JPH01161151A - 血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬 - Google Patents
血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬Info
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- JPH01161151A JPH01161151A JP31747987A JP31747987A JPH01161151A JP H01161151 A JPH01161151 A JP H01161151A JP 31747987 A JP31747987 A JP 31747987A JP 31747987 A JP31747987 A JP 31747987A JP H01161151 A JPH01161151 A JP H01161151A
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- Japan
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
この発明は、血清中のチオール基、特に血清中のメルカ
プトアルブミンを主体とするチオール基をクロマトグラ
フィー等でメルカプトアルブミン成分を分画することな
く直接測定（定量）する方法、及びこれ（こ用いる試薬
に関するものである。
プトアルブミンを主体とするチオール基をクロマトグラ
フィー等でメルカプトアルブミン成分を分画することな
く直接測定（定量）する方法、及びこれ（こ用いる試薬
に関するものである。
〈従来の技術〉
血清中のアルブミン量と疾患との関係は、特に栄養障害
時の有効な指標とされるので、アルブミン量はこれと親
和性を有する色素を使用して、色素結合法という簡便法
によって日常的に測定されでいる。
時の有効な指標とされるので、アルブミン量はこれと親
和性を有する色素を使用して、色素結合法という簡便法
によって日常的に測定されでいる。
他方、アルブミン分子に存在するチオール基については
、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、各種肝疾患等により
、これがシスティンやグルタチオン等と結合し、その結
果Ｓ−８（混合ジスルフイド）結合し１とアルブミンか
増大することか報告されでいる。従ってチオール基を持
つメルカプトアルブミン（以下１−Ｉ Ｍ△という）と
疾患により増えるノンメルカプトアルブミン（以下ＨＮ
△という）の含有率を測定することは、臨床検査の分野
において有用なことである。
、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、各種肝疾患等により
、これがシスティンやグルタチオン等と結合し、その結
果Ｓ−８（混合ジスルフイド）結合し１とアルブミンか
増大することか報告されでいる。従ってチオール基を持
つメルカプトアルブミン（以下１−Ｉ Ｍ△という）と
疾患により増えるノンメルカプトアルブミン（以下ＨＮ
△という）の含有率を測定することは、臨床検査の分野
において有用なことである。
さて、血清中には種々の干渉物質が存在するので、従来
血清中のチオール基（特に血清中のＨＭＡを主体とする
チオール基）を単に試薬を添加するたけて直接測定する
ことはできなかった。
血清中のチオール基（特に血清中のＨＭＡを主体とする
チオール基）を単に試薬を添加するたけて直接測定する
ことはできなかった。
すなわち、血清中のチオール基の測定は、その中に含ま
れているアルブミンを予じめカラムクロマトグラフィー
等により分画して共存する干渉物質を除去した後、これ
に５，５′−ジチオどスコニトロペンゾイックアシット
（ＤＴＮＢ）％＞ｉ加してアルブミンのチオール基によ
り呈色させ、その吸光度を測定することにより行なわれ
ていたのである。
れているアルブミンを予じめカラムクロマトグラフィー
等により分画して共存する干渉物質を除去した後、これ
に５，５′−ジチオどスコニトロペンゾイックアシット
（ＤＴＮＢ）％＞ｉ加してアルブミンのチオール基によ
り呈色させ、その吸光度を測定することにより行なわれ
ていたのである。
〈発明が解決しようとする問題点〉
しかしなから、前記したカラムクロマトグラフィー等に
より分画する操作は煩雑で時間かかがり過ぎるので、血
清中のチオール基の直接測定法の開発か望まれていた。
より分画する操作は煩雑で時間かかがり過ぎるので、血
清中のチオール基の直接測定法の開発か望まれていた。
発明者等は、前記ＤＴＮＢを使用して、血清中のチオー
