとえば、この
種の配列は動物およびひとホルモン、たとえば各棟のＩ
ＦＮ−α、特にα２．ｄｊ、ｄＪ、α７．　α１％　Ｉ
ＰＮ−β、ＩＦＮ−７，ひとインシュリンおよび成長ホ
ルモン、牛成長ホルモン、豚成長ホルモンおよびエリス
ルホイエチン、ひと血液ファクターおよびグラスミノー
ゲン、ウィルスもしくは細菌性抗原、たとえばＨＢＶの
核もしくは表面抗原またはＦＭＤＶの抗原ならびに原始
核もしくは成熟核起原のその個有用なポリペプチドを暗
号化することができる。特に好ましくは、α型インタ７
エロンが使用される。

本発明の発現ベクターにおいて、これらＤＮＡ配列を発
現しかつこの配列によシ暗号化されたポリペプチドを生
産する方法は周知されている。

これらは、適尚な宿主をベクターの発現制御配列に作用
結合された所望のＤＮＡ配列金有する発椀ベクターで形
質転換させ、この宿主を適尚な重石条件下で培養し、か
つ培養物から所望ポリペプチドを１収することを含む。

特に好塘しくは、宿主細胞を足常期に到達させた振、ｂ
Ｔ望のポリペプチドを回収する。当梨省に１本発明の範
囲から逸脱することなく、特定の遺伝子発現に対し特に
効果的である方法を公知の方法から選択することができ
る。

本発明を二層よく理解するよう、以下の実施例によｐ本
発明を説明するが、これのみに限定されない。

方法および相科 全ての制限酵素、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼは、ニュー・イングランド・ビオラブ社
から購入し喪。これら酵素反応の条件は、エヌ・パナヨ
タトスおよびアール・ディー・ウェルズによシジャーナ
ルーバイオロジカル・ケミストリー％第一２！４１％、
第ｊ１１！〜ｊ／貞（／り７り）ならびにエヌ・パナヨ
タトスおよびアール・ディー・ウェルズによりジャーナ
ル・モレキュラー・バイオロジー。

ｗＪ／　Ｊ　７巻、ｉｆ／〜１０りＪ（（／？７Ｐ）Ｋ
記載されている。必袂に応じ、その後の反応のためＤＮ
Ａをエーテル抽出および次いでＥｔＯＨ沈澱によりｇ製
した。アガロースおよびポリアクリルアミドのゲル電気
泳動はパナヨタトスおよびウェルズ、上記に配賦された
ように行なった。

ポリメラーゼニー大型断片（ベーリンガー社）（［クレ
ノーＪ）による「充填」反応は１．２０ｍＭトリス−Ｍ
ＣＩ　（ＰＨ７ｊ　）、／　ＯｍＭＭｇＣｌｔ。

０）ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．コｊ’ｍＭジチオスレイトー
ルおよびそれぞれＡＯｍＭの一種のデオ鹸ジヌクレオチ
ドトリホスフェート（ジグｉ−社）において３７℃で３
０分間行なった。

β−ラクタマーゼ活性を測是するため、１ＩＩＬｔの細
胞培養物をリゾチームによシＯ℃で３０分間処理し１次
いで凍結−解凍を１回行なった。

順次増加する量の溶菌細胞溶液を、ｏ、ｔＭの燐酸塩緩
衝液（ｐＨ７，０）中にＩＯ／Ｊｌ１７ｍｌの亘トロセ
フイン（グラクツ・リサーチ社）を含有するキュベツト
へ加えた。＄ｊＪｓ＋ｍにおける吸光度の経時的増加を
分光光度法により追跡し友。

