JPS63298047A - 電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡもしくは、ＤＮＡ部分分解物の塩基配
列を決定する為の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法に関する、特に電気泳動分離用媒体液の調液に関す
るものである。

〔従来の技術〕

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
クリルアミドの高分子濃度グラジェントゲルは、一枚の
支持体の上または二枚の支持体の間に濃度の異なるゲル
を電気泳動方向に層状に形成させ、膜状物として用いら
れて来た。

しかしながら支持体上にゲルを形成して用いる方法は、
支持体上にゲルを形成する時、泳動槽にセントする時、
ゲルの保存中、あるいは分析試料を添加するときなどに
誤まってゲルをこわしたり、試料以外のものをゲルの上
に落してゲルをｔ員なったりすること等があり、操作上
細心の注意と熟練が必要であった。

一方二枚のガラス板などでモールドをつくり、この中で
ゲルを形成させて、そのモールドを垂直に保ったま＼電
気泳動分析を行う垂直式電気泳動法においては、モール
ドの厚さを均一にすることは困難であったり、ゲル形成
液がゲル化しないうちに狭いモールド中にゲル液を注入
しなければならないことなど操作上高度の熟練を要して
いた。

特にＤＮＡの塩基配列決定操作においては、−枚のゲル
で出来るだけ多くのＤＮＡの断片を分析できるように長
いゲルを作ることが望ましいが、そのようなゲルはその
製造および取扱いが難しかった。また、ガラス板を用い
るために、そのガラス板が破損しやすいという欠点があ
った。

近年工業的に電気泳動用グラジェントゲル物質を製造す
る方法として、アクリルアミドモノマー及び架橋剤の混
合物の水溶液または水分散液を作り、光の照射を吸収し
、モノマーの重合を開始する遊離ラジカル発生物質を添
加した後、該溶液を所望のゲル生成物の形に形成し、形
成した溶液に光照射してモノマー溶液または、分散液を
重合させ架橋させる際、ゲルの多孔度を変えるためにモ
ノマー溶液に印加する光照射時間を調整する工程を含む
電気泳動グラジェントゲルの製法。（特開昭６１−２８
５１２号公報参照） さらに又単量体、架橋剤および重合開始剤を含有し、濃
度の相互に異る二種類の水溶液を混合比率を漸次変化さ
せながら混合しつつ成形器に導入し、該成形器中で単量
体と架橋剤との重合を完了させ、電気泳動方向に重合体
の濃度勾配を有する電気泳動用グラジェントゲルの製造
方法。（特公昭６１−２２９０３号公報、特公昭６１−
３９６１７号公報参照）等が開示されている。

更に又、電気泳動分離用媒体液の調液方法としては連続
的に流量比をかえた濃・淡二種のモノマー液に一定量の
集合反応開始剤液を加える方法が用いられていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記最初の製法は光照射の設備と生産性
の悪さによるコスト高と、ゲルの厚みが厚いための解像
性が悪い点１反応開始剤が製造終了後も光の存在下で重
合・架橋反応をおこし、安定性、再現性のあるグラジェ
ントゲルが得られない等の問題点を有し、次の製造方法
はやはりバッチ式製造方式であるため生産性が悪く、又
電気泳動分離用媒体液を成形器に分岐流入する際に均一
に分岐することが難しく、再現性のあるグラジェントゲ
ルが得られない等の問題点を有していた。

更に又モノマー液と重合反応開始剤液との混合方法とし
ては重合反応開始剤液がモノマー液が薄い時は過剰とな
りゲル膜そのものが不安定であるという欠点があった。

本発明の目的は上記問題点を解消し、生産性が高く、再
現性が高く、ゲル膜の安定性のよい電気泳動用グラジェ
ントゲル膜の製造方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の前記目的は、連続的に走行するウェブ上に電気
泳動分離用媒体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジ
ェントゲル膜の製造方法において、該電気泳動分離用媒
体液が、連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー
液と、その混合モノマー液に対応して連続的に流量を変
えた重合反応開始剤液とその希釈液とをスタティックミ
クサーによって混合開成されながら、塗布ヘッドに供給
されることを特徴とする電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法によって達成される。

本発明において走行するウェブとは、平面性のよいシー
ト状のもので非導電性かつ実質的に水不透過性であれば
、どのような材質のものでもよ（、ポリエチレンテレフ
タレート、ビスフェノールＡのポリカルボネートのよう
なポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリエチ
レン、ポリスチレン３ポリ塩化ビニルなどのビニル系重
合体、ナイロンなどのポリアミドなど、およびそれらの
共重合体（例、塩化ビニリデン、塩化ビニルコポリマー
）が好ましく用いられる。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電気泳動分
離用媒体膜を作れるものであれば何でもよく、その代表
的なものとしては、アクリルアミドゲル、アガロースゲ
ル、澱粉ゲル、寒天ゲル。