ル基を直接測定する方法についで、カラムクロマトグラ
フィー法と比較検討したところ、ＤＴＮＢの呈色を阻害
するのは、血清中の低分子物質（セファデックスＧ−２
５脱塩川カラムの低分子分画）である事実を突きとめた
が、いずれにしても従来血清中のチオール基の測定試薬
として使用されていたＤＴＮＢは、チオール基の直接測
定試薬としては不適当であることか判明した（第１図参
照）。
ル基を直接測定する方法についで、カラムクロマトグラ
フィー法と比較検討したところ、ＤＴＮＢの呈色を阻害
するのは、血清中の低分子物質（セファデックスＧ−２
５脱塩川カラムの低分子分画）である事実を突きとめた
が、いずれにしても従来血清中のチオール基の測定試薬
として使用されていたＤＴＮＢは、チオール基の直接測
定試薬としては不適当であることか判明した（第１図参
照）。
そこで発明者等は、ＤＴＮＢとは異なった機構（反応）
により呈色する試薬を鋭意検討した結果、血清中のチオ
ール基の直接測定試薬（呈色試薬）としては、４，４“
−ビスジメチルアミノベンズヒドロール（以下ＢＤＡ
Ｂという）が最適であること、また血清中の総チオール
基量はＨＭＡで大部分を占められでいるという事実を知
り本発明を完成した。
により呈色する試薬を鋭意検討した結果、血清中のチオ
ール基の直接測定試薬（呈色試薬）としては、４，４“
−ビスジメチルアミノベンズヒドロール（以下ＢＤＡ
Ｂという）が最適であること、また血清中の総チオール
基量はＨＭＡで大部分を占められでいるという事実を知
り本発明を完成した。
く問題を解決するための手段〉
すなわちこの発明は、
■血清に、４，４’−ビスジメチルアミノベンズヒドロ
ール、及び蛋白変性剤を添加して生ずる呈色の程度を比
較測定することを特徴とする血清中のチオール基の直接
測定方法、及び ■４，４′ −ビスジメチルアミノベンズヒドロール（
ＢＤＡＢ）及び蛋白変性剤を含有することを特徴とする
血清中のチオール基の直接測定方法に用いる試薬、 を提供し、血清中から予じめアルブミンを分画しなくて
もチオール基を直接測定することができるようにするこ
とを目的として開発したものである。
ール、及び蛋白変性剤を添加して生ずる呈色の程度を比
較測定することを特徴とする血清中のチオール基の直接
測定方法、及び ■４，４′ −ビスジメチルアミノベンズヒドロール（
ＢＤＡＢ）及び蛋白変性剤を含有することを特徴とする
血清中のチオール基の直接測定方法に用いる試薬、 を提供し、血清中から予じめアルブミンを分画しなくて
もチオール基を直接測定することができるようにするこ
とを目的として開発したものである。
本発明においては、血清に４，４’−ビスジメチルアミ
ノベンズヒドロールと蛋白変性剤を添加するものである
が、他の物質を添加しないという趣旨ではない。分析上
、通當必要ヒする他の物質を添加することはもちろんで
ある。
ノベンズヒドロールと蛋白変性剤を添加するものである
が、他の物質を添加しないという趣旨ではない。分析上
、通當必要ヒする他の物質を添加することはもちろんで
ある。
本発明に使用するＢＤＡＢは、従来のＤＴＮＢとは次に
記載するようにチオール基に対する特性が異なっている
。
記載するようにチオール基に対する特性が異なっている
。
すなわち、従来のＤＴＮＢ法によるチオール−ジスルフ
ィド交換反応が親電子置換反応であるのに対し、本発明
におけるＢＤＡＢ法は、以下に示すようにカチオンに対
するチオール基の求核反応の結果生する呈色（吸光度変
化）をモニターする点にある。
ィド交換反応が親電子置換反応であるのに対し、本発明
におけるＢＤＡＢ法は、以下に示すようにカチオンに対
するチオール基の求核反応の結果生する呈色（吸光度変
化）をモニターする点にある。
従って、血清等の体液中に共存する低分子干渉物質の影
響を受けないので、カラムクロマトグラフィー等による
前処理を必要とせず、直接測定が可能となるのである。
響を受けないので、カラムクロマトグラフィー等による
前処理を必要とせず、直接測定が可能となるのである。
本発明に係る血清中のチオール基の直接測定方法及びそ
れに用いる試薬には、蛋白変性剤を必要とする。蛋白変
性剤としては、塩酸グアニジンか最も適している。その
他、ラウリル硫酸、尿素、エタノール、アセトン等も使
用できる。
れに用いる試薬には、蛋白変性剤を必要とする。蛋白変
性剤としては、塩酸グアニジンか最も適している。その
他、ラウリル硫酸、尿素、エタノール、アセトン等も使
用できる。
塩酸グアニジンか測定系に存在すると、１×１０５とい
う高い分子吸光係数を得られる１とめ、検体は極めて少
量でよい。
う高い分子吸光係数を得られる１とめ、検体は極めて少
量でよい。
また、分光光度計で測定する際の吸収極大か６１２ｎｍ
