JPH01138453A - 電気泳動用グラジェントゲルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 ＤＮＡもしくは、ＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定す
る為の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法に関す
る、特に電気泳動分離用媒体液の塗布方法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
クリルアミドの高分子濃度グラジェントゲルは、二枚の
支持体の間に濃度の異なるゲルを電気泳動方向に層状に
形成させ、膜状物として用いられて来た。

しかしながら従来の層状に形成させる方法では■　連続
的な濃度変化を持たせたゲルが作製できない。■　濃度
の異なるゲル液を数多く準備する必要がある。■　ゲル
形成液がゲル化しないうちに狭いモールド中にゲル液を
注入しなければならないことで操作上高度の熟練を要す
る。という欠点があった。

近年電気泳動用グラジェントゲルを製造する装置として
、高濃度ゲル溶液の収納槽と、低濃度ゲル溶液の収納槽
と、内容積が可変可能な槽からなり前記両ゲル溶液を混
合する混合部と、前記再収納槽の底部と混合部とを連結
し前記両ゲル溶液を混合部に供給するゲル溶液供給路と
、このゲル溶液供給路に介設された送液手段と、この送
液手段に作動制御信号を出力し両ゲル溶液の送液量を制
御するとともに送液手段作動開始前に混合部に内容積可
変信号を出力する制御手段と、所定厚さの縦型矩型板状
で内部にゲル作製室を有するゲル作製部と、混合部外か
らな内部に一端が開口し他端が前記ゲル作製部外からそ
の下辺の全幅に等間隔でゲル作製室内に開口し混合部内
の混合液をそれぞれゲル作製室に供給する多数の混合液
供給路とを備えてなる濃度勾配作製装置（実開昭６２−
１１５１６２号公報参照）が開示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記の作製装置を用いてグラジェントゲ
ルを作製すると、■　高濃度ゲル溶液と低濃度ゲル溶液
の混合部での混合が不充分な為、濃淡勾配がはっきりし
ない。■　混合液の供給路による分割液量が等しくなら
ない為、ゲル作製部で、等分子量方向（巾方向）に均一
なゲルにならない等の問題点を有していた。

本発明の目的は上記問題点を解消し、等分子量方向（巾
方向）に均一で、且つ電気泳動方向に濃淡ウェブのはっ
きりした連続的な濃度勾配をもった電気泳動用グラジェ
ントゲルを安定性、再現性良く製造する方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の前記目的は、連続的に濃度勾配をもったモノマ
ー液と重合反応開始剤液とを混合しながら電気泳動分離
用媒体液としてゲル形成器に供給し、二枚のガラス板の
モールド中にゲルを形成する電気泳動用グラジェントゲ
ルの製造方法であって、該媒体液を該ゲル形成器供給口
よりスロット出口に到る間、幅方向を連続的に拡げ、厚
み方向を連続的に縮少して供給する過程を有することを
特徴とする、変性剤として尿素を含む電気泳動用グラジ
ェントゲルの製造方法によって達成される。

本発明において連続的に濃度勾配をもった七ツマー液と
は、連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液に
よって作られる。そしてそのモノマー液の濃度の変化と
しては３〜３５Ｗ／Ｖ％が好ましい。

本発明において混合する方法とては、−Ｃのタンク内で
攪拌機によって行ってもよいが、スタティックミクサー
による混合調液が好ましい。

スタティックミクサーとは、流体がミクサーの中に通さ
れる時、流体自身の運動により攪拌作用が生じるものを
いい、管状のものとしてはスパイラルチューブ、左右交
互らせん状、邪魔板入りプロペラ状等がある。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電気泳動分
離用媒体膜を作れるものであれば何でもよく、その代表
的なものとしては、アクリルアミドゲル、アガロースゲ
ル、澱粉ゲル、寒天ゲル等の原料となる液をいう。