初期割合を使用して、β−ラクタマーゼ活性のレベルを
決定した。

実施例１ 第７図＆ｉ、本発明の発現ベクターの製造および徒用方
法の１例を示している。

ｐＶ［ｊ／、すなわちｏｏｌＥＩの誘導体〔ヴイーψヘ
ルシフィールド等、ｒミニ−ＣｏｌＥＩプラスｉドの特
性化」、ジャーナル・パクテリオロジー、第／２１．巻
、第４！４！７〜ｊ３頁（ｌり７ｔ）；ニー・才力、「
小１ａｏｌ）ＥＩ誘導体のヌクレオチド配列；自己複製
およびコリシンＥ！免疫性に対する必頭領域の構造」、
モレキュラー・ゼネラ尤・ジエネテイツク、第１７コ巻
、第１ｊ／〜！り頁（ｌり７り）〕をＡｌｕ　Ｉによ）
制限し、ＰＩプｐモータとＲＮＡＩを暗号化するＤＮＡ
配列のン部とを鳴する鈍端、２よ！塩基対断片をポリア
クリルアミド夛ル（７１上での電気泳動によって単離し
た（第１図）。

次いで、ｐＮＫｓ−タフ〔エヌ・パナヨタトスおよびケ
ー・トルオング、［予備選択塩基の間のＤＮＡ配列の特
異的削除」、ヌクレイツク・アシッドφリサーチ、第２
巻、第ｊｔｌ、７り〜すｒ頁（／りＪ’／））ｉｓａｌ
Ｉで制限し、上方端部を８Ｉによって除去し、得られた
断片をＩＦＮ−αコを暗号化するＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡ断片へ結合させた（第１図）。この作成は、加工部
位を再生しない。寧ろ、これはＡＴＧ開始コドン（バク
テリオファージＴ７断片から）を有する４Ｊ４造をもた
らし、このコドンはＩＦＮ−αコの最初のアミノ酸を暗
号化するＴＧＴコドンに結合している（第１図）。さら
に、この構造は、ＩＦＮ−αコの最初のアミノ酸のＴＧ
Ｔコドンに続くシ＋ｕＪＡＩ制限部位を特徴とする。

この構造をｐＮＫ８り７−αコと命名した。所望生成物
を暗号化するその他のＤＮＡ配列を、同様にして或いは
当業界で周知のその他の方法を用いて、ｐＮＫｓり７の
Ｓａｌ　Ｉ部位に挿入し、これを本発明全実施するため
次のように使用することができる。

次いで、ｐＮＫｓり７−α、２を匣ＲＩでｆ１１１Ｊ限
し、旦ｃｏ　ＲＩ残基に慣用方法でクレノーおよびｄＮ
ＴＰ金充填し、この充填部位へ鈍端人１ｕ　Ｉ断片を上
記のように慣用方法で結合させて膀）ｔＩ部位を再生さ
せた（第１図）。

この結合ｎ＊　ＰｌプロモータとバクテリオファージＴ
７の／グ、７〜／！、０％領域から採取された／／、２
ｂｐ断片を特徴とする発現制御配列〔バナヨタトスおよ
びトルオング、上記）　ｉ　ＲＮＡ　１およびＤＮＡ複
製を開始するためのプライマＲＮＡならびにその鯛整領
域を暗号化するベクターのデプリコン内におけるＤＮＡ
配列；およびベクターの発現制御配列に作用結合された
ＩＦＮ−αコを暗号化するＤＮＡ配列からなる組換ＤＮ
Ａ分子を生成した（第７図）。この組換ＤＮＡ分子をｐ
Ｐｌ−Ｔ、−αコと命名した。

さらに、上ｎピと同様にｐＶ’）（ｊ／の、２ｊｊ塩基
対Δ腹Ｉ断片を単離し、かつこれをｐＮＫｓり７のとＲ
Ｉ制限および上方端部へのクレノー／ｄＮＴＰの充填に
より調製された断片へ結合させることにより、ベクター
ｐＰ１−Ｔｙｉ調製した。第１図に図示しないこのベク
ターは、プロモータＰＩおよびバクテリオファージＴ７
からのＤＮＡ配列を特徴とする発現制御配列；ＲＮＡＩ
およびＤＮＡ１！製を開始するためのプライマＲＮＡな
らびにその制御領域を暗号化するベクターのレプリコン
内におけるＤＮＡ配列；および所望ポリペプチドを暗号
化するＤＮＡ配列をベクターのＴ７領域およびこの配列
のＡＴＧ開始コドンの直後においてベクター中へ挿入し
てプロモータＰ１に作用結合させうるシ已工制限部位を
特徴とする。

