JPH0584861B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、DNAもしくは、DNA部分分解物の
塩基配列を決定する為の電気泳動用グラジエント
ゲル膜の製造方法に関する、特に電気泳動分離用
媒体液をウエブに塗布する塗布ヘツドに関するも
のである。

〔従来の技術〕

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性
のないアクリルアミドの高分子濃度グラジエント
ゲルは、一枚の支持体の上または二枚の支持体の
間に濃度の異なるゲルを電気泳動方向に層状に形
成させ、膜状物として用いられて来た。

しかしながら支持体上にゲルを形成して用いる
方法は、支持体上にゲルを形成する時、泳動槽に
セツトする時、ゲルの保存中、あるいは分析試料
を添加するときなどに誤まつてゲルをこわした
り、試料以外のものをゲルの上に落してゲルを損
なつたりすること等があり、操作上細心の注意と
熟練が必要であつた。

一方二枚のガラス板などでモールドをつくり、
この中でゲルを形成させて、そのモールドを垂直
に保つたまゝ電気泳動分析を行う垂直式電気泳動
法においては、モールドの厚さを均一にすること
は困難であつたり、ゲル形成液がゲル化しないう
ちに狭いモールド中にゲル液を注入しなければな
らないことなど操作上高度の熟練を要していた。

特にDNAの塩基配列決定操作においては、一
枚のゲルで出来るだけ多くのDNAの断片を分析
できるように長いゲルを作ることが望ましいが、
そのようなゲルはその製造および取扱いが難しか
しつた。また、ガラス板を用いるために、そのガ
ラス板が破損しやすいという欠点があつた。

近年工業的に電気泳動用グラジエントゲル物質
を製造する方法として、アクリルアミドモノマー
および架橋剤の混合物の水溶液または水分散液を
作り、光の照射を吸収し、モノマーの重合を開始
する遊離ラジカル発生物質を添加した後、該溶液
を所望のゲル生成物の形に形成し、形成した溶液
に光照射してモノマー溶液または、分散液を重合
させ架橋させる際、ゲルの多孔度を変えるために
モノマー溶液に印加する光照射時間を調整する工
程を含む電気泳動グラジエントゲルの製造（特開
昭61−28512号公報参照） さらに又単量体、架橋剤および重合開始剤を含
有し、濃度の相互に異る二種類の水溶液を混合比
率を漸次変化させながら混合しつつ成形器に導入
し、該成形器中で単量体と架橋剤との重合を完了
させ、電気泳動方向に重合体の濃度勾配を有する
電気泳動用グラジエントゲルの製造方法（特公昭
61−22903号公報、特公昭61−39617号公報参照）
等が開示されている。

又、連続的に走行するウエブ上に電気泳動分離
媒体液を塗布する塗布ヘツドとしては、第６図に
示す様な一般的なものが用いられていた。即ち塗
布液１２としての電気泳動分離媒体液は定量ポン
プ２２によつて塗布ヘツド１８内のキヤビテイ１
９に圧送される。キヤビテイ１９はスロツト開口
２４に連通している塗布幅一杯に拡がつたスロツ
ト２３に塗布液を供給する液溜りである。塗布液
１２はキヤビテイ１９から縮流してスロツト２３
に入りスロツト開口２４からコーテイングローラ
２０の上のウエブ１３に塗布される。この際塗布
の安定化のために塗布ビード後方を背圧にするた
めの差圧チヤンバー２１が用いられる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記最初の製法は光照射の設備
と生産性の悪さによるコスト高と、ゲルの厚みが
厚いための解像性が悪い点、反応開始剤が製造終
了後も光の存在下で重合・架橋反応をおこし、安
定性、再現性のあるグラジエントゲルが得られな
い等の問題点を有し、後者次の製造方法はやはり
バツチ式製造方法であるため生産性が悪く、又電
気泳動分離用媒体液を成形器に分岐流入する際に
均一に分岐することが難しく、再現性のあるグラ
ジエントゲルが得られない等の問題点を有してい
た。