ポリアクリルアミドゲル膜に含有させる変性剤としては
、少なくとも１個のカルバモイル基を持つ化合物を挙げ
ることができ、その具体例としては、尿素、ホルムアミ
ド等が挙げられる。これらのうちで尿素が特に好ましく
用いられる。変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性
ゲルの容積に対し、約４０　ｗ　ｔ　／　ｖ％から６０
　ｗ　ｔ　／　ｖ％の範囲で用いられる。尿素を用いる
場合には、単量体と架橋剤とを含む水性ゲル１１に対し
約６モル（約３６０ｇ）から飽和溶解量まで、好ましく
は約７モル（約４２０ｇ）から飽和溶解量までの範囲で
用いることができる。

媒体膜の厚みは分離の目的に応じて選ばれるが通常５０
μ慣から約１．０＋ｍ＋＋、好ましくは約２００μ霧か
ら約０．５ａｍの範囲とされる。

本発明における二枚のガラス板のモールド中に媒体液を
供給口よりスロット出口に到る迄幅方向を連続的に拡げ
厚み方向に連続的に縮少して提供するとは、供給口より
スロット状出口に到る媒体液流路を■　媒体液流路の縁
線を急激に変化・させることなく連続的に変化させる■
　幅を拡げる時はそれに対応して厚味を縮少する■　拡
張、収縮の角度を規制する等によって、流れ全体として
の渦流、滞留をさけることをいう。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。第１図は本発
明の電気泳動用グラジェントゲルの製造方法の工程図で
ある。

電気泳動分離用媒体液１２は、低濃度モノマー液ｌ、高
濃度モノマー液２、更に重合反応開始剤３をスタティク
ミクサー７内で攪拌・混合することによって調液される
。

第２図は本発明の濃・淡二種のモノマー液の流量比の関
係の説明図である。連続的に流量比をかえるということ
は、例えば当初高濃度モノマー液２は０Ｌ１２／ｌ１ｉ
ｎ、低濃度モノマー液１は　３８ｍｊ！／ｗｉｎの流量
比で始まるが、電気泳動用グラジェントゲルの製品長さ
を２とすると、図上、高濃度モノマー液２は実線で、低
濃度モノマー液１は点線で示すように流量を変え、合計
の流量は３８　ｍｌｌ　／ｗｉｎということで一定であ
るが、濃度は連続的に変化することになる。製品長さ２
の終りは高濃度モノマー液２は３８　ｍｆ／ｗｉｎ　、
低濃度モノマー液１はＯｍｊ！／ｗｉｎ　となり濃度の
濃い膜成分になっている。この様な流量比の変更を任意
のパターンで行うために、第１図において流量勾配送液
ポンプ４．５がパーソナルコンビエータ１１の指令によ
りコンピュータリンケージアダプタＩＱを経由してコン
トローラ９ａによって制御される。

一方重合反応開始剤液３は定流量送液ポンプ６によって
コントローラー９ｂに制御され一定量をスタティックミ
クサー７に送り込まれ、スタティックミクサー７内で低
濃度モノマー液１と高濃度モノマー液２そして重合反応
開始剤３は攪拌混合され電気泳動分離用媒体液１２が出
来る。電気法゛動分離用媒体液１２はゲル形成器８に供
給され、二枚のガラス板のモールド１３に供給される。

次に第３図（ａ）、（ｂ）は本発明のゲル形成器８の一
実施例の正面図及び側面断面図である。ゲル形成器８は
スタティックミクサー７からの電気泳動分離用媒体液１
２を供給口１４で受け、スロワ）１６を通じてスロット
開口１７より二枚のガラス板のモールド１３中に供給し
ている。

本発明の場合、供給口１４からスロット１６への塗布液
の供給が幅、厚味共に連続的に拡大、縮少させ、拡大、
縮少の角度を比較的ゆるやかにしなければならないため
、ゲル形成器８のスロットＩ６の長さが従来のものと比
較して長くなる。第６図は従来のゲル形成器を示したも
のである。