イー・コリＨＢ／θｌをＰＰｆ　−Ｔ７−αコにょｐ慣
用の条件を用いて形質転換させ、この形質転換宿主をｐ
Ｈ７３にてゆり〈シ振とぅしながら極めて僅かに通気し
て培養し、インタ７エｐンを生成させた。　たとえば、
振とりフラスコにおいてＬ−プｏｘ（ｐ）１７ｊ）を使
用し、ｉｔｏ〜−コリ− ，２００ｒｐｍで振とうさせ、かっ殆んど一杯のフラス
コに対しできるたけ通気を減少させた。収量：　３　ｘ
　／　０６単位１０　ｉ）／／　。

＊　ｐＰｌ　−Ｔｙ−ａ−２ｕ、ｌ細胞当りｆｉ−２０
個のコピーを有することが確認された。

ｐＰｔ　−Ｔｚ−αコの嶋コピー突然変異ｆｉＩＩを作
成するため、慣）４３栄件を用いてイー・コリＫ　／　
、２ＭＯを形質転換させ、この培養物を−ｏｍｙ／ｍｅ
のメチシリンを補充したし一プロス／寒大板に接種した
。次いで、これら緑天板上に増殖した集落の幾つかを選
択し、これらを上記と同様にメチシリンを補充した他の
塵天板へ接種した。

第一の寒天板上に増殖した乗＃をランダムに選択して、
これらをニトロセフイン（グラクン社）によりβ−ラク
タマーゼ生産につき試験した。

ｐＰ、−Ｔ、−α２の高コピー数を有する集落はこの分
析において大きな赤色斑点を示し、したがってこの組換
ＤＮＡ分子の天然の高コピー突然変異種を選択すること
ができた。この尚コピー突然変異体の／　ｆｍを選択し
、そのコピー数が親ベクターよりも約５倍多いことを確
認した。この突然変異種のβ−ラクタマーゼ生産は、予
想通９．親ベクターにおけるよりも約５倍多いものであ
った。

次いで、慣用のマキサムーギレパード技術を用いて天然
突然変異の領域におけるｐＰＩ−Ｔ、　−αコを配列決
定し、この突然変異が配列（ｐＢＲｌ、２．２）の位［
ｊ　Ｏλりに現われ、この場合ＧＣ塩基対はＡＴ塩基対
と交換されていることを確認した（第１図）、この突然
変異は、ＲＮＡＩを暗号化するＤＮＡ配列に生ずる。こ
の高コピー突然変異種をｐＰＩ−Ｔ、−α、２　（ｏｏ
ｐ−）と命名した（第１図）。

実質的に同じ方法でｐＰＩ−Ｔ、を用いて。

ＩＦＮ−αコを暗号化するＤＮＡ配列を持たない同じ高
コピー突然変異種を調製した。この発現ベクターをＰＰ
Ｉ　−Ｔｙ　（ｃｏｐ−）と命名する。

第弘図に示したこの発現ベクターは、　Ｐｒプロモータ
を特徴とする発現制御配列と、ＲＮＡＩおよびＤＮＡ複
製を開始するためのプライマＲＮ　Ａならびにその制御
領域を暗号化するベクターのレプリコン内におけるＤＮ
Ａ配列とを特徴とし、この１）ＮＡ配列はｐＢＲｊ、２
．２の位置３０コタにおけるＡＴ対ＧＣの塩基対突然俊
異紫特徴とし、この突然変異は突然変異のないベクター
に比較して急当な宿主においてベクターのコピー数を増
加させると共に、ベクターの発現制御配列の制御下に遺
伝仔およびＤＮＡ配列の発現を増幅し、さらに所望のボ
リペフ゛チドを暗号化するＤＮＡ配列をベクター中へ挿
入してこれをこのベクターのｐ１発現制御配列に作用結
合させうるルはＩ制御部位を特徴とする。