と長波長側にあるので共存物質の影響を全く受けないこ
とか有利である。
と長波長側にあるので共存物質の影響を全く受けないこ
とか有利である。
なお、本願に係る油清中のチオール基の直接測定方法及
びそれに用いる試薬は、測定対象が血清ばかりではなく
、伯の体液にも応用可能である。
びそれに用いる試薬は、測定対象が血清ばかりではなく
、伯の体液にも応用可能である。
〈実施例１〉
試薬：６Ｍ−塩酸グアニジン、１４ｕＭ−ＤＢＡＢを拭
む５０ｍＭ−酢酸緩衝液 （ｐＨ５，０） 操作・検体５０ｕρに、前記試薬２ｍβを添加し−ｉＪ
十分攪拌後、室温で２０分間放置し、波長６１２ｎｍで
吸光度を測定する。同時にｌ−Ｉ Ｍへの希釈列を検体
と同様に操作して、その濃度と得られた吸光度から検量
線を作成し、血清中の総チオール基物質量を求めた。得
られた検量線を第２図（Ａ）に示す。
む５０ｍＭ−酢酸緩衝液 （ｐＨ５，０） 操作・検体５０ｕρに、前記試薬２ｍβを添加し−ｉＪ
十分攪拌後、室温で２０分間放置し、波長６１２ｎｍで
吸光度を測定する。同時にｌ−Ｉ Ｍへの希釈列を検体
と同様に操作して、その濃度と得られた吸光度から検量
線を作成し、血清中の総チオール基物質量を求めた。得
られた検量線を第２図（Ａ）に示す。
また、６Ｍ−塩酸グアニジンに代えて０．１７Ｍ−ラウ
リル硫酸ナトリウムを使用したときの検量線を第２図Ｃ
Ｂ）に示す。
リル硫酸ナトリウムを使用したときの検量線を第２図Ｃ
Ｂ）に示す。
次に、健常者及び各疾患者（リウマチ、痛風、糖尿病、
癌）の血清を用いて、本発明に係る血清中のチオール基
の直接測定方法を実施した。ま１と、比較としてＨＰＬ
Ｃ（高速液体カラムクロマトグラフィー、加化成■製
アサヒバツクＥＳ−５０２のＩＥＣ，移動相として０．
４Ｍ 硫酸ナトリウム、０．０５ＭＮ−メチルビペラジ
ン。
癌）の血清を用いて、本発明に係る血清中のチオール基
の直接測定方法を実施した。ま１と、比較としてＨＰＬ
Ｃ（高速液体カラムクロマトグラフィー、加化成■製
アサヒバツクＥＳ−５０２のＩＥＣ，移動相として０．
４Ｍ 硫酸ナトリウム、０．０５ＭＮ−メチルビペラジ
ン。
１％ シアン化メチル（ｐＨ４，８））で血清を分離し
、ｌ−Ｉ Ｍ Ａ及びＨＮＡを測定した。また、ＨＭＡ
／ （ＨＭＡ＋ＨＮＡ）を求めた。その結果を第３図及
び第４図に示す。
、ｌ−Ｉ Ｍ Ａ及びＨＮＡを測定した。また、ＨＭＡ
／ （ＨＭＡ＋ＨＮＡ）を求めた。その結果を第３図及
び第４図に示す。
第３図及び第４図によれば、従来のＨＰＬＣ法による疾
患の検定法よりも、本願発明の方法による疾患の検定方
法の方か有意性か高いこと、すなわち健常者及び各疾患
者の差か明らかである。
患の検定法よりも、本願発明の方法による疾患の検定方
法の方か有意性か高いこと、すなわち健常者及び各疾患
者の差か明らかである。
本発明に係る血清中のチオール基の直接測定方法及びそ
れに用いる試薬についで、試薬の濃度、測定粂件等を補
足すると次の通りである。
れに用いる試薬についで、試薬の濃度、測定粂件等を補
足すると次の通りである。
（１）前記しプと試薬は塩酸グアニジンにおいては、２
〜６モル、ＤＢＡＢｉこおいては、４〜２０ｕＭの範囲
で使用可能である。
〜６モル、ＤＢＡＢｉこおいては、４〜２０ｕＭの範囲
で使用可能である。
ｅ））ＤＢＡＢの緩衝液の至適ｐＨは５．○である。
（３）試薬を添加して１０分後には、吸光度かほぼ安定
する。
する。
〈発明の効果〉
以上のように、この発明（こ係る血清中のチオール基の
直接測定方法及びそれに用いる試薬によれば、血清中の
ＨＭＡｕ主とするチオール基含有量を、ｌ−Ｉ Ｐ Ｌ
Ｃ等により分画することなく直接測定することかな可
能となるので、日常の検査に迅速、簡便かつ高精度の測
定法として十分利用できる。
直接測定方法及びそれに用いる試薬によれば、血清中の
ＨＭＡｕ主とするチオール基含有量を、ｌ−Ｉ Ｐ Ｌ
Ｃ等により分画することなく直接測定することかな可
能となるので、日常の検査に迅速、簡便かつ高精度の測
定法として十分利用できる。
また、これを用いた疾患の検定は、従来のＨＰ Ｌ Ｃ
法によるＨＭＡとＨＮＡの含有比率による検定よりも有
意性が高いという効果を有する。
法によるＨＭＡとＨＮＡの含有比率による検定よりも有
意性が高いという効果を有する。
第１図は、ＤＴＮＢｕ使用する、血清中のｌ−Ｉ ＭＡ
の直接測定結果と、血清中の低分子物質（セファデック
スＧ−２５脱塩川カラムの低分子分画）を除去したとき
の測定結果を示す。 第２図（Ａ）、（Ｂ）は、本願発明によるＨＭＡの検量
線（各々順に、６Ｍ−塩酸グアニジン、及び０．１７Ｍ
−ラウリル硫酸ナトリウムを使用）を示す。 第３図は、ＨＰＬＣ法による Ｈ Ｍ Ａ ／ （ＨＭ Ａ ＋ ｌ−Ｉ Ｎ Ａ ）