尚、第３囲い）において厚味方向の縮少の角度α、　　
　≦０．３５”が好ましい。第３図（ａ）はゲル形成器
を正面から見た断面図で、電気泳動分離用媒体液１２を
供給口１４よりスロット出口１７に到る間、スロワ）１
６の幅方向を連続的に拡げる状態を示す。理想的には図
中、点線で示すようにベンチュリー型に拡げるのが好ま
しいが、角度的規制より考えて工作を而単にするとすれ
ば拡がりの角度θ≦４０’に直線的にすることが一般に
用いられる。

二枚のガラス板のモールドを示したのが第４図。

二枚のガラス板のモールドをゲル形成器にセットした状
態を示したのが第５図である。

〔作　　用］ 本発明は連続的に濃度勾配をもったモノマー液と重合反
応開始剤液とを混合しながら電気泳動分離用媒体液とし
てゲル形成器に供給することによって、例えば、スタテ
ィックミクサーの攪拌力と自送力により前後の液の混合
がなく、ゲル形成器に送られる為、従来にない濃淡勾配
のはっきりしたゲルを安定して製造することが出来る。

更に又本発明は媒体液を供給口よりスロット状出口に到
る間幅方向に連続的に拡げ、それに伴って厚味方向に連
続的に縮少させることにより、急激な液流の拡張、縮少
をさけるため、具体的には■　液流路の緯線を連続的に
拡張する（例えばベンチュリーの様に）ことにより通路
の縁線に生じ゛る渦流（滞留）をさける。■　幅を拡げ
る時はそれに対応して厚味を縮少することによって各流
路にわたって均一な液抵抗になる。■　拡張、収縮の角
度を規制する、例えば液が拡がる時の角度θ≦４０°、
厚味方向の角度はα≦０．３５°゛とすることによって
渦流の発生を防ぎ、液の部分的滞留をなくするのである
。

これらによって横幅全体に亘って均一なゲルを得ること
が出来る。

〔実　施　例〕

本発明の実施例について第１図、第２図、を用いながら
説明する。

電気泳動分離用媒体液 低濃度モノマー液１として□■ アガロース・・・・・・・・・６５ｇ 尿素　・・・・・・・４．２００ｇ アクリルアミド・・・・・・　５４９ｇ１．３．５−）
リアクリ ロイル−へキサヒドロ− ３−トリアジン・・・・・・　５．７ｇ脱イオン水　　
ｕｐ　ｔｏ　９，０Ｏｈｊ！を作り高濃度モノマーとし
て□■ アガロース・・・・・・・・・４０ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・　１　、８３０ｇ１．３．５
−）リアクリ ロイル−へキサヒドロ− ３−トリアジン・・・・・・・１９ｇ 脱イオン水　　ｕｐ　ｔｏ　９．ＯＯＯｍｊ！を作り緩
衝液として□■ トリスヒドロギシメチル アミン　　　　・・・・・１２１．１４ｇはう酸　　　
　・・・・・６５．４ｇ エチレンジアミンテトラ 酢酸２ナトリウム塩・・・・７．４５ｇ脱イオン水　　
ｕｐ　ｔｏ　１，００（１／！を作り緩衝液■・・・・
・・・・・・・・７５０ｍ　１２．９χポリビニルピロ
リドン水溶液・８０ｈ　１２５　ｚＮ、　Ｎ、　　Ｎ’
、　Ｎ’−ｆ　）　ラメチルエチレンジアミン液・・・
・・・６．７ｍｊ２の混合液−■を 低濃度モノマー■９，０００ｍｊ！、高濃度モノマー■
９．ＯＯＯ＋ａｊ！の各々に加え、夫々を低濃度モノマ
ーｔ＆　１　、高濃度上ツマー液２とする。

次に重合反応開始剤液３として ２χｄｉ−２エチルへキシルスル ホサクシスート液・・・・・・１００ｎ＋　４２０．３
７５χリボフラビンリン酸 エステルナトリウム塩水溶液・１５０ｍ　１３．７５χ
ペルオキソニ硫酸ア ンモニウム水溶液・・・・・・１６０ｍ／！の混合溶液
を作り、夫々の３液をタンクに入れる。