７９ｒ望のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を塾↓
！部位へ挿入して、これらＤＮＡ配列をベクターの発現
制御配列へ作用結合させるためＫ　ＰＰＩ　−Ｔ？　（
ｃｏｐ−）を［接に使用することもできるが、好ましく
は所望のＤＮＡ配列を低コピー親プラスミドｐＰＩ−Ｔ
７中へ挿入し１次いで所望の篩コヒーおよび発現増幅変
異柚を選択し、或いは低コピー制御領域をその他のベク
ターで予め選択されたＣｏｐ−領域と交換する（たとえ
ば第３図）。

慣用条件を用いてイー・コリＨＢ１０／ｆｐＰ１−Ｔ、
−α２　（ｏｏｐ−）で形質転換させ、とれを前■ヒと
同様に緩徐な増殖の条件下＜　−７，ｒ　ｓ／４０〜コ
００ｒｐｍ、振とりフラスコにおける少ない通気、或い
は発酵槽におけるＰＩ−１７，？）で培養した。′　収
量：　２〜ｒ　ｘ　／　０部単位１０　Ｄ／ｌ。

本最適収量を得るために形質転換培養物の増殖を遅くす
るのが重要であると思われる。

発酵槽において、これは−を約乙ｒＫ調整するだけで行
なわれる。

したがって、親菌株を用いて生産されるインタフエロン
のレベルに比較して、高コヒー突然変異種を使用すれば
インタフエロンの収ｆｔ拡約、２００倍増加した。コピ
ー数の増加は遺伝子の発現において僅か約３倍の増加に
過ぎないので（これはプロモータｐｉの制御下にないβ
−ラクタマーゼについてと同様である）。本発明の発現
ベクターはコピー数を増加させるだけでな一、３Ｊ−＋
− く、さらにプロモータＰ！からの遺伝子発現を増幅させ
ると信じられる。

実施例λ 第一図は１本発明の発現ベクターの製造および使用方法
の他の具体例を図示している。

ここでも、ｐＶＩ（ｔ／　［ヘルシフィールド勢、上記
］１視工■′で制限した。今回は、Ｐｍプロモータとプ
ライマＲＮＡを暗号化するＤＮＡ配列の１部とを有する
鈍端−タを塩基対断片を前記と同様に電気泳動によって
単離した。次いで。

この断片を前記と同様にＰ、を有するＡ槙１断片につき
ｐＮＫ８り７−αコの熱ユＲＩ部位へ挿入した。得られ
たベクターをｐＰｍ−Ｔ、−αコと命名した。イー・コ
Ｉ）ＨＢ１０／へ形質転換させかつ前記と同様に培養す
ると、　　ＰＰ、、−Ｔ７−αコはインタフエロンを生
成した。収ｔｔ１０ｘ１０’単位１０Ｄ／／、ここでも
、仁のプラスミドは約２０個のコヒー／細胞を有した。

さらにｈ　ＰＰ１−Ｔ７につき前ｄｄシたと＃１は同じ
手順を用いて。

発現ベクターｐＰｍ−Ｔ７を陶製した。

−３グー ｐｐｍＴ７−α、２　（’ＪたはｐＰｍ　−Ｔｙ　）の
高コピー突然変異種を得るため、前記と同様に処理して
メチシリン上での増殖およびニトロセフインを用いる選
択によって天然突然変異種を選択した。この場合も１選
択した突然変異種はｐＢＲＪ、２２の位匝３０．２りに
おいてＧＣ塩基対とＡＴ塩基対とを交換した。”　　Ｉ
ＦＮ−αコのＤＮＡ配列を有する高コピー突然変異種を
ｐｐｍ１’、−ａ　２　（ｃｏｐ−）と命名した。ｐｐ
ｍ−’ｒ、の高コピー突然変異種をｐｐｍ−Ｔｙ　（ｃ
ｏｐ−）と命名した。