更に又従来の塗布ヘツドで塗布した製品の幅方
向の膜厚は均一性が充分でなく、長時間の運転に
より異物の発生があり、その為塗布ヘツドの分解
洗浄が必要であつた。

本発明の目的は上記問題点を解消し、塗布幅全
体に亘つて均一な塗布膜厚で、異物の発生がなく
ウエブの走行方向に連続的に濃度勾配をもつた電
気泳動用グラジエントゲル膜を生産性が高く、安
定性、再現性良く製造する方法を提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の前記目的は、濃・淡二種のモノマー液
の流量比を連続的に変えながら混合することによ
り濃度が時間と共に変わるモノマー液と重合反応
開始剤とを混合した電気泳動分離用媒体液を、塗
布液として塗布ヘツドに供給し該塗布液を走行す
るウエブ上に塗布して電気泳動方向に連続的に濃
度勾配をもつた膜を得る電気泳動用グラジエント
ゲル膜の製造方法であつて、該塗布液が該塗布ヘ
ツドの供給口よりスロツト開口に到る間、該ウエ
ブの幅方向に向つてスロツト幅を連続的に拡げる
とともにスロツトの厚み方向を連続的に縮小して
スロツトの断面積の急激な変化を小さくし、該ス
ロツト開口より該塗布液を該ウエブ上に塗布す
る。

ことを特徴とする電気泳動用グラジエントゲル膜
の製造方法によつて達成される。

本発明において濃度が時間と共に変わるモノマ
ー液は、濃淡二種のモノマー液の流量比を連続的
に変えながら混合することによつて作られる。そ
してそのモノマー液の濃度の変化としては３〜
35W／Ｖ％が好ましい。

本発明において混合する方法としては、一般の
タンク内で攪拌機によつて行つてもよいが、スタ
テイツクミクサーによる混合調液が最も好まし
い。

スタテイツクミクサーとは、流体がミクサーの
中に通される時、流体自身の運動により攪拌作用
が生じるものをいい、管状のものとしてはスパイ
ラルチユーブ、左右交互らせん状、邪魔板入りプ
ロペラ状等がある。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電
気泳動分離用媒体膜を作れるものであれば何でも
よく、その代表的なものとしては、アクリルアミ
ドゲル、アガロースゲル、澱粉ゲル、寒天ゲル、
セルロースアセテート多孔質膜、濾紙等の原料液
となる液をいう。

本発明における電気泳動分離用媒体液の塗布ヘ
ツドとしては、スライドビードコート、エクスト
ルージヨンコート、ホツパーコート、ターテンコ
ート等の塗布ヘツドが用いられる。媒体膜の厚み
は分離の目的に応じて選ばれるが通常50μmから
約1.0mm、好ましくは約200μmから約0.5mm。多孔
質膜や濾紙の場合には約70μmから約１mmの範囲
とされる。

本発明における走行するウエブとは、平面性の
よいシート状のもので非導電性かつ実質的に水不
透過性であれば、どのような材質のものでもよ
く、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエノー
ルＡのポリカルボネートのようなポリエステル、
ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリ
スチレン、ポリ塩化ビニルなどのビニル系重合
体、ナイロンなどのポリアミドなど、およびそれ
らの共重合体（例、塩化ビニデリン、塩化ビニル
コポリマー）が好ましく用いられる。

本発明における、塗布液が塗布ヘツドの供給口
よりスロツト開口に到る間、ウエブの幅方向に向
かつてスロツト幅を連続的に拡げるとともにスロ
ツトの厚み方向を連続的に縮小してとは、供給口
よりスロツト状開口に到る塗布液流路を塗布液
流路の縁線を急激に変化させることなく連続的に
変化させる幅を拡げる時はそれに対応して厚味
を縮少してスロツトの断面積の急激な変化を小さ
くする拡張、収縮の角度を規制する等によつ
て、流れ全体としての渦流、滞留をさけることを
いう。結果として本発明は従来塗布ヘツドに用い
られていたキヤビテイを使用しないことになる。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。