流量勾配送液ポンプ４．５で低濃度モノマー液１、高濃
度モノマー液２の流量和を３８１１！／ｌ１ｉｎとし、
それに重合反応開始剤液３の流量２．９２＋／！／ｗｉ
ｎを定流量送液ポンプ６で、スタティックミクサー７内
に送液する。

スタティックミクサー７内では上記３液が自刃により混
合攪拌し、電気泳動分離用媒体液１２が出来る。

ゲル形成器８より電気泳動分離用媒体液１２が二枚のガ
ラス板のモールド１３中に供給される。

その時の低濃度モノマー液１と高濃度モノマー液２との
流量比は、第２図に示したとおりである。

上記によって作られた電気泳動分離用媒体液１２は幅１
ＢＣＩ、厚み２００μ−の二枚のガラス板のモールド中
に供給した。

実施例−１ この時のゲル形成器における幅方向の供給口よりスロッ
トへの拡がり角度θ−４０°、厚味の縮少角度α−０，
３５’にて行ったところ、幅方向に均一な濃度の良質の
ゲルが得られた。

比較例−１ 実施例−１と同様の塗布液濃度・温度で同様にして、拡
がり角度θ＝４５°縮少角度α＝０．５゜のゲル形成器
を用いてゲル形成を行ったところ、巾方向に放物線状の
濃度分布になった。

〔発明の効果］ 本発明は連続的に濃度勾配をもった七ツマー液と重合反
応開始剤液とを混合しながら、電気泳動分離用媒体液と
してゲル形成器に供給し、二枚のガラス板のモールド中
にゲルを形成する電気泳動用グラジェントゲルの製造方
法であって、塗布前のスタティックミクサー等の使用に
より濃度勾配の正確な安定した再現性の良い電気泳動用
グラジェントゲルの製造が可能になった。又ゲル形成器
に媒体を供給する際供給口よりスロット出口に到る間、
幅方向を連続的に拡げ、厚味方向を連続的に縮少して供
給することにより媒体液のゲル形成器内の滞留による異
物の発生はなくなり、又幅方向に均一な成分のゲル形成
が可能となり製品品質が一段と向上した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わる電気泳動分離用媒体液の製造工
程図、第２図は本発明に係わる電気泳動分離用媒体液の
濃度勾配、第３図は本発明に係わる正面図（ａ）、側面
図（ロ）、第４図は二枚のガラス板のモールドを示し、
第５図は二枚のガラス板のモールドをセットした図、第
６図は従来のゲル形成器の正面図を示す。 １・・・低濃度モノマー液 ２・・・高濃度モノマー液 ３・・・重合反応開始剤液 ４．５・・・流量勾配送液ポンプ ６・・・定流量送液ポンプ ７・・・スタティックミクサー ８・・・ゲル形成器 ９ａ、９ｂ・・・コントローラ １０・・・コンピュータリンケージアダプタ１１・・・
パーソナルコンピューター １２・・・電気泳動分離用媒体液 １３・・・二枚のガラス板のモールド １４・・・供給口　　　１６・・・スロット１７・・・
スロット開口 １日・・・ゲル形成器　１９・・・供給口２０・・・ス
ロット ２１・・・スロット出口 代理人　弁理士（８１０７）佐々木　清除”ｉ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 連続的に濃度勾配をもったモノマー液と重合反応開始剤
   液とを混合しながら電気泳動分離用媒体液としてゲル形
   成器に供給し、二枚のガラス板のモールド中にゲルを形
   成する電気泳動用グラジェントゲルの製造方法であって
   、該媒体液を該ゲル形成器供給口よりスロット出口に到
   る間、幅方向を連続的に拡げ、厚み方向を連続的に縮少
   して供給する過程を有することを特徴とする変性剤とし
   て尿素を含む電気泳動用グラジェントゲルの製造方法。