を示す。 第４図は、本願発明の血清中のチオール基の直接測定方
法による総ＳＨ基濃度を示す。 手続補正書（方式）（自発） 昭和６３年０４月０７日
の直接測定結果と、血清中の低分子物質（セファデック
スＧ−２５脱塩川カラムの低分子分画）を除去したとき
の測定結果を示す。 第２図（Ａ）、（Ｂ）は、本願発明によるＨＭＡの検量
線（各々順に、６Ｍ−塩酸グアニジン、及び０．１７Ｍ
−ラウリル硫酸ナトリウムを使用）を示す。 第３図は、ＨＰＬＣ法による Ｈ Ｍ Ａ ／ （ＨＭ Ａ ＋ ｌ−Ｉ Ｎ Ａ ）
を示す。 第４図は、本願発明の血清中のチオール基の直接測定方
法による総ＳＨ基濃度を示す。 手続補正書（方式）（自発） 昭和６３年０４月０７日
Claims (4)
- （１）血清に、４，４’−ビスジメチルアミノベンズヒ
ドロール、及び蛋白変性剤を添加して生ずる呈色の程度
を比較測定することを特徴とする血清中のチオール基の
直接測定方法。 - （２）蛋白変性剤が塩酸グアニジンである特許請求の範
囲第１項記載の血清中のチオール基の直接測定方法。 - （３）４，４’−ビスジメチルアミノベンズヒドロール
及び蛋白変性剤を含有することを特徴とする血清中のチ
オール基の直接測定方法に用いる試薬。 - （４）蛋白変性剤が塩酸グアニジンである特許請求の範
囲第３項記載の血清中のチオール基の直接測定方法に用
いる試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31747987A JPH0746103B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | 血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31747987A JPH0746103B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | 血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01161151A true JPH01161151A (ja) | 1989-06-23 |
| JPH0746103B2 JPH0746103B2 (ja) | 1995-05-17 |
Family
ID=18088685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31747987A Expired - Fee Related JPH0746103B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | 血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0746103B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0788595A4 (en) * | 1994-10-27 | 2000-05-03 | Oxigene Inc | METHOD FOR TESTING IMMUNOCOMPETENCY |
| JP2023067248A (ja) * | 2021-10-29 | 2023-05-16 | 日東紡績株式会社 | 血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を測定する方法およびキット |
-
1987
- 1987-12-17 JP JP31747987A patent/JPH0746103B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0788595A4 (en) * | 1994-10-27 | 2000-05-03 | Oxigene Inc | METHOD FOR TESTING IMMUNOCOMPETENCY |
| JP2023067248A (ja) * | 2021-10-29 | 2023-05-16 | 日東紡績株式会社 | 血清または血漿中の還元型アルブミン濃度または酸化型もしくは還元型アルブミンの割合を測定する方法およびキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0746103B2 (ja) | 1995-05-17 |
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Legal Events
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