第１図は本発明の電気泳動用グラジエントゲル
膜の製造方法の工程図である。

電気泳動用媒体液１２は、低濃度モノマー液
１、高濃度モノマー液２、更に重合反応開始剤液
３をスタテイツクミクサー７内で攪拌・混合する
ことによつて調液される。

第２図ａは本発明の濃・淡二種のモノマー液の
流量比の関係の説明図である。連続的に流量比を
かえるということは、例えば当初高濃度モノマー
液２は０ml／min、低濃度モノマー液１は19ml／
minの流量比で初まるが、電気泳動用グラジエン
トゲル膜の製品単位長をｌとすると、図上、高濃
度モノマー液２は実線で、低濃度モノマー液１は
点線で示すように流量を変え、合計の流量は19
ml／minということで一定であるが、濃度は連続
的に変化することになる。製品単位長ｌの終りは
高濃度モノマー液２は19ml／min、低濃度モノマ
ー液１は０ml／minとなり濃度の濃い膜成分にな
つている。この様な流量比の変更を繰返し行うた
めに、第１図において流量勾配送液ポンプ４，５
がパーソナルコンピユータ１１の指令によりコン
ピユーターリンケージアダプタ１０を経由してコ
ントローラー９ａによつて制御される。

一方重合反応開始剤液３は定流量送液ポンプ６
によつてコントローラー９ｂに制御され一定量を
スタテイツクミクサー７に送り込まれ、スタテイ
ツクミクサー７内で低濃度モノマー液１と高濃度
モノマー液２そして重合反応開始剤液３は攪拌混
合され電気泳動用媒体液１２が出来る。電気泳動
用媒体液１２は塗布ヘツド８に供給され、ウエブ
１３上に塗布されることになる。

第２図ｂは第２図ａの濃度比率によつて作られ
る電気泳動用グラジエントゲル膜の平面図、第２
図ｃは第２図ｂの側面図である。

第２図ａの製品単位長ｌ間の間隙ｔは試料注入
口の部分として打抜かれ、カバーシート等によつ
て試料注入口になる部分である。

次に第３図ａ，ｂは本発明の塗布ヘツドの一実
施例の側面断面図である。塗布ヘツド８はスタテ
イツクミクサー７からの塗布液である電気泳動分
離用媒体液１２を供給口１４で受け、スロツト１
６を通じてスロツト開口１７よりウエブ１３上に
コーテイングローラ２０の上で塗布をしている。
第３図、ａとｂは塗布液１２をウエブ１３上に塗
りつけるコーテイングローラ２０上の位置の違い
で、どちらを用いても良い。

本発明の場合供給口１４からスロツト１６への
塗布液の供給が幅、厚味共に連続的に拡大、縮少
させ、拡大、縮小の角度を比較的ゆるやかにしな
ければならないため、塗布ヘツドのスロツト１６
の長さが従来のものと比較して長くなる。、その
ためコーテイングローラ２０に対して塗布ヘツド
８の位置が第３図ａ及びｂの様な配置になる。

尚、第３図ｂにおいて厚味方向の縮少の角度α
≦0.35°が好ましい。第４図は第３図、の塗布ヘ
ツドを正面から見た断面図で、第５図は透視図で
ある。第４図において塗布ヘツド８の塗布液１２
の供給口１４よりスロツト開口１７に到る間、ス
ロツト１６の幅方向を連続的に拡げる状態を示
す。理想的には図中、点線で示すようにベンチユ
リー型に拡げるのが好ましいが、角度的規制より
考えて工作を簡単にするとすれば拡がりの角度θ
≦40°に直線的にすることが一般に用いられる。