これを第３図に示す。この場合も、ｐｐｍ−’ｒｙ（ｏ
ｏｐ−）を使用してＤＮＡ配列を直接に５ａｌＩ部位へ
挿入しうるが、好ましくは遺伝子挿入のため低コピー親
ベクターを使用し１次いで得られた組換ＤＮＡ分子を突
然変異またはクローン化によって高コピーかつ発現増幅
改変種まで改変させる（たとえば第３図）。

＊この手順を用いて天然の高コピー突然変異種を選択す
る都度、同一の突然変異種を選択した。

緩徐な増殖条件下で前記と同様にイー・コリＨＢ１０／
を形質転換させかつ発酵させると、形質転換細胞はイン
タフエロンを生成した。収：！ｔ：０．７〜Ｊ　ｘ　／
　０’単位１０Ｄ／ｌ！。　この場合も−ｐＰｍ−Ｔｙ
−α−２（ｃｏｐ−）を用いるインタフエロンの生産レ
ベルは、親菌株のレベルの約２００倍であった。β−ラ
クタマーゼ生産（ベクターにおけるＩＦＮ−αコとは異
なる制御配列の制御下における）はｐｐｍ−Ｔ２−　α
２　（ｅｏｐ−）において僅か約ｊ倍だけ増加したので
、　　ｐＰｍ　−Ｔｙ−α、２　（ｏｏｐ−）における
突然変異はコピー数を増加させると共にベクターにおけ
るＰｍからの遺伝子発現のレベルをも増加させるよう作
用すると信じられる。

実施例３ 第３図は１本発明の発現ベクターの製造および使用方法
に関する他の具体例を図示している。

先ず、低コピー数の組換ＤＮＡ分子をクローン化させ、
次いでこの分子を高コピー数の増幅された発現まで改変
するのが好ましいと判明したので、前記のｐＰｌ−Ｔｙ
−αコを４副ＲＩ／Ｂｇｌｌｌおよび５ａｕＪＡＩで制
限し、かつｐｐｘ　−Ｔｙ−αコのＴ７配列とＩＦＮ−
α−の最初のアミノ酸を暗号化するＴＧＴコドンとを有
する約／／ｊ塩基対の４ｘｏＲＩ／加ＪＡＩ断片を単離
した（第３図）。

次いで％　ｐｐｒ−Ｔｙ−αコを且すエおよび部分的に
ＥａｏＲＩで制限して、ＰＸプロモータを有するＥａｏ
ＲＩ−リ±工断片を単離した（第３崗）。ベクター中に
多数の５ａｕＪＡＩ部位が存在するので、この制限方法
を使用した。

次いで、これら２つの断片をＩＦＮ−α７を暗号化する
断片（その最初のアミノ酸を暗号化するＴＧＴコドンを
除く）と結合させた。ＩＦＮ−α７を有しかつＩＦＮ−
α７の最初のアミノ酸を暗号化するＴＧＴコドンの直後
のＢｇｌ　３１部位を特徴とするｐＢＲＪ、２．２から
誘導された組換ＤＮＡ分子を制限化することによｆｉ、
　　ＩＦＮ−α７断片を生成させた（第３図）。′＊μ
已ｎ部位はシ、ｕＪＡＩ部位に補完的であ３７− る。

この３つの部分からなる結合Ｆｉ、、アンピシリン耐性
を暗号化する遺伝子（β−ラクタマーゼ）の再編成と、
ＩＦＮ−α７を暗号化する遺伝子のＦ）編成とをもたら
した（第３図）。さらに。

ＩＦＮ−α７を暗号化する遺伝子は、ベクターのＴ７配
列の末端ＡＴＧ開始コドンに直接に融合されかつプロそ
一タｐｔに作用結合される。

この分子をＰｐｒ　−Ｔ、−α７（ａ）と命名した（第
３図）。ｒ（−）Ｊは、パリ４■部位から旦す■部位ま
で延在するベクターのレプリコンを有する配列が前記し
たｐＰＩ−Ｔｙ−αコのそれとは同一でないことを意味
する。何故なら、ＩＦＮ−α７暗号化配列を壱するｐｓ
ｉＩ／−シ已Ｂ断片におけるこの領域は、　　ｐＰｌ−
Ｔ、−α２における対応の領域とは同一でないからであ
る。