セルロースアセテート多孔質膜、濾紙等の原料液となる
液をいう。

本発明における電気泳動分離用媒体液の塗布ヘッドとし
てはスライドビードコート、エクストルージョンコート
、ホッパーコート、カーテンコート等の塗布ヘッドが用
いられる。塗布する媒体膜の厚みは分離の目的に応じて
選ばれるが通常５０μｍから約１．Ｏｎ＋、好ましくは
約２００μｍから約０．５■ｌ多孔質膜や濾紙の場合に
は約７０μｍから約１ｎ＋の範囲とされる。

本発明における電気泳動用グラジェントゲル膜とは、一
つの製品単位長の中に濃度勾配をもったものをいう。

本発明においてスタティックミクサーとは、流体がミク
サーの中に通される時、流体自身の運動により攪拌作用
を行うものをいい、管状のものとしてはスパイラルチュ
ーブ、左右交互らせん状、又はプロペラ状邪魔板入り等
がある。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の調液部分の工程図である。

電気泳動用媒体液１４は、低濃度モノマー液１゜と高濃
度モノマー液２、更に重合反応開始剤液３ａと重合反応
開始剤液の希釈液３ｂとをスタティックミクサー８及び
９内で攪拌・混合することによって調液される。

第２図（ａｌは本発明の濃・淡二種のモノマー液の流量
比の関係の説明図である。連続的に流量比をかえるとい
うことは、例えば当初高濃度モノマー液２はＱ　ｍ　Ｉ
ｔ　／ｍｉｎ　、低濃度モノマー液は１９ｍｆｆ／ｍｉ
ｎの流量比で初まるが、電気泳動用グラジェントゲル膜
の製品単位長を！とすると、図上、高濃度上ツマー液２
は実線で、低濃度モノマー液１は点線で示すように流量
を変え、合計の流量は１９　ｍ　ｌ！、／ｗｉｎという
ことで一定であるが、濃度は連続的に変化することにな
る。又その混合モノマー液に対応して連続的に流量比を
変えた重合反応開始剤液とその希釈液とは第２図（ｂ）
に示すように、第２図ｆａ）に対応して、重合反応開始
剤液３ａと希釈液３ｂとを夫々点線と実線で示す様に流
量を変化させることをいう。合計流量は（０，９６１−
０，５）＝１．４６ｍ１／ｍｉｎとなる。濃度は連続的
に変化するにとになる。製品単位長βの終りは高濃度モ
ノマー液２は１９　ｍ　１２　／ｍｉｎ　、低濃度モノ
マー液１はＯｍ　ｌ　／ｍｉｎとなり濃度の濃い膜成分
になっている。この様な流量比の変更を繰返し行うため
に、第１図において流量勾配送液ポンプ４，５がパーソ
ナルコンピュータ１３の１旨令によりコンピューターリ
ンケージアダプタ１２を経由してコントローラ　ｌｌａ
によって制御しスタティックミクサー８に送液される。

一方重合反応開始剤液３ａ及び希釈液３ｂは流量勾配送
液ポンプ６．７によってコントローラー１１ｂに制御さ
れ、スタティックミクサー９に送り込まれる。その後ス
タティックミクサー８内でモノマー液と一緒に攪拌混合
されて電気泳動用媒体液１４が出来る。電気泳動媒体液
１４は塗布ヘッド１０に供給され、ウェブ１５上に塗布
されることになる。

第３図は第２図の濃度比率によって作られる電気泳動用
グラジェントゲル膜の平面図、第４図は第３図の側面図
である。

第２図、第３図の切断長β間の間隙ｔは試料注入口の部
分として打抜かれ、カバーシート等によって試料注入口
になる部分である。

〔作　　用〕

本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続
的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混
合モノマー液濃度に対応して連続的に流量比を変えた重
合反応開始剤液その希釈液とをスタティックミクサーに
よって混合調液されながら、塗布ヘッドに供給されるこ
とにより、スタティックミクサーの攪拌力と自送力によ
り前後の溶液の混合がなく、塗布ヘッドに送られる為、
従来にないｉＪ′ｅ？、勾配のはっきりした塗布膜を安
定して再現性よく製造することが出来るようになった。