幅と厚味の状態を共に示したのが第５図の透視
図である。

〔作用〕

本発明は連続的に濃度勾配をもつたモノマー液
と重合反応開始剤液とを混合しながら電気泳動分
離用媒体液として塗布ヘツドに供給することによ
つて、例えば、スタテイツクミクサーの攪拌力と
自送力により前後の液の混合がなく、塗布ヘツド
に送られる為、従来にない濃淡勾配のはつきりし
た塗布膜を安定して製造することが出来る。しか
も、生産性もよく製造出来る。

更に又本発明は塗布液を供給口よりスロツト状
開口に到る間幅方向に連続的に拡げ、それに伴つ
て厚味方向に連続的に縮少させることにより、急
激な液流の拡張、縮少をさけるため、具体的に
は、液流路の縁線を連続的に拡張する（例えば
ベンチユリーの様に）ことにより通路の縁線に生
じる渦流（滞留）をさける。幅を拡げる時はそ
れに対応して厚味を縮少して、スロツトの断面積
の急激な変化を小さくすることによつて各流路に
わたつて均一な流抵抗になる。拡張、収縮の角
度を規制する例えば液が拡がる時の角度θ≦40°、
厚味方向の角度はα≦0.35°とすることによつて
渦流の発生を防ぎ、液の部分的滞留をなくするの
である。

又特にキヤビテイを用いないことは、キヤビテ
イからスリツトに液が流出する場合に縮少部分の
各所において生じる渦と、それによる液の部分的
滞留とそれによる異物の発生を防ぐためである。
これらによつて塗布の横幅全体に亘つて均一な塗
布膜を得ることが出来る。

〔実施例〕

本発明の実施例について説明する。

電気泳動分離用媒体液は 低濃度モノマーとして − アガロース ……65ｇ 尿素 ……4200ｇ アクリルアミド ……549ｇ １，３，５−トリアクリロイル−ヘキサヒ
ドロ−Ｓ−トリアジン ……5.7ｇ 脱イオン水 up to 9000mlを作り 高濃度モノマーとして − アガロース ……40ｇ 尿素 ……4200ｇ アクリルアミド ……1830ｇ １，３，５−トリアクリロイル−ヘキサヒ
ドロ−Ｓ−トリアジン ……19ｇ 脱イオン水 up to 9000mlを作り 緩衡液として − トリスヒドロキシメチルアミン
……121.14ｇ ほう酸 ……65.4ｇ エチレンジアミンテトラ酢酸２ナトリウム
塩 ……7.45ｇ 脱イオン水 up to 1000mlを作り、 緩衡液 ……750ml 2.9％ポリビニルピロリドン水溶液・800ml 25％Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレン
ジアミン液 ……6.7ml の混合液を 低濃度モノマー9000ml、高濃度モノマー
9000mlの各々に加え、夫々を低濃度モノマー液
１、高濃度モノマー液２とする。

次に重合反応開始剤液３として ２％di−２エチルヘキシルスルホサクシネ
ート液 ……100ml 0.375％リボフラビンリン酸 エステルナトリウム塩水溶液・150ml 3.75％ペルオキソニ硫酸アンモニウム水溶
液 ……160ml を作り、上記３液を夫々のタンクに入れる。

流量勾配送液ポンプ４，５で低濃度モノマー液
１、高濃度モノマー液２の流量和を19ml／minと
し、それに重合反応開始剤液３の流量1.46ml／
minを定流量送液ポンプ６で、スタテイツクミク
サー７内に送液する。