ｐＰｌＴ、−α７（ａ）の所望の高コピー突然変異種を
調製しかつ旦ｉｎｄ　［１部位からＰｓｔＩ部位まで延
在するベクターのレプリコンを廟スる配列をｐＰＩ　−
Ｔｙ−α、２　（ｃｏｐ　　ｊ”の配列に一致させるた
め、ｐｐｒ　−Ｔｙ　（（ｔｏｐ　−）　＊＊をシは！
で制限し、制限残基にクレノーおよびｄＮＴＰを充填し
、かつこの断片を旦ｓｔｌで制限し、そしてＲＮＡＩａ
ｏｐ″″突然変異を有する旦り−Ｉ−８ａｌ　Ｉ断片を
単離した（第３図）。この断片をｐＰｌ−Ｔ、−σ７か
ら旦りｄｌｌ制限によフｌ！Ｉｌｌ製された断片と結合
し、クレノーおよびｄＮＴＰを充填し１次いでＰｇｔＩ
で制限した（第３図）。

この結合は、高コピー数突然変異種によるｐＰＩ−Ｔｙ
−α７（ａ）の低コピー数領域の置換をもたらし、Ｈｉ
ｎｄ［１部位と且１」部位との間のベクターの領域をｐ
Ｐｌ　−Ｔ、−α、２　（ｃｏｐ−）の領域に同一とし
た。得られた組換ＤＮＡ分子をｐＰ、−Ｔ’７−α７　
（ａｏｐ−）と命名した。