しかも、従来の様に混合したモノマー液と不平衡な重合
反応開始剤液量でなく、バランスのとれた液量になるの
でゲル膜の安定性が向上した。

〔実　施　例〕

本発明の実施例について第１図、第２図、第３図を用い
ながら説明する。

電気泳動分離用媒体液 低濃度上ツマ−として□■ アガロース・・・・・・・・・６５ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・・　５４９ｇ１．３．５−１
−リアクリ ロイル−へキサヒドロ− ３−トリアジン・・　・・・　・　５．７ｇ脱イオン水
　　ｕｐ　ｔｏ　９，０００ｍｊ＋を作り高濃度上ツマ
−として□■ アガロース・・・・・・・・・４０ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・　１　、８３０ｇ１．３．５
−トリアクリ ロイル−へキサヒドロ− ８−トリアジン・・・・・・・１９ｇ 脱イオン水　　ｕｐ　ｔｏ　９，０００ｍｆｆを作り緩
衝液として□■ トリスヒドロキシメチル アミン　　　　・・・・・１２１．１４ｇはう酸　　　
　・・・・・６５．４ｇ エチレンジ７ミンテトラ 酢酸２ナトリウム塩・・・・７．４５ｇ脱イオン水　　
ｕｐ　ｔｏ　１，０００ｍＡを作り緩衝液■・・・・・
・・・・・・・７５０ｍ　１２．９χポリビニルピロリ
ドン水溶液・８００ｍ　１１２５　Ｘテトラメチルエチ
レンジアミン液・・・・６．７ｍｌ の混合液□■を 低濃度モノマー■９，０００ｍ　７！、　高濃度上ツマ
−■９．０００ｍ　ｆｔの各々に加え、夫々を低濃度上
ツマー液１．高濃度モノマー＊２とする。

次に重合反応開始剤液３ａとして ２χｄｉ−２エチルへキシルスル ホサクシネート液・・・・・・１００ｍ　１１０．３７
５χリボラフラビンリン 酸エステルナトリウム塩水 溶ン夜　　　　　　　　　　　　　　　　・　　・　　
・　　・　　・　　・　１５０ｍ　　１３．７５χテル
オキソニ硫酸ア ンモニウム水溶液・・・・・・１６０ｍ　Ｉｔを希釈液
３ｂとして ２χｄｉ−２エチルへキシルレボ サクシネート液・・・・・・・１００ｍ　１０．３７５
χリポラフラビンリン 酸エステルナトリウム塩水 溶液　　　　　　・・・・・・１５０ｍ　ｌ脱イオン水
・・・・・・・・・１６０１Ｉ１１２を作り、夫々の３
液をタンクに入れる。

流量勾配送液ポンプ４．５で低濃度上ツマー液１、高濃
度モノマー′／＆２の流量和を１９ｍβ／ｍｉｎとし、
それに流量勾配送液ポンプ６．７で１合反応開始剤液３
ａ、希釈液３ｂの流量和を１．４６ｍρ／分として、ス
タティックミクサー８．９内に送液する。

スタティックミクサー８，９内では上記４液が自刃によ
り混合攪拌し、スタティックミクサー８の出口で電気泳
動分離用媒体液１４が出来上る。

塗布ヘッド１０により電気泳動分離用媒体液１４がウェ
ブ１５上に塗布される。

その時の低濃度モノマー液１と高濃度上ツマー液２及び
重合反応開始剤液３と希釈液４との流量比は、第２図（
ａ＋、　（ｂ）に示したとおりであり、塗布されたゲル
膜の濃度は第３図、第４図の状態になる。

尚、電気泳動分離用媒体膜としての製品は、例えば特開
昭６０−２０３８４７号公報に開示しである様に、ウェ
ブ上にあらかじめ両端部にスペーサーを貼付ける工程、
塗布後硬化処理をする工程。

試量注入口としてコーム（櫛）を打抜く工程、カバーシ
ートを貼付ける工程、製品長さに切断する工程９等を経
て初めて製品となる。

しかしこれらの工程は如何なる方法、手段を用いても本
発明とは関係がない。

〔発明の効果〕

本発明は連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒
体液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜
の製造方法において、該電気泳動分離用媒体液が、連続
的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混
合上ツマー液の濃度に対応して連続的に流量比を変えた
重合反応開始剤液とその希釈液とをスタティックミクサ
ーによって混合調液されながら、塗布ヘッドに供給され
ることを特徴とする電気泳動用グラシエントゲル膜の製
造方法により従来よりも一層生産性が良く、製品の安定
性、再現性を向上することが出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の調液部分の工程図、第２図は本発明の濃・淡二種
のモノマー液（ａｌと、重合反応開始剤液と希釈液との
（ｂ）流量比の関係の説明図。第３図は第２図の濃度比
率によって作られる本発明の電気泳動用グラジェントゲ
ル膜の平面図、第４Ｔｆ！Ｊは第２図の断面図である。 ■・・・低濃度モノマー液 ２・・・高濃度上ツマー液 ３ａ・・・重合反応開始剤液 ３ｂ・・・希釈液 ４．５・・・流量勾配送液ポンプ ６．７・・・流量勾配送液ポンプ ８．９・・・スタティックミクサー １０・・・塗布ヘッド １１ａ、ｌｌｂ・・・コントローラー １２・・・コンビエータリンケージアダプタ１３・・・
パーソナルコンピューター １４・・・電気泳動用媒体液 １５・・・ウエブ 手続補正書 昭和６２年７月λ日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）連続的に走行するウェブ上に電気泳動分離用媒体
   液を連続的に塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の
   製造方法において、該電気泳動分離用媒体液を、連続的
   に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液と、その混合
   モノマー液に対応して連続的に流量比を変えた重合反応
   開始剤液とその希釈液とをスタティックミクサーによっ
   て混合調液しながら、塗布ヘッドに供給することを特徴
   とする電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法。