スタテイツクミクサー７内では上記３液が自力
により混合攪拌し、電気泳動分離用媒体液１２が
出来る。

塗布ヘツド８より電気泳動分離用媒体液１２が
ウエブ１３上に塗布される。

その時の低濃度モノマー液１と高濃度モノマー
液２との流量比は、第２図ａに示したとおりであ
り、塗布されたゲル膜の濃度は第２図ｂ、第２図
ｃの状態になる。

上記によつて作られた電気泳動分離用媒体液は
塗布幅18cmのPETのフイルムの上に150〜200
c.c.／m²で塗布を行つた。

（実施例 １） この時の塗布ヘツドにおける幅方向の供給口よ
りスロツトへの拡がり角度θ＝40°、厚みの縮少
角度α＝0.35°にて行つたところ、長時間の運転
をしても塗布スジの発生等の故障はなく、全幅に
亘つて均一な厚みの良質の塗布品質が得られた。

（比較例 １） 実施例−１と同様の塗布液濃度・温度で同様に
してPETフイルム上に、拡がり角度θ＝45°縮少
角度α＝0.5°の塗布ヘツドを用いて塗布を行つた
ところ、塗布厚味は端部が薄く、全体として放物
線状の塗布厚味になつた。また長時間の連続運転
に対し多少スジつぽい塗布品質であつた。

〔発明の効果〕 本発明は連続的に濃度勾配をもつたモノマー液
と重合反応開始剤液とを混合しながら、電気泳動
分離用媒体液として塗布ヘツドに供給し、走行す
るウエブ上に塗布する電気泳動用グラジエントゲ
ル膜の製造方法であつて、塗布前のスタテイツク
ミクサー等の使用により濃度勾配の正確な安定し
た再現性の良い電気泳動用グラジエントゲル膜の
生産性の良い製造が可能になつた。又塗布ヘツド
に塗布液を供給する際供給口よりスロツト開口に
到る間、幅方向を連続的に拡げ、厚味方向を連続
的に縮少して供給することにより塗布液の塗布ヘ
ツド内の滞留による異物の発生はなくなり、又幅
方向に均一な成分の塗布が可能となり製品品質が
一段と向上した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わる電気泳動分離用媒体液
の製造工程図、第２図は本発明に係わる電気泳動
分離用媒体液の濃度勾配ａとその塗布膜の平面図
ｂ、側面図ｃである。第３図は本発明に係わる塗
布ヘツドの側面断面図ａ，ｂ、第４図は第３図の
正面断面図、第５図は第４図の透視斜視図、第６
図は従来の塗布ヘツドの側面断面図を示す。 １……低濃度モノマー液、２……高濃度モノマ
ー液、３……重合反応開始剤液、４，５……流量
勾配送液ポンプ、６……定流量送液ポンプ、７…
…スタテイツクミクサー、８……塗布ヘツド、９
ａ，９ｂ……コントローラ、１０……コンピユー
タリンケージアダプタ、１１……パーソナルコン
ピユーター、１２……電気泳動分離用媒体液、１
３……ウエブ、１４……供給口、１６……スロツ
ト、１７……スロツト開口、１８……塗布ヘツ
ド、１９……キヤビテイ、２０……コーテイング
ローラ、２１……差圧チヤンバー、２２……ポン
プ、２３……スロツト、２４……スロツト開口。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 濃・淡二種のモノマー液の流量比を連続的に
   変えながら混合することにより濃度が時間と共に
   変わるモノマー液と、重合反応開始剤とを混合し
   た電気泳動分離用媒体液を、塗布液として塗布ヘ
   ツドに供給し、該塗布液を走行するウエブ上に塗
   布して電気泳動方向に連続的に濃度勾配をもつた
   膜を得る電気泳動用グラジエントゲル膜の製造方
   法であつて、該塗布液が該塗布ヘツドの供給口よ
   りスロツト開口に到る間、該ウエブの幅方向に向
   かつてスロツト幅を連続的に拡げるとともにスロ
   ツトの厚み方向を連続的に縮小してスロツトの断
   面積の急激な変化を小さくし、該スロツト開口よ
   り該塗布液を該ウエブ上に塗布することを特徴と
   する電気泳動用グラジエントゲル膜の製造方法。