＊この工程は、単に得られたベクターをｐｐＩ−Ｔｙ−
αコ（ｏｏｐ−）と比較するために行なった。これは、
ベクターの使用については必要とされない。

＊＊　ｐＰｌ　−ＴｙおよびｐＰＩ　−Ｔｙ−αコ（６
０Ｐ−）の−片り−Ｉ／ＡｖａＩ断片を交換することに
より、　　ＰＰＩ−Ｔｙ　（（ＩＯＰ−）を調製した。

同様にして、前記と同様にメチシリンおよびニトロセフ
イン法によりｐＮＫｓり７から調製しうるｐＮＫ８り７
（ａｏｐ）から所望のａｏｐ−断片を得ることができた
。

イー・コ＋）ＨＢＩＯ／の形質転換と前記したように緩
徐な増殖条件下における発酵との後。

ＩＦＮ−α７生産につき分析した。収ｉ：／〜ダ×７０
９単位１０Ｄ／１０ 本明細書中に記載した方法で作成した微生物およびベク
ターは、ツタ１２年２月ｌｊ日付けでメリーランド州ロ
ックビル在のアメリカン働タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託されて次のように同定された培養物を例と
する；Ｊ　Ｐ／　ＰＯイー・コリＭＣ／　０４　／　（
ＰＰＩ−Ｔｙ）３りｌざタ　　イー・コリＭＣ１ｏＡ／
（ｐＰｒ−Ｔｙ（ＯＯＰ−）） 以上１本発明の多くの具体例につき記載したが１本発明
の基本構成を改変して本発明の方法および構成を利用す
る他の具体例を与えることができる。したがって、上記
実施例に限定されることなく、本発明の範囲内において
多くの改変をなしうることか了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の発現ベクターの作成および使用方法の
ｌ具体例を示す略図であり、第２図は本発明の発現ベク
ターの作成および使用方法の他の具体例を示す略図であ
り、第３図は本発明の発現ベクターの作成および使用方
法のさらに他の具体例を示す略図であ）、第１図は本発
明の発現ベクターの７種であるｐｐＩ−Ｔｙ　（ｃｏｐ
−）の略図で６！？。 第５図は本発明の発現ベクターの別の１種であるｐｐｍ
−’ｒｙ　（ａｏｐ−）の略図である。 特許出願人　　バイオジエン　ナームローズベンノット
シャップ 出願人代理人　弁理士　浜　１）治　雄−参／− 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｌθ、ｌ フライ？扉Δ Ｈθ、４ ＝＝＝＝ｐｌ！ＩＲ３２２ −ｃｏｔｌ／ Ｆ／Ｇ、５ ζ在Ｊ ：＝＝＝＝ｐＨＮ　３２２ −　Ｃｏｌ　Ｅｌ ｍ■　ファージｒ２ ・　　　　ｃｏｐ一点史も灸叉 手続補正書（旅 昭和５８年ｌ１月７日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１６９５３１号 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 「而）　　　（オランダ領アンチル） ４、代理人 ６、補正の内容 ファージｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１３ＲＮＡＩのプロモータ、ＤＮＡＩ製を開始するた
   めのプライマＲＮＡのプロモータおよびその訪導体より
   なる群から選択される少なくとも／ａのプロモータを特
   徴とする発現制御配列と、ＲＮＡＩおよびＤＮＡ複製を
   開始するためのプライマＲＮＡならびにその□制御領域
   を暗号化するベクターのレプリコン内のＤＮＡ配列とか
   らなプ、前記ＤＮＡ配列は改変なしのベクターに比較し
   て適当な宿主におけるベクターのコピー数を増大させか
   つ前記ベクターの発現制御配列の制御下で遺伝子および
   ＤＮＡ配列の発現を増幅させる少なくとも１つの改変と
   、所望のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列を前記ベ
   クター中に挿入して前記発現−制御配列に作用結合させ
   うる少なくとも１つの制限部位を有することを特徴と一
   ／− する改良発租ベクター。 （２１ｎｉｌ　記改変がｐＨＲＪＪ−の位置！０２りに
   おけるＡＴ対ＧＣの突然変異、感温性高コピー数突然変
   異と削除とを含めその他の単一もしくけ枚数の突然変異
   よシなる群から選択されることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項記載の発現ベクター。 （３）前記改変がｐＢＲＪ、２．２の位ｔ　Ｊ　０−２
   ２におけるＡＴ対ＧＣの突然変異であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１．！Ｊｌ記載の発現ベクター。 （４）　　前記発現制御配列がさらにシャインダルガル
   ノ配列およびその他の発現関連配列を含め他の１０モー
   タ、オペレータ、リポソーム結合部位をｉ号化する配列
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３
   項のいず　　　　　゛れかに記載の発現ベクター。 （５）前記発現制御配列がさらにバクテリオファージＴ
   １のシャインダルガルノ配列を含めリボソーム結合部位
   を暗号化する配列を含むこ　ｊ　− とを特徴とする特許請求の範囲第≠項記載の発現ベクタ
   ー。 １６）　　ＰＰＩ　−Ｔ７　（００Ｐ−″）およびｐＰ
   ｍ−Ｔ７（ＯＯＰ−）よりなる群から選択されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   に記載の発現ベクター。 （７）前Ｈピベクター中にその制限部位において挿入さ
   れかつ発現制御配列に作用結合された成熟核もしくは原
   始核ポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列をさらに含む
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第６項のい
   ずれかに記載の発現ベクター。 （８）前記ＤＮＡ配列が、動物およびひとホルモン、ウ
   ィルスおよび細菌性抗原ならびにその他の成熟核もしく
   は原始核ポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配列よりなる
   群から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第７
   項記載の発現ベクター。 （９）　　前記ＤＮＡ配列が、ひとおよび動物インタ７
   エロン、ひとおよび動物成長ホルモン、ＦｌｖｌＤＶノ
   抗原、ｆｉ　４３　Ｖの抗原、ひとインシュリン、ひと
   血液因子およびプラスミノーゲン活性化剤およびエリス
   ロボイエチンＪ：Ｑなる群から選択されるポリペプチド
   を暗号化することを特徴とする請求 載の帖現ベクター。 （１１薯　　特♂’Ｌ　６Ｎ求の範囲第７項乃至弟２項
   のいずれかにｄ１載のベクターにより形質転換された宿
   主を培参しかつポリペプチドを回収することを特徴とす
   るポリペプチドの製